Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство здравоохранения Республики Узбекистан

ВТОРОЙ Ташкентский государственный медицинский институт

На правах рукописи

УДК. 616.1:615.9:613.632

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Структурные и метаболические изменения миокарда у экспериментальных животных при интоксикации пестицидом Вантекс

14.00.16 - Патологическая физиология

Хамидова Нигора Ададьевна

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РУз, д.м.н., профессор Каримов Х.Я.

Ташкент - 2005

Оглавление

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Пестициды и их экотоксическое действие

1.2 Кардиотоксическое действие некоторых видов пестицидов

1.3 Физико-химические свойства и краткая токсикологическая характеристика Вантекса

2. Материал и методы исследования

2.1 Характеристика экспериментального материала

2.2 Методы исследования

3. Результаты собственных исследований

3.1 Перекисное окисление липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты у экспериментальных животных при острой и хронической интоксикации пестицидом Вантекс

3.2 Степень цитолиза кардиомиоцитов и эндогенной интоксикации в организме опытных животных при воздействии пестицида Вантекс

3.3 Степень гипоксии в гомогенатах сердечной ткани белых крыс при введении различных доз пестицида Вантекс

3.4 Состояние адениннуклеотидной системы миокарда животных в остром и хроническом эксперименте

3.5 Морфологические изменения миокарда в динамике острой интоксикации пестицидом Вантекс

Заключение

Литература

Условные сокращения

ПОЛ - перекисное окисление липидов

АОС - антиоксидантная система

МДА - малоновый диальдегид

ДК - диеновая коньюгата

ТК - триеновая коньюгата

СОД - супероксиддисмутаза

Кат - каталаза

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МК - молочная кислота

ПВК - пировиноградная кислота

б-ГБД-альфа-гидроксобутиратдегидрогеназа

АТФ - аденозинтрифосфат

АДФ - аденозиндифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

АЛТ - аланин-аминотрансфераза

АСТ - аспартат-аминотрансфераза

СМП - средне-молекулярные пептиды

ПТ - парамецийный тест

Введение

Актуальность проблемы. В результате научно-технического прогресса, проникшего во все области человеческой деятельности, усиливается процесс химизации сельского хозяйства, который неразрывно связан с интенсивным применением эффективных удобрений, а также агротехнических и биологических средств защиты и обработки сельскохозяйственных культур [40].

К числу наиболее востребованных в народном хозяйстве химических соединений относятся пестициды, применение которых, наряду с повышением урожайности сельскохозяйственных культур, приводит к нарушению экологического равновесия между средой и организмом, что представляет собой потенциальную опасность для здоровья человека [40,41,43,52].

Как известно, пестициды относятся к числу наиболее распространенных загрязнителей биосферы и по характеру биологического действия являются наиболее опасными соединениями, влияющими на обмен углеводов, липидов, белков, биогенных аминов и на механизмы энергообеспечения [5,46,50,78,123,].

Учитывая вышеизложенные факты, изучение механизма биологического действия пестицидов, выявление ранних стадий интоксикации, разработка мер предотвращения и терапии возможных отрицательных эффектов воздействия пестицидов на организм человека, служат важнейшим профилактирующим и упреждающим фактором охраны здоровья населения [31].

К настоящему времени накоплено немало литературных сведений, посвященных изучению патогенетических механизмов действия ксенобиотиков, вызывающих функционально-метаболические и структурные изменения практически во всех органах и системах : в центральной и периферической нервной системе, сердечно-сосудистой, кроветворной, иммунной системах, в желудочно-кишечном тракте [5,10,13,17,21,55,62,86,95,135,140]. В условиях клиники и экспериментальными исследованиями установлено, что пестициды оказывают общетоксическое действие, обладают кумулятивными свойствами и имеют отдаленный мутагенный, эмбриотоксический, гонадотропный, тератогенный и бластомогенный эффекты [63,74,84,95,102,103,108,136].

Однако, вопросы, касающиеся кардиотоксического действия пиретроидов - пестицидов нового поколения, несмотря на актуальность и злободневность проблемы, освещены недостаточно.

Сердечно-сосудистая патология сегодня занимает ведущее место в структуре причин смертности населения всего земного шара. Известно, что одной из этиологических причин возникновения заболеваний сердца является токсический фактор [17,44,95].

Учитывая данное обстоятельство, применение химических средств в народном хозяйстве порождает необходимость выявления и внедрения в сельскохозяйственную практику новых избирательных инсектоакарицидов, эффективных для насекомых в малых дозах и малотоксичных для теплокровных животных и человека, а также разработку профилактических мероприятий, направленных на безопасное применение пестицидов [81,88,99].

В этом плане перспективным является пестицид нового поколения - пиретроид Вантекс, изучаемый в настоящей работе. Препарат предложен фирмой Dow AgroScienses (США), широко используется в хлопководстве Узбекистана в качестве инсектоакарицида. Однако патофизиологические механизмы его токсического действия на организм до конца не ясны.

Отсутствие исследований о влиянии Вантекса на сердечно-сосудистую систему обусловило актуальность темы и послужило основанием для проведения работы.

Цель работы: оценка структурных и метаболических изменений миокарда у экспериментальных животных в условиях острого и хронического воздействия интсектоакарицида Вантекс.

Задачи исследования

1. В экспериментальных условиях определить интенсивность процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови и ткани сердца у опытных животных при острой и хронической интоксикации пестицидом Вантекс.

2. Определить состояние ферментов системы антиоксидантной защиты в организме экспериментальных животных при остром и хроническом введении пестицида Вантекс.

3. В остром и хроническом эксперименте изучить степень цитолиза кардиомиоцитов и эндогенной интоксикации в организме опытных животных при воздействии пестицида Вантекс.

4. Оценить степень гипоксии в гомогенатах сердечной ткани белых крыс при введении различных доз пестицида Вантекс.

5. Исследовать влияние пестицида Вантекс на состояние адениннуклеотидной системы миокарда экспериментальных животных.

6. Изучить морфологические особенности миокарда в динамике острой интоксикации Вантексом.

Научная новизна

Впервые изучено состояние системы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови и сердечной ткани и системы антиоксидантной защиты (АОЗ) крови, получены данные о степени цитолиза кардиомиоцитов, эндогенной интоксикации, исследовано развитие гипоксии и состояние адениннуклеотидной системы в ткани миокарда при интоксикации пестицидом Вантекс, подтвержденные ультраструктурными исследованиями. Показано, что использованные дозы пестицида оказывают мембрано-деструктивное действие, активизируют процессы ПОЛ, ингибируют активность ферментов АОС. Впервые получены данные о морфологических и ультраструктурных изменениях в миокарде при интоксикации пестицидом Вантекс.

Практическая значимость

Установленные особенности изменений свидетельствуют о токсическом повреждении миокарда, что подтверждается морфологическими данными. Изучение патофизиологических механизмов токсического действия пестицида Вантекс на организм позволит улучшить раннюю диагностику интоксикаций при проведении предварительных и периодических медицинских осмотров, разработать новые методы профилактики и патогенетического лечения при острых и хронических отравлениях лиц, работающих с пиретроидами - пестицидами нового поколения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Активизация ПОЛ, являясь пусковым механизмом гиперлипопероксидации, характеризуется увеличением содержания диеновых и триеновых конъюгатов (ДК и ТК), а также малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови и, особенно, в митохондриальной фракции миокарда, как при остром, так и при хроническом отравлении, что сопровождается ингибированием активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в крови, приводит к повышению активности трансаминаз, накоплению среднемолекулярных пептидов (СМП) при укорочении продолжительности жизни парамеций в сыворотке крови.

2. Интоксикация пестицидом характеризуется развитием гипоксии в ткани миокарда, указывающей на наличие деструктивных процессов и проявляющейся увеличением содержания молочной кислоты (МК) и снижением содержания пировиноградной кислоты (ПВК) в сыворотке крови и миокарде при увеличении активности ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и б-гидроксобутиратдегидрогеназы (б-ГБД). Выявлено снижение уровня аденозинтрифосфата (АТФ), повышение содержания аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинмонофосфата (АМФ), более выраженное при острой интоксикации, что совпадает с накоплением молочной кислоты в гомогенатах сердечной ткани, свидетельствующее об увеличении доли альтернативных путей энергообеспечения.

Внедрение в практику:

Основные аспекты диссертационной работы внедрены в плановую работу токсикологической лаборатории ЦНИЛ и в учебный процесс по курсу токсикологии студентам и резидентам Второго ТашГосМИ.

Апробация работы:

Основные фрагменты диссертационного материала доложены на:

Научно-практической конференции «Охрана окружающей среды и здоровье человека ». Ташкент, 2003 г.

Основные принципы постановки исследований по оценке влияния пестицидов на сердечно-сосудистую систему.

Commercial Potential of Toxins: Developing Toxins for Applications in Drug Discovery and Diagnostics. June 17-19, 2004, Ljubljana, Slovenia.

Status of carbohydrates exchange for an acute intoxication with insectoacaricide Vantex.

Научно-практической конференции, посвященной 70 летию НИИ санитарии, гигиены и профзаболеваний. Ташкент,200, посвященной 70-летию НИИ санитарии, гигиены и профзаболеваний. Ташкент,2004 г.

Роль углеводного обмена при острой интоксикации инсектоакарицидом Вантекс.

Также основные положения диссертации доложены на научном заседании ЦНИЛ и кафедры патологической физиологии Второго ТашГосМИ (Ташкент,2005); на межкафедральной научной конференции кафедр патологической физиологии, биохимии, нормальной физиологии и гистологии Второго ТашГосМИ (Ташкент,2005); на межинститутском научном семинаре кафедр патологической физиологии, биохимии, биологии, биофизики I-II-ТашГосМИ, ТашПМИ (Ташкент,2005).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 журнальные статьи.

1. Обзор литературы

1.1 Пестициды и их экотоксическое действие

В начале 60-х годов нашего столетия человечество впервые стало осознавать серьезность встающих перед ним экологических проблем и хрупкость самого существования жизни на планете Земля. Реальностью стали глобальное потепление климата, возникновение озоновых дыр над полюсами, массовое распространение токсикантов и загрязнение воды, воздуха, почв, продуктов питания вредными химическими веществами, вымирание многих видов растений и животных, снижение биоразнообразия в результате деятельности растущего народонаселения планеты. Академик РАН К.Я. Кондратьев на Межпарламентской Ассамблее стран-участников СНГ (апрель, 1995 г.) заявил: "...пока мы вели долгие споры о том, какие меры следует предпринять, чтобы предотвратить наступающий экологический кризис, он уже наступил". Осознание этого факта звучало и на первом Всероссийском съезде по охране природы в июне 1995 года [30].

В результате научно-технического прогресса, проникшего во все области человеческой деятельности, усиливается процесс химизации сельского хозяйства, который неразрывно связан с интенсивным применением эффективных удобрений, а также агротехнических и биологических средств защиты и обработки сельскохозяйственных культур. Известно, что уже к 2000 году производство химических веществ в мире возрасло примерно в 2 раза за прошедшее десятилетие. Уже сегодня в банке данных Chemical Abstract Services (США) имеются сведения о почти 8 млн. различных химических соединений, причем несколько десятков тысяч из этого количества находят широкое применение в многообразных сферах жизни и постоянно используются людьми[30].

К числу потенциально опасных токсикантов и в то же время наиболее востребованных в народном хозяйстве относятся пестициды. Это химические препараты, используемые для борьбы с вредителями и болезнями растений, сорняками, микроорганизмами, вызывающими порчу сельскохозяйственной продукции, материалов и изделий, а также для борьбы с паразитами и переносчиками опасных заболеваний человека и животных [9].

По химическому составу выделяются 3 основные группы пестицидов [80]:

1. Неорганические соединения (соединения ртути, фтора, бария, серы, меди, а также хлораты и бораты).

2. Пестициды растительного, бактериального и грибного происхождения (пиретрины, бактериальные и грибные препараты, антибиотики и фитонциды).

3. Органические соединения, к которым относятся пестициды высокой физиологической активности: хлорорганические соединения (гексахлорциклогексан, гептахлор, и др.); фосфорорганические соединения (хлорофос, метилнитрофос, карбофос, и др.); производные карбаминовой, тио- и дитиокарбаминовой кислот (пиримор, карбин, тиллом); нитропроизводные фенолов (нитрафен, каратан); фталимиды (гранозан, меркуран и др.); хиноны (дихлон); производные мочевины и др.

В настоящее время практически весь современный ассортимент пестицидов представлен органическими веществами.

Хлорорганические пестициды, такие как ДДТ, неправильно называемый дустом, и гаммаизомер ГХЦГ, в настоящее время запрещены к применению ввиду их сильной токсичности и мутагенности, длительному разложению в природе и способностью накапливаться в пищевых цепях.

Фосфороорганические инсектоакарициды применяются до сих пор. Они быстро разлагаются в биологических средах, не фитотоксичны (не ядовиты для растений), обладают широким спектром действия против членистоногих насекомых и клещей. Однако они высокотоксичны для теплокровных и человека и к ним быстро вырабатывается устойчивость у вредителей.

Пиретрины - контактные инсектициды с быстрым парализующим действием (нокдаун-эффект). Применяются в форме аэрозолей, дустов, эмульсий и т.п. для борьбы с бытовыми насекомыми (клопы, вши, тараканы). Могут использоваться для уничтожения вредных насекомых в сельском хозяйстве и при обработке запасов, однако их действие очень кратковременно. Из-за нестабильности пиретринов к ним редко возникает резистентность. Инсектицидное действие их усиливается при добавлении различных веществ синергистов (пиперонилбутоксид, тропиталь, сезамекс и др.). Для большинства стран пиретрины - привозные, дорогие инсектициды, поэтому синтезированы аналоги этих препаратов -пиретроиды.

Синтетические пиретроиды - вещества, сходные с выделенными из растений пиретринами, сейчас представлены на рынке наиболее широко. Они гораздо менее токсичны для человека, чем предыдущая группа пестицидов, но более токсичны для насекомых и клещей. Они не накапливаются в пищевых цепях, быстро разлагаются, нефитотоксичны, но к ним также быстро вырабатывается устойчивость у вредителей.

Пестициды подразделяют по объектам применения:

инсектициды для борьбы с вредными насекомыми;

акарициды против клещей;

нематициды против нематод;

родентициды против грызунов;

фунгициды (антисептики) против грибов;

антибиотики (антисептики, бактерициды) против бактерий;

гербициды средства борьбы с сорной растительностью;

арборициды против сорной древесной растительности и многие другие группы препаратов.

В качестве инсектицидов для борьбы с членистоногими используют главным образом фосфорорганические соединения, синтетические пиретроиды и, частично, в основном в Африке, Китае и Южной Азии, хлорорганические соединения, такие, как ДДТ и линдан (линдан - 98-100%-ный g-изомер гексахлорциклогексана, гексахлоран - техническая смесь изомеров гексахлорциклогексана, содержащая 12-13% g-изомера).

Инсектициды по характеру действия в зависимости от способа поступления в организм подразделяются на:

контактные - проявляющие свое действие при соприкосновении с насекомыми (керосиновая эмульсия, бордоская жидкость, хлорокись меди);

кишечные - действующие при попадании в желудочно-кишечный тракт (соединения мышьяка, фтора и бария, фосфорорганические соединения);

системные - проникающие в растение и транслоцирующие в нём, вызывающие гибель вредителей при питании соком обработанных растений;

фумиганты - химические вещества, проникающие в организм насекомых и животных через дыхательные пути в виде газа или пара. К ним относятся и инсектоакарициды фумигантного действия, которые так же вызывают отравление вредных насекомых и клещей при поступлении через органы дыхания.

Пестициды выпускают в разнообразных препаративных формах, что влияет на их общую токсичность. В настоящее время сокращен выпуск дустов, разработаны новые формы в виде концентратов эмульсий, смачивающихся порошков, растворимых порошков, гранулятов, микрокапсул.

Разнообразны способы применения пестицидов: опыливание, опрыскивание, фумигация, рассев или внесение гранулированных препаратов и т.п.

Но, наряду с позитивным действием этих химикатов, имеется множество отрицательных сторон воздействия пестицидов. Многолетнее применение ксенобиотиков в огромных масштабах во всех странах мира привело к нарушению равновесия в окружающей среде, возникновению хронических отравлений, стертых форм интоксикации, повышению уровня общей заболеваемости, снижению работоспособности, развитию отдаленных эффектов и другим вредным последствиям [97]. Число отравлений в год, по данным ВОЗ, составляет 500 000, из них более 5 000 случаев оканчиваются смертельным исходом. Неблагоприятному воздействию пестицидов подвергаются не только лица, непосредственно работающие с ними, но и проживающие или работающие вблизи обрабатываемых участков, занятые уходом за посевами, сбором и переработкой урожая, содержащего остаточное количество химикатов. Не исключается возможность попадания данных химических соединений в пищевые продукты растительного и животного происхождения [94,106]

Большую опасность с точки зрения возможного загрязнения пищевых продуктов пестицидами представляет почва, которая подвергается значительному воздействию. В результате ее загрязнения экотоксинами, она становится, по сути дела, их кладовой, чему способствует стабильность пестицидов, приводящая к постоянному накоплению в растениях и т.д.[94,106].

Объектом циркуляции инсектицидов в окружающей среде является атмосферный воздух. Такие агротехнические приёмы, как аэрообработка посевов, механическое опрыскивание и другие способы интенсивно загрязняют атмосферный воздух и др. Облако пестицидов в ряде случаев воздушными потоками может уноситься на большие расстояния от мест обработки или оседать на почву и водоёмы, токсически действуя на людей, непосредственно не контактирующих с этими соединениями. При изучении гигиенических условий применения некоторых пестицидов отмечено загрязнение ими воздуха окружающей зоны, а также накопление этих соединений в почве в течение 6-8 мес.[96,99].

Инсектициды, поступающие в водоёмы, нарушают процессы самоочищения и влияют на кислородный режим воды, тем самым, ограничивают водопользование и ухудшают санитарные условия жизни населения[96].

Диагностика острых и хронических отравлений пестицидами, в частности инсектицидами, выявление ранних изменений в организме представляет значительные трудности. Это обусловлено отсутствием в большинстве случаев специфических признаков интоксикаций и преобладанием стёртых форм отравления с нечётко выраженной симптоматикой. Последнее объясняется преимущественным воздействием малых доз инсектицидов. Диагностика интоксикации затруднена ещё и потому, что в сельском хозяйстве, наряду с отдельными препаратами, широко применяются их смеси. Кроме того, в течение сезона работающие могут подвергаться последовательному воздействию различных веществ, что создаёт опасность комбинированного влияния. Предпосылкой для правильной диагностики интоксикации пестицидами могут служить точное знание природы химического состава, количество и продолжительность воздействия при контакте [15,31,32].

При воздействии химических соединений чрезвычайно важно одновременно учитывать как анамнестические данные, так и объективно выявляемую клиническую симптоматику, сопоставляя их с данными лабораторных исследований.

При острой интоксикации пестицидами в дозах 1/5 и 1/10 от LD50 можно выделить несколько стадий. Так, стадия первичных реакций, в зависимости от уровня токсичности пестицида, длится 3-7 дней и характеризуется появлением первых признаков повреждения, более выраженных на ультраструктурном уровне [16,18,57]. Стадия адаптации резистентности продолжается 7-14 суток в зависимости от индивидуальных особенностей организма и характера токсического действия. Стадии компенсации и декомпенсации развиваются в течение 3-4 месяцев при хронической интоксикации дозами 1/100 и 1/500 от LD50 и характеризуются сочетанием механизмов нарушения и коррекции в соотношении, зависящем от степени токсичности вещества и индивидуальной резистентности организма.

С точки зрения токсического действия ядохимикатов на организм большую опасность представляют ксенобиотики второго типа. Так, высокие дозы ФОС вызывали нарушения в углеводном и энергетическом обмене [71,78], интенсификацию ПОЛ [71,100], что важно учитывать в токсикологических и патофизиологических исследованиях, при выявлении характера воздействия и установлении безвредных для организма уровней воздействия химических средств защиты растений.

Многочисленные исследования [5,46,50] выявили влияние пестицидов практически на все виды обмена веществ. Так, их воздействие приводит к изменению энергетического обмена, проявляющееся нарушениями уровня макроэргов, пировиноградной и молочной кислот, замедлением синтеза нуклеиновых кислот и белка, нарушением углеводного и липидного обменов, интенсивным накоплением метаболитов [78,123].

Установлено также, что воздействие пиретроида дециса приводит к накоплению концентрации ПВК и МК в крови на 25-27% и снижению активности общей ЛДГ в 1,26-1,6 раза [10]. Характерные изменения в углеводном обмене свидетельствуют об усилении аэробного гликолиза и нарушении интенсивности окислительно-восстановительных процессов. Избыток недоокисленных продуктов углеводного обмена способствует метаболическому ацидозу и, следовательно, усилению токсического эффекта пестицида группы пиретроидов - дециса.

Известно, что некоторые пестициды угнетают неспецифическую реактивность иммунитета, что сопровождается снижением комплиментарной активности сыворотки крови и перераспределением сывороточных белков [10].

Обладая широким спектром нейрогуморальных характеристик, данные химические соединения блокируют систему передачи нервных импульсов, стимулируют развитие в период беременности отклонений в тканевой структуре плода [10].

Современные данные свидетельствуют о том, что при любых патологических воздействиях на организм особое место занимают нарушения окислительно-восстановительных процессов с тем или иным развивающимся типом гипоксии. Имеются указания на то, что возникающие при этом местные изменения носят как бы вторичный характер, поскольку ранние проявления первичных нарушений процессов энергообмена обнаруживаются в ЦНС [13]. При воздействии некоторых видов пестицидов отмечается торможение гликолиза и дыхания, нарушение обмена свободных нуклеотидов - АТФ, АДФ, нарушение обмена биогенных аминов [38,78,123].

Известно, что в печени, как в центральном органе детоксикации, происходит метаболизм химических соединений, и клетки печени становятся мишенью, как для самих пестицидов, так и для их метаболитов. В результате этого в печёночных клетках могут происходить изменения от тончайших ультраструктурных до глубоких патологических [129,130]. Они могут быть обратимыми и зависят от дозы и продолжительности действия химического агента.

Имеются многочисленные данные о том, что ксенобиотики даже в пороговых дозах оказывают повреждающее воздействие на функциональную деятельность различных органов и систем, в том числе и на сердечно-сосудистую. Однако, вопросы, касающиеся влияния пиретроидов на сердце, в литературных источниках освещены еще недостаточно.

1.2 Кардиотоксическое действие некоторых видов пестицидов

Сердечно-сосудистая патология сегодня занимает ведущее место в структуре причин смертности населения всего земного шара. Известно, что одной из этиологических причин возникновения заболеваний сердца является токсический фактор [17,44,95].

Клиническими и экспериментальными исследованиями установлено, что длительное воздействие пестицидов на организм увеличивает частоту и усугубляет течение заболеваний сердечно-сосудистой системы - коронарной недостаточности, гипертонической болезни, атеросклероза сосудов [10,16,17,18].

Так, Гадалина И.Д. и соавт. [26] подтверждают возможность поражения сердечно-сосудистой системы даже при действии малых доз пестицидов дитиокарбаматного ряда и развитие наиболее распространенной формы патологии сердца - атеросклероза. При этом важное значение приобретает выявление ранних метаболических сдвигов, предшествующих доклинической, преморбидной стадии атеросклероза, когда отсутствуют выраженные морфологические нарушения. Изменения в сердце могут быть обусловлены нарушением как регуляторной деятельности нервной системы, так и биохимических процессов в миокарде и сосудах. Авторы данной научной статьи пришли к выводам, что:

- сульфокарбатион К при длительном пероральном введении половозрелым животным приводит к нарушению метаболизма сердечной мышцы, изменению сократимости и электролитного баланса

- пестицид вызывает биохимические изменения, характерные для ранних проявлений атеросклероза, причём меньшая доза пестицида дает более выраженный атерогенный эффект.

- при ингаляционном поступлении данного пестицида влияние на сердечно-сосудистую систему животных менее сильное, чем при пероральном.

Проведенные исследования [55,77] показали, что хлорорганические пестициды (ДДТ, линдан и алдрин), фосфороорганические соединения (хлорофос) и производный карбаминовой кислоты (севин) влияют на развитие и течение экспериментально вызываемых патологических состояний сердечно-сосудистой системы - питуитриновой коронарной недостаточности, адренало-кофеинового миокардита и холестеринового атеросклероза. Большей способностью к развитию названных патологических процессов обладают стойкие кумулятивные хлорорганические соединения. Наименее выраженное влияние из всех исследованных пестицидов оказал хлорофос. Установлена определённая зависимость эффекта от дозы пестицидов и времени их воздействия.

Довжанский И.С. и соавт. в своём научном труде [35] пришли к выводам том, что нарушение липидного обмена и связанный с ним ранний атеросклероз могут быть использованы в качестве прогностического критерия развития интоксикационного синдрома, вызванного группой 2,4 -Д (хлорфеноксипроизводные) и фосфороорганическими пестицидами. Группа учёных заключила также, что одним из первых механизмов повреждения клеточных мембран при хронической интоксикации пестицидами являются процессы перекисного окисления липидов при недостаточной антиоксидантной защите.

В работе Щицковой А.П. и соавт. [101] также исследовались атерогенные свойства пестицидов, которые, вызывая характерные закономерности в нарушении липидного обмена, ускоряют развитие и отягощают течение атеросклероза.

Результаты проведенных Михайловой О.Г. и Ивановым Ю.В. биохимических и цитологических исследований [63] при интоксикации пестицидом сумилекс позволяют считать, что выявленные нарушения в обмене липидов и углеводсодержащих биополимеров являются признаками обратимой ранней долипидной стадии атеросклероза, которая при определенных условиях может перейти в атеросклеротический процесс в организме.

В своей статье Абрамов Б.Д. [1] отмечает необходимость ускорения процесса прогнозирования отдаленных последствий действия пестицидов на сердечно-сосудистую систему и своевременного выявления факторов внешней среды в этиологии, патогенезе и профилактике заболеваний. Однако, данная проблема, как подчеркивает автор, не могла быть на том этапе окончательно решенной. Ибо первые признаки кардиотоксического действия малых доз, близких к пороговым, выявляются лишь к 6-8 месяцам от начала эксперимента. При этом патологическое его действие трудно отличить от естественных нарушений, связанных со старением организма животных.

Попович М.И., Голиков М.А. [78,79] в своем научном труде отмечают, что под действием смеси пестицидов происходит значительное уменьшение содержания АТФ в сердцах животных. Авторы констатируют противоречивость исследований о влиянии пестицидов на изолированную фракцию саркоплазматического ретикулума скелетов мышц: одни и те же пестициды в одном случае стимулируют поглощения ионов кальция, в другом - существенно подавляют. Поэтому представляется актуальным изучение функционального состояния системы Ca²⁺ насоса сердца при токсическом воздействии пестицидов [113].

Морфогистохимические и электронно-микроскопические исследования позволили Щицковой А.П. и соав. [101] создать относительно объективную картину состояния элементов сердечно-сосудистой системы с определением дозовой и временной зависимости действия пестицидов. Как показывает практика, при высоких дозах вводимых химических веществ развиваются стереотипные гетерогенные нарушения структуры и функции клеток, сосудистые и микроциркулярные расстройства. При низких дозах пестицидов выявлены различия в особенностях их биологического действия на сердце в зависимости от химического строения препаратов. Снижение активности АТФ, развитие очагового склероза в миокарде, нарушение ультраструктуры миокардиоцитов свидетельствуют об изменениях энергетического баланса в миокарде. Биохимические исследования, проведенные группой авторов, установили рост активности ЛДГ в миокарде на 90-й день интоксикации пестицидом, уменьшение уровня ЛДГ в сыворотке крови, что свидетельствует об определенных нарушениях и перестройке биоэнергетических процессов в кардиомиоцитах.

Анализ состояния ультраструктур миокарда у животных при воздействии большой концентрации пестицидов показал, что миокард функционирует в условиях заметного напряжения энергетических ресурсов. Повреждение митохондриальных мембран (как наружных, так и внутренних) влечет за собой нарушения окислительного фосфорилирования, утилизации АТФ миофибриллами и др. Эти изменения, в свою очередь, приводят к снижению энергии сокращения миофибриллярного аппарата, нарушению возбуждения, связанного с сокращением и расслаблением миокарда. Энергетическая недостаточность компенсируется за счет развития гигантских форм митохондрий, гипертрофии миофибрилл [101].

Иваницкий В.А. [37] пришел к выводу, что адаптационная перестройка симпато-адреналовой системы, обеспечивающая приспособление миокарда к длительному влиянию пестицидов, в то же время может вызывать нарушение трофических процессов в ткани.

Вендило М.В. [18] в своей научной статье сделал выводы о том, что хроническая интоксикация пестицидами вызывает изменения ультраструктуры миокарда экспериментальных животных; в основе механизма действия препаратов лежат процессы, которые следует расценить как капилляро-паренхиматозную дистрофию, обусловленную нарушением сосудисто-тканевых отношений, изменением гематопаренхиматозного барьера и внутриорганных гемодинамических процессов; выраженность изменений в миокарде зависит от дозы препарата.

Ахмерова А.А. [8] отмечает, что наряду с патологическим процессом в паренхиме, наблюдались изменения в строме органов в виде клеточных инфильтратов в сердце. Малые дозы и концентрации пестицидов не вызывали клинических проявлений отравления. В то же время в организме животных обнаружено возникновение защитно-приспособительных реакций, а при длительных опытах - и морфологических изменений. При действии малых доз и концентраций изменения имели неспецифический и обратимый характер.

Коллектив авторов научной статьи [7,10,103] подтверждает факт влияния пиретроидов, в частности дельтаметрина, на сердечно-сосудистую систему через периферическую нервную систему. Пестициды увеличивают высвобождение катехоламинов из синаптических нервных окончаний; обладают прямым положительным инотропным действием на миокард; способны проникать через плацентарный барьер, вызывая структурно-метаболические нарушения в тканях плаценты, оказывая токсическое действие на плод.

В связи с вышеизложенным, формирование единой политики, направленной на повышение урожайности хлопчатника, основной сельскохозяйственной культуры Узбекистана, должно основываться на надежной защите растений от вредителей, болезней и сорняков путем применения высокоэффективных, малотоксичных, экологически безвредных химических и биологических средств.

В настоящее время в сельско-хозяйственном производстве в качестве инсектицидов широко применяют синтетические аналоги природных пиретринов - пиретроиды.

Несколько слов о том, что представляют собой пиретроиды [51].

Пиретроиды, синтетические эфиры хризантемовой кислоты, аналоги пиретринов. Получают взаимодействием хлорангидрида хризантемовой кислоты со спиртовой компонентой в присутствии третичных аминов или переэтерификацией этилового спирта хризантемовой кислоты в присутствии натрия. Наиболее токсичные для насекомых соединения найдены среди эфиров циклопентенолонов, замещенных бензиловых спиртов и N-оксиметилимидов. На основе пиретроидов выпускаются препараты : аллетрин, фуретрин, циклетрин, бартрин, диметрин, неопинамин, которые применяют в основном для борьбы с бытовыми насекомыми, обычно в виде аэрозолей.

Пиретрины - смесь сложных эфиров (+)-транс-хризантемовой и (+)-транс-пиретриновой кислот с замещенным (+)-пиретролоном; инсектициды, содержащиеся в некоторых видах ромашки вида пиретрум. Оптически и геометрически активные жидкие бесцветные высококипящие соединения, легко гидролизующиеся щелочью, устойчивы в слабокислой среде, легко разлагаются при действии света, влаги и воздуха. Токсичность пиретринов ЛД50 перорально для крыс 200-2600мг/кг. Сопутствующие вещества удаляют осаждением, адсорбцией на угле или вымораживанием с последующей фильтрацией. Технический 25%-ный экстракт содержит 10% пиретрина I, 9% пиретрина I I, 3% цинерина I, около 3 % цинерина I I и следы жасмолинов. Соотношение компонентов в смеси и токсичность для теплокровных животных могут изменяться в зависимости от сорта цветков, условий роста растения, обработки во время экстрагирования или отгонки растворителя.

Несмотря на высокие коэффициенты видовой чувствительности, нельзя исключать возможное вредное воздействие пиретроидов на организм человека, в частности, на сердечно-сосудистую систему.

В сельском хозяйстве контакт с пестицидами бывает особенно интенсивным и возникает необходимость в более целенаправленном и систематическом медицинском осмотре за состоянием здоровья работающих с использованием в основном специфических методов лабораторной диагностики. При обобщении литературных данных интоксикации пестицидами нам удалось выяснить токсическое действие их на организм. Из этого вытекает важность изучения общих механизмов токсичности, которые, в конечном счете, определяют характер патологического процесса и клиническую картину отравления. Имея достаточно подробное представление о механизме биологического действия пестицидов на организм, познав механизмы токсического действия данного химического вещества, мы можем вплотную подойти к разработке патогенетического обоснования профилактики, диагностики и лечения вызванных интоксикаций.

Учитывая всё вышеизложенное, применение химических средств в народном хозяйстве порождает необходимость выявления и внедрения в сельскохозяйственную практику новых избирательных инсектоакарицидов, эффективных для насекомых в малых дозах и малотоксичных для теплокровных животных и человека, а также разработку профилактических мероприятий, направленных на безопасное применение пестицидов.

В этом плане перспективным является инсектоакарицид Вантекс, краткая физико-химическая характеристика которого представлена в следующем разделе.

1.3 Физико-химические свойства и токсикологическая характеристика Вантекса

Препарат относится к пестицидам нового поколения - пиретроидам. Широко используется в хлопководстве Республики Узбекистан в качестве инсектоакарицида.

Вантекс 60г/л предлагается фирмой Дау АгроСаенс (США).

Действующее вещество: гамма-цихалотрин, получают из инсектицидно-активных изомеров лямбда-цихалотрина.

Химическое название: циклопропанкарболовая кислота, 3-(2-хлоро-3.3.3-трифторо-1-пропенил)-2,2-диметил,ционо-(3-феноксифенил)метиловый эфир. Молекулярная масса 449,854. Химически чистый гамма-цихалотрин представляет собой твёрдое вещество белого цвета без запаха с температурой плавления: 55,6°С, давление паров 3,45х10^-7 Па (при 20^оС). Растворим в воде, органических растворителях. Не огнеопасен, не взрывоопасен, не окисляется. Температура самовоспламенения 398^оС.

Физико-химические свойства препаративной формы.

Вантекс содержит 60 г/л действующего вещества, остальное - сокомплемент и растворитель. Представляет собой жидкость бежевого цвета с запахом ароматического растворителя. Не взрывоопасна, точка возгорания больше 93⁰С, температура самовозгорания больше 400^оС, рН 5,57. Относительная плотность 1,014 г/мл при 20⁰С. Продукт изготовлен на основе воды и сам является водяной суспензией в микрокапсулах.

Рекомендуемая норма расхода и способ применения: наземное опрыскивание в период вегетации.

Метаболизм в объектах окружающей среды.

Поведение препарата в почве происходит тремя путями:

- фотодеградацией, когда при опрыскивании почвы лямбда-цихалотрин быстро разлагается с периодом полураспада 2 дня при искусственном освещении и 30 дней - при естественном освещении;

- микробиологической деградацией, при которой лямбда-цихалотрин быстро биодеградирует в различных типах почв с периодами полураспада 22 и 82 дня соответственно. Основные пути деградации - гидролиз и гидроксилация. Первоначальные продукты деградации разлагаются в аэробных условиях в почве и минерализуются до СО2;

- химической деградацией, являющейся в основном результатом микробиологической активности.

Лямбда-цихалотрин практически не мигрирует в почве за счёт прочного закрепления почвенно-поглощающим комплексом. Опыты, проведенные на 4-х типах почв (песчанная, супесчанная, суглинистая, глинистая), показали отсутствие вертикальной миграции лямбда-цихалотрина в полевых условиях.

Поведение в воде.

Проведенное исследование метаболизма лямбда-цихалотрина на хлопчатнике препарата в сельхозкультурах происходит первоначально из-за разложения эфирных связей. Кроме того, происходит фотообусловленная изомеризация.

На основании экспертизы научного досье фирмы установлено, что Вантекс по параметрам острой токсичности при внутрижелудочном поступлении относится к веществам 3 класса опасности (СанПиН № 0059-96).

Гигиенические нормативы и регламенты применения препарата:

Допустимая суточная доза (ДСД)- 1,2мг/кг.чел.сутки или 0,04мг/кг.

ПДК в воде водоёмов-0,001мг/л.

ПДК в воздухе рабочей зоны-0,1мг/м.куб.

ПДК средне-суточное в атмосферном воздухе населённых мест 0,003мг/м^3.

Срок выхода на обработанное поле - 10суток.

Санитарно-защитная зона (СЗЗ)-100метров.

При изучении кумулятивных свойств препарата (методом субхронической токсичности по Лиму) в условиях многократного введения его белым крысам показали, что в связи с отсутствием гибели животных препарат относится к веществам, не обладающим материальной кумуляцией, но установлены физиологические и биохимические сдвиги ряда показателей. Отмеченные изменения позволили заключить, что пиретроид обладает кумулятивными свойствами функционального характера.

При изучении сенсибилизирующих свойств Вантекса выявлено, что препарат относится к веществам, не обладающим аллергенными свойствами.

Результаты полученных исследований по изучению отдалённых эффектов действия Вантекса показали, что пестицид не оказывает гонадотоксического, эмбриотропного и мутагенного эффектов действия на организм белых крыс.

2. Материалы и методы исследования

2.1 Характеристика экспериментального материала

На основании экспертизы научного досье фирмы установлено, что Вантекс по параметрам острой токсичности при внутрижелудочном поступлении относится к веществам 3 класса опасности (СанПиН № 0059-96). Средне-смертельная доза препарата (LD50), установленная для крыс, составляет 820 мг/кг массы тела.

Исследование проведено на 336 половозрелых белых крысах- самцах массой 180-200 грамм, содержащихся на обычном рационе вивария. Проведено 2 серии экспериментов: острая и хроническая. Для воспроизведения модели интоксикации была использована препаративная форма Вантекса, которая вводилась внутрижелудочно. В каждой серии эксперимента животные были поделены на 4 группы, трем из которых препарат вводился в различной дозировке, четвертая, являясь контрольной, получала 0,9% раствор NaCl.

В первой серии (острой) препарат вводился внутрижелудочно однократно в дозах 15 от LD50 (что соответствует 164 мг/кг.), 110 от LD50 (82 мг/кг) и 150 от LD50 (16,4 мг/кг) и 4 группа - контроль. Забой производился через 2, 24, 48 и 72 часа, а также на 7 и 14 сутки.

Во второй серии экспериментов (хронической) белые крысы получали пестицид внутрижелудочно, ежедневно, 6 раз в неделю на протяжении всего опыта в дозах 1/100 (8,2 мг/кг), 1/500 (1,64 мг/кг), 1/1000 (0,82 мг/кг) от LD 50 и 4 группа служила контролем. Забой производился через 14 суток, 1 месяц, 2, 3, 4 месяца и также через 1 месяц после последней затравки.

Материалом для исследования явилась ткань миокарда и кровь.

В установленные сроки животных забивали под легким эфирным наркозом декапитацией, в холодной комнате при температуре воздуха 0+2°С.

Таблица 2.1 Объем проведенных исследований

№	НАИМЕНОВАНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ	КОЛИЧЕСТВО ПРОВЕДЕННЫХ АНАЛИЗОВ
		В КРОВИ	В ТКАНИ МИОКАРДА
1.	Диеновые конъюгаты ( ДК )	168	24
2.	Триеновые конъюгаты ( ТК )	168	24
3.	Малоновый диальдегид ( МДА)	168	24
4.	Супероксиддисмутаза (СОД )	168	-
5.	Каталаза	168	-
6.	Молочная кислота ( МК )	168	24
7.	Пировиноградная кислота ( ПВК )	168	24
8.	Лактатдегидрогеназа (ЛДГ )	168	-
9.	б-Гидроксобутират-дегидрогеназа (б-ГБД )	168	-
10.	Средне-молекулярные пептиды (СМП)254	168	-
11.	Средне-молекулярные пептиды (СМП)280	168	-
12.	Парамецийный тест ( ПТ )	168	-
13.	Аланин-аминотрансфераза (АлАТ )	168	-
14.	Аспартат-аминотранфераза (АсАТ )	168	-
15.	Аденозин-монофосфат (АМФ)	-	168
16.	Аденозин-дифосфат (АДФ)	-	168
17.	Аденозин-трифосфат (АТФ)	-	168
Всего	2352	624
Итого проведено анализов 2976

2.2 Методы исследования

Определение интенсивности процесса ПОЛ в сыворотке крови и митохондриях сердца.

Об интенсивности процесса перекисного окисления липидов в сыворотке крови и ткани сердца экспериментальных животных судили по содержанию диеновых и триеновых конъюгатов, а также малонового диальдегида. Содержание ДК и ТК в сыворотке крови определяли методом Гаврилова В.Б. и Мишкорудной М.М.[24].. Принцип метода заключается в экстракции ДК и ТК смесью гептан-изопропанола в кислой среде с последующим измерением оптической плотности на спектрофотометре СФ -26 при длине волны 232 нм. Содержание конъюгатов рассчитывали в относительных единицах на мл сыворотки крови и на мг митохондриального белка..

Содержание МДА в сыворотке крови определяли по методу Л.И. Андреевой и соавт.[3]. Расчёт продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой производили с учётом коэффициента молярной экстинкции МДА, равного 1, 56 · 10⁵ моль

А = Еоп · 10⁶ · 4 мл./Е оп.· 85,47=1,56 · 10⁵ · 0,3 мл.

где А - содержание МДА (в мкмоль/л или нмоль/мл), 4 мл - объём бутанольной фазы, 0,3 мл - объём сыворотки и пересчитывали на мл сыворотки крови и на мг митохондриального белка.

Определение активности ферментов антиоксидантной системы

Определение активности супероксиддисмутазы в крови.

Принцип метода основан на способности фермента СОД тормозить реакцию восстановления нитрозамина синего в щелочной среде [65].Снимали на ФЭК при длине волны 535-545 нм в кювете толщиной 10 мм. Расчёт проводили по проценту торможения (Т% восстановления нитрозамина синего):

Т% = Ек-Ео / Ек 100

Где Ек - показания спектрофотометра контрольной пробы.

Ео - показания спектрофотометра опытной пробы.

Определение активности каталазы в крови

Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибденовой кислоты стойкое окрашивание . Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контроля.

Активность каталазы в крови (Е) определяли по формуле:

Е=(А хол - Аопыт) · 22,2мл.

Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови.

Активность ферментов аспартат-аминотрансферазы (АсАТ) и аланин- аминотрансферазы (АлАТ) определяли с помощью тест наборов фирмы ''Lachema'' (Чехия). Принцип метода [132] заключается в том, что АлАТ катализирует реакцию между L-аланином и 2-оксоглутаматом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты, а АсАТ катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаматом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалоацетат.

Исследование степени эндогенной интоксикации

Об эндогенной интоксикации в организме экспериментальных животных судили по уровню среднемолекулярных пептидов (СМП) и парамецийному тесту (ПТ).

Определение содержания СМП проводили методом Габриэляна Н.И. и соавт. [23]. Предлагаемый способ заключается в осаждении 10 % трихлоруксусной кислотой грубо дисперсных белков с последующей детекцией элюирующей фракции при длине волны 254 (общая фракция) и 280 нм (СМП, сохраняющие ароматические аминокислоты). Уровень «средних молекул» во всех сериях исследований выражали в условных единицах, количественно соответствующих данным экстинкции, на мл сыворотки крови.

Определение степени токсичности сыворотки крови определяли по парамецийному тесту методом Пафомова Г.А. и соавт. [72]. Он заключается в том, что в меланжере для эритроцитов смешивается 0, 01 мл сыворотки крови и 0, 01 мл взвеси, содержащей от 8 до 10 парамеций. Определяли время гибели половины парамеций и выражали его в секундах.

Определение показателей углеводного обмена

Определение содержания молочной кислоты. Содержание молочной кислоты (МК) в сердечной ткани определяли по методу Хохорста [127]. Принцип энзиматической реакции состоит в том, что в присутствии лактатдегидрогеназы (ЛДГ) молочная кислота переходит в пировиноградную (ПВК), причем связывание образующегося в ходе реакции пирувата гидразин-глициновым буфером свидетельствует о полном окислении лактата. Образование восстановленной формы НАД, эквимолярное количеству окисленного лактата, регистрировали на спектрофотометре «Hitachi-330» (Япония) при длине волны 340 нм. Количество МК выражали в мкмолях на 1 г. ткани.

Х= ДЕ V K/6,22

где V = 2, 45; К = 22,5

Определение содержания пировиноградной кислоты. Содержание пировиноградной кислоты (ПВК) в сыворотке крови, миокарде определяли по методу Цоха и Лампрехта [116]. Принцип ферментативной реакции состоит в том, что в присутствии ЛДГ пируват восстанавливается до лактата по реакции:

Пируват+ НАДН+ Н⁺лактат + НАД⁺

Количество использованного в реакции пирувата эквивалентно количеству НАДН, убыль которого регистрировали на спектрофотометре «Hitachi-330», при длине волны 340 нм. Количество ПВК выражали в мкмолях на 1 г ткани.

Х= ДЕ · V · K/6,22

V = 2,1, К = 12, 44

Определение активности лактатдегидрогеназы и б-гидроксобутират- дегидрогеназы

Определение активности ЛДГ и -ГБД проводилось при помощи тест наборов OY MEDIX AB, соответствующие рекомендациям Скандинавского комитета по ферментам[149]. Из пяти лактатдегидрогеназных изоферментов ЛД1-ЛД5 в сердечной мышце имеются ЛД1-ЛД2. Все пять изоферментов имеют одинаковое сродство с пируватом, при этом ЛД1 и ЛД2 имеют самое большое сродство с 2-оксимасляной кислотой. Характерную для сердца концентрацию изоферментов ЛД1-ЛД2 определяли измерением активности ЛД, применяя 2-оксибутиратную кислоту в качестве субстрата (ГБД определение). Определяли уменьшение абсорбции в минуту при 340 нм.

Вычисляли ЛД и ГБД активность с помощью формулы реакции:

7235 · ДА340/мин=(U/I) МЕ/л, где

ДА340 - коэффициент молярной абсорбции, равный 6220 л мол -1см1-

Определение содержания компонентов адениннуклеотидной системы в сердечной ткани

Содержание компонентов адениннуклеотидной системы в ткани сердца определяли общепринятыми стандартными методами, используя тест-наборы фирмы Boehringer-Mannheim (ФРГ), на основе метода Лампрехта и Тротшольда [132]

Х=ДЕVК/6,22,

где ДЕ - изменение оптической плотности пробы, вызванное использованием АТФ в сопряженной системе ферментативных реакций; ДЕ=Е4-Е3; V-конечный объем пробы в кювете; К- коэффициент разведения пробы по отношению к 1 г. ткани, в данном случае равный 41,6; 6,22- коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов.

По сумме содержаний показателей адениннуклеотидов высчитывали их суммарный пул (УAd). Также определяли относительный аденилатный заряд по формуле:

ОАЗ = АТФ+ 1/2АДФ/ АТФ+АДФ+АМФ

что соответствует доле адениннуклеотидов, содержащих макроэргический фосфат. Исследования проводили на спектрофотометре Hitachi - 330 (Япония). Данные выражали в мкмоль г / ткани.

Морфологическое исследование сердечной ткани.

Для светооптических исследований сердечную ткань экспериментальных животных фиксировали в 10%-ном растворе формалина на буферном фосфате (рН=7,3) и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологический анализ срезов сердца проводили на бинокулярном микроскопе фирмы «Leica» (Германия).

Для электронно-микроскопического исследования взятые у животных органы промывались в изотоническом растворе KCl, после чего ткани резались на кусочки размером 1 ммі, погружались в фиксирующий раствор глютарового альдегида. Фиксируемые ткани помещались в холодильник на 1 сутки. После тщательной промывки в нескольких сменах фосфатного буфера (рН - 7,4) проводилась вторичная фиксация материала в 1%-ой осмиевой кислоте (OsO4). Фиксированную ткань обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, абсолютном спирте и ацетоне. Образцы заливали в эпоксидную смесь эпонаралдита и полимеризовали в термостате при температурах 37; 45; 56 С. Из полученных блоков на ультрамикротоме LKB (Швеция) готовили ультратонкие срезы, которые поэтапно контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Срезы, монтированные на сеточках, просматривали в электронном микроскопе JEM 100 SX (Япония) при ускоряющем напряжении в 80-100 kV.

...