Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

03.02.07 - генетика

доктора биологических наук

Сироткина Ольга Васильевна

Санкт-Петербург - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Петербургском институте ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И.И.Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук Вавилова Татьяна Владимировна

доктор биологических наук Шварцман Александр Львович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Слозина Наталья Михайловна

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук профессор Баранов Владислав Сергеевич

доктор медицинских наук профессор Иванов Андрей Михайлович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «12» мая 2011 года в _________часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан «____»____________________2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 205.001.01

кандидат медицинских наук Санников М.В.

тромбоцитарный рецептор сосудистый генетический

Основные положения работы

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) справедливо называют эпидемией XXI века. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2005 году от ССЗ умерло 17,5 миллионов человек в мире, что составило 30% всех случаев смерти. К 2015 году около 20 миллионов человек могут уйти из жизни от ССЗ, главным образом, от болезней сердца и инсульта, которые, по прогнозам, останутся единственными основными причинами смерти. Наблюдается устойчивая тенденция к “омоложению” сердечно-сосудистой смертности. У лиц молодого возраста развитие артериальных тромбозов обусловлено, в первую очередь, нарушениями тромбоцитарного гемостаза (Руксин В.В., 1998; Trip M.D. et al, 1990; Koenig W., 1998; Ardissino D. et al, 1999; Folsom A.R., 2001). Важным фактором сохранения нормальной работы сердечно-сосудистой системы является своевременное предупреждение острых кардиологических состояний путем раннего и достоверного определения возможных рисков патологических изменений миокарда. В этой связи изучение молекулярных механизмов активации тромбоцитов, несомненно, является актуальным, и имеет большое практическое значение.

В клинической практике для блокирования процессов тромбоцитарной агрегации широкое применение нашли аспирин, блокаторы гликопротеиновых IIb-IIIa рецепторов (абциксимаб, эптифибатид, монафрам) и клопидогрел (Бокарев И.Н. и др., 2008; Phillips D.R. et al, 2005; Capodanno D., 2010). При назначении антиагрегантных препаратов врач и пациент могут столкнуться с индивидуальной чувствительностью к лекарству, причиной которой будут служить, в том числе, и генетические факторы. Учитывая распространенность сердечно-сосудистых заболеваний и медико-социальную значимость их терапии и вторичной профилактики, вопросы индивидуальной чувствительности к антитромботическим препаратам встают на первое место в числе фармакогенетических исследований. В настоящее время объяснить вариабельность ответа тромбоцитов на индукцию агонистами и ингибирование селективными блокаторами известными генетическими вариантами тромбоцитарных рецепторов невозможно.

Актуальным является и поиск лабораторных критериев оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов. Само определение аспирин- или клопидогрел-резистентности, а также индивидуальной чувствительности к блокаторам GP IIb-IIIa рецепторов подразумевает использование адекватных лабораторных тестов для анализа функциональной активности тромбоцитов (Cattaneo M., 2007; Gurbel P.A., Tantry U.S., 2007; Oestreich J.H. et al, 2009). В связи с этим встает вопрос о развитии современных технологий оценки действия антиагрегантных препаратов. Последние рекомендации Американской ассоциации торакальных специалистов (ACCP 2008) не предусматривают лабораторный мониторинг антиагрегантной терапии (Hirsh J. et al, 2008), тем не менее, использование различных методов анализа функциональной активности тромбоцитов для этой цели широко обсуждается. Все известные на данный момент функциональные тесты имеют свои положительные стороны и недостатки. Необходимо четкое определение пределов референтных значений и терапевтических интервалов для каждого из лабораторных методов оценки тромбоцитарной активности и эффективности антиагрегантной терапии (Paniccia R. et al, 2007; van Werkum J.W. et al, 2008; Oestreich J., Smyth S., Campbell C., 2009; Vila P.M., Urooj Zafar M., Badimon J.J., 2009; Combescure C. et al, 2010). Однако стандартизированного параметра, по которому можно было бы однозначно судить о гиперактивности тромбоцитов и степени ее изменения на фоне антиагрегантных препаратов, в настоящее время не существует. Исследователи в своих работах либо ограничиваются анализом агрегации тромбоцитов in vitro при действии агонистов и ингибиторов различными методами, либо анализируют клинические исходы у пациентов, принимающих антиагреганты (Sharma R.K. et al, 2009; Mansour K. et al, 2009). Очевидно, что такого подхода недостаточно. Для определения маркера «высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии», который может в конечном итоге прогнозировать клинические исходы у пациентов (Hayward C.P.M., 2009), необходимо проведение комплексных генетических, фармакогенетических и функциональных исследований, в том числе с использованием современных молекулярных технологий, что и было предпринято в данной работе.

Цель исследования

Целью данной работы явилось определение молекулярно-генетических механизмов активации тромбоцитов, установление значения этих механизмов в развитии сердечно-сосудистых заболеваний и чувствительности к антиагрегантным препаратам.

Задачи исследования

1. Определить роль генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов в активации тромбоцитов и развитии ССЗ.

2. Определить вклад количественных характеристик тромбоцитарных рецепторов (уровень экспрессии генов и количество зрелых рецепторов на поверхности клеток) в активацию тромбоцитов.

3. Разработать новые лабораторные методы оценки функционального состояния тромбоцитов на основе молекулярно-генетических технологий.

4. Определить влияние молекулярно-генетических факторов на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам.

5. Разработать алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам.

Научная новизна и теоретическая значимость полученных результатов

В настоящей работе впервые проведена комплексная оценка активности тромбоцитов у пациентов с ССЗ и здоровых доноров на основании функциональных и молекулярно-генетических методов исследования, включая генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции, анализ уровня экспрессии генов тромбоцитарных рецепторов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, определение количества ключевых тромбоцитарных рецепторов на мембране тромбоцитов на проточном цитометре, определение активности тромбоцитов одновременно 3-мя методами - индуцированная агрегация, спонтанная агрегация и проточная цитометрия.

Впервые у больных с ССЗ проведен одновременный анализ генетических вариантов шести ключевых тромбоцитарных рецепторов - GP IIb-IIIa, GP Ibб, GP Ia-IIa, GP VI, P2Y12 и P2Y1, выявлены генетические факторы риска развития ССЗ в разных поло-возрастных группах. Впервые в российской популяции идентифицированы генетические варианты Leu40Arg GP IIIa, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и C-154T GP VI, и охарактеризовано их влияние на функциональную активность тромбоцитов и риск развития ССЗ. Впервые измерен уровень экспрессии генов GP IIIa, GP IIb, GP VI, P2Y12, P2Y1 и P2X1 в тромбоцитах здоровых доноров и больных с ССЗ. Показано влияние количественных характеристик рецепторов GP IIb-IIIa, P2Y12, P2Y1 и P2X1 на функциональную активность тромбоцитов.

Впервые проведен комплексный анализ молекулярно-генетических факторов, модулирующих индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии, с учетом генетических вариантов рецепторов «мишеней» и ферментов Р-450, метаболизирующих лекарственные средства. Разработан оригинальный метод оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии на основе проточной цитометрии и сформулирован алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам клопидогрелу и аспирину.

Полученные результаты вносят значительный вклад в понимание фундаментальных механизмов регуляции рецепторов тромбоцитов и активации тромбоцитарного гемостаза.

Практическая значимость работы

В работе определены молекулярно-генетические факторы риска развития ССЗ и высокой функциональной активности тромбоцитов, которые позволяют формировать группы повышенного риска и проводить в этих группах патогенетически обоснованную профилактику. Выявлены молекулярно-генетические факторы, определяющие индивидуальную чувствительность к аспирину и клопидогрелу. Их учет позволит персонализировать антиагрегантную терапию у больных с ССЗ.

Разработан новый метод оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии на основе проточной цитометрии с использованием специфичных флуоресцентно-меченых антител. Сопоставление традиционных лабораторных методов оценки функциональной активности тромбоцитов и нового метода на основе проточной цитометрии показало эффективность последнего в клинической практике для определения функциональной активности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии. В результате проведенной работы показана необходимость комплексного лабораторного подхода к оценке тромбоцитарной активности с использованием функциональных и молекулярно-генетических исследований.

Для практического применения сформулирован алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам клопидогрелу и аспирину.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Генетические варианты тромбоцитарных рецепторов Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12, С807Т GP Ia и Т13254С GP VI вносят существенный вклад в формирование повышенной тромбоцитарной активности и увеличивают риск развития ССЗ.

2. Количество рецепторов GP IIb-IIIa и АДФ-рецепторов P2Y12 и P2Y1 на поверхности тромбоцитов и уровень экспрессии генов GP IIb, GP IIIa, P2Y12 и P2Y1 влияют на функциональную активность тромбоцитов.

3. Метод проточной цитометрии может быть использован для оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии. В качестве показателей тромбоцитарной активности предложены расчетные параметры К₁ и К₂, которые характеризуют относительные изменения количества GP IIb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе индуцированной активации.

4. Генетические варианты Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12, G6986A CYP3A5 и T13254C GP VI, A-842G COX-1 модулируют индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином, соответственно.

Апробация работы

Основные теоретические и практические положения диссертации представлены в докладах на конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ “Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии” (18-20 сентября 2003 г., Санкт-Петербург), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (25-27 ноября 2003 г., Москва), на конференциях «Фундаментальные науки - медицине» (2003 г., 2008 г., 2009 г., Москва), на 8-ой, 9-ой и 10-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология-наука XXI века» (17-21 мая 2004 г., 19-24 апреля 2005 г. и 17-21 апреля 2006 г., г. Пущино), на 18^th, 20^th и 21^st International Congress on Thrombosis (June 20-24, 2004, Slovenia, Ljubljana,; June 25-28, 2008, Athens, Greece; July 6-9, 2010, Milan, Italy), семинарах политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (2004 г., 2007 г., Санкт-Петербург), на II и IV Всероссийских научных конференциях с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (2-4 февраля 2005 г. и 4-6 февраля 2009 г., Москва), на Одиннадцатом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (23-26 октября 2005 г., Москва), на V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (24-27 мая 2005 г., Уфа; 15-18 мая 2010 г., Ростов-на Дону), на XX, XXIst и XXIIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (August 6-12, 2005, Sydney, Australia; July 6-12, 2007, Geneva, Switzerland; July 11-16, 2009, Boston, US), Международном конгрессе «Гипертензия - от Короткова до наших дней» (15-17 сентября 2005 г., Санкт-Петербург), на 3-х конференциях Eurepean Human Genetics Conference (May 6-9, 2006, Amsterdam, The Nederlands; June 16-19, 2007, Nice, France; May 31-June 3, 2008, Barselona, Spain), на 5-и Российских национальных конгрессах кардиологов (12-14 октября 2004 г., г. Томск, 18-20 октября 2005 г., 10-12 октября 2006 г., 7-9 октября 2008г. и 5-7 октября 2009 г., г. Москва), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (2007 г., Санкт-Петербург), Всероссийской конференции с международным участие «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия» (5-7 июня 2007 г., Санкт-Петербург, Россия), на 52^nd GTH Congress (20-23 February 2008, Wiesbaden), научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (28-30 сентября 2009 г., Москва), на XXI и XXIII International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology (April 28 - May 1, 2008, Sydney, Australia; 10-12 May, 2010, Brighton, UK), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-28 июня 2009 г., Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (26-28 ноября 2009, Москва), на Nottingham Platelet Conference «Platelets - Past, Present and Future» (15-16 July 2010, Nottingham, UK), First European Joint Congress of EFCC and UEMS «Laboratory Medicine in Health Care» (13-16 October 2010, Lisbon, Portugal) и I Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (17-19 ноября 2010 г., Москва).

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику лечебной и учебной работы ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И.И.Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Публикации

По теме диссертации опубликованы 74 научные работы, из них: 15 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 6 статей в сборниках, 1 пособие для врачей, 1 заявка на патент.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц, иллюстрирована 51 рисунком и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 258 научных источников (31 - на русском языке и 227 - на иностранном).

Материалы и методы исследования

Характеристика обследованных групп

В исследование вошли лица, которые были обследованы и проходили лечение на базе Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова, Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова и Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий, подписали информированное согласие и не были связаны узами родства. Всего исследован биологический материал 991 человека. Для анализа генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов, функциональной активности тромбоцитов, измерения количества рецепторов на мембране тромбоцитов, измерения уровня экспрессии генов тромбоцитарных рецепторов были сформированы следующие группы: 1) 207 мужчин, перенесших инфаркт миокарда (ИМ) до 45 лет, средний возраст (45±0,4) лет (группа ИМм), и соответствующая контрольная группа - 195 мужчин без сердечно-сосудистых и тромбоэмболических эпизодов, средний возраст (40±0,4) лет (группа Км); 2) 209 мужчин и 71 женщина, средний возраст (61±9) лет, со стабильными проявлениями ишемической болезни сердца (группа ИБС), принимающие аспирин (100 мг/сутки) или клопидогрел (75 мг/сутки), или комбинированную терапию клопидогрел (75 мг/сутки) плюс аспирин (100 мг/сутки); 3) 84 мужчин и 16 женщин, средний возраст (57±1) год, с диагнозом острый коронарный синдром (группа ОКС), принимающие аспирин (100 мг/сутки) или клопидогрел (75 мг/сутки), или комбинированную терапию клопидогрел (75 мг/сутки) плюс аспирин (100 мг/сутки); 4) 59 мужчин и 16 женщин, средний возраст 58±2 года, перенесшие инфаркт миокарда после 45 лет (группа ИМс) и принимающие комбинированную терапию клопидогрел (75 мг/сутки) и аспирин (100 мг/сутки) после нагрузочной дозы клопидогрела 300 мг; 5) 133 добровольца обоего пола без сердечно-сосудистых и тромбоэмболических эпизодов в анамнезе (группа Д), не принимающих каких-либо антиагрегантных препаратов (41% мужчин, 59% женщин, средний возраст (39,6±1,5) лет). Критериями исключения пациентов из исследования являлись: активное внутреннее кровотечение, кардиогенный шок, тяжелые сопутствующие заболевания, самостоятельно влияющие на прогноз, анемии различного генеза, количество тромбоцитов менее 200 тыс./мкл.

Методы исследования

Исследованные генетические варианты тромбоцитарных рецепторов и ферментов, отвечающих за индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам, а также количество обследованных лиц по группам представлены в таблице 1.

Таблица 1. Исследованные генетические варианты в обследованных группах

ДНК выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом. Для идентификации однонуклеотидных замен амплифицировали (амплификатор «Терцик», НПФ «ДНК-Технология», Россия) участок гена методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Продукты ПЦР и рестрикции анализировали после электрофоретического разделения и визуализации в УФ-свете (Маниатис Т. и соавт., 1984).

Лицам, включенным в исследование, проводился анализ агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ и/или коллагеном, стандартным фотометрическим методом (Born G.V.R., 1962; Born G.V.R., 1964; O`Brien D.K. et al, 1966) и анализ спонтанной агрегации тромбоцитов в отсутствие индукторов. Пациентам, получающим антиагрегантную терапию, проводили контроль индуцированной агрегации тромбоцитов до начала терапии и на фоне приема антиагрегантных препаратов.

Для анализа функциональной активности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии был разработан оригинальный метод (описан в разделе «Результаты исследования»). В качестве маркеров активации тромбоцитов измеряли экспрессию Р-селектина на поверхности тромбоцитов и плотность рецепторов фибриногена гликопротеинов GP IIb-IIIa в цельной крови до и после активации индуктором (10 мкМ АДФ).

Количество рецепторов GP IIb-IIIa, GP Ibб, GP Ia-IIa, GP VI, P2Y12, P2Y1 и P2X1 на поверхности тромбоцитов определяли методом проточной цитометрии на CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США) с помощью флуоресцентно меченых антител.

Экспрессию генов тромбоцитарных рецепторов определяли как уровень мРНК, измеренный ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan технологии на амплификаторе ABI Prism 7000 Sequence detection System (Applied Biosystems, США) и амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США). В качестве референсного гена был выбран в-актин. мРНК выделяли из массы тромбоцитов с использованием набора для выделения РНК RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). Для получения кДНК использовали набор для обратной транскрипции RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва). Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые пробы для измерения уровня экспрессии генов P2Y12, GP IIb, GP IIIa и GP VI были оригинально сконструированы с помощью программного обеспечения Primer Express software. Праймеры и пробы для генов P2Y1, P2X1 и в-актина были описаны ранее в литературе (Wang L. et al, 2002; Czermak C. et al, 2004).

Для поиска новых генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов в программе «VectorNT» были разработаны оригинальные праймеры, и амплифицированные фрагменты ДНК подвергались секвенированию на автоматическом секвенаторе ABI 373 с использованием набора реагентов Termo Sequenase II (Amersham Pharmmacia, США).

Эксперименты по ингибированию тромбоцитарной агрегации селективными блокаторами GP IIb-IIIa и аспирином проводились in vitro в группе доноров совместно с лабораторией клеточной адгезии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий. Для оценки антиагрегационного эффекта лекарственных препаратов богатая тромбоцитами плазма (БТП) инкубировалась с монафрамом («Фрамон», Россия), эптифибатидом («Shering Plow»/«Cor Therapeutics», США), а также аспирином в течение 3 - 5 мин перед добавлением 20 мкМ АДФ. Ингибиторный эффект рассчитывался по степени уменьшения максимальной степени агрегации Т (%) по сравнению с контрольным образцом без препаратов по формуле:

И=(Т^К-Т^А+)/Т^КЧ100%,

где И - ингибирование тромбоцитов, Т^К - степень агрегации в контрольном образце без антагониста, Т^А+ - степень агрегации при добавлении лекарственного препарата.

Результаты обрабатывали с использованием программы Statistica 7.0. Достоверность различий распределения анализируемых аллелей в группах определяли точным методом Фишера (p<0,05 принимали за значимый уровень достоверности). Относительный риск (OR) рассчитывали с 95% доверительным интервалом (CI) по формуле:

OR=a/bЧd/c,

где a и b - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный аллель, c и d - количество человек контрольной группы, имеющих и не имеющих мутантный аллель, соответственно. Границы доверительного интервала вычисляли по формулам:

OR_min=OR^{(1-1,96/vч2)} и OR_max=OR^{(1+1,96/vч2)},

где ч²=((aЧd-bЧc)-0,5n)²Ч(n-1)/(n₀Чn₁Чm₀Чm₁); n₁=a+b; n₀=c+d; m₁=a+c; m₀=b+d; n=n₁+n₀+m₁+m₀. Средние величины приведены со стандартным отклонением среднего значения (M±m). Для сравнения средних использовали непараметрические методы - U-тест Манн-Уитни, тест Крускал-Уиллиса и парный тест Вилкоксона, корреляции оценивали по Спирману.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов, ассоциированных с развитием ССЗ

При анализе Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т GP Ia, Т13254С GP VI и Thr145Met GP Ibб в группе ИМм и группе Км было обнаружено достоверное превалирование Pro33 аллеля гена GP IIIa и Met145 аллеля гена GP Ibб у больных по сравнению с контролем Км (табл. 2). Относительный риск развития ИМ у носителей данных аллелей возрастал - OR (ProPro+LeuPro против LeuLeu)=1,94 [95% CI 1,34-2,79] и OR (MetMet+MetThr против ThrThr)=2,0 [95% CI 1,26-3,16], что позволяет отнести варианты Leu33Pro GP IIIa и Thr145Met GP Ibб к строгим генетическим факторам риска развития ИМ у мужчин в молодом возрасте. Исследованные аллельные варианты рецептора для фибриногена Leu33Pro GP IIIa и Ile843Ser GP IIb, рецепторов для коллагена С807Т GP Ia и Т13254С GP VI, рецептора для фактора Виллебранда Thr145Met GP Ibб были описаны ранее, как ассоциированные высокой функциональной активностью тромбоцитов и риском развития сердечно-сосудистой и цереброваскулярной патологией (Gonzalez-Conejero R. et al, 1998; Feng D. et al, 1999; Carter A.M. et al, 1999; Santoso S. et al, 1999; Carlsson L.E. et al, 1999; Vijayan K.V. et al, 2000; Reiner A. et al, 2000; Croft S. et al, 2001;). Полученное нами распределение генотипов Leu33Pro GP IIIa и Thr145Met GP Ibб согласуется с данными других исследователей (Терещенко С.Н. и соавт., 1999; Newman P.J. et al, 1989; Gonzalez-Conejero R. et al, 1998). Обнаруженная ассоциация аллелей Pro33 GP IIIa и Met145 GP Ib с повышенным риском развития ИМ в молодом возрасте также соответствует результатам зарубежных авторов (Weiss E.J. et al, 1996; Carter A.M. et al, 1997; Zotz R.B. et al, 1998; Gonzalez-Conejero R. et al, 1998).

Таблица 2.Распределение генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов у больных, перенесших ИМ до 45 лет, и в контрольной группе

N обозначает нормальный аллель «дикого» типа, M - мутантный аллельный вариант, NN - нормальная гомозигота, NM - гетерозигота, MM - гомозигота по мутантному аллельному варианту, значение p<0.05 рассматривается как статистически значимое.

Мы проанализировали функциональную активность тромбоцитов в группах ИМм и Км в зависимости от генетических вариантов Leu33Pro GP IIIa, С807Т GP Ia и Thr145Met GP Ibб, частота которых была выше у пациентов, перенесших ИМ (табл. 3). Скорость АДФ-индуцированной агрегации достоверно повышалась у пациентов с ИМ, являющихся носителями мутантного аллеля Pro33 GP IIIa, что позволяет отнести данный полиморфизм к генетическим факторам, определяющим высокую функциональную активность тромбоцитов. Для С807Т GP Ia и Thr145Met GP Ibб такой зависимости не наблюдается, что можно объяснить механизмом активации данных рецепторов - индуктором для рецептора GP Ia-IIa выступает коллаген, для рецептора GP Ibб физиологическим агонистом выступает фактор Виллебранда, а индуктром в лабораторных исследованиях - ристоцетин.

Таблица 3. АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов у пациентов, перенесших ИМ в молодом возрасте, и в контрольной группе в зависимости от генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов для фибриногена, коллагена и фактора Виллебранда

*p=0,047; **p=0,02 - достоверность различий у носителей полиморфных аллелей относительно «дикого» генотипа

Ключевую роль в процессах агрегации тромбоцитов играют рецепторы P2Y12 и P2Y1, которые связываются с АДФ, важнейшим физиологическим индуктором агрегации тромбоцитов, который в том числе используется для анализа in vitro. Для поиска полиморфных вариантов гена P2Y12, ассоциированных с усилением агрегационных свойств тромбоцитов, были проанализированы 324 человека в возрасте до 45 лет из групп ИМм и Км. Из них для исследования выбрали 44 человека с высокими показателями АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов и без мутации гена Leu33Pro GP IIIa, у которых выявили две однонуклеотидные замены в 18 и 36 положении от стартового кодона синтеза белка ATG: С18Т и G36Т. Проанализировав варианты C18T и G36Т гена P2Y12 в группах ИМм и Км, мы обнаружили статистически значимое накопление аллеля Т18 в контроле по сравнению с больными - 38% и 29%, соответственно (p=0,04). Относительный риск развития ИМ у носителей Т18 аллеля в гомо- или гетерозиготном состоянии снижался вдвое - OR=0,67 [95% CI 0,50-0,89]. Одновременно наблюдалась тенденция к увеличению частоты Т36 аллеля в группе ИМм по сравнению с Км - 17% и 12,5%, соответственно (p=0,1). Частоты аллелей С18 и G36 в группе пациентов составили 71% и 83%, в контрольной группе - 62% и 87,5%, соответственно. В группе ИМм было отмечено уменьшение скорости АДФ-индуцированной агрегации у носителей генотипов СТ18 и ТТ18 по сравнению с генотипом СС18 - (0,84±0,05) %/сек и (1,01±0,08) %/сек, соответственно (p=0,03), а в группе Км - увеличение скорости агрегации у носителей генотипов GT36 и TT36 по сравнению с генотипом GG36 - (1,31±0,16) %/сек и (1,12±0,06) %/сек, соответственно (p=0,07). Аналогичные результаты были получены Fontana P. и соавт., которые при исследовании гена P2Y12 обнаружили те же однонуклеотидные замены. Следует отметить, что эти авторы нашли ассоциацию Т36 аллеля с развитием артериальной болезни нижних конечностей, но не считали аллель Т18 функционально значимым и не рассматривали его в своей работе (Fontana P. et al, 2003).

Мы определили, что между исследуемыми нуклеотидными заменами C18T и G36Т гена P2Y12 существует сцепление и это утверждение статистически достоверно (коэффициенты неравновесности по сцеплению в двух группах составили D_ИМм=?0,0342 (ч²=5,28) и D_Км=-0,0417 (ч²=7,1)). Таким образом, нами были впервые в России выявлены нуклеотидные замены С18Т и G36Т гена P2Y12, ассоциированные с изменением функциональной активности тромбоцитов, и определен протективный гаплотип T18G36, связанный с уменьшением скорости АДФ-индуцированной агрегации и снижением риска развития ИМ у мужчин в молодом возрасте.

В группе ИМс были проанализированы генетические варианты: Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т G PIa, Т13254С GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 (табл.4). В качестве группы сравнения были выбраны доноры-добровольцы (группа Д). Частоты Leu33Pro GP IIIa, С807Т GP Ia, C18T P2Y12 и G36T P2Y12 статистически не различаются у пациентов и доноров. Более того, при сравнении групп ИМс и ИМм было обнаружено достоверное накопление мутантных аллелей T36 P2Y12 и Ser843 GP IIb у пациентов, перенесших ИМ в возрасте до 45 лет. Частоты аллелей составили - 9,6% и 17% для T36 P2Y12 в группах ИМс и ИМм, соответственно (p=0,035), 43,4% и 61,1% для Ser843 GP IIb в группах ИМс и ИМм, соответственно (p=0,01). Напротив, у пациентов старшего возраста превалировала мутация гена GP VI. Частота аллеля С13254 GP VI была повышена в группе ИМс как по сравнению с донорами, так и c группой ИМм - 23,4% и 4,5% у пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет и моложе 45 лет, соответственно (p<0,0001). Относительный риск развития ИМ после 45 лет у носителей аллеля С13254 GP VI возрастал почти в четыре раза - OR=3,74 [95% CI 1,22-11,48]. Эти данные полностью согласуются с результатами зарубежных авторов (Croft S. et al, 2001; Ollikainen E. et al, 2004) и позволяют отнести мутацию Т13254С GP VI к строгим факторам риска развития ИМ у мужчин и женщин после 45 лет.

Таблица 4. Распределение генотипов Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т GP Ia, Т13254С GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 у пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет, и в группе доноров без ССЗ в анамнезе

Мы проанализировали показатели коллаген-индуцированной агрегации в общей группе пациентов и доноров в зависимости от генотипов коллагеновых рецепторов (рис. 1). Степень коллаген-индуцированной агрегации не отличалась у носителей генотипов Т13254С GP VI (ТС+СС против TT), тогда как скорость агрегации была существенно выше у носителей мутантного аллеля. Однако различия не достигали статистической значимости (p=0,1), возможно вследствие недостаточного объема выборки. Аналогично влияла на коллаген-индуцированную агрегацию и мутация рецептора коллагена GP Ia-IIa. Степень агрегации не зависела от C807T GP Ia, а скорость была достоверно выше у носителей Т807 аллеля (p=0,04).

Рис. 1. Показатели коллаген-индуцированной агрегации в общей группе пациентов и доноров, в зависимости от генотипов GP VI (а) и GP Ia-IIa (б)

На основании проведенного сравнения можно судить о различии в патогенетических механизмах развития ИМ в молодом возрасте и после 45 лет. У пациентов старшего и пожилого возраста превалирует мутация рецептора GP VI, который активируется коллагеном - основным компонентом сосудистой стенки, индицирующим адгезию и агрегацию тромбоцитов при повреждении эндотелия, в том числе в результате разрыва атероматозной бляшки.

В группе ИБС были проанализированы следующие полиморфизмы: Leu33Pro GP IIIa, Т13254С GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 (табл. 5). Анализ данных в группе ИБС показал картину распределения генотипов Leu33Pro GPIIIa и G36T P2Y12 аналогичную группе ИМм. С другой стороны при сравнении групп ИБС и ИМм между собой было выявлено превалирование Т13254С GPVI у пациентов с ИБС - частота мутантного аллеля составила 11,9% и 4,5% в группах ИБС и ИМм, соответственно (p=0,0003).

Таблица 5. Распределение генотипов Leu33Pro GP IIIa, Т13254С GP VI, C18T P2Y12 и G36T P2Y12 у пациентов со стабильными проявлениями ИБС и в группе доноров

Таким образом, генетическими факторами риска развития ИБС в смешенной по полу и возрасту группе могут выступать Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12, а также Т13254С GP VI. При этом относительный риск развития ИБС у носителей Pro33 GP IIIa возрастает незначительно (OR=1,20 [CI NS 1,0-2,18]), а у носителей T36 P2Y12 - почти вдвое (OR=1,75 [95% CI 1,16-2,65]).

В группе ОКС были проанализированы генетические варианты рецепторов GP IIb-IIIa, P2Y12 и P2Y1 (табл. 6).

Таблица 6. Распределение генотипов Leu33Pro GP IIIa, A1622G P2Y1, C18T P2Y12 и G36T P2Y12 у пациентов с ОКС и в группе доноров без ССЗ в анамнезе

У пациентов с ОКС только частота полиморфизма G36T P2Y12 имела тенденцию к увеличению по сравнению с донорами без ССЗ, относительный риск развития ОКС у носителей Т36 аллеля возрастал в 1,6 раза. Частоты остальных генотипов не отличались от таковой в группах Д, ИМс, ИБС, ИМм.

В группе ОКС также как у мужчин, перенесших ИМ в молодом возрасте, функциональная активность тромбоцитов была выше у носителей мутации Leu33Pro GP IIIa. В то же время у носителей мутантного аллеля G1622 P2Y1 степень АДФ-индуцированной агрегации оказалась ниже, чем у лиц с генотипом «дикого типа» (табл. 7). Следует отметить, что в литературе сведения о влиянии полиморфизма A1622G P2Y1 на функциональную активность тромбоцитов противоречивы. Найдено как усиление агрегационного ответа на АДФ у носителей G-аллеля (Hetherington S. et al, 2005), так и снижение агрегации при наличии GG генотипа (Fontana P. et al, 2005).

Таблица 7. Зависимость степени АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов от генотипов Leu33Pro GP IIIa, A1622G P2Y1, C18T P2Y12 и G36T P2Y12 у пациентов с ОКС

На основании исследования генетических вариантов ключевых тромбоцитарных рецепторов у пациентов с ССЗ можно заключить, что Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т GP Ia, Т13254С GP VI, Thr145Met GP Ibб, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 модулируют функциональную активность тромбоцитов и могут быть ассоциированы с риском развития сердечно-сосудистой патологии в различных поло-возрастных группах.

Анализ молекулярно-генетических механизмов высокой функциональной активности тромбоцитов

Одним из лабораторных критериев функциональной активности тромбоцитов является их спонтанная агрегация, которая оценивается in vitro без добавления экзогенных индукторов. Наличие спонтанной агрегации является фактором риска развития ССЗ (Trip M.D. et al, 1990; Breddin H.K. et al, 1999). Для выяснения молекулярных механизмов, определяющих спонтанную агрегацию тромбоцитов, нами были проанализированы максимальный размер агрегатов (R макс) и максимальная скорость образования агрегатов (V макс, R/мин) в зависимости от Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, уровня экспрессии генов GP IIb и GP IIIa, количества зрелых рецепторов GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов (табл. 8). Максимальный уровень спонтанной агрегации у носителей аллеля Pro33 GP IIIa (генотипы ProPro и LeuPro) был почти в 1,5 раза выше, чем у доноров с генотипом LeuLeu, хотя скорость агрегации в этих группах достоверно не различалась. Исследуемые параметры не различались в зависимости от мутации Ile843Ser GP IIb.

Содержание GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов и концентрация тромбоцитов были одинаковыми в исследованных группах с различными генотипами Leu33Pro GP IIIa. Эти данные указывают на то, что повышение уровня спонтанной агрегации у доноров с мутацией Leu33Pro GP IIIa было обусловлено изменениями функциональной активности GP IIb-IIIa.

Таблица 8.Параметры спонтанной агрегации, содержание GP IIb-IIIa и концентрация тромбоцитов в БТП у доноров с различными генотипами GP IIb-IIIa

*p=0,03 - между носителями LeuLeu и LeuPro+ProPro

Как было показано ранее в исследовании Vijayan и соавт (Vijayan K.V. et al, 2000), выполненном на модельных клетках, замена Leu33Pro приводит к усилению сигнальных и адгезивных функций рецептора GP IIb-IIIa. Возможно, именно эти эффекты являются причиной повышенной спонтанной агрегации у носителей аллеля Pro33 GP IIIa. Нами была определена существенная индивидуальная вариабельность в содержании GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов от 44,8Ч10³ до 82,7Ч10³ молекул на клетку, которая влияла на интенсивность спонтанной агрегации - выявлена корреляция между уровнем спонтанной агрегации и количеством GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов (R=0,39, p=0,05). Уровень экспрессии генов GP IIb и GP IIIa не влиял на показатели спонтанной агрегации. Полученные данные свидетельствует о том, что на интенсивность спонтанной агрегации влияет как генетический полиморфизм Leu33Pro GP IIIa, так и количество рецептора GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов.

Анализ соотношения количества рецепторов GP IIb-IIIa и генотипа Leu33Pro GP IIIa показал достоверные различия в группе доноров (n=50) - количество рецептора было выше у носителей аллеля Pro33 (рис. 2).

Рис. 2. Количество рецепторов GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов у носителей аллельных варианов Leu33Pro GP IIIa

Мы проанализировали нуклеотидную последовательность промоторной области гена GP IIIa у доноров с высокой плотностью рецепторов GP IIb-IIIa и обнаружили неописанный ранее в российской популяции полиморфизм A-425C GP IIIa. Генетический вариант A-425C оказался сцеплен с Leu33Pro, что согласуется с данными других исследований (Negrier C. et al, 1998; O'Halloran A. et al, 2005). Таким образом, связь между количеством рецептора и генотипом Leu33Pro GP IIIa можно объяснить изменением структуры промоторной области и регуляции работы гена.

Ни максимальный уровень спонтанной агрегации, ни ее скорость не зависели от генетических вариантов C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1. Не было найдено корреляции между R макс или V макс и количеством рецепторов P2Y12, P2Y1 и P2X1 на мембране тромбоцитов исследованных доноров. На параметры спонтанной агрегации не влиял и уровень экспрессии генов P2Y1 и P2X1. В то время как уровень экспрессии гена P2Y12 коррелировал со скоростью спонтанной агрегации - R=0,61 (p=0,047).

В группе доноров с увеличением скорости АДФ-индуцированной агрегации была ассоциирована мутация Leu33Pro GP IIIa, а Ile843Ser GP IIb - с увеличением степени АДФ-индуцированной агрегации (табл. 9).

Таблица 9. Параметры АДФ-индуцированной агрегации в зависимости от генотипов рецептора GP IIb-IIIa у доноров без ССЗ в анамнезе

*p=0,049 - IleSer+SerSer против IleIle; **p=0,08 - ProPro+LeuPro против LeuLeu

Полученные результаты еще раз подтверждают, что генетические варианты Leu33Pro GP IIIa и Ile843Ser GP IIb влияют на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Ранее влияние Leu33Pro GP IIIa на АДФ-индуцированную агрегацию было показано в группе лиц, вошедших в Framingham Offspring Study - всего 1422 человека (Feng D. et al, 1999; Feng D. et al, 2001).

Рис. 3. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикционного анализа гена GP IIIa: 1 - маркер молекулярного веса pBR322 HaeIII; 2 - ПЦР-продукт; 3 - гаплотип Pro33Pro33/Leu40Arg40; 4,5 - гаплотип Leu33Pro33/Leu40Arg40; 6 - генотип Pro33Pro33; 7 - «дикий» генотип Leu33Leu33; 8 - генотип Leu33Pro33

В ходе исследования при генотипировании Leu33Pro GP IIIa в группе из 359 человек у 7 исследуемых (2%) нами была обнаружена не описанная ранее мутация гена GP IIIa, сцепленная с Leu33Pro GP IIIa (рис. 3). Сиквенирование исследуемого участка гена GP IIIa показало наличие нуклеотидной замены T1585G, что приводит к замене лейцина на аргинин в 40 положении аминокислотной последовательности белка. В результате данной мутации появляется дополнительный сайт рестрикции для эндонуклеазы MspI. Анализ АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у гетерозиготного носителя гаплотипа Leu33Pro33/Leu40Arg40 гена GP IIIa выявил нетипичную картину - при индукции АДФ в любой концентрации (в том числе при низких пороговых дозах - 1,25 мкМ) возникал однотипный ответ - одноволновая кривая с максимальной амплитудой от 63% до 80%, характеризующей высокую степень агрегации, и с высокой скоростью агрегации. При этом отсутствовала тенденция к дезагрегации даже на малых дозах АДФ. Следует о...