Размещено на http://www.allbest.ru/

КЛИНИКО - ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СТРАТЕГИИ И ТАКТИКИ ИММУНОТЕРАПИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

ПОПОВА Лариса Леонидовна

Санкт-Петербург 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор Суздальцев Алексей Александрович

доктор медицинских наук Козлов Виктор Константинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Жданов Константин Валерьевич

доктор медицинских наук профессор Журкин Александр Тихонович

доктор медицинских наук профессор Симбирцев Андрей Семенович

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «___» октября 2009 года в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.01 в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «___» июня 2009 года

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Пономаренко Геннадий Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Вирусным гепатитам принадлежит одно из первых мест в общей структуре инфекционных заболеваний, при этом особое значение приобрел гепатит С. Его широкая распространенность в настоящее время (200 млн. инфицированных HCV в мире, из них 5 миллионов проживают в России), развитие неблагоприятных исходов -- переход в хроническую форму (до 85%), формирование в дальнейшем цирроза печени и гепатоциллюлярной карциномы (до 20%), а также высокая стоимость лечения, превратили эту инфекцию в серьезную медико-социальную проблему современного здравоохранения [Лобзин Ю.В. и соавт., 2004, 2005; Сологуб Т.В., 2004; Жданов К.В. и соавт., 2004, 2006; Шахгильдян И.В, 2005; Gheorghe L. et al., 2005; Hoofnagle J.H., 2005; Huo T.I., 2007].

Инфицирование HCV сопровождается мобилизацией неспецифической иммунной защиты и развитием HCV-специфического иммунного ответа. Характер взаимодействия вируса и иммунной системы хозяина изменяется с течением времени и зависит от влияния значительного числа факторов, что и определяет исход заболевания. Современные знания и концепции, касающиеся иммунопатогенеза HCV-инфекции, характеризуются противоречивостью высказываемых суждений о роли различных компонентов иммунной защиты в течении вирусного гепатита С [Никитин И.Г., 1999; Сологуб Т.В., 2002; Еналеева Д.Ш., Фазылов В.Х., 2003; Журкин А.Т., 2004; Игнатова Т.М., 2005; Гусев Д.А. и соавт., 2001; Лобзин Ю.В. и соавт., 2007; Жданов К.В. и соавт., 2007; Никитин В.Ю. и соавт., 2007; Собчак Д.М. и соавт., 2007; Козлов В.К. и соавт., 2008, 2009].

Доказана возможность внепеченочной репликации вируса, в частности в иммунокомпетентных клетках, которые могут становиться резервуаром
НСV-инфекции, источником реинфицирования гепатоцитов и причиной развития стойкой иммунной недостаточности [Курамшин Д.Х., 2002; Козлов В.К., 2004; Мицура В.М., 2004; Буеверов А.О., 2006]. Функциональная и структурно-морфологическая дезорганизация иммунной системы, возникающая у больных ХГС, является одной из причин препятствующих достижению стойкого вирусологического ответа при проведении этиотропной терапии.

Успешное лечение больных ХГС без понимания особенностей иммунного реагирования по отношению к возбудителю каждого конкретного пациента и коррекции возникающих иммунных нарушений невозможно. Это связано и с доказанным негативным воздействием HCV на иммунную систему и иммунотропными эффектами интерферонотерапии (rIFN-б) - основного компонента противовирусного лечения.

В настоящее время этиотропное лечение больных ХГС либо недостаточно эффективно - так, при монотерапии непролонгированными rIFN-б стабильная ремиссия наблюдается лишь у 12-30% пациентов, либо очень дорого - при использовании пегилированных форм rIFN-б и комбинированной схемы лечения с синтетическим аналогом гуанозина (рибавирин) [Волчек И.В. и соавт., 2000; Лобзин Ю.В., 2001; Майер К.П., 2004; Богомолов П.О. и соавт., 2005; Ивашкин В.Т. и соавт., 2007; Лопаткина Т.Н., 2007; В.К. Козлов и соавт., 2008]. С учетом этих обстоятельств, с целью увеличения количества пациентов со стабильной ремиссией идет постоянный поиск наиболее эффективных противовирусных препаратов и оптимальных схем их применения. Подходам же иммуноориентированной патогенетической направленности в стратегии оптимизации комплексного лечения больных ХГС не уделяется достаточного внимания.

При ХГС препаратами выбора среди лекарственных средств с доказанным иммунотропным действием многие исследователи называют цитокины с регуляторным механизмом действия (rIL-2) [Журкин А. Т., 2001; Лобзин Ю.В., 2001; Козлов В.К., 2002; Жданов К.В. и соавт., 2003; Скляр Л.Ф., 2003; Мицура В.М., 2004; Бабаченко И.В. и соавт., 2006; Егорова В.Н. и соавт., 2008]. Их место в лечении больных гепатитом С является предметом дискуссии. К наиболее актуальным вопросам относятся: обоснованность использования иммунотропных препаратов при лечении больных ХГС, выбор из множества иммуноактивных препаратов конкретных лекарственных средств, стратегия их применения, схемы назначения и способы введения. До сих пор не установлены и иммунологические критерии контроля эффективности иммуноориентированной терапии при ХГС. Высокая стоимость иммунологического обследования, в том числе, требующего привлечения современных технологий лабораторного анализа, диктует необходимость изыскания четких критериев необходимой достаточности любого обследования и выработки алгоритмов его проведения.

Таким образом, повсеместный рост числа больных ХГС и остающиеся до конца не изученными особенности иммунопатогенеза HCV-инфекции, а также отсутствие принципов и алгоритмов иммунодиагностики и дифференцированной тактики иммунотропного лечения этих пациентов, определяют актуальность, цель и задачи представляемой диссертационной работы.

Цель исследования

На основании комплексного клинико-биохимического, вирусологического и иммунологического обследования пациентов дать обоснование стратегии и тактики иммунотерапии при ХГС.

Задачи исследования:

1. Провести углубленное клинико-эпидемиологическое и иммунологическое обследование больных хроническим вирусным гепатитом С в Самарской области на этапе первичного обращения за врачебной помощью.

2. Изучить корреляционные взаимосвязи результатов биохимического и иммунологического обследования больных хроническим гепатитом С, а также оценить влияние клинической формы HCV-инфекции (манифестное, латентное) и известных предикторов эффективности противовирусной терапии на состояние изучаемых параметров иммунного статуса.

3. Изучить динамику клинико-биохимических и иммунологических показателей (основные субпопуляции лимфоцитов, параметры гуморального звена иммунитета, факторы неспецифической резистентности, спектр циркулирующих в периферической крови цитокинов) на фоне комбинированной противовирусной терапии rIFN-б в сочетании с синтетическим аналогом гуанозина (рибавирин).

4. Изучить состояние биохимических показателей и параметров иммунного статуса у больных ХГС после завершения комбинированной противовирусной терапии. Сопоставить в зависимости от ее исхода (стабильная ремиссия или рецидив заболевания) биохимические и иммунологические показатели и разработать математическую модель прогноза эффективности противовирусной терапии.

5. Разработать стратегию и тактику применения иммунотропных препаратов ронколейкин® и ликопид у больных ХГС, а также оценить эффективность предложенной схемы иммуноориентированного лечения.

Научная новизна исследования. На большом клинико-эпидемиологическом материале, охватывающем наблюдения за HCV-инфицированными на протяжении 2000-2008 гг., изучены и уточнены современные эпидемиологические тенденции распространения хронического гепатита С в Самарской области. Представлен детальный анализ клинико-биохимических параметров, характеризующих патогенез современного течения ХГС. Определен необходимый спектр иммунологического обследования пациентов с HCV-инфекцией, учитывающий практическую значимость данной технологии лабораторного анализа. Доказано, что при ХГС иммунная дисфункция с признаками недостаточности иммунного ответа развивается при любой клинической форме заболевания.

Впервые описаны корреляционные связи иммунологических показателей с биохимическими. Исследована взаимосвязь выявленных особенностей иммунного реагирования с длительностью инфицирования пациентов и активностью репликации вируса в сыворотке крови, а также известными предикторами эффективности противовирусной терапии.

Изучен характер изменений иммунного статуса и цитокинового спектра у больных ХГС последовательно на всех этапах этиотропного лечения и после его завершения. Определено прогностическое значение отдаленных последствий, выявленных изменений иммунного статуса и устойчивых биохимических корреляций для определения исхода заболевания. Созданы и верифицированы математические модели прогноза эффективности противовирусной терапии - дискриминантная модель методом логистической регрессии и «деревьев решений» по биохимическим и иммунологическим предикторам (приоритетные справки № 020667/2009115107 и № 020668/2009115108 от 20. 04. 2009).

Обоснованы стратегия и тактика применения иммунотропных препаратов ронколейкин® и ликопид у пациентов с HCV-инфекцией. При проведении иммуноориентированной терапии у больных ХГС использовано системное действие перорального способа введения препарата ронколейкин® и разработана схема его сочетанного применения совместно с препаратом ликопид (патенты на изобретение: № 2345787 от 10. 02. 2009 года; № 2348412 от 10. 03. 2009 года ).

Практическая значимость. Определен необходимый спектр иммунологического обследования пациентов с HCV инфекцией -- абсолютное число ИКК (CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-, CD16⁺-лимфоцитов), содержание IgА, IgG, IgМ, ЦИК, СН-50, динамическое исследование которых позволяет контролировать состояние иммунной системы у больных ХГС при проведении противовирусной терапии и после ее завершения в качестве дополнительного критерия эффективности лечения.

Изучено прогностическое значение отдаленных последствий, выявленных изменений иммунного статуса и устойчивых биохимических корреляций для определения исхода заболевания. Создана математическая модель (методом логистической регрессии и «деревьев решений») прогноза эффективности противовирусной терапии.

Установлено, что в качестве профилактики рецидива заболевания у больных ХГС доказанной эффективностью обладает следующий протокол использования иммунотропных препаратов: непосредственно после завершения основного курса этиотропной терапии назначается комбинация препаратов ронколейкин^® и ликопид.

Личное участие автора в получении результатов. Настоящее диссертационное исследование лично проводилось автором в его полном объеме с формированием база данных и осуществлением статистической обработки клинического материала и последующим обобщением полученных результатов. гепатит хронический терапия биохимический

Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании и лечении больных, а также в организации и проведении лабораторного и инструментального исследований. Автором лично изучены и подробно проанализированы клинико-лабораторные проявления, патоморфологические и инструментальные особенности, а также иммунологические показатели у каждого пациента. Автором диссертационного исследования научно обоснована методология оценки параметров, отражающих функциональное состояние печени и иммунной системы, и уточнены независимые от других причин прогностические факторы, которые свидетельствуют о возможном развитии рецидива HCV-инфекции. Автором сформирована база данных, проведена статистическая обработка материала и обобщение полученных результатов.

Автором разработана стратегия применения и обоснован протокол иммуноориентированной терапии, следование которому позволяет добиваться увеличения числа пациентов со стабильным вирусологическим ответом на комплексное лечение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Больные ХГС имеют клинические и лабораторные признаки дисбаланса иммунной системы в виде изменения содержания Т- и NK-лимфоцитов, дисглобулинемии, снижения активности системы комплемента и повышения количества циркулирующих иммунных комплексов ЦИК (р<0,001) при любой клинической форме заболевания, в том числе при отсутствии РНК HCV в сыворотке крови, которые сохраняются после завершения ПВТ у половины пациентов.

2. Комбинированная противовирусная терапия оказывает выраженное влияние на все звенья иммунитета: статистически значимые различия в значениях отдельных параметров иммунного статуса у больных ХГС с разным исходом ПВТ (стабильный вирусологический ответ или рецидив) появляются к третьему месяцу лечения и позволяют по определенным предикторам (математическая модель) судить о вероятности развития того или иного исхода терапии.

3. При определении стратегии лечения больных ХГС, необходимо учитывать наличие иммунной дисфункции у большинства этих пациентов и разнохарактерные изменения иммунного статуса как при проведении ПВТ, так и после её завершения, что диктует необходимость индивидуального подбора иммуноориентированной терапии. Тактика назначения этих препаратов определяется степенью и характером выявляемых нарушений. У больных с первичным вирусологическим ответом, при предпосылках к возможному рецидиву заболевания целесообразно назначать иммунотропные препараты непосредственно после завершения основного курса лечения под контролем иммунного статуса.

4. Применение после завершения основного курса ПВТ у больных ХГС комбинации иммунотропных препаратов «Ронколейкин^®» и «Ликопид» по разработанной нами схеме достоверно увеличивает число больных со стабильным вирусологическим ответом.

Реализация внедрения результатов исследования

На основании полученных результатов исследования разработаны 3 методических рекомендации, которые утверждены в центральном координационном методическом совете ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава».

Материалы диссертации использованы при выполнении плановой темы НИР: «Клинико-эпидемиологическая характеристика парентеральных вирусных гепатитов (ВГВ, ВГС) в крупном промышленном регионе, лечение, исходы» (номер государственной регистрации темы 01.2.00 410038).

Полученные результаты внедрены в практику работы инфекционных отделений и кабинетов инфекционных заболеваний стационаров и поликлиник Самарской области.

Данные диссертационного исследования внедрены и используются в научной и лечебной работе кафедры и клиники инфекционных болезней СамГМУ, а также в учебно-педагогическом процессе на кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» при преподавании тем: «Вирусные гепатиты», «Принципы диагностики нарушения иммунной регуляции и проведения иммуноориентированной терапии у больных инфекционными заболеваниями» студентам лечебного, медико-профилактического, педиатрического факультетов, а также при проведении занятий с врачами общей практики - слушателями цикла повышения квалификации по специальности инфекционные болезни и цикла профессиональной переподготовки по специальности общей врачебной практики (семейная медицина).

Апробация и публикация материалов исследования

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены:

на VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии, (Москва, Россия, 2006); V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии, (Москва, 2007); VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакотерапии», (Москва, 2007); XII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека», (Самара, 2007), Международном евро-азиатском конгрессе по инфекционным болезням, «Актуальные вопросы гепатологии», (Витебск, 2008); XIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека», (Самара, 2008); III Санкт-Петербургском гепатологическом конгрессе и Северо-западной школе гастроэнтерологии и гепатологии (Санкт-Петербург, 2009); I Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2009);

а также на ежегодных Российских конференциях «Гепатология сегодня», (Москва, 2000-2009); XXXVII итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского Военно-медицинского института «Актуальные вопросы современной медицины», (Самара, 2004); VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», (Москва, 2005); научно-практической конференции Казанского государственного медицинского университета, (Казань, 2007); научно-практической конференции «Новое в лечении гепатитов», (Самара, 2007).

Кроме того, результаты исследования были доложены на заседаниях Областного Научного Общества инфекционистов Самарской области (2004 - 2009).

По материалам исследования опубликовано 54 печатные работы, в том числе 9 статей в журналах, рецензируемых ВАК Минобрнауки РФ, получено 2 патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Основной текст диссертации изложен на 407 страницах машинописного текста на русском языке и включает: введение, аналитический обзор литературы, характеристику материалов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации.

Диссертация иллюстрирована 94 таблицами и 107 рисунками. Список литературы содержит 307 источников, в том числе 205 отечественных и 102 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Настоящее исследование состоит из трех частей. При анализе эпидемиологических, клинико-лабораторных и инструментальных данных состояния печени и иммунной системы (первая часть работы) использовались результаты обследования 487 больных ХГС, подтвержденного серологическими и молекулярно-биологическими исследованиями. При формировании групп сравнения среди пациентов основной выборки (первичное обращение за медицинской помощью) были выделены больные не леченые ранее и имевшие в анамнезе указание на проведение противовирусной терапии. Среди первых сформированы две группы пациентов: группа I (n=382) -- с признаками репликации вируса в сыворотке крови (НСV-ab+, RNK-НСV+), и группа II (n=37) -- с отсутствием вируса в крови (НСV-ab+, RNK-НСV-). Остальные пациенты, имевше в анамнезе указание на ПВТ, также прелставлены двумя группами: III-я (n=22) -- с наличием стабильного вирусологического ответа (НСV-ab+, RNK-НСV-) и IV-я (n=46) -- с рецидивом заболевания (НСV-ab+, RNK-НСV+). Для динамического наблюдения за состоянием основных клинических и лабораторных параметров на фоне ПВТ по «стандарту» (вторая часть работы) и с применением иммуноориентированной терапии (третья часть работы) среди больных первой группы была выделены пациенты (n=173) по следующим критериям: возраст от 18 до 51 года, фиброз печени (по данным УЗИ и пункционной биопсии) не выше F₃, умеренная или высокая концентрация НСV в сыворотке крови, 1b генотип вируса, отсутствие аутоиммунных заболеваний, патологии эндокринной системы и нарушения обмена веществ с избыточной массой тела. Работа с пациентами в третьей части исследования, при обосновании схемы применения иммуноориентированных препаратов (ронколейкин^®, ликопид), проводилась на основе их письменного согласия, в соответствии с международными этическими требованиями, предъявляемыми к медицинским исследованиям с участием человека.

Все пациенты наблюдались в клинике инфекционных болезней СамГМУ и Самарском Областном Гепатологическом Центре. Возраст больных составил от 18 до 68 лет, в среднем 32,4 ±7,2 года, преобладали лица мужского пола (мужчин - 63,7%, женщин - 36,3%). Согласно данным специфического обследования: иммуноферментного (ИФА) и молекулярно-биологического (ПЦР) - все наши пациенты, инфицированные НСV, были серопозитивными (HCV-ab +). Среди больных с положительной реакцией ПЦР в сыворотке крови при первичном обращении наиболее часто регистрировался 1b генотип (65%) и высокая или умеренная вирусная нагрузка -- 61% и 31% соответственно.

Обследование соответствовало международным и отечественным рекомендациям по ведению больных с заболеваниями печени и иммунными нарушениями [Шерлок Ш., Дули Дж., Хаитов Р.М. и соавт., 2002; Лобзин Ю.В.и соавт., 2003, 2005; Жданов К.В, и соавт., 2004; Мухин Н.А., 2004; Козлов В.К., 2008]. Исследование биохимических параметров функции печени в сыворотке крови проводили на автоматическом биохимическом анализаторе «Hitachi - 902» фирмы «Roch-Diagnostics», производства Японии с помощью коммерческого набора реактивов фирмы «Roch-Diagnostics» (Швейцария). Исследование клеточного звена иммунитета производилось путем определения относительного (процентного) и абсолютного числа зрелых Т- и В-лимфоцитов, а также естественных (натуральных) киллеров - NK. Для постановки реакции использовали стандартную панель моноклональных антител производства Becton Dickinson, включающую антитела к CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD16⁺, CD20⁺ - дифференцировочным антигенам лейкоцитов и соответствующие изотипические контроли. Иммунофенотипирование (CD3⁺4⁺; CD3⁺8⁺; CD3^-CD20⁺; CD3^-CD16⁺) проводили на лазерном проточном цитофлюориметре Becton Dickinson FACS Calibur с помощью компьютерной программы Cell Quest Pro. Содержание иммуноглобулинов (IgА, IgМ, IgG) в сыворотке крови определяли с помощью реакции преципитации радиальной иммунодиффузии по Манчини. Гемолитическую активность системы комплемента оценивали по 50% гемолизу (СН50) сенсибилизированных эритроцитов барана. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) - определяли методом осаждения полиэтиленгликоля м.м.6000. Содержание цитокинов в плазме определялось с помощью наборов реагентов ЗАО «Вектор-бест» и набором реагентов ProCon IL-2 (ООО «Протеиновый Контур», Санкт-Петербург) твердофазным иммуноферментным методом основным компонентом. Фгоцитарную активность лейкоцитов (ФАЛ) оценивали по способности нейтрофильных гранулоцитов крови поглощать частицы полистирольного латекса. Для определения HCV-ab в сыворотке были использованы скрининговые тест-системы иммуноферментного анализа НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород) и «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Определение РНК HCV проводили методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с помощью комплекта реагентов «АмплиСенс HCV-Мониторинг-FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Вирусная нагрузка определялась количественным методом (линейный диапазон измерения тест-систмы: 500-50 000 000 МЕ/мл). Проведение реакции амплификации, анализ и учёт результатов проводили при помощи прибора IQ iCyber (BioRad, США), либо полуколичественным методом по степени разведения сыворотки с детекцией в агарозном геле, также с помощью комплекта реагентов «АмплиСенс» вариант 100R для ПЦР-амплификации к RNA-НСV. Ультразвуковое исследование органов брюшной полости проводилось на сканере Toshiba 370A Power vision 6000, использовались два мультичастотных датчика (конвексный 3,0-6,0 Мгц и линейный 6,0-11,0 Мгц). Часть исследований проводилось на ультразвуковом сканере Sonoace X-8 с применением технологии Dynamic MR^T. Пункционная биопсия печени производилась с учетом всех существующих противопоказаний к проведению данной манипуляции по классической методике интеркостальным латеральным доступом. Прижизненные гистологические, а также аутопсийные исследования проводились сотрудниками патологоанатомического отделения клиник СамГМУ и кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО СамГМУ (зав. кафедрой - д.м.н., профессор Федорина Т.А., зав. прозекторским отделением - к.м.н., Семеная Е.В.).

Статистическая обработка материала. Первый этап статистического анализа включал оценку формы распределения изучаемых данных (визуально по гистограммам распределения, по показателям асимметрии и эксцесса, а также по критерию Шапиро-Уилки), который выявил заметные отличия от нормальной формы для некоторых биохимических и иммунологических показателей. Это обусловило применения как параметрических, так и непараметрических методов анализа. Проводили сравнения двух групп по критериям Стьюдента, Крамера-Уэлча, Манна-Уитни-Вилкоксона для независимых и связанных выборок (в зависимости от дизайна); сравнения нескольких групп -- с помощью однофакторного дисперсионного анализа и анализа Краскела-Уоллиса. Сравнения дисперсий проводили с помощью критерия Фишера. Для анализа взаимосвязей применяли корреляционный анализ Спирмена, а также факторный анализ. Сравнения и взаимосвязи качественных данных выявляли с помощью анализа таблиц сопряженности с расчётом статистики ?² и, в случае таблицы 22, с применением точного метода Фишера. Моделирование исходов лечения проводили с помощью логистической регрессии и деревьев решений. Данные представляли в форме среднего и его ошибки или медианы и квартилей, в зависимости от формы распределения. Анализ данных выполняли в среде статистического пакета SPSS 11.5 и SPSS AnswerTree 3.0. Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При детальном анализе клинико-эпидемиологических данных о больных ХГС за 2000-2008г.г. наблюдения (n=487), было показано, что группа пациентов наиболее активного возраста - 18-50 лет остается доминирующей, составляя до 90% всех случаев, при этом преобладают лица молодого возраста (до 30 лет - 68%). За изучаемый период число пациентов, инфицированных ХГС через внутривенное введение наркотиков, уменьшилось в 2 раза: с 58,8% (2000г.) до 23,2% (2008г.). Количество больных, заражение которых произошло через половой путь передачи, возросло с 6,2% (2000г.) до 14,4% (2008г.). Остается высоким удельный вес больных с неуточненным фактором передачи инфекции (до 22% случаев). Учитывая, преимущественно молодой возраст пациентов, вероятно, имеет место либо скрываемая наркотическая зависимость, либо половой путь инфицирования. У пациентов, которые имели возможность судить о давности заболевания (68% общей выборки, n=259), предполагаемый срок инфицирования составил: до 1года - 12,3%, от 2 до 5 лет - 41,5%, свыше 5 лет - 46,2%. Наиболее распространенным генотипом HCV-инфекции в Самарской области остается 1в генотип. В различные годы наблюдения генотипическая структура НСV-инфекции была следующей (минимальные и максимальные значения, в %): 1b -- от 37,7 (2000г.) до 63,1 (2007г.); 3a -- от 28,1 (2003г.) до 42,1 (2000г.); 2 -- от 4,0 (2006г.) до 8,7 (2004г.); 1а -- не определялся в 2000, 2001, 2003, 2007гг. и был максимальным -3,6 в 2006г.; микст -- от 0,9 (2005г.) до 7,1 (2000г.); не типировался -- от 1,1 (2006г.) до 6,9 (2001г.). Генотип 3а чаще встречался у мужчин, чем у женщин (в среднем на 13%). Начало регистрации вирусной нагрузки в Самарской области - 2001 год. Результаты распределения пациентов по величине вирусной нагрузки при первичном обращении в различные годы наблюдения были следующими: низкая -- от 4% в 2007г. до 12% в 2002г., умеренная -- от 26 % в 2005г. до 41% в 2006г., высокая -- от 48% в 2006г. до 69 % в 2005г. Из полученных нами данных следует, что при любом генотипе HCV инфекции на протяжении всего анализируемого периода при первичном обращении больных ХГС наиболее часто регистрируется максимальное содержание вируса.

У большинства наших пациентов (88,6%) при первичном обследовании в сыворотке крови выявлено изменение функциональных проб печени. Сравнения результатов биохимического исследования сыворотки крови по средним величинам проводилось по критерию Манна-Уитни-Вилкоксона. Для некоторых изучаемых параметров выявлена ассиметричная, отличная от нормальной форма распределения. Это в первую очередь касалось активности ферментов, некоторых показателей МВС-синдрома. Следует отметить, что у пациентов отличались не только средние значения, но и разбросы метаболических показателей. Сравнение дисперсий по F-критерию Фишера выявило статистически значимые различия дисперсий в группе обследованных (все p<0,001, кроме общего белка -- p=0,002), по сравнению с группой контроля, в том числе и для показателей, не имевших различий в средних значениях. Это подтверждает известный факт, что при вирусном гепатите страдают в той или иной степени все функциональные пробы печени.

На следующем этапе был проведен корреляционный анализ по Спирмену основных биохимических показателей, что выявило взаимосвязанные параметры. Содержание альбумина имело обратную зависимость от активности АлАТ и ГГТП (r= -0,30, p=0,019 и r= -0,45, p=0,005, соответственно), содержание ?₁-глобулина -- прямую взаимосвязь с активностью АсАТ (r= 0,54, p=0,002), ГГТП (r= 0,39, p=0,019). Отмечена положительная взаимосвязь активности ферментов (АлАТ-АсАТ: r=0,81, АлАТ-ГГТП: r=0,49, АсАТ-ГГТП: r=0,49, все p <0,001), а также, отдельных показателей белковых фракций между собой: отрицательные корреляции альбумина с глобулинами (с б2 r=-0,39; с в: r=-0,42; с г: r=-0,45; все p <0,005) и взаимосвязь фракции ?- глобулинов с тимоловой пробой: r=0,49, p <0,005. Кроме того, выявлена третья группа взаимосвязанных показателей б1-глобулина с ГГТП: r=0,39, p=0,019, и ЩФ r=-0,34, p=0,031. Таким образом, проведя двухфакторный и многофакторный статистический анализ состояния функции печени по результатам исследования биохимических параметров у больных ХГС (НСV-ab+, RNK-НСV+), мы зарегистрировали три группы устойчиво коррелирующих показателей. В дальнейшем это позволило сопоставить характер иммунного ответа больных ХГС не только с отдельными биохимическими показателями, но и с группами взаимосвязанных параметров.

Результаты изучения показателей иммунной системы и факторов неспецифической резистентности у больных ХГС, не получавших противовирусную терапию, проводилось по результатам обследования группы I (НСV-ab+, RNK-НСV +; n=382) -- при их первичном обращении. В качестве контроля (группа К, НСV-ab -, RNK-НСV-; n=50) исследовались сыворотки здоровых доноров сопоставимых по полу, возрасту и сопутствующим заболеваниям, как правило, это были студенты и сотрудники кафедры и клиники. Для каждого показателя, характеризующего иммунный статус, в иммунологической лаборатории СамГМУ были установлены границы нормальных значений для жителей Самарской области.

На первом этапе статистического анализа (по F-критерию Фишера), мы выявили значительную дисперсию параметров в группе обследованных пациентов. Статистический анализ значимости различий по отклонению от средней величины (меры разброса) вариабельности основных показателей ИС в группе больных ХГС и здоровых доноров был следующим: дисперсия содержания лейкоцитов и относительного количества лимфоцитов (включая все изучаемые субпопуляции и ИРИ) - достоверно отличалась от группы контроля, все p<0,001. Абсолютные значения ИКК менялись, как правило, однонаправлено с минимальным разбросом, однако и в этом случае дисперсия показателей для CD4⁺ и CD8⁺ клеток значимо отличалась при сравнении с группой здоровых доноров, все p<0,04.

По результатам дисперсионного анализа показателей гуморального звена и факторов неспецифической защиты широта дисперсии -- IgА, IgG, IgМ, ЦИК, СН-50, нейтрофилов, тромбоцитов (все p<0,001) и эозинофилов (p=0,003), значимо отличалась от показателей группы здоровых доноров. При этом, часть параметров изменялась однонаправлено: преимущественно в сторону снижения - лейкоциты (30,0%), CD3⁺ (абс.10,4%), CD4⁺ (абс.42,7%), CD8⁺ (абс.37,6% и отн.21,3%), CD16⁺ (абс.86,2% и отн.71,9%), CD20⁺ (абс.53,2%) -лимфоциты, ЦИК (75,0%), СН-50 (65,2%) или повышения - лимфоциты (абс. 22,6% и отн. 60,9%), IgМ (37,8%), IgG (23,9%). Остальные показатели отличались разбросом значений, которые выходили за границы нормы, как в сторону повышения, так и в сторону понижения, хотя, как правило, наблюдалось преобладание либо сниженных значений (CD3⁺ отн, CD4⁺ отн^.), либо повышенных (CD20⁺отн., ИРИ, IgА). Описанная закономерность влияла на результаты, полученные при сравнении их средних величин. Сравнение средних величин абсолютного и относительного содержания ИКК, а также отдельных показателей гуморального звена и факторов неспецифической защиты у здоровых доноров и больных ХГС, мы проводили с помощью критерия Манна-Уитни-Вилкоксона (при сравнении двух групп) и с помощью дисперсионного анализа в классическом параметрическом варианте и в непараметрическом варианте по Краскелу-Уоллису при сравнении трех групп и более. При выявлении значимых различий последующие попарные сравнения проводили по методу Тьюки, Даннета или Ньюмена-Кейлса. В группе наблюдения отмечалась умеренное снижение содержания лейкоцитов 5,15±0,18х10⁹/л, значимое (p<0,001) по сравнению с показателями здоровых доноров 6,59±0,15х10⁹/л. Незначительное повышение относительного числа лимфоцитов (35,69±1,39 х10⁹/л) было достоверным только для субпопуляции CD20⁺ (14,12±0,88х10⁹/л, p=0,002). Относительное содержание СD4⁺-лимфоцитов было снижено: до 40,37±1,02х10⁹/л, (p=0,003) и СD16⁺ -- до 11,65±0,69х10⁹/л; (p<0,001). Абсолютное количество лимфоцитов (1,74±0,07х10⁹/л, p=0,003) было достоверно снижено, как и содержание всех изучаемых субпопуляций: CD3⁺(1,19±0,05х10⁹/л), СD4⁺ (0,70±0,03х10⁹/л), CD8⁺ (0,43±0,02х10⁹/л), СD16⁺ (0,20±0,01х10⁹/л) и CD20⁺ (0,23±0,02х10⁹/л), p<0,001. Сравнение показателей гуморального звена и факторов неспецифической резистентности также показало значимые различия с данными группы здоровых доноров. Зарегистрировано снижение активности системы комплемента до 43,30±1,01; (p<0,001), количества моноцитов (5,05±0,38; p=0,005) и тромбоцитов (206,62±8,71; p<0,001), вместе с тем были повышены -- ЦИК (93,92±0,51%; p<0,001) и содержание всех иммуноглобулинов: IgА (2,54±0,11 г/л; p<0,001), IgМ (1,92±0,09 г/л; p<0,001) и IgG (17,31±0,63 г/л; p= 0,008).

Таким образом, детальный анализ субпопуляционного состава ИКК, отдельных показателей гуморального звена и факторов неспецифической защиты показал значительный структурный дисбаланс во всех звеньях иммунитета. Выявлена тенденция, свидетельствующая о развитии иммунной недостаточности со снижением абсолютного числа практически всех основных субпопуляций лимфоцитов (особенно постоянно и глубоко - CD8⁺- и CD16⁺- клеток). Вместе с тем, зарегистрировано повышение содержания субпопуляции CD20⁺ лимфоцитов, гиперглобулинемия (IgG, IgМ, IgА), а также повышение концентрации ЦИК в сочетании со значительным уменьшением активности системы комплемента. Описанные изменения характерны для иммунного ответа отражающего преобладание Th2 ответа над Th1.

С целью изучения особенностей иммунного статуса у пациентов в зависимости от клинической формы заболевания, проведено сопоставление изучаемых параметров в подгруппах с манифестной (1) и латентной (2) формой HCV-инфекции. Манифестное течение было зарегистрировано у 74,2% больных ХГС и характеризовалось преимущественно, наличием астеновегетативного синдрома (89,7%), гепатолиенального (77,2%) и диспепсического (47,7%). Латентная форма встречалась у 25,8% больных, в этой группе пациентов основным клиническим проявлением было увеличение печени (64,3%), у большинства из них в сочетании со спленомегалией. При иммунологическом обследовании больных с манифестным течением заболевания была выявлена умеренная лейкоцитопения в 34,6% случаев, при латентном - в 28,2%. Относительное содержание лимфоцитов в группе с латентным течением ХГС было нормальным, в группе с манифестным - чаще повышенным (37,2%). От здоровых доноров обе группы достоверно отличались по большинству показателей: в 38,3% - 44,5% регистрировались низкие значения относительного числа ИКК (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD16⁺ - клеток), повышенные (до 40% случаев) -- СD20⁺-лимфоцитов. Вместе с тем, несмотря на то, что абсолютное число ИКК было снижено у большинства пациентов как в 1-й подгруппе, так и во 2-й группе сравнения, (у каждого третьего - по CD3⁺ -клеткам, у каждого второго - по СD8⁺-лимоцитам, в 60% случаев снижены CD4⁺-, и до 80% - CD16⁺- клетки), достоверно группы между собой различались только по абсолютному числу CD16⁺ - лимфоцитов. Такая же тенденция отмечена и при сравнении средних величин относительных значений. Статистически значимое различие между группами выявлено для единичных показателей: более высокое при манифестном течении содержание относительного числа CD20⁺ клеток, IgM и нейтрофилов (p<0,05). Подтверждение значимости снижения уровня моноцитов у больных ХГС при сравнении с группой контроля -- только для манифестных форм (p<0,011).

На следующем этапе исследования у больных I группы ХГС (RNA HCV+), мы провели сравнительный анализ взаимосвязи изучаемых параметров иммунного статуса и неспецифической резистентности с биохимическими показателями сыворотки крови. Результаты сравнения содержания ИКК в подгруппах с различной степенью повышения АлАТ (при норме до 41 ед/л), показали, что при любых значениях АлАТ имеется достоверное снижение содержания абсолютного числа всех ИКК по отношению к группе контроля: лейкоцитов, CD4⁺ и CD16⁺ - клеток, все p_K<0,001; CD3⁺ и CD20⁺ - клеток, p_K<0,02; CD8⁺ клеток, p_K=0,004. При сравнении результатов исследования АлАТ в анализируемых подгруппах между собой, зарегистрированы значимые различия содержания абсолютного числа всех субпопуляций лимфоцитов и относительного - для CD3⁺-, CD4⁺- и CD16⁺- клеток. Кроме того, при АлАТ свыше 5 норм не только абсолютное, но и относительное содержание CD3⁺- и CD4⁺- лимфоцитов ниже, чем в других подгруппах (p<0,05).

При статистическом анализе результатов, полученных при сравнении показателей гуморального звена и факторов неспецифической резистентности, было показано, что при любых значениях АлАТ содержание Ig всех изучаемых классов, ЦИК, СН-50 (p_K<0,003), а также ряд других показателей крови -- моноциты и тромбоциты, (p_K<0,006) отличаются от группы контроля. При сравнении подгрупп с разной степенью повышения АлАТ между собой, значимые отличия зарегистрированы только для IgA и тромбоцитов.

Мы провели статистический анализ взаимосвязи изменения параметров иммунного статуса и значений других биохимических показателей. Наиболее интересные данные получены при сравнении групп с разной степенью повышения ГГТП (норма 11- 49 ед/л), белкового спектра -- альбумина (норма 57-67г/л), фракций глобулинов б1-глобулина (норма 3,5-6 %), г-глобулина (норма 13-19%) и тимоловой пробы (норма 0-4ед). Изменение субпопуляционного состава лимфоцитов по уровню содержания ГГТП в сыворотке крови характеризовалось достоверным снижением абсолютного количества всех ИКК и относительного - CD4⁺-, CD16⁺-, CD20⁺- клеток, при любой степени повышения ГГТП. Подобные изменения были зарегистрированы для тимоловой пробы и альбумина. При анализе содержания глобулинов и их фракций выявлены корреляции для б1- и г- глобулинов с абсолютными значениями CD3⁺ и CD4⁺ лимфоцитов и только относительными - CD4⁺.

Для изучения взаимосвязи биохимических и иммунологических показателей мы применили ранговый корреляционный анализ по Спирмену. Выявлен обратный характер взаимосвязи между основными иммунокомпетентными клетками CD3⁺, CD4⁺ с показателями цитолиза и тимоловой пробой. Получены следующие коэффициенты корреляции CD3⁺-лифоцитов (относительного содержания): с АЛТ: -0,38, p= 0,006; с АСТ: -0,35, p=0,057; с ГГТП: -0,56, p=0,005, с тимоловой пробой: -0,43, p=0,006. Для CD4⁺-лимфоцитов аналогичные взаимосвязи выглядят следующим образом: с АЛТ: -0,41, p=0,003; с АСТ значимой корреляции не выявлено; с ГГТП: -0,49, p=0,016, с тимоловой пробой: -0,34, p=0,035. Абсолютное содержание данных фенотипов лимфоцитов коррелировало только с активностью ГГТП (с CD3⁺ r= -0,51; p=0,01; с CD4⁺ r= -0,56; p=0,005). Содержание в-липопротеидов находится в прямой взаимосвязи с содержанием CD20⁺-лимфоцитов (для относительного содержания r=0,44, p=0,045; для абсолютного r=0,46, p=0,034).

Изучение корреляций белкового спектра и клеточных факторов иммунитета выявило обратную зависимость концентрации общего белка с относительным содержанием CD8⁺-клеток (r=-0,38, p=0,012); ?₁-фракции глобулинов и лимфоцитов c CD3⁺ и CD4⁺ (отн.) (r= -0,36, p=0,025 и r= -0,41, p=0,010, соответственно) и прямую зависимость между фракцией ?-глобулинов и CD20⁺-клетками (r=0,37, p=0,025).

Анализ взаимосвязей с показателями гуморального звена показал положительную корреляцию тимоловой пробы с уровнем ЦИК (r=-0,73; p<0,001) и отрицательную с активностью комплемента (r=-0,35, p =0,044). Кроме того, выявлена положительная связь активности щелочной фосфатазы и уровня ЦИК (r=- 0,37, p=0,044), а также уровня в-глобулинов с содержанием иммуноглобулинов М и нейтрофилами, а г-глобулины с IgG.

Для комплексной оценки выявленных взаимосвязей во всём их многообразии мы провели факторный анализ на основе матриц ранговых корреляций Спирмена по всем переменным.

Таблица 1

Факторные нагрузки иммунологических и метаболических показателей

Примечание: Факторные нагрузки меньшие 0,4 не показаны

Выделение факторов проводили методом главных компонент с последующим вращением факторов по методу варимакс. Число выделяемых факторов определяли визуально по графику «каменистой осыпи». Следует отметить, что во всех многочисленных построенных вариантах факторной модели (с немного различающимся исходным набором показателей с разным числом выделяемых факторов) первый и вторые компоненты устойчиво сохранялись одни и те же. Рассмотрим более подробно наиболее приемлемую модель. Результаты факторного анализа -- нагрузки по выделенным компонентам -- представлены в таблице 1. Пригодность имеющихся данных для факторного анализа подтверждается достаточным результатом теста Кайзера-Мейера-Олкина (КМО) (0,71) и значимым уровнем теста сферичности Бартлетта (?²=194,8, p<0,001).

Оценка показателей относительной дисперсии простых факторов (communalities) свидетельствует о том, что доля дисперсии в исходных переменных, объясняемая факторным решением, превышает 0,50 для каждой из переменных, то есть каждая из переменных имеет право быть включенной в модель.

Процент объяснённой дисперсии по всем выделенным компонентам составляет 73,5% общей дисперсии.Как видно из данных, представленных в таблице, первую компоненту (32,8% обшей дисперсии выборки) определяют активность ГГТП, АЛТ, содержание CD3⁺ и CD4⁺ клеток и фракция ?₁-глобулинов; её можно охарактеризовать как связанную с цитолизом. Вторую компоненту (19,0% обшей дисперсии) определяют альбумин, ?-глобулины и CD20⁺-лимфоциты. Третья компоненту (13,3% обшей дисперсии) -- щелочная фосфатаза, ?₁-глобулин и CD20⁺ -лимфоциты. Тимоловая проба определяет четвёртую компоненту (8,4% обшей дисперсии) со значительно меньшим участием CD3⁺ лимфоцитов.Состояние изучаемых параметров иммунного ответа у больных ХГС (НСVab+, RNA-НСV+) в зависимости от длительности инфицирования, генотипа вируса и активности вирусной репликации НСV проводили однофакторным дисперсионным анализом с последующим проведением апостериорных тестов по методу Бонферрони. Изучение эффекта взаимодействия этих признаков проводили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Ассоциации, взаимосвязи рассматриваемых группирующих признаков проводили с помощью анализа таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат.

На следующем этапе мы изучили характер изменения содержания лимфоцитов и их основных субпопуляций у пациентов с различными сроками инфицирования. Возможность проведения такого исследования (при наличии уточненного эпидемиологического анамнеза) была у 68% пациентов общей выборки (n=259). Мы выделили 3 подгруппы: до 1 года - 12,3% (n=31); от 2 до 5 лет - 41,5% (n=107); свыше 5 лет - 46,2% (n=121). Выявлено статистически значимое расширение дисперсии иммунологических параметров во всех группах исследования в сравнении со здоровыми донорами. Статистический анализ полученных значений средних величин показал, что абсолютное содержание ИКК в сравниваемых группах и уровень значимости их отличий при любой длительности заболевания было ниже показателей в группе здоровых доноров.

Изучение возможной взаимосвязи содержания ИКК и длительности инфицирования продемонстрировал линейный характер снижения количества лейкоцитов при нарастании сроков инфицирования. График абсолютного содержания лимфоцитов и их основных субпопуляций не имел линейного характера, а отразил выявленный тренд с изломом, соответствующий уменьшению дефицита ИКК при средних сроках инфицирования. Полученные данные позволили выявить схожий характер зависимости для CD3⁺ -, CD4⁺ -, CD8⁺ - и CD16⁺ - клеток. Нарушение относительного содержания субпопуляций лимфоцитов, отражающее дисбаланс в клеточном звене иммунитета, наиболее значимо проявилось для СD16⁺ - и CD20⁺- клеток.

Рис. 1 Относительное содержание CD20⁺-лимфоцитов в зависимости от вирусной нагрузки и срока инфицирования HCV

В дальнейшем мы сопоставили содержание ИКК у больных с разным генотипом вируса (1b, 3а, 2, 1а, микст), но в этом случае достоверных различий получено не было. Анализ таблиц сопряженности всех признаков между собой не выявил достоверных ассоциаций между ними, за исключением эффекта взаимодействия (p=0,032) для вирусной нагрузки и срока инфицирования по отношению к CD20⁺-лимфоцитам. Установлено, что если у больных со слабой или высокой вирусной нагрузкой показатели CD20⁺ одинаковы при любом сроке инфицирования, то у больных с умеренной вирусной нагрузкой со сроком инфицирования более 5 лет содержание CD20 - лимфоцитов почти вдвое ниже (10,75±3,42%), чем у больных с такой же нагрузкой, но сроком инфицирования менее 5 лет (23,00± 4,31%), p=0,032.

При сравнении клинико-лабораторных данных больных ХГС с различной активностью НСV в сыворотке крови при их первичном обращении в группах I (НСV-ab+, RNA-НСV+; n=382) и II (НСV-ab +, RNA-НСV- ; n=37) между собой и здоровыми донорами, наряду с наличием определенных клинических признаков, отличающих данных пациентов, выявлены различия и биохимических параметров, отражающих функцию печени. Сравнение дисперсий по F-критерию Фишера показало статистически значимое расширение дисперсий относительно здоровых доноров не только в I-ой группе сравнения, но и во II-ой (кроме ЩФ, б1- и в -глобулинов ), все p<0,05. При сравнении средних величин биохимических параметров в группе с естественной ремиссией и у здоровых доноров обращает на себя внимание факт достоверного отличия, прежде всего, показателей белкового спектра. Так, у пациентов II группы повышены значения альбумина (52,91±1,16), б1-глобулинов (3,16±0,10), в-глобулинов (14,25±0,43), все p<0,001, а также тимоловой пробы (3,60:3,00;4,50), p=0,002. Содержание общего белка (73,65±0,68), б2-глобулинов (6,78±0,31) и в-липопротеидов (3,39±0,34)-снижено, все p<0,005. Статистического различия не зарегистрировано по значениям ферментов. Вместе с тем, по сравнению с I группой значения трансаминаз (АлАТ-18,40:14,30;27,30,АсАт-15,20:12,80;28,30), а также транспептидазы (ГГТП-18,00:13,00;33,00) достоверно ниже - все p<0,001. Кроме того, ниже, чем в первой группе значения г-глобулинов (17,39±0,68) и б2-глобулинов (6,78±0,31), все p<0,005. Значительные разбросы метаболических показателей и достоверные различия их средних значений у пациентов, инфицированных HCV без репликации в сыворотке крови, подтверждает факт их отличия по функциональному состоянию печени как от больных при наличии активности вируса HCV в крови, так и от группы здоровых доноров.