Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам

Мы не выявили корреляции между степенью и скоростью коллаген-индуцированной агрегации и количеством рецепторов GP VI и GP Ia-IIa. Коллаген-индуцированная агрегация не зависла и от уровня экспрессии генов коллагеновых рецепторов.

При наличии мутации Т13254С GPVI количество рецепторов GP VI на поверхности тромбоцитов увеличивалось - (1,52±0,04) против (1,82±0,16) для TT и (ТС+СС) генотипов, соответственно (p=0,057). Количество рецептора GP VI на мембране тромбоцитов исследовалось в ряде работ (Furihata K. et al, 2001; Clemetson K.J., 2003; Best D. et al. 2003; Joutsi-Korhonen L. et al, 2003; Samaha F.F. et al, 2005). Авторы указывали на ассоциацию носительства полиморфизма Т13254С с изменениями количества GP VI на поверхности клеток и функциональной активности тромбоцитов. В исследуемой нами группе доноров замена Т13254С не влияла на уровень экспрессии гена GP VI. С целью выявления полиморфных вариантов, модулирующих уровень мРНК, мы сиквенировали участок промоторной области у лиц с высокой экспрессией гена GP VI. Нами была найдена нуклеотидная замена С-154Т GP VI, которая ассоциировалась как с увеличением числа рецепторов на поверхности тромбоцита, так и с высоким уровнем экспрессии гена GP VI (рис. 5). Ранее в литературе был описан данный полиморфизм, но не было найдено каких-либо ассоциаций T(-154) аллеля с изменением количества рецептора или функциональной активностью тромбоцитов (Croft S. et al, 2001; Best D. et al, 2003).

Рис. 5. Количество рецептора на мембране (а) и уровень экспрессии гена GP VI (б) в зависимости от генотипов С-154Т GP VI

Скорость коллаген-индуцированной агрегации была значительно увеличена в нашем исследовании у носителей С807Т GP Ia - (7,9±2,5)%/мин. и (16,9±4,2)%/мин. для СС и (CT+TT), что согласуется с зарубежными данными (Pontiggia L. et al, 2002).

Таким образом, генетические варианты тромбоцитарных рецепторов, уровень экспрессии их генов и плотность рецепторов на мембране влияют на индуцированную агрегацию тромбоцитов, исследуемую in vitro в лабораторных условиях.

Новый метод оценки функционального состояния тромбоцитов на основе проточной цитометрии

Одной из задач данного диссертационного исследования явилось формирование новых лабораторных подходов к оценке функциональной активности тромбоцитов. В своей работе мы разработали оригинальный метод анализа функциональной активности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии с оценкой изменения содержания Р-селектина и гликопротеинового рецептора GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов при индукции АДФ. Примеры цитометрического определения содержания Р-селектина и рецептора GP IIb-IIIa на поверхности клеток приведены на рисунке 6 (а,б).

Рис. 6. Экспрессия Р-селектина (а) и количество рецептора GP IIb-IIIa (б) на мембране тромбоцитов донора Н. до и после активации клеток 10 мкМ АДФ

Содержание рецептора GP IIb-IIIa определялось как средняя интенсивность флуоресценции (MFI), в то время как уровень экспрессии Р-селектина определяли как % клеток, меченных соответствующим антителом CD62P-PE. Следует особо подчеркнуть, что исследование проводится в цельной крови. Анализ показал достоверное увеличение экспрессии Р-селектина и количества рецепторов GP IIb-IIIa после индукции 10 мкМ АДФ в группе доноров без ССЗ и тромбоэмболических заболеваний в анамнезе, не принимающих каких-либо антиагрегантных препаратов (рис. 7).

Рис. 7. Количество рецепторов GP IIb-IIIa (а) и экспрессия Р-селектина (б) на поверхности тромбоцитов здоровых доноров до и после активации 10 мкМ АДФ

Известно, что до 80% рецепторов GP IIb-IIIa равномерно распределены на мембране тромбоцитов, остальные 20% находятся на мембране открытой канальцевой системы «внутри тромбоцита» (Шитикова А.С., 2000). У исследованных нами доноров количество GP IIb-IIIa после индукции АДФ возрастало в среднем на (17±3)%, что соотносится с экспонированием рецепторов открытой канальцевой системы наружу в ходе цитоскелетной перестройки клетки в результате активации. Р-селектин - основной компонент, участвующий во взаимодействии тромбоцитов с лейкоцитами и ответственный за образование тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов, экспрессируется только активированными тромбоцитами (Shantsila E., Lip G.Y.H., 2009). В нашей работе количество клеток доноров, экспрессирующих Р-селектин в отсутствие активации in vitro, составило около 2%. Тогда как при активации 10 мкМ АДФ число тромбоцитов, несущих на своей поверхности молекулы Р-селектина, увеличивалось почти до 18%. Это подтверждает положение, что не активированные тромбоциты не экспрессируют Р-селектин на своей поверхности.

Мы оценивали функциональную активность тромбоцитов в разработанном нами методе не только по количеству рецепторов GP IIb-IIIa и экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов до и после инкубирования с АДФ, но также по расчетным показателям К₁ и К₂, вычисляемым по формулам:

,

где MFI^АДФ+ - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa после инкубации с индуктором, MFI^АДФ- - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa в отсутствие индуктора;

,

где %CD62P-PE^АДФ+ - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину, после инкубации с индуктором; %CD62P-PE^АДФ- - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину в отсутствие индуктора.

Рассчитанные параметры К₁ и К₂ отражают увеличение количества рецептора GP IIb-IIIa и экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов после индукции АДФ в %. Применение таких расчетных показателей позволяет оценивать и сопоставлять функциональную активность тромбоцитов, измеренную с помощью проточной цитометрии, в различное время и с использованием различных партий реактивов. Это особенно актуально в условиях практической работы клинико-диагностической лаборатории, в том числе при мониторинге антиагрегантной терапии.

Проанализировав группу доноров без ССЗ в анамнезе, не принимавших каких-либо антиагрегантных препаратов на момент проведения исследования (n=34), мы определили значения показателей функциональной активности тромбоцитов, измеренной методом проточной цитофлуориметрии, которые были приняты нами за референтные значения (табл. 11).

Таблица 11.Значения параметров функциональной активности тромбоцитов в группе доноров, принимаемые за референтные значения

Мы сопоставили цитофлуориметрические показатели функциональной активности тромбоцитов с данными стандартной агрегатометрии в общей группе доноров и пациентов старше 45 лет с ИМ (n=85), и выявили корреляцию между исследуемыми параметрами (табл. 12).

Таблица 12.Корреляция между параметрами цитометрического исследования тромбоцитарной активности и стандартной агрегатометрии

R - коэффициент корреляции по Спирману, p - достоверность

В литературе нет данных о сравнении фотометрического метода и проточной цитометрии. Хотя попытки применить проточную цитометрию для оценки тромбоцитарной активности предпринимались (Storey R.F. et al, 2002; Chen M.-C. et al, 2003; Okano K. et al, 2010). Все использовавшиеся до настоящего времени подходы имели целый ряд существенных недостатков. Во-первых, в большинстве описанных способов использовали богатую тромбоцитами плазму (БТП) или фиксированные клетки. Приготовление БТП делает преаналитический этап с одной стороны трудоемким, с другой - искажает реальную функциональную активность тромбоцитов вследствие их преждевременной активации в результате центрифугирования. При использовании фиксированных тромбоцитов нельзя с уверенностью утверждать, что результаты анализа в полной мере отражают процессы, происходящие in vivo. Во-вторых, в качестве маркера тромбоцитарной активации, измеренной с помощью проточной цитометрии, использовали в основном Р-селектин. Антитела к рецептору GP IIb-IIIa применяли для выделения популяции тромбоцитов, но не как маркеры функциональной активности. Мы предположили, что измерение количества GP IIb-IIIa и экспрессии Р-селектина без индукции агонистом (АДФ) не отражает способности тромбоцитов к активации. Такой подход позволяет только констатировать состояние тромбоцитов на данный конкретный момент, но не дает возможности определить способность тромбоцитов к их дальнейшей реакции, в том числе на фоне антиагрегантных препаратов. Все исследования, проводившиеся до сих пор, включали отдельно доноров или больных ССЗ. Сравнение параметров функциональной активности тромбоцитов, измеренных методом проточной цитометрии, у здоровых лиц и пациентов не проводились; не были установлены пределы нормальных значений анализируемых показателей.

Разработанный нами метод имеет ряд преимуществ. Он исключает приготовление БТП, что упрощает пробоподготовку и минимизирует нежелательные воздействия на тромбоциты. Исследование проводится на нативных клетках, способствуя максимальному отражению процессов, происходящих in vivo. Кроме того, мы соединили принцип активации тромбоцитов АДФ, который заложен в стандартной индуцированной агрегации, и проточную цитофлуориметрию с использованием FITC- и PE-меченных антител к рецептору GP IIb-IIIa и Р-селектину. Данный подход оправдал себя и позволяет предложить новые лабораторные критерии для оценки функционального состояния тромбоцитов. Сравнение с традиционным фотометрическим методом подтверждает, что параметры К₁ и К₂ адекватно отражают активность тромбоцитов.

Несмотря на существующее разнообразие методов и подходов, лабораторная оценка чувствительности к антиагрегантным препаратам остается в настоящее время не решенной до конца проблемой (Oestreich J.H. et al, 2009). В данной работе мы применили разработанный метод определения функциональной активности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии для оценки эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином, для чего были сформированы три подгруппы: 1) доноры без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе, не принимающие какие-либо лекарственные препараты, влияющие на функцию тромбоцитов (группа Д) - 34 человека; 2) пациенты старше 45 лет, перенесшие ИМ не менее 6 месяцев назад, на момент исследования принимающие аспирин 100 мг/день (группа А) - 19 человек; 3) больные старше 45 лет с диагнозом острый ИМ, находившиеся в момент исследования на стабильной антиагрегантной терапии клопидогрелом (75 мг/день) и аспирином (100 мг/день) не менее 7 дней (группа К+А) - 32 человека. У всех лиц определяли параметры MFI^АДФ-, MFI^АДФ+, К₁ (%) и %CD62P-PE^АДФ-, %CD62P-PE^АДФ+, К₂ (%), а также степень АДФ-индуцированной агрегации Т (%) при 2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ АДФ (табл. 13).

Таблица 13. Параметры функциональной активности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии по данным проточной цитометрии и стандартной агрегатометрии

*p<0,05 - (К+А) против А и Д; **p<0,05 - А и (К+А) против Д; ***p<0,05 - Д против А и (К+А)

Исследование показало, что у больных, принимавших только аспирин, показатель К₁, характеризующий изменение количества рецепторов GP IIb-IIIa в ходе активации АДФ, составил 15%, что не отличалось от группы доноров, в то время как у пациентов, принимавших клопидогрел в комбинации с аспирином, данный показатель был менее 8%, что можно расценивать как эффективное подавление АДФ-индуцированной активации селективным блокатором АДФ-рецептора P2Y12 - клопидогрелом. Данный показатель К₁ коррелирует с параметрами стандартной АДФ-индуцированной агрегации, и также как степень агрегации Т(%), снижен на фоне клопидогрела более чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой доноров. Аналогичное 50% ингибирование активации GP IIb-IIIa на фоне блокатора АДФ-рецептора P2Y12 было показано в работе Braun O.O. и соавторов (Braun O.O. et al, 2008). Информативным и наглядным в отношении оценки функциональной активности тромбоцитов на фоне антиагрегантных препаратов, оказалось экспрессирование Р-селектина на поверхности тромбоцитов. Его высокий уровень наблюдается у пациентов, резистентных к антиагрегантной терапии аспирином (Shantsila E., Lip G.Y.H., 2009; Ferguson A., Dokainish H., Lakkis N., 2008). В нашей работе количество клеток, экспрессирующих Р-селектин в отсутствие активации in vitro, составило у доноров около 2%. Однако у пациентов с ССЗ даже на фоне приема антиагрегантных препаратов это значение достоверно увеличивалось вдвое, что говорит о наличии активации тромбоцитарного гемостаза у больных ИМ, несмотря на терапию. При активации in vitro число клеток, связывающихся с антителами к Р-селектину, увеличивается у доноров и больных на фоне приема аспирина - до 20%. В то время как у пациентов, принимающих клопидогрел, число тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин, меняется незначительно и составляет менее 7%, что свидетельствует об эффективном подавлении тромбоцитарной активности. Параметр К₂, характеризующий изменение экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов при их активации, не различается у доноров и пациентов, принимающих аспирин, но в 1,5 раза снижен у больных на фоне приема клопидогрела. Таким образом, у пациентов, принимающих только аспирин, не происходило значимого подавления тромбоцитарной активности, несмотря на то, что степень АДФ-индуцированной агрегации, измеренной фотометрическим методом, на фоне аспирина достоверно снижалась по сравнению с контрольной группой и приближалась по своим значениям к таковой у пациентов на двойной антиагрегантной терапии клопидогрел и аспирин (табл. 13). Наши данные показывают, что не всегда параметры стандартной агрегатометрии адекватно отражают функциональную активность тромбоцитов у больных, принимающих антиагреганты.

На основании проведенного исследования нами предложены новые лабораторные критерии для оценки гиперагрегации тромбоцитов и эффективности действия клопидогрела и аспирина: при значении К₁?10 % и К₂?50% действие антиагрегантного препарата можно оценивать как эффективное, значения К₁>10% и К₂>50% могут считаться маркерами высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии или неэффективности действия антиагрегантного препарата.

Наше исследование показало, что лабораторный контроль функционального состояния тромбоцитов у пациентов, принимающих антиагрегантные препараты, целесообразно проводить с помощью проточной цитометрии на 5-7 сутки. Оптимальность данного срока была апробирована у 10 пациентов, принимающих двойную антиагрегантную терапию - клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день).

Рис. 8. Параметры К₁ (а) и К₂ (б) до начала и на 5 день антиагрегантной терапии

Снижение активности тромбоцитарного гемостаза по показателям К₁ и К₂ происходит уже на 5 день приема антиагрегантных препаратов (рис. 8), тогда как максимальная степень АДФ-индуцированной агрегации достоверно снижается при всех концентрациях индуктора только на 10 день, а скорость агрегации практически не изменяется (табл. 14).

Таблица 14.Параметры АДФ-индуцированной агрегации в зависимости от длительности проведенной антиагрегантной терапии

*p<0,05 по сравнению с «до начала терапии»

Можно сделать вывод о более высокой чувствительности лабораторного метода проточной цитометрии для определения активности тромбоцитов при оценке эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелом по сравнению со стандартной АДФ-индуцированной агрегацией. Параметры К₁ и К₂ адекватно отражают активность тромбоцитов и могут быть использованы в качестве маркеров их гиперфункции. Определение таких маркеров «высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии» является крайне необходимым, так как может в конечном итоге прогнозировать клинические исходы у пациентов (Hayward C.P.M., 2009).

Мы проанализировали зависимость показателей функционального состояния тромбоцитов, измеренных методом проточной цитометрии, от молекулярно-генетических факторов тромбоцитарной активности. В общей группе доноров и больных ИМ старше 45 лет (n=85) до и после активации 10 мкМ АДФ была выявлена положительная и достоверная корреляция между количеством рецептора GP IIb-IIIa и количеством АДФ-рецепторов P2X1, P2Y1 и P2Y12 на мембране тромбоцитов. Коэффициенты корреляции по Спирману R составили от 0,34 до 0,54 при значениях p от 0,01 до 0,00003. В группе доноров количество рецепторов P2Y12 достоверно коррелировало с количеством клеток, экспрессирующих Р-селектин как в отсутствие индуктора, так и при активации АДФ - R=0,54 (p=0,008) и R=0,42 (p=0,046), соответственно.

Анализ взаимосвязи между параметрами GP IIb-IIIa MFI^АДФ-, GP IIb-IIIa MFI^АДФ+ и уровнем экспрессии генов P2X1, P2Y1 и P2Y12 выявил корреляцию между GP IIb-IIIa MFI^АДФ- и экспрессией P2X1 (R=0,29; p=0,049), между GP IIb-IIIa MFI^АДФ- и экспрессией P2Y1 (R=0,25; p=0,07) и между GP IIb-IIIa MFI^АДФ+ и экспрессией P2Y1 (R=0,35; p=0,01). После активации 10 мкМ АДФ наблюдалась тенденция к корреляции между уровнем экспрессии гена P2Y12 и числом клеток, экспрессирующих на своей поверхности Р-селектин - R=0,27 (p=0,07).

Уровень экспрессии гена рецептора коллагена GP VI также имел тенденцию к корреляции с цитометрическими показателями тромбоцитарной активности К₁ и К₂ - R=0,45 (p=0,09) для обоих параметров. Полученные корреляции между цитометрическими показателями функциональной активности тромбоцитов и количественными характеристиками тромбоцитарных АДФ- и коллагеновых рецепторов, запускающих реакции активации, могут служить еще одним подтверждением того, что для полной и необратимой агрегации тромбоцитов необходима скоординированная передача сигнала через рецепторы GP VI, P2Y12 и P2Y1.

При анализе взаимосвязи между результатами цитометрического исследования тромбоцитарной активности и генетическими вариантами Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т GP Ia, Т13254С GP VI, С-154T GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 мы получили следующие достоверные различия: значения параметра К₁ в зависимости от генотипов Ile843Ser GP IIb и Т13254С GP VI (рис. 9а), количества GP IIb-IIIa до и после активации АДФ в зависимости от генотипов С-154T GP VI (рис. 9б) и экспрессия Р-селектина до и после активации АДФ в зависимости от генотипа С807Т GP Ia (рис. 9в).

Рис. 9. Зависимость цитометрических показателей от исследованных генотипов

Полученные результаты позволяют заключить, что генетические варианты тромбоцитарных рецепторов влияют на функциональную активность тромбоцитов, измеренную методом проточной цитометрии, при этом у носителей мутантных аллелей функциональная активность тромбоцитов повышена.

Влияние молекулярно-генетических факторов на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам

1. Антагонисты GP IIb-IIIa рецепторов

Известно, что индуцируемые реакции тромбоцитов пропорциональны количеству формирующихся комплексов агонист-рецептор. Ответ на антиагрегантные лекарственные препараты будет зависеть от плотности соответствующих рецепторов на мембране тромбоцитов. Исследования антагонистов GP IIb-IIIa рецепторов показали, что интенсивность тромбоцитарной агрегации строго коррелирует с количеством свободных рецепторов на поверхности клеток (Thcheng J.E. et al, 1994; Mazurov A.V. et al, 2002). Но до сих пор остается неясным, влияют ли межиднивидуальные вариации GP IIb-IIIa на эффективность селективных блокаторов данного рецептора.

В экспериментах in vitro мы проанализировали ингибиторный эффект антагонистов GP IIb-IIIa - препартов монафрам и эптифибатид. Монафрам уменьшал степень АДФ-индуцированной агрегации менее эффективно у доноров - носителей Pro33 аллеля гена GP IIIa, чем у доноров с генотипом LeuLeu (рис. 10а), тогда как ингибирование агрегации тромбоцитов эптифибатидом не зависело от генотипов Leu33Pro GP IIIa (рис. 10б). Степень ингибирования агрегации тромбоцитов монафрамом и эптифибатидом достоверно различалась в подгруппах с высоким (>60Ч10³) и низким (40-50Ч10³) содержанием рецепторов GP IIb-IIIa на поверхности клеток (рис. 11). Различия не достигали статистической значимости при 3 мкг/мл монафрама, при этой концентрации препарата наблюдали 100% ингибирование агрегации у 32 доноров из 35. Только 3 донора показали степень ингибирования отличную от 100%, однако надо сказать, что у этих индивидуумов количество рецептора GP IIb-IIIa составило более 75Ч10³ на клетку.

Рис. 10. Ингибирование АДФ-индуцированной агрегации в зависимости от генотипа Leu33Pro GP IIIa: а) монафрам; б) эптифибатид; ? - генотип LeuLeu; _ - генотип LeuPro+ProPro; * - p<0,05

Рис. 11. Ингибирования АДФ-индуцированной агрегации монафрамом (а) и эптифибатодом (б) в зависимости от количества рецепторов GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов: 1 - >60Ч10³/клетку; 2 - 50-60Ч10³/клетку; 3 - 40-50Ч10³/клетку

Полученные результаты позволяют заключить, что на индивидуальную чувствительность к селективным блокаторам антительной природы влияют генетические вариации рецептора GP IIb-IIIa, так как нарушают структуру эпитопа, узнаваемого mAB. Ранее был показан эффект «дозы гена» - гомозиготные носители Pro33 аллеля демонстрируют большую реактивность тромбоцитов и соответственно меньший ингибиторный эффект GP IIb-IIIa антагонистов, чем гетерозиготы LeuPro (Feng D. et al, 1999; Michelson A.D. et al, 2000). Эти данные были получены на выборке, включающей достаточное число носителей ProPro генотипа. В работах с малым числом исследованных гомозиготных носителей Leu33Pro GP IIIa не получено достоверных различий в эффективности блокаторов GP IIb-IIIa у лиц с различными генотипами рецептора (Lasne D. et al, 1997; Andrioli G. et al, 2000; Weber A.A. et al, 2002; Frey U.H. et al, 2003; Aalto-Setalo K. et al, 2005). Мы показали, что на чувствительность к антагонистам, как антительной, так и пептидной природы, в большей степени влияет количество рецептора GP IIb-IIIa.

2. Аспирин

Снижение эффективности ингибирования агрегации тромбоцитов аспирином, т.е. развитие резистентности, является хорошо известным феноменом. Число пациентов, у которых наблюдается аспирин-резистентность может достигать 24-35% и даже 57% (Szczeklik A. et al, 2005). Активация тромбоцитов протромбогенными агонистами стимулирует образование эндогенного ТxА₂, который усиливает активацию тромбоцитов и увеличивает количество активированных молекул GP IIb-IIIa. При стимуляции агрегации АДФ, действие ТxА₂ делает процесс образования агрегатов необратимым и вызывает развитие, так называемой, второй волны агрегации (Шиффман Ф.Дж., 2000). Наши результаты показали блокирование данного процесса аспирином (рис. 12).

Рис. 12. Степень АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в присутствии аспирина в зависимости от количества GP IIb-IIIa (а) и генотипа Leu33Pro GP IIIa (б): а) - >60Ч10³ рецепторов/тромбоцит, _ - <50Ч10³ рецепторов/тромбоцит; б) - генотип LeuPro+ProPro GP IIIa, _ - генотип LeuLeu GP IIIa; *p<0,05 и **p<0,01

Оказалось, что аспирин в одинаковой степени подавляет агрегацию тромбоцитов в группах с высоким и низким содержанием рецепторов GP IIb-IIIa - в обоих случаях ~ на 50% от контрольного уровня без добавления препарата. Однако в связи с тем, что исходный уровень агрегации был выше у лиц с высоким содержанием рецептора, уровень остаточной агрегации в присутствии препарата в этой группе также был существенно (более чем в 2 раза) выше, чем у доноров с низким содержанием GP IIb-IIIa (рис. 12а).

При добавлении аспирина уровень АДФ-индуцированной агрегации также в одинаковой степени снижался в группах с генотипом «дикого типа» LeuLeu GP IIIa и у носителей Pro33 аллеля (LeuPro+ProPro) - на (55±6)% и (46±6)%, соответственно (р>0,1) (рис. 12б). Как в контрольных образцах, так и в присутствии препарата, уровень агрегации, был несколько выше у носителей Pro33 аллеля гена GP IIIa, но эти различия не достигали статистической значимости (р=0,07 в присутствии аспирина и р=0,1 без препарата).

Мы проанализировали генетические варианты Leu33Pro GP IIIa, T13254C GP VI и A-842G COX-1 у 153 пациентов группы ИБС одновременно с измерением степени агрегации тромбоцитов, индуцированной арахидоновой кислотой (АК) и АДФ (1 мкМ и 10 мкМ) до начала терапии (АК0, 1АДФ0, 10АДФ0) и через две недели после приема препарата в стандартной дозировке 100 мг/день (АК2, 1АДФ2, 10АДФ2). Через 2 недели наблюдений на фоне приема аспирина у пациентов с ИБС наблюдалось значимое снижение степени агрегации тромбоцитов во всех тестах: (18,7±1,5)% и (5,3±0,6)%, (19,9±1,4)% и (10,8±0,9)%, (6,3±0,7)% и (2,4±0,3)% для АК0 и АК2, 10АДФ0 и 10АДФ2, 1АДФ0 и 1АДФ2, соответственно (p<0,00001). Однако у 18% больных функциональная активность тромбоцитов в ответ на аспирин по результатам анализа агрегации, индуцированной АК, не изменялась или увеличивалась, что говорило о наличии у этих пациентов аспирин-резистентности. При этом достоверных различий в распределении исследованных генотипов у больных с аспирин-резистентностью и пациентов, положительно ответивших на терапию аспирином по результатам лабораторных тестов, найдено не было (табл. 15).

Таблица 15.Распределение генотипов Leu33Pro GP IIIa, T13254C GP VI и A-842G COX-1 у пациентов в зависимости от чувствительности к аспирину

Мы наблюдали более эффективное снижение степени АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (АДФ 1мкМ) через 2 недели после начала терапии аспирином у носителей Pro33 аллеля гена GP IIIa (генотипы LeuPro и ProPro) по сравнению с пациентами, имеющими «дикий» генотип LeuLeu: (1,4±0,3)% и (2,7±0,4)%, соответственно (p=0,03). Также большее снижение агрегационной активности тромбоцитов на фоне приема аспирина показали носители C13254 аллеля гена GP VI, и различия при индукции 10 мкМ АДФ (10АДФ2) имели тенденцию к достоверности: (7,5±1,5)% и (11,1±1,1)%, для носителей генотипов ТС и ТТ, соответственно (p=0,1). Одновременно была показана тенденция к более высокой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (АДФ 10мкМ) на фоне приема аспирина в течении 14 дней у носителей полиморфизма A-842G COX-1 (AG генотип по сравнению с АА генотипом): (14,3±3,2)% и (10,6±1,0)%, соответственно (p=0,09). Однако в дальнейшем наблюдаемые нами эффекты пропадали, и степень агрегации не отличалась у больных с различными генотипами GP IIIa, GP VI и COX-1 через 1 и 6 месяцев приема аспирина.

Также мы проанализировали функциональную активность тромбоцитов на фоне приема аспирина у пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет (n=18). В данной группе функциональная активность тромбоцитов была оценена по показателям АДФ-индуцированной агрегации (2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ АДФ) - T(%) и V(%/мин), а также параметрам, измеренным на проточном цитометре - К₁ и К₂, в зависимости от генетических вариантов Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т GP Ia, Т13254С GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1, количества рецепторов GP IIb-IIIa, P2Y12, P2Y1 и P2X1 на поверхности тромбоцитов и уровня экспрессии генов GP IIb, GP IIIa, P2Y12, P2Y1 и P2X1.

Аналогично группе ИБС, пациенты с ИМ - носители Pro33 аллеля гена GP IIIa на фоне аспирина (100 мг/день) показывали меньшую степень АДФ-индуцированной агрегации (10 мкМ АДФ) - (61,7±5,2)% против (72,7±2,4)% для генотипов LeuPro+ProPro и LeuLeu, соответственно (p=0,09). Полиморфизм Leu33Pro GP IIIa обсуждался в литературе в связи с развитием аспирин-резистентности, но эффекты Pro33 аллеля строго зависели от лабораторных методов оценки эффективности действия аспирина, примененных в различных исследованиях (Goodman T., Ferro A., Sharma P., 2008).

Противоположные результаты были получены для Т13254С GP VI. Если обследованные нами пациенты с ИБС эффективнее снижали функциональную активность тромбоцитов в зависимости от носительства мутации Т13254С GP VI, то у больных ИМ степень АДФ-индуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) при приеме аспирина была несколько выше при наличии мутации Т13254С GP VI - (56,9±5,0)% и (70,2±5,1)% для TT и ТС генотипов, соответственно (р=0,09). Показатели функциональной активности тромбоцитов на фоне приема аспирина, измеренные с помощью цитометрического анализа, также показывали более высокие значения у носителей мутантного аллеля С13254 GP VI: К₁=(4,0±2,3)% и К₂=(67,8±23,8)% для лиц с генотипом «дикого типа» ТТ, К₁=(17,2±3,1)% и К₂=(72,4±6,9)% для пациентов с генотипом ТС (р=0,02 и р=0,09 для К₁ и К₂, соответственно). Таким образом, в группе больных ИМ старше 45 лет мы выявили ассоциацию Т13254С GP VI с низкой эффективностью аспирина, и данный результат согласуется с Lepantalo A. и соавт. (Lepantalo A. et al. 2006). Следует обратить особое внимание на критерии, по которым оценивалось снижение эффективности действия аспирина, в разных группах анализировались разные показатели - либо АДФ-индуцированная агрегация при различных концентрациях индуктора (группы ИБС и ИМс), либо показатели проточной цитометрии (группа ИМс), либо (у Lepantalo A. и соавт.) - PFA-100 анализ. Полученные отличия в результатах фармакогенетического исследования говорят о необходимости стандартизировать методы оценки функциональной активности тромбоцитов и индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам с установлением четких критериев состояния «аспирин-резистентности». Наши выводы полностью согласуются с позицией рабочей группы по аспирин-резистентности (Working Group on Aspirin Resistance) комитета по науке и стандартизации (SSC) Международного общества по тромбозу и гемостазу (ISTH) (Michelson A.D. et al, 2005).

Генотипы A1622G P2Y1 и G36T P2Y12 не влияли на развитие аспирин-резистентности, что не противоречит результатам других исследователей (Bernardo E. et al, 2006; Goodman T., Ferro A., Sharma P., 2008). Мы получили неожиданные результаты о влиянии полиморфизма C18T P2Y12, описанного нами как протективный в отношении развития ИМ и гиперагреации тромбоцитов, на индивидуальную чувствительность больных ИМ к аспирину. Скорость АДФ-индуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) была несколько выше у носителей Т18 аллеля - (38,9±4,3) %/мин против (26,9±3,8) %/мин у лиц с генотипом СС (р=0,09). Выше был и показатель K₂ - (85,9±3,3) % и (63,7±9,8) % у носителей СТ+ТТ и СС генотипов P2Y12, соответственно (р=0,05). Параметр K₁ также был несколько выше у носителей Т18 аллеля, но различия не достигали статистической значимости - (14,2±4,2) % и (17,5±2,6) % для СТ+ТТ и СС генотипов P2Y12, соответственно (p>0,1). Однозначных выводов об ассоциации C18T P2Y12 с развитием аспирин-резистентности на основании полученных результатов делать нельзя. Но следует учитывать, что ранее данный полиморфный вариант был ассоциирован с увеличением риска возникновения церебро-васкулярных осложнений на фоне стандартной терапии клопидогрелом (Zeigler S. et al, 2005).

Таким образом, несмотря на то, что функциональная активность тромбоцитов у пациентов, принимающих аспирин, может быть различной в зависимости от исследованных генотипов, нельзя назвать эти генетические варианты строгими факторами, определяющими развитие аспирин-резистентности. Тем не менее, на практике у больных ССЗ целесообразно учитывать наличие полиморфных вариантов T13254C GP VI и A-842G COX-1, модулирующих индивидуальный ответ на аспирин.

3. Клопидогрел

Результаты исследований, таких как COMMIT, СLARITY, CAPRIE, CURE и CREDO показали высокую эффективность клопидогрела во вторичной профилактике неблагоприятных клинических исходов. Но одновременно были получены данные о варьировании индивидуального ответа на клопидогрел, и описан феномен резистентности к клопидогрелу (Jaremo P., 2002; Gurbel P., 2003; Angiolillo D., 2004; Gurbel P. et al, 2005; Rocca B., Patrono C., 2005).

Для анализа молекулярно-генетических факторов, влияющих на индивидуальную чувствительность к клопидогрелу, нами были обследованы 94 пациента с ОКС и 28 пациентова, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет. Исследование АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов проводилось больным ОКС исходно (1-ая точка), через 7 дней (2-ая точка), через 30 дней (3-ая точка), через 6 - 8 месяцев с момента госпитализации (4-ая точка) при концентрациях АДФ 1, 2, 5, 10 и 20 мкМ, пациентам с ИМ - на 3-4 день (1-ая точка), на 12-15 день (2-ая точка, не менее 7 дней терапии клопидогрелом) и через 6 месяцев (3-я точка) при концентрации АДФ 2.5, 5 и 10 мкМ.

При первом измерении не было обнаружено ассоциации между активностью тромбоцитов и исследуемыми генетическими вариантами. Однако в динамике наблюдалось следующее: носители мутаций G36T P2Y12 и C807T GP Ia изначально показывая более высокую степень агрегации, на фоне терапии более эффективно ее снижали. Напротив, у носителей мутантных аллелей Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12 и A1622G P2Y1 не наблюдалось уменьшения степени агрегации тромбоцитов, тогда как пациенты с генотипами «дикого типа» по указанным полиморфизмам вполне адекватно реагировали на антиагрегантную терапию клопидогрелом.

В настоящий момент нет однозначного мнения о влиянии полиморфизмов генов GP IIIa, P2Y12 и P2Y1 на индивидуальную чувствительность кардиологических пациентов к клопидогрелу, результаты исследований носят противоречивый характер. Ряд работ не показывают ассоциации генетических вариантов Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12 и C18T P2Y12 с вариабельностью ответа на клопидогрел (von Beckerath N. et al, 2005; Angiolillo D.J. et al, 2005; Smith S.M.G. et al, 2006; Lev E.I. et al, 2007). Другие авторы связывают полиморфизмы Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 с гиперреактивностью тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии и с развитием клопидогрел-резистентности (Dropinski J. et al, 2005; Malek L.A. et al, 2008; Feher G. et al, 2009; Staritz P. et al, 2009), а C18T P2Y12 выступает фактором риска развития цереброваскулярных осложнений на фоне терапии клопидогрелом (Ziegler S. et al, 2005). Более того, генетические варианты рецептора P2Y12 модулируют не только ответ тромбоцитов на клопидогрел, но и на ингибитор АДФ-рецепторов нового поколения - кангрелор (Bouman H.J. et al, 2010). Этот факт опровергает мнение некоторых исследователей о том, что новые препараты снимут вопрос «резистентности» и индивидуальной чувствительности к антиагрегантной терапии с повестки дня.

Под клопидогрел-резистентностью чаще всего подразумевается отсутствие снижения функциональной активности тромбоцитов или развитие неблагоприятных клинических исходов на фоне приема препарата. Патогенетически более корректным можно считать определение резистентности как неспособность препарата блокировать целевой рецептор Р2Y12 и эффективно подавлять агрегацию тромбоцитов. Так как такое определение позволяет использовать лабораторные методы диагностики резистентности к клопидогрелу - определение остаточной активности Р2Y12 рецепторов путем измерения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов до и после начала терапии клопидогрелом (Gurbel P.A., Tantry U.S., 2007). В своем исследовании мы относили пациентов к клопидогрел-резистентным, если степень АДФ-индуцированной агрегации не снижалась или повышалась по отношению к исходной точке.

В группе пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет, клопидогрел-резистентность наблюдалась у 7 из 28 проанализированных по 2-м точкам пациентов, то есть составила 25%. В группе больных с ОКС клопидогрел-резистентность была выявлена у 24 из 94 проанализированных на 1-ой и 2-ой точках пациентов, и также составила 25%. Данная частота развития клопидогрел-резистентности в среднем соответствует таковой, описанной в литературе (Angiolillo D. et al, 2004; Gurbel P. et al, 2005; Phillips D.R. et al, 2005; Barsky A.A., Arora R.R., 2006; Ferguson A. et al, 2008).

Клопидогрел является пролекарством и для перехода его в активную форму необходима трансформация с помощью ферментов системы цитохромов Р-450 - CYP2C19, CYP3A4 и CYP3A5. Снижение активности данных ферментов может служить одной из причин развития клопидогрел-резистентности. Мы проанализировали генетические варианты А-293G CYP3A4, G6986A CYP3A5 и G681A CYP2C19 в группах ИМс и ОКС. Проведенный генетический анализ цитохромов CYP2C19, CYP3A4 и CYP3A5 не выявил полиморфизм, ассоциированный с развитием резистентности к клопидогрелу. И в группе ИМс, и в группе ОКС, пациенты, в целом положительно отвечающие на клопидогрел, показывали более высокие значения АДФ-индуцированной агрегации, если являлись носителями GA или AA генотипа G6986A CYP3A5. Среди цитохромов Р-450 чаще связывают с пониженной чувствительностью к клопидогрелу полиморфизм гена CYP2C19 (Hulot J. et al, 2006; Frere C. et al, 2008; Varenhorst C. et al, 2009). Варианты CYP3A4 и CYP3A5 в полной мере не объясняют развитие клопидогрел-резистентности, и их ассоциация с данным феноменом оценивается исследователями по-разному (Lau W.C. et al, 2004; Smith S. et al, 2006; Angiolillo D. et al, 2006; Frere C. et al, 2008).

Мы оценили количество рецепторов P2Y12 и P2Y1 на поверхности тромбоцитов до приема клопидогрела и через 1 месяц двойной антиагрегантной терапии клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день). Антитела, которые использовались в исследовании, способны связываться только со свободными, не заблокированными активным метаболитом клопидогрела, рецепторами. На фоне антиагрегантной терапии клопидогрелом наблюдалось статистически достоверное снижение количества рецепторов P2Y12 и P2Y1 на мембране тромбоцитов (рис. 13).

Рис. 13. Количество рецепторов P2X1, P2Y1 и P2Y12 на поверхности тромбоцитов пациентов исходно и через 1 месяц терапии клопидогрелом

Количество рецептора P2X1 также было снижено, что довольно трудно объяснить, так как природа данного рецептора отлична от P2Y12 и P2Y1 - он является кальциевым каналом и активируется АТФ. Тем не менее, известно, что он может играть ключевую роль в активации тромбоцитов рядом индукторов, даже на фоне антиагрегантной терапии (Grenegard M. et al, 2008). В нашем исследовании от количества свободных рецепторов P2X1 зависела АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов на фоне двойной терапии клопидогрел+аспирин - наблюдалась прямая и достоверная корреляция между средней интенсивностью флуоресценции и степенью агрегации при 2,5 мкМ АДФ (R=0,68; p=0,02).

Также был проанализирован уровень экспрессии генов АДФ-рецепторов P2X1, P2Y1 и P2Y12 в тромбоцитах здоровых доноров и у пациентов, чувствительных и резистентных к клопидогрелу. Уровень экспрессии генов P2X1 и P2Y1 не различался у пациентов с положительным и отрицательным ответом на клопидогрел. В то время как экспрессия гена P2Y12 была выше у пациентов, не чувствительных к антиагрегантной терапии (табл. 16). Мы впервые выявили ассоциацию между высоким уровнем экспрессии гена P2Y12 и развитием клопидогрел-резистентности. Braun O.O. и соавт. не нашли такой взаимосвязи, однако они показали прямую корреляцию между количеством рецептора P2Y12 на поверхности тромбоцитов и эффективностью клопидогрела (Braun O.O. et al, 2007). Следует отметить, что работа Braun O.O. и соавт. - это единственное на настоящий момент исследование, которое, как и наше, было посвящено анализу уровня экспрессии гена и количества рецептора P2Y12 у пациентов, принимающих клопидогрел.

Таблица 16.Уровень экспрессии генов АДФ-рецепторов тромбоцитов P2X1, P2Y1 и P2Y12 у доноров и пациентов, чувствительных и резистентных к клопидогрелу

*p<0,01 - по сравнению с (+) ответом и контрольной группой

Таким образом, на основании проведенного нами фармакогенетического исследования можно заключить, что:

1) генетические варианты Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12 и G6986A CYP3A5 модулируют индивидуальный ответ пациентов на терапию клопидогрелом - степень АДФ-индуцированной агрегации у носителей полиморфных аллелей остается высокой;

2) резистентные к клопидогрелу пациенты, которые составляют 25%, характеризуются высоким уровнем экспрессии гена P2Y12, кодирующего рецептор - «мишень» для клопидогрела;

3) лабораторным маркером, показывающим степень блокирования рецептора P2Y12 на мембране тромбоцитов, выступает количество свободных рецепторов, измеренное методом проточной цитометрии с использованием соответствующих флуоресцентно меченых антител.

Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам

Поиск причин различной чувствительности к антиагрегантым препаратам и сложность в оценке состояния тромбоцитарного гемостаза привели к необходимости искать комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов, что и было предпринято в данной работе. Оценка эффективности действия антиагрегантного препарата должна вестись одновременно по двум направлениям: наблюдение за клиническими исходами и анализ биологического действия препарата, то есть подавления активации и агрегации тромбоцитов с использованием адекватных лабораторных тестов. При этом обязательно надо учитывать индивидуальный генотип пациента, который может влиять на эффективность лекарственного средства. На примере клопидогрела, комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантной терапии, должен учитывать генетические варианты цитохромов Р-450, метаболизирующих клопидогрел, АДФ-рецепторов P2Y12 и P2Y1, являющихся «мишенью» для препарата, а также те генетические факторы, которые определяют гиперагрегацию тромбоцитов, и в первую очередь - Leu33Pro GP IIIa (рис. 14).

Рис. 14. Комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов и чувствительности к клопидогрелу с учетом молекулярно-генетических механизмов активации тромбоцитарного гемостаза

В настоящее время активно ведется поиск новых методов анализа функциональной активности тромбоцитов как таковой, а также остаточной реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии. Результаты исследований подтверждают наш тезис о необходимости проведения комплексного анализа. Так Marcucci R. и соавт. показали, что только лабораторные тесты с использованием нескольких агонистов могут адекватно отразить состояние тромбоцитарного гемостаза и выявить высокую реактивность тромбоцитов на фоне терапии (Marcucci R. et al, 2010). Однако до сих пор нет четкого алгоритма обследования пациентов с целью выявления факторов риска высокой реактивности тромбоцитов, в том числе генетических, и рекомендаций по тактике анитиагрегантной терапии, основывающихся на проведенных лабораторных исследованиях. Помимо трудностей лабораторного определения состояния «резистентности» к антиагрегантным препаратам, существует проблема преодоления низкой чувствительности к лекарственному средству, решить которую возможно только с позиций персонализированной медицины. Уже появились сообщения о снижении функциональной активности тромбоцитов путем увеличения дозы аспирина до 325 мг/день (Brambilla M. et al, 2010), а также о возможном повышении дозы клопидогрела или замене клопидогрела на антагонисты АДФ-рецепторов последнего поколения, GP IIb-IIIa блокаторы, антагонисты рецепторов тромбина (Zurn C.S., Geisler T., Gawas M., 2010; Barrero A.E., 2010).

Мы сформулировали алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам (рис. 15).

Рис. 15. Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам

Перед назначением клопидогрела рекомендуется провести анализ функциональной активности тромбоцитов, причем не ограничиваться одним методом, а использовать несколько подходов: АДФ-индуцированная агрегация при нескольких концентрациях индуктора (2,5, 5 и 10 мкМ АДФ), коллаген-индуцированная агрегация, исследования на проточном цитометре с расчетом параметров K₁ и К₂.

Следующее определение функциональной активности тромбоцитов проводится через 5-7 дней терапии клопидогрел 75 мг/день + аспирин 100 мг/день. Одновременно проводится молекулярно-генетический анализ Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12, T13254C GP VI, G6986A CYP3A5 и A-842G COX-1. Если у пациента отсутствуют указанные мутации, а показатели функциональной активности тромбоцитов снизились по сравнению с исходной точкой, можно сделать заключение об эффективном действии антиагрегантной терапии и продолжать прием клопидогрела и аспирина в стандартной дозировке 75 мг/день и 100 мг/день, соответственно, в течении рекомендованного срока согласно диагнозу. Наличие мутаций T13254C GP VI и A-842G COX-1 при высокой степени коллаген-индуцированной агрегации и отсутствии изменений параметров K₁ и К₂ в сторону уменьшения по сравнению с исходными говорят о низкой индивидуальной чувствительности к аспирину. В таком случае может быть рекомендована коррекция дозы аспирина до 325 мг/день, доза клопидогрела остается стандартной (75 мг/день). Сохраняющаяся высокая функциональная активность тромбоцитов на фоне двойной антиагрегантной терапии клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день) по сравнению с исходной с показателями степени индуцированной агрегации тромбоцитов больше 50% для всех индукторов и параметрами K₁>10% и К₂>50%, особенно при детекции у данных пациентов генетических вариантов Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12 или G6986A CYP3A5, говорит о развитии «клопидогрел-резистентности» и повышенном риске повторных сердечно-сосудистых событий. В таком случае следует пересмотреть тактику антиагрегантной терапии. В первую очередь, может быть рекомендовано увеличение дозы клопидогрела до 150 мг/день, доза аспирина остается стандартной (100 мг/день). Если дальнейшее наблюдение за больным не покажет положительной динамики в снижении функциональной активности тромбоцитов, следует поставить вопрос о смене антиагрегантной терапии - замене клопидогрела на более быстродействующие антагонисты P2Y12, в том числе не требующие метаболизации ферментом CYP3A5 (особенно актуально у носителей мутации G6986A CYP3A5), или на ингибиторы GP IIb-IIIa рецепторов и рецепторов тромбина.