В 2013 году заболеваемость злокачественными новообразованиями мужчин в России составила 369,0 на 100 000, а женщин 377,3 на 100 000 [2]. Смертность в 2013 году от злокачественных новообразований среди мужчин составила 231,3 на 100 000, а среди женщин - 175,2 на 100 000.

Распространенность злокачественных новообразований на 100 000 населения в 2013 году составила 2164, в том числе злокачественных новообразований желудка - 94,3; поджелудочной железы - 10,8; трахеи, бронхов и легких - 88,7; молочной железы - 392, 5 [3].

Выявляемость опухолевых процессов в I-II стадии от числа больных с впервые в жизни установленным диагнозом злокачественного новообразования в России в 2003-2013 гг. выросла с 42,2% до 50,8% [3]. Удельный вес больных с IV стадией опухолевого процесса несколько снизился с 23,6% до 21,1%.

Летальность больных в течение первого года с момента установления диагноза злокачественного новообразования в России в 2003-2013 гг. уменьшилась с 33,8% до 25,3%. В 2013 году наблюдались 65,5% больных более 5 лет от числа больных, состоявших на учете, а в 2003 году этот показатель был равен 59,7% [3].

Современные достижения науки и техники существенно расширили возможности распознавания злокачественных новообразований (ЗНО). Тем не менее, несмотря на широкий арсенал вспомогательных методов исследования врач, зачастую, по-прежнему испытывает существенные затруднения в постановке правильного диагноза, что в конечном итоге отражается на результатах лечения.

Именно на этапах обследования больных в поликлиниках и стационарах общей лечебной сети возникает наибольшее количество ошибок в диагностике, следствием которых является задержка и, нередко невозможность оказания им радикальной помощи [12].

Другая основная причина запущенности онкологических больных, обусловлена скрытым атипичным течением болезни. Серьезные трудности возникают при распознавании опухоли, развивающейся на фоне другого патологического процесса. До сих пор, например, значителен удельный вес диагностических ошибок при распознавании рака легкого у больных, страдающих хроническим туберкулезом этого органа [4].

Одним из основных критериев оценки диагностического компонента помощи онкологическим больным в учреждениях общей лечебной сети является показатель запущенности, который в 2010 году в России составил 22,3%, что конечно неадекватно современным возможностям медицины [13].

Неуклонным как в целом мире, так и в России остается рост злокачественных новообразований, например, в Российской Федерации в 2010 году впервые в жизни выявлено 516874 случая злокачественных новообразований, прирост данного показателя по сравнению с 2009 годом составил 2,4 % [13].

Расчеты, проведенные ВОЗ, показывают, что в 2008 году в мире количество всех заболевших онкопроцессами различной локализации составило 12,4 млн. человек, а умерших - 7, 6 млн. Если показатели заболеваемости останутся на прежнем уровне, то к 2030 году количество заболевших составит 20,0 млн., умерших - 12,9, а при условии ежегодного однопроцентного роста - уже 26,4 и 17,0 млн., т.е. вырастут на 213, 0 % и 223,0 % соответственно[14].

Учитывая тот факт, что морфологическая верификация диагноза рака до начала лечения является непременным правилом онкологической диагностики, а также то, что прирост показателя морфологического подтверждения наличия ЗНО в 2010 году в РФ имеет всего 0,8 %, следует рассматривать цитологическое исследование как одно из важнейших в комплексном обследовании больных.

Основной тенденцией в развитии современной онкологии остается стремление к выявлению злокачественных опухолей на раннем этапе их развития, что требует дальнейшего совершенствования методов диагностики. Важность подобного направления исследований вполне понятна, таккак только при раннем выявлении ЗНО существующие на сегодняшний день методы лечения могут привести к наибольшему успеху. Так, по данным Национального центра санитарного просвещения населения РФ, самая высокая скорректированная выживаемость (95%) отмечена при I стадии процесса. Диагностика ЗНО во II стадии процесса снижает 5-летнюю выживаемость, которая составляет 79 %. Диагностика опухолей в III стадии процесса дает 55 %. Диагноз в IV стадии - это вероятность прожить 5 лет у 14,6% всех онкологических больных. Кроме того, высока стоимость лечения и реабилитационных мероприятий. Наименее затратным является лечение онкологических больных в I стадии, лечение больных во II стадии стоит в 3,2 раза дороже, в III стадии - в 5 раз и в IV стадии - в 5,5 раза.

Таким образом, неудовлетворительные результаты диагностики и как следствие лечения больных со ЗНО до настоящего времени остаются актуальными вопросами клинической онкологии.

Новые подходы, решения данной проблемы кроятся и в общепринятых методах исследования, например, в цитологическом. Предлагаемый метод, который описывается в данной работе, называется гемофильтроцитологическое исследование венозной крови онкологических больных и заключается в выделении с помощью микрофильтрации из крови данных больных циркулирующих раковых клеток (ЦРК) и цитоморфологическом их описании с целью установления диагноза.

По современным данным, канцерогенез представляет собой многоуровневый, многошаговый процесс, в котором многочисленные экзо-, эндогенные и наследственные факторы, являясь носителями прямых и косвенных канцерогенов и (или) их индукторами, изначально влияют на все клетки, ткани, органы и системы человеческого организма, приводя через гено- и негенотоксические механизмы к изменениям, мутациям молекулярно- генетического аппарата клетки и ее последующей злокачественной трансформации [15-18].

В настоящее время выделяют три фазы взаимоотношения опухоли и иммунной системы: фаза иммунологического надзора, равновесия и ускользания. Каждая из них характеризуется определенными иммунологическими сдвигами и в большинстве случаев коррелирует со стадией заболевания [19-24]. Фаза иммунологического надзора характеризуется появлением единичных опухолевых клеток, которые распознаются и элиминируются компонентами врожденного и адаптивного иммунитета. В подавляющем большинстве опухолевых клеток наблюдается постоянная активность сигнальных каскадов, сообщающих о различных нарушениях клеточного метаболизма. В нормальных клетках такие сигналы приводят к остановке пролиферации и запуску репаративных процессов, а в случае невозможности последних - к активации программируемой клеточной гибели. Инактивация в опухолевых клетках белка р53 и других молекул, участвующих в реализации остановки клеточного цикла и апоптоза, приводит к отмене этих событий, однако не прекращает рассылку сигналов о нарушениях [25].

Одним из последствий активации данных сигнальных каскадов является экспрессия на поверхности клеток, так называемых стресс-индуцированных молекул MICA и MICB, относящихся к семейству неканонических молекул гистосовместимости Ic класса [26,27]. В частности, показано, что экспрессия этих молекул активируется в результате повреждающих ДНК воздействий [304], а также в результате аномального пролиферативного сигнала, возникающего при активирующих мутациях в киназных доменах цитоплазматической части рецепторов ростовых факторов [27].

Представленные на клеточной поверхности стресс-индуцированные молекулы распознаются рецептором NKG2D, который несут все NK-клетки, а также большинство гдТ-лимфоцитов и часть CD8=бвТ-лимфоцитов [28-32]. Этот рецептор лимфоцитов не имеет собственных сигнальных последовательностей в цитоплазматической части, но функционирует в связи с адаптерными молекулами DAP10 [33-35]. Адаптерные молекулы воспринимают импульс, возникающий при связывании рецептора NKG2d на поверхности лимфоцитов со стресс-индуцированными молекулами на поверхности клеток-мишеней, и осуществляют дальнейшую передачу сигнала, который индуцирует цитотоксическое действие лимфоцита [36-39]. Таким образом, экспрессия стресс-индуцированных молекул должна приводить к иммунологическому уничтожению трансформированной клетки.

Итогом первой фазы иммунного ответа на опухоль является уничтожение большинства опухолевых клеток с сохранением части опухолевых клеток, приобретающих способность в той или иной степени контролировать развитие иммунного ответа. Совместное воздействие TGF-в1 и VEGF инициирует формирование опухолевой стромы, необходимой для обеспечения трофики опухолевых клеток, иммуносупрессивного действия и поддержки процесса метастазирования [40-43]. Таким образом, помимо уничтожения опухолевых клеток, под действием иммунной системы происходит формирование опухолевой стромы необходимой для прогрессии всех солидных опухолей. В элиминации опухолевых клеток в фазе иммунологического надзора принимают участие натуральные киллеры (NK), натуральные киллеры с Т-клеточным рецептором (NKT), гамма-дельта Т-клетки (гд-Т), макрофаги и гранулоциты [44-46]. NK-клетки играют ключевую роль в неспецифической элиминации опухолевых клеток [47-48].

Фаза равновесия характеризуется интенсивным ростом опухоли и активацией процессов ангиогенеза. На данном этапе развития взаимодействия опухоли и иммунной системы в опухоль мигрируют предшественники дендритных клеток и незрелые Т-лимфоциты как CD4+, так и CD8+фенотипа [49]. В микроокружении опухоли появляются дендритные клетки и макрофаги. Ключевым моментом функционирования адаптивного иммунитета является презентация антигена антиген-презентирующими клетками (АПК), в роли которых в абсолютном большинстве случаев выступают дендритные клетки (DC) [50]. Дендритные клетки - это высокоспециализированная субпопуляция клеток, основной функцией которых является поглощение, процессинг и презентация антигенов в составе молекул главного комплекса гистосовместимости в комбинации с ко-стимулирующими молекулами [51-54]. Клинически опухоль чаще всего проявляет себя в виде локальных форм. В этот период иммунологические реакции аналогичны таковым в фазе надзора, однако процессы канцерогенеза превалируют над защитными механизмами. В связи с этим наблюдается постепенное увеличение объема опухолевой массы.

Вполне вероятно, что на данном этапе определяется дальнейшая последовательность взаимодействия опухоли и иммунитета: если активация АПК происходит физиологично [55,56], то существует достаточно высокая вероятность того, что дальнейшее развитие иммунного ответа вызовет ремиссию опухолевого процесса. Если же влияние опухоли модифицирует созревание АПК [57], то формируемый иммунный ответ будет неполноценным и не способным препятствовать канцерогенезу [58,59]. Реализация того или иного сценария зависит от многих аспектов, наиболее существенными из которых являются общее состояние иммунной системы и гистологическое происхождение опухоли. Факторами плохого прогноза является пожилой возраст, иммуносупрессивные вмешательства в анамнезе, происхождение новообразования из нервной ткани [60].

Фаза ускользания характеризуется сдвигом цитокиновой регуляции в сторону иммуносупрессии, дисбалансом эффекторных и супрессорных иммунокомпетентных клеток, наличием молекулярных дефектов на стадиях распознавания, презентации антигена и трансдукции сигнала внутрь клетки.

Цитокины - регуляторные пептиды, продуцируемые клетками организма [48,61-65]. Осуществляя свои функции в микроокружении опухоли, цитокины способствуют как созреванию и активации иммунокомпетентных клеток, так и формированию иммунологической толерантности. В настоящее время известно более 20 цитокинов, вовлеченных в этот процесс [16,66-72]. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) - наиболее важный проангиогенный фактор, подавляет созревание дендритных клеток, а также через генерацию незрелых миелоидных клеток (iMC) Т-клеточную активность [73-76]

Главное «поле битвы» иммунной системы и опухоли - ее микроокружение. В фазе ускользания отмечается увеличение доли незрелых дендритных клеток и супрессорных Т-регуляторов в общей популяции. Зрелые дендритные клетки экспрессируют на своей поверхности CD40, CD80, CD83, CD86 и характеризуются высоким уровнем продукции IL-12. Под действием VEGF, IL-6, TGF-в, IL-10, COX-2, PGE2, ганглиозидов, находящихся в микроокружении опухоли, блокируется дифференцировка и созревание дендритных клеток, что делает невозможным формирование адекватного иммунного ответа [77-81].

Регуляторные Т-клетки относятся к системе адаптивного иммунитета и созревают из незрелых Т-клеток. Они подавляют иммунный ответ путем регуляции функций эффекторных клеток. В настоящее время выделяют 3 типа регуляторных клеток: CD4+CD25+Treg, Th3, Tr1. Кроме того, имеются супрессорные клетки с фенотипом CD8+, однако их функция не до конца понятна. Наибольшее значение в иммуносупрессии у онкологических больных имеют CD4+CD25+ Treg клетки. CD4+CD25+Treg имеют костномозговое происхождение. Высокая концентрация этих клеток выявляется у больных раком молочной железы, колоректальным раком, раком легкого, поджелудочной железы. Образуются они из тех же клеток - предшественников, что и Т-хелперы под влиянием избыточных концентрацией TGF-в, IL-10 и VEGF. Механизм супрессивного действия CD4+CD25+Treg клеток связан с секрецией супрессорных цитокинов (TGF-в, IL-10), с «конкуренцией» в отношении лигандов (IL-2), индукцией толерантности дендритных клеток, и, в ряде случаев, их прямым лизисом [82-89].

Третьей характерной особенностью фазы ускользания является наличие молекулярных дефектов дендритных клеток и лимфоцитов. В частности, обнаружено снижение уровня экспрессии МНС I и II, СD80, CD86, CD154 на поверхности антиген-презентирующих клеток из опухоли, а также снижение уровня экспрессии о - цепи ТСRT-хелперов [52,90-94].

Наиболее ясное обобщение признаков характерных для злокачественного роста предложено в работе основоположников молекулярной онкологии, Doglas Hanahan и Robert Weinberg, представлено на страницах журнала Cell в 2000 г. [9]. По мнению данных авторов, все или почти все опухоли характеризуются несколькими неотъемлемыми чертами, перечисленными ниже.

1. Самодостаточность в отношении сигналов пролиферации, связанная с аутопродукцией факторов роста, соответствующих рецепторов или других компонентов сигнального промитотического каскада. Существенно, что нормальная клетка никогда не делится сама по себе; для запуска пролиферативной программы необходим сигнал извне, доставляемый эндокринной системой(гормоны), паракринными механизмами (тканевые факторы роста) или через синаптические окончания нейронов (нейротрофика). Следовательно, увеличение количества клеток в норме происходит лишь в том случае, если многоклеточный организм-хозяин продуцирует сигналы к наращиванию клеточной массы. Трансформированная клетка продуцирует подобные сигналы сама для себя, вне зависимости от потребностей организма, что и приводит к безостановочному делению опухолевого клона[47,50,96-100].

2. Потеря чувствительности к сигналам, сдерживающим процесс пролиферации, обусловленная инактивацией супрессорных (антимитотических) белков. Клоны, обладающие аномальной способностью к аутостимуляции пролиферативного каскада, могут возникать в организме достаточно часто, что связано постоянным мутационным процессом в клетках организма. В случае появления клеток со способностью к аутокринной стимуляции деления организм-хозяин продуцирует сдерживающие сигналы, доставляемые к клеткам в виде гуморальных факторов и направленные на прекращение пролиферации. Трансформированные клетки, в отличие от нормальных, утратили способность к восприятию таких сигналов. Подобная нечувствительность к супрессорным воздействиям может происходить в результате утраты соответствующих мембранных рецепторов или других компонентов сигнальных каскадов, участвующих в проведении экстрацеллюлярного сигнала к клеточному ядру [101-107].

3.Замедление процессов программируемой клеточной гибели, опосредованное дисбалансом биохимической регуляции процессов апоптоза. Наиболее изученная разновидность программируемой клеточной гибели - апоптоз - обеспечивает «плановую» элиминацию клеток; этот процесс особенно выражен в тканях с высокой интенсивностью обновления клеток - эпителии желудочно-кишечного тракта, кожи, крови. Помимо этого, клетка способна распознавать собственные повреждения ДНК и другие биохимические изменения, представляющие угрозу с точки зрения злокачественной трансформации. При появлении подобных нарушений запускается «суицидная» программа, приводящая к самоуничтожению потенциально опасных клеток. Раковые клетки, в отличие от нормальных, утратили способность к самоэлиминации, что позволяет им сохранять жизнеспособность, несмотря на наличие повреждений ДНК и ассоциированных с гиперпролиферацией стрессовых условий существования [108-112].

4. Неограниченный репликативный потенциал клеток (преодоление «лимита Хэйфлика»), сопряженный с реактивацией экспрессии фермента теломеразы, и, как следствие, отсутствием физиологического укорачивания теломер. В 1961-1962 гг. американский ученый LeonardHayflick установил, что нормальные клетки могут делиться не более 100-150 раз, после чего весь клон (т.е. исходная клетка и ее потомки, обладающие соответственно меньшим резервом возможных делений) утрачивает возможность к самовоспроизведению. Неограниченный репликативный потенциал опухолевых клеток принято объяснять активацией фермента теломеразы, которая компенсирует наблюдаемое в ходе клеточного деления физиологическое укорочение концевых участков хромосом[113-119].

5.Стимуляция процессов ангиогенеза в опухоли, вызванная экспрессией трансформированными клетками ангиогенных факторов и направленная на удовлетворение повышенных потребностей быстроделящихся неопластических компонентов в оксигенации. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что опухолевые клетки могут сформировать клинически распознаваемое новообразование лишь в том случае, если они продуцируют факторы неоангиогенеза [54,120-126].

Таким образом, формирование сосудистой сети опухоли происходит не само по себе, а за счёт активных, управляемых трансформированными клетками биологических процессов. К настоящему времени идентифицированы десятки факторов, провоцирующих или, наоборот, ингибирующих ангиогенез [127-129].

6. Способность к инвазии и метаcтазированию, ассоциированная с продукцией опухолью гистолитических ферментов (протеаз), а также факторов, угнетающих локальной иммунитет. Эта способность злокачественной трансформации почти всегда упоминается в качестве ключевых компонентов опухолевого роста [130-134].

7. Геномная нестабильность, опосредованная инактивацией систем репарации ДНК и нарушениями в молекулярном контроле клеточного цикла. Для опухолевой клетки характерно ускоренное накопление мутаций, что, по крайней мере, отчасти связано со снижением эффективности процессов репарации ДНК. Подобная особенность приводит к чрезвычайной биологической пластичности новообразований, которые способны быстро приспосабливаться к изменяющимся условиям метаболизма и разнообразным лечебным воздействиям [113,135-139].

8. Перестройка стромальных компонентов, создающая более благоприятные условия для эволюции злокачественного клона. Длительное время предполагалось, что элементы стромы образуют лишь пассивный каркас для размножающихся опухолевых клеток. Открытие последних лет установили, что подобное утверждение далеко от истины. Многочисленные факты свидетельствуют, что стромальные компоненты опухолей заметно отличаются от таковых в нормальных тканях, что фибробласты, инфильтрирующие эпителиальные новообразования, содержат соматические мутации необходимые для жизнедеятельности злокачественного новообразования [140,141].

Венцом примерно 10-летней серии экспериментов стало доказательство факта активации онкогенов в опухолях. К середине 80-х годов онкогенная теория рака приобрела удивительную стройность. Её основные положения можно упрощённо сформулировать следующим образом [142]:

- онкогеном называется ген, который, а) в норме оказывает активирующее влияние на процессы пролиферации и/или препятствует клеточной гибели; б) активируется в опухолях; в) проявляет трансформирующие свойства в экспериментах по трансфекции.

- онкогены необходимы для нормального функционирования тканей; их работа находится под строгим контролем сигнальных систем организма. Соматическая мутация в онкогене приводит к независимости клетки от внешних регулирующих влияний, т.е. клеточный клон, находясь в условиях аутостимуляции, приобретает способность к неконтролируемому размножению[143,144]. Генетические повреждения в онкогенах могут возникать вследствие случайного мутационного процесса, однако вероятность мутаций существенно повышается при увеличении канцерогенной нагрузки [145-149].

- при вирусном канцерогенезе у животных вирус содержит уже активированную версию онкогена, и, таким образом, является лишь транспортной формой последнего. У человека, напротив, большинство опухолей возникает за счёт активации (мутации) эндогенных онкогенов [150-152].

- активация одного онкогена почти всегда компенсируется. Процесс злокачественной трансформации требует сочетанных нарушений в нескольких онкогенах.

К настоящему моменту идентифицированы сотни онкогенов. Они принадлежат к самым разнообразным классам белков и могут выполнять широкий спектр клеточных функций [153-158].

Открытие антионкогенов послужило очень заметным этапом в истории молекулярной онкологии, добавив целостности и логичности к имеющимся до этих воззрений [159-165]. Антионкогеном (супрессорным геном) называется ген, который а) в норме оказывает инактивирующее влияние на процессы пролиферации и/или способствует клеточной гибели; б) инактивируется в опухолях; в) осуществляет реверсию злокачественного фенотипа в экспериментах по трансфекции.

К супрессорным генам, с оговорками можно отнести практически все гены, участвующие в поддержании геномной стабильнсти [166-173]. Наследственные мутации во многих из них - BRCA1, BRCA2, MLH1, MSH2, HPC1, ELAC2 - являются причиной так называемых семейных раковых синдромов [302, 303]. Многочисленные работы свидетельствуют о несомненной роли микроРНК в онкогенезе [128,174,175]. BRCA1 и BRCA2 кодируют непохожие друг на друга белки, однако, оба продукта этих генов играют ключевую роль в поддержании целостности генома, в частности, в процессах репарации ДНК [176-178]. Оказалось, что спектр мутаций в этих генах исключительно широк [179-181].

Главным итогом российских исследований является вывод об исключительно частой встречаемости мутации BRCA1 5382insC [182-189]. Более того, эта мутация доминирует в пограничных государствах с преимущественно славянским населением - в Польше, Белоруссии, Латвии и Литве [46,60,190,191]. Данный вариант отвечает примерно за 2-5% общей заболеваемости раком молочной железы.

Современная наука полагает, что для возникновения трансформированного клеточного клона необходимо как минимум 5-9 мутаций в разных онкогенах и антионкогенах, в то время как меньшее количество мутаций почти всегда компенсируется защитными системами организма. Подобная особенность объясняет возрастное распределение онкологических заболеваний: большинство опухолей проявляет себя лишь во второй половине жизни, так как для их манифестации необходима целая цепь мутационных событий [116,192-195].

Опухоли характеризуются широким спектром различных генетических нарушений: активации гена HRAS1 и инактивации гена hMLN1, гена р53, гена RB1 [196-199]. Многие онкогены и антионкогены поражаются посредством микромутаций - небольших изменений в последовательности ДНК, проявляющихся микроделециями, микроинсерциями или нуклеотидными заменами. Подобный тип нарушений лежит в основе активации онкогенов RAS, BRAF, EGFR, инактивации супрессорного гена р53 и т.д. [17,21,23,24,77,78]

Большинство опухолей также характеризуется нестабильностью на уровне протяжённых участков хромосом, поэтому для новообразований исключительно типичны нарушения копийности генетического материала. Увеличение копийности онкогенов обозначается термином амплификация и приводит к возрастанию количества соответствующих белковых продуктов. Значительно чаще амплификаций встречаются делеции участков хромосом [200,201]. Транслокации - перестройки хромосом, приводящие к изменению уровня экспрессии генов или образованию химерных белков - в большей степени охарактеризованы для онкогематологических патологий. Наиболее известной является транслокация BCR-ABL, приводящая к образованию так называемой филадельфийской хромосомы и наблюдаемая при хроническом миелолейкозе. Изучение транслокаций в солидных опухолях длительное время практически не проводилось, затем бурный прогресс технологий молекулярной цитогенетики подтвердил причастность данной разновидности генетических нарушений к патогенезу широкого спектра опухолей эпителиального происхождения [195,202,203].

ЦРК могут быть обнаружены в крови пациентов с эпителиальными опухолями с использованием различных аналитических подходов. Злокачественные новообразования, возникшие из эпителия, составляют большинство раковых заболеваний, и более 90% смертей среди пациентов с карциномой вызваны метастатическими опухолями [204]. В соответствии с сегодняшней моделью каскад развития метастаза включает в себя: локализованную инвазию, интравазацию (проникновение рака через базальную мембрану и кровеносные сосуды), транспортировку через циркуляцию, задержку в микрососудах, кровоизлияние, формирование микрометастаза, фазу затишья и, наконец, развитие кровеносных сосудов (неоангиогенез), колонизацию и формирование макрометастаза [56,205-207]. Пока опухолевые клетки транспортируются в сердечно-сосудистой системе, на них ссылаются как на ЦРК в кровотоке и рассеянные опухолевые клетки в костном мозге [208-210]. ЦРК прогностически значимы, имеют отношение к клинической стадии, рецидиву болезни, опухолевому метастазированию, отклику на лечение и последующей выживаемости пациентов в ходе терапии [211-214, 306]. Появляется все больше работ демонстрирующих, что ЦРК являются новой заменой и независимым маркером для оценки риска возникновения рецидива, корректировки курса терапии и мониторинга лечения [6-9,11,214,307].

Были приложены значительные усилия для выработки новых надежных биомаркеров, чтобы усовершенствовать деление больных, отслеживать реакцию на лечение и выявить потенциальные новые терапевтические цели [208,215]. В последние годы внимание сфокусировалось на идентификации ЦРК в периферической крови раковых пациентов [216], которые отделяются от первичной опухоли и курсируют посредством циркуляции в отдаленные места, где потенциально могут развиться во вторичные опухоли [217,218]. Присутствие ЦРК коррелирует с неблагоприятным клиническим исходом и поэтому выявление ЦРК может быть клинически значимым в качестве фактора прогнозирования [219-221]. Молекулярный анализ ЦРК может также предоставить многообещающие результаты для оценки успешности лечения [222-225].

Изоляция, подсчет и молекулярная диагностика ЦРК крайне сложна [226]. Эти клетки могут быть выявлены и подсчитаны с достаточной чувствительностью и специфичностью с использованием различных автоматических и полуавтоматических методик. Однако при цитометрических методах фоновая экспрессия возможных маркеров, таких как цитокератин (ЦК) -8, -18 и -19 в нормальных эпителиальных клетках может дать ложные положительные результаты [227]. С другой стороны, методики, в основе которых лежит нуклеиновая кислота (например, обратная транскриптаза ПЦР в режиме реального времени), не позволяют проводить анализ клеточной морфологии [228]. В дополнение, одна из наиболее важных задач текущего исследования - это идентификация подмножеств ЦРК и их характеристика на молекулярном уровне, для выявления механизма, позволяющего индивидуально адаптировать лечение [229,230].

Критический момент при изучении ЦРК, особенно в свете возможного клинического использования, это разработка эффективного анализа для их определения. Поскольку ЦРК немногочисленны в сравнении с циркулирующими клетками крови, существуют значительные технические сложности с определением этих редких клеток и с их дифференциацией от более распространенных гематологических клеток и нормальных эпителиальных клеток.

ЦРК сначала должны быть обогащены и отделены от других клеток крови, и в настоящий момент существует целая совокупность методов как сделать это[231].Восприимчивые методы обогащения опухолевых клеток могут значительно увеличить «урожай», в дальнейшем изолированные клетки могут подвергнуться диагностике с использованием прямых методик, основанных на иммуноцитохимии, для определения протеинов, характерных для рака; или путем оценивания нуклеиновой кислоты, используя метод обратной транскриптазы ПЦР в режиме реального времени в попытке выявить транскрипты молекул РНК, специфичные для опухоли.

Однако клиническое применение результатов исследований ЦРК было осложнено использованием нестандартизованных, часто неспецифичных и/или невосприимчивых методов определения, дающих противоречивые результаты. По сути дела, идеального метода на сегодня не существует, некоторые ограничения присущи каждому методу, которые частично могут быть преодолены при комбинированном подходе [227].

Отделение ЦРК от других клеток в крови на основе градиента плотности может быть выполнено с использованием коммерчески доступных жидких наборов градиента плотности (Ficoll [GE, Healthcare, AmershamBiosciences, USA], Lymphoprep™ [NycomedPharmAS, Oslo, Norway]; OncoQuick® [GreinerBioOne, Frickenhausen, Germany]) или других похожих жидкостей [232,233]. Этот процесс генерирует разделение клеток по слоям на основе их плотности.У этого метода есть определенные ограничения: в частности, возможная потеря ЦРК вследствие нежелательной миграции в слои плазмы, а также формирование неспецифических скоплений, содержащих ЦРК на дне градиента.

Прямое обогащение эпителиальных клеток путем фильтрации основано на наблюдении, что подавляющее большинство клеток периферической крови являются в числе наименьших по размеру в человеческом теле. Они могут быть выделены путем фильтрации крови с использованием поликарбонатного мембранового калиброванного фильтра с порами [234]. Эти фильтры использовались в клинических исследованиях [235,236], но эффективность их применения в процессе обогащения ЦРК не была полностью подтверждена.

Усовершенствованием в этой области является новая платформа определения рака, измеряющая активность теломеразы из жизнеспособных ЦРК, захваченных парилен-Ц гнездовым микрофильтром. Захваченные клетки сохраняют нормальную морфологию, что подтверждено сканированием электронным микроскопом и легко могут быть подвергнуты манипуляциям и дальнейшему анализу [237].

Не так давно была изобретена новая концепция 3-D микрофильтрации для обогащения ЦРК. Устройство уже показало себя как ценный прибор для оценки и диагностики обогащенных, жизнеспособных клеток, как в клинических, так и в исследовательских целях [238].

Иммуномагнитное выделение клеток - широко используемая техника обогащения ЦРК [239]. Выбор маркеров, специфически выраженных ЦРК, осложнен тем, что антигены, раздельные с другими циркулирующими неопухолевыми клетками, дефицитны. Антитела, специфичные для эпителиальных антигенов, такие как ЦК, EpCAM и BerEP4, наиболее широко используемые маркеры определения эпителиальных опухолевых клеток, несмотря на различные показатели ложно положительных и отрицательных окрашиваний.

Маркеры, специфичные для конкретного органа, включая антиген, характерный для простаты, карциноэмбриональный антиген или рецептор эпидермального фактора роста 2 (EGFR2/HER2) также используются [227].

Новый иммуномагнитный автоматический разделитель клеток, theMagSweeper™ (DavisRWetal., LelandStanfordJuniorUniversity, PaloAlto, CA, USA), аккуратно накапливает целевые клетки, прикрепленные к магнитным частицам. TheMagSweeper способен обогащать ЦРК из крови в количестве 10⁸ ; клетки могут быть выделены индивидуально на основе их физических параметров, в то же время всякие клетки, неспецифически связанные с шариками, исключаются из анализа. Устройство может перерабатывать 9 мл крови в час и очищенные клетки, представляющие интерес, могут быть индивидуально отобраны для последующего биохимического анализа, т.к. данная технология сохраняет клеточную функцию и не нарушает генную экспрессию [240].

За вышеуказанными методами обогащения следует этап выявления, который в идеале должен защитить целостность выявленных ЦРК, вместе с тем позволяя провести дополнительные биологические исследования. Некоторые методы сочетают в себе обогащение с определением, другие проводят исследования по выделению клеток, используя необогащенную кровь, поскольку обогащение может вызвать неизбежную потерю ЦРК.

В литературе известны различные методы анализа циркулирующих раковых клеток [127,146]: поиск клеток^тм, потоковая цитометрия, методы, опирающиеся на образ, RT-PCR, технология иммуносорбетного пятна, связанная с энзимами, AdnuTest ^тм, Telomescan ^тм, ЦРК - чип.

Принимая во внимание недостатки потоковой цитометрии, связанные с подсчетом «редких явлений» в больших объемах жидкости и с ограниченной способностью сортировать субпопуляцию клеток, представляющую интерес, в осуществимых условиях, недавно был разработан новый подход к иммуномагнитному обогащению ЦРК из периферической крови и к финальному захвату этих клеток в центральной точке предметного стекла (микроскопа), подходящего для обычного микроскопического анализа [241]. Запатентованная система (Micro-Count™ - Микроподсчет) эксплуатирует утвержденную технологию магнитных шариков со специфическими преимуществами традиционной микроскопии в исследовании образца, состоящего из очень малого количества клеток.

Система состоит из пластины, вмещающей в себя разные виды высокоэффективных неодимовых магнитов, расположенных на дне стандартной склянки с шестью емкостями,используемой для обогащения/разделения. Квадратное 20-мм покровное стекло (расположенное на дне емкости) может быть использовано для восстановления ЦРК в конце процедуры. Данное покровное стекло может с легкостью послужить для последующей цитологической диагностики. В качестве альтернативы (или в параллельной емкости) отделенные клетки могут быть непосредственно восстановлены на дне емкости для дальнейших молекулярных исследований. Особые преимущества системы заключаются в:

· нет необходимости подвергать магнитному воздействию образец внутри стандартного магнитного столба, где «положительно отобранные» клетки должны быть освобождены вследствие механического толчка;

· отсутствии «вымывания»/лизиса, что гарантирует меньшие манипуляции и минимальное вмешательство в жизнеспособность клетки;

· хранении образца после подсчета для постоянной записи случаев, в которых допускается последующий анализ (любыми традиционными или иммунопроцедурами)

Опыт, накопленный в связи с микрофлюидовой обработкой, относящейся к так называемым «чиповым исследованиям», способствует совершенствованию клеточных манипуляций внутри микроустройств многоцелевого использования. Эти устройства функционируют в полностью контролируемом микропространстве, где различные физические и/или электрофизические процессы задействуются для проведения специфических манипуляций над целевыми клетками в различных условиях и по возможности максимально без ручного вмешательства или без маркирования [240].

В этой сфере Stott и др. недавно разработали микрофлюидовое устройство второго поколения, чип в виде елочки (колоса). Данное устройство значительно отличается от других ЦРК-чипов благодаря своему геометрическому дизайну, позволяющему вызывать микровихревое смешивание, разрушающее ламинарное движение образцов крови и увеличивающее число взаимодействий «клетка-поверхность» в устройстве, на которое нанесен слой антитела. Сверх того, камеры были сделаны из прозрачных материалов, позволяющих запечатлеть захваченные ЦРК, используя при этом традиционные гистопатологические красители, микроскопию с проводимым светом, а также антитела, связанные с иммунофлуоресценцией [242]. Чип в форме елочки был протестирован в РС3 клеточной линии рака простаты и на пациентах с метастатическим раком простаты, сверяя при этом результаты с полученными в ходе анализа при помощи ЦРК-чипа: чип в виде елочки показал более высокий коэффициент потока и более высокие значения эффективности и чистоты захвата ЦРК; такие же выводы были сделаны в качестве предположения при похожем исследовании пациентов с раком легкого.

Другая трудность в подобного рода исследованиях связана с нахождением условий, позволяющих минимизировать вмешательство нежелательных клеток и одновременно максимизировать сигнал(ы) (флуоресценция либо любая другая физическая информация). Благодаря тому, что ЦРК всегда редкие явления, система выявления по большей части включает в себя измерение и уточнение не интересующих нас сигналов [243-248]. Наконец, было сконструировано несколько других новых приборов, комбинирующих разные устоявшиеся принципы анализа с выявлением в «микропространстве», чтобы гарантировать высокоэффективный и/или чувствительный подход к идентификации и дифференциации субпопуляции клеток, представляющей интерес [53,249-255]. Большинство этих комбинированных технических методик направлены на минимальное воздействие на клетки с целью их дальнейшего исследования. Важно, что некоторые из них предназначены не только для прогнозирования/ диагностирования, но также быть частью терапии по удалению ЦРК после их обнаружения [256,257].