NO-залежні механізми ушкодження слинних залоз щурів при дії на органи ротової порожнини метилового ефіру метакрилової кислоти
Протекторна та токсична дія оксиду азоту та його метаболітів на слинні залози та органи ротової порожнини. Вплив інгібіторів і субстрату NO-синтаз на активність NOS та орнітиндекарбоксилази в тканинах піднижньощелепних залоз за умов дії метилметакрилату.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | диссертация |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 26.06.2018 |
| Размер файла | 741,8 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
- 2-й етап: нітритредуктазна реакція. У ході реакції 3 спостерігається відновлення нітритів і нітратів до NO.
Рис. 1.3. Цикл оксиду азоту [27,89]
Автори вважають, що існування циклу оксиду азоту є необхідним для запобігання токсичної дії надмірної кількості метаболітів NO. При цьому, незалежні від активності NOS шляхи утворення NO, за спостереженнями дослідників, активуються при дефіциті кисню (гіпоксії, ішемії, ацидозі), тобто виконують роль резервної системи для забезпечення NO, коли ендогенний L-аргінін/NOS шлях, що потребує аеробних умов, є дисфункціональним [89,92,93,208,230]. При гіпоксії активність нітритредуктазних систем в 102-103 разів вища, ніж NOS [93].
Нещодавно висунуто концепцію щодо ключової ролі СЗ у механізмі авторегуляції кількості оксиду азоту в організмі ссавців [55, 58].
В останні роки був з'ясований механізм концентрування неорганічних нітросполук у СЗ завдяки феномену ентеро-саліварної циркуляції нітратів [157,208]. Показано, що ці сполуки після всмоктування у кишечнику (або після утворення при окисненні ендогенних нітритів) можуть захоплюватися та концентруватися у СЗ до 20-разового перевищення в слині [205]. Далі нітрат-аніони під впливом нітратредуктази слини відновлюються до нітритів, а ті, в свою чергу, до NO [119,136,157,207].
Таким чином, за фізіологічних умов при сприятливому кисневому режимі тканин NO ефективно виробляється за участю NOS і секреція неорганічних нітросполук СЗ може бути мінімальною. При гіпоксії або підвищеному функціональному навантаженні продуктивність NOS зменшується і для підтримки адекватного рівня NO у тканинах підвищується секреція наведених аніонів зі слиною, їх транспортування у органи шлунково-кишкового тракту та кров, відновлення до оксиду азоту [206]. Цей механізм забезпечує необхідний рівень NO в організмі ссавців і дозволяє уникнути різких коливань вмісту цього біорегулятора та його метаболітів.
Порушення функціонування наведеного механізму авторегуляції кількості оксиду азоту в організмі може супроводжуватися утворенням активних форм нітрогену (АФН) - пероксинітриту, NO2, N2O3 [263], токсичність яких значно перевищує таку у нітрат-йонів. Цей процес можна розглядати як формування патологічної детермінанти з подальшим утворенням патологічної системи, наслідком є розвиток дизрегуляторної патології [32].
В останні роки було виявлено, що за умов надлишкового надходження нітрат- та нітрит-йонів у організм ссавців порушується функціонування циклу NO як механізму забезпечення негативного зворотного зв'язку [55,58]. Так, за умов відтворення хронічної інтоксикації нітратом натрію активність NOS (головним чином, іNOS) у тканинах різних органів гризунів, у т.ч. СЗ [16,106,107], не тільки не знижується, як це повинно було бути за механізмом авторегуляції рівня NO, але й значно підвищується, викликаючи суттєве збільшення продукції .О, активності ПОЛ, зниження АО захисту. У тканинах СЗ щурів виявлена здатність NO, що утворюється nNOS, запобігати розвитку названих вище вільнорадикальних порушень [106].
Примітно, що дизрегуляторні розлади у функціонуванні циклу NO виявляються також під час розвитку патологічних процесів у великих СЗ - карагенінового (на тлі хронічної інтоксикації нітратом натрію) [10-12] та травматичного [52,53] сіаладенітів, токсичних уражень СЗ [106,107], сіаладенозу за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому [42].
Дослідниками показано, що у патогенезі наведених вище процесів чільне місце займає утворення такої АФН, як пероксинітрит [40,51,52, 105]. Останній являє собою молекулу з коротким терміном існування, що має потужний деструктивний потенціал. Це пояснюється здатністю ONOO- утворювати діоксид азоту (NO2) і надзвичайно активний гідроксильний радикал (*OН-), інактивувати Mn-СОД і впливати на мітохондріальний дихальний ланцюг, сприяючи збільшенню рівня .О, що призводить до пошкодження не тільки мітохондріальної мембрани, але і ДНК, ліпідів і білків [143,178,232,262]. Окрім цього, накопичення пероксинітриту сприяє розвитку апоптозу по шляху активації проапоптотичних білків Bax [150].
Pall M.L. [233] у 2013 році запропонував концепцію про цикл NO/ONOO- як механізм, що функціонує за принципом «зачарованого» кола, у центрі знаходиться підвищений рівень пероксинітриту та окисний стрес (рис. 1.4). Інші компоненти цього циклу представлені: активацією NF-кB та iNOS, продукцією прозапальних цитокінів, NO, .О, мітохондріальною дисфункцією (знижений енергетичний потенціал, АТФ), активацією NMDA та TRP-рецепторів, підвищенням внутрішньоклітинної концентрації йонів Са2+ та виснаженням ВН4. За даними автора, всі ці процеси утворюють причинно-наслідкові зв'язки в патогенезі серцевої недостатності, проте, ймовірно, цикл NO/ONOO- може розглядатися як типовий елемент патологічного системогенезу.
Рис. 1.4. Цикл NO/ONOO- [233]
Примітно, NO може виступати як досить потужний антиоксидант у клітинах ссавців, запобігаючи пошкодження АФК, яке може бути викликане реакціями з металами, .О і ліпідними радикалами. З іншого боку, АФН (ONOO-, NO2) здатні окиснювати субстрат, а N2O3 - є основним джерелом нітрозилювання біомолекул. Таким чином, ці АФН створюють умови, що призводять до нітрозативного або окисного стресу. Так як NO і NO2 є ліпофільними, вони можуть мігрувати через клітини, збільшуючи кількість потенційних мішеней [276].
Важливо відзначити, що оксид азоту у високих концентраціях здатний виявляти токсичну дію. Негативні ефекти NO, на думку авторів, залежать від джерел синтезу NO, природи клітин, концентрації NO та окислювально-відновних характеристик біологічного середовища [56, 181]. Варто відзначити, що результат дії NO в ефективних концентраціях залежить від відстані між клітинами-мішенями і джерелом синтезу NO
В останні роки доведено існування досить тісних зв'язків між системою NO та активністю транскрипційних чинників.
Відомо, що експресія гена iNOS відбувається за участю ядерного фактора кB (NF-кB), тому активність цієї ізоформи може знижуватися за умов пригнічення як транскрипції її мРНК, так і активності NF-кB [160,239]. У промоторі iNOS виявлено сайти для зв'язування не тільки NF-кB, але і інших транскрипційних чинників і цитокінів (активатора транскрипції 1, фактора транскрипції jun/fos, IL-6 та ін.) [130,190,234, 273]. Через активацію NF-кB опосередковується вивільнення цитокінів - індукторів iNOS - TNF-б та IL-1в [190].
Механізм обмеження експресії гена iNOS за участю NO пов'язаний зі зниженням експресії NF-кB у гепатоцитах щурів і в культурі первинних гепатоцитів людини [251]. На процес активації NF-кB негативно впливає утворення пероксинітриту [200] та функціональна активність nNOS [237,266]. Ці факти, вочевидь, доводять існування негативного зворотного зв'язку між NO та NF-кB, що дозволяє контролювати експресію гена iNOS, запобігаючи надмірне утворення NO та інших АФН.
Лише одиничні роботи відбивають взаємовідносини системи NO та активації NF-кB у патогенезі функціонально-метаболічних розладів СЗ. Так, А.М. Єлінська та В.О. Костенко [41,42] в експерименті на білих щурах дослідили роль NOS і NF-кB у механізмах порушень вільнорадикальних процесів і білоксинтезуючої функції піднижньощелепних СЗ за умов моделювання метаболічного синдрому. Авторами показано, що з індукцією іNOS і NF-кB пов'язана продукція .О НАДФН-залежним (мікросомальним та NO-синтазою) і НАДН-залежним (мітохондріальним) електронно-транспортними ланцюгами, утворення вторинних продуктів ПОЛ, зменшення активності б-амілази та орнітиндекарбоксилази у тканинах СЗ.
Таким чином, численні літературні джерела вказують на здатність NO виявляти регуляторну, протективну та цитотоксичну дію на різні органи ссавців, у тому числі СЗ. Підкреслюється неоднозначність ефектів NO за умов розвитку інтоксикацій, запалення і реактивно-дистрофічних уражень СЗ через можливість порушення механізмів авторегуляції кількості NO в організмі, його здатності взаємодіяти з іншими АФК з утворенням високотоксичних АФН (зокрема, пероксинітриту), а також складні взаємостосунки системи NO з функціональним станом транскрипційного ядерного фактора кB, що вказує на необхідність дослідження цих систем для з'ясування типових механізмів ураження СЗ при дії токсичних чинників.
Незначна кількість публікацій стосується ролі NO у механізмах токсичної дії метилметакрилату. Проте практично відсутні роботи про участь різних ланок системи NO (ізоформ NOS, їх субстрату, АФН) та NF-кB у механізмах ушкодження або протекції тканин СЗ за умов впливу залишкового мономера, що обґрунтовує доцільність та своєчасність цього дослідження.
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Загальна характеристика матеріалів та методів дослідження
Експерименти виконані на 90 білих щурах-самцях лінії Вістар масою 180-230 г.
Тварин утримували в умовах акредитованого віварію згідно із “Стандартними правилами по упорядкуванню, устаткуванню та утриманню експериментальних біологічних клінік (віваріїв)”. При роботі з тваринами дотримувалися вимог “Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються в експерименті та інших наукових цілях” (Страсбург, 18.03.1986 р.). Проведені дослідження відповідають етичним та морально-правовим вимогам згідно з наказом МОЗ України № 281 від 01.11.2000 р. Комісією з питань біоетики Вищого державного навчального закладу України “Українська медична стоматологічна академія” (протокол № 129 від 19.01.2016 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.
Проведено 9 серій дослідів (таблиця 2.1).
Таблиця 2.1. Розподіл експериментальних груп тварин
|
№ |
Характеристика серій |
|
|
1 |
2 |
|
|
1. |
Контрольна серія. У інтактних тварин виконували щоденні сеанси зрошення слизової оболонки порожнини рота водопроводною водою (“плацебо”) у дозі 0,5 мл протягом 30 діб |
|
|
Дослідні серії |
||
|
2. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб |
|
|
3. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб + введення селективного інгібітора nNOS 7-нітроіндазолу (7-NI) |
|
|
4. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб + введення селективного інгібітора iNOS аміногуанідину |
|
|
5. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб + введення субстрату NO-синтазної та аргіназної реакції L-аргініну |
|
|
6. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб + введення інгібітора аргінази L-норваліну |
|
|
7. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб + введення скевенджеру пероксинітриту L-селенометіоніну |
|
|
8. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб + введення інгібітора активації NF-кB - JSH-23 (4-метил-N-(3-фенілпропіл) бензол-1,2-діаміну) |
|
|
9. |
Аплікація 1 % розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота щурів протягом 30 діб + введення інгібітора активації NF-кB - JSH-23 (4-метил-N-(3-фенілпропіл) бензол-1,2-діаміну) + введення субстрату NO-синтазної та аргіназної реакції L-аргініну |
Для дослідження під ефірним наркозом вилучали піднижньощелепні СЗ у комплексі з великими під'язиковими. Останні відсепаровували, після чого тварин декапітували, не виводячи з наркозу.
2.2 Методика зміни режимів функціонування NOS, аргінази, активності NF-кB та оцінки продукції пероксинітриту
З метою модифікації функціонування NOS і аргінази, рівня утворення пероксинітриту та активності NF-кB застосовували сполуки, наведені у таблиці 2.2.
Таблиця 2.2. Сполуки, що змінюють режими функціонування NOS і аргінази, рівень утворення пероксинітриту та активність NF-кB, які використовували у дослідженні
|
Назва сполуки |
Призначення |
Виробник |
Шлях введення |
Режим дозування |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
7-нітроіндазол (7-NI) |
Селективний інгібітор nNOS |
“Sigma-Aldrich, Inc.”, США |
в/о |
30 мг/кг [194], 2 рази на тиждень |
|
|
Аміногуанідин |
Селективний інгібітор іNOS |
“Sigma-Aldrich, Inc.”, США |
в/о |
20 мг/кг [264], 2 рази на тиждень |
|
|
L-аргінін |
Субстрат NOS і аргінази |
“Kyowa Hakko Kogyo Co LTD”, Японія |
в/о |
500 мг/кг [36], 2 рази на тиждень |
|
|
L-норвалін |
Неселектив-ний інгібітор аргінази |
“Sigma-Aldrich, Inc.”, США |
в/о |
дозі 10 мг/кг [54], через день |
|
|
L-селенометіонін |
Скевенджер перокси-нітриту |
“Sigma-Aldrich, Inc.”, США |
в/о |
3 мг/кг [194], 2 рази на тиждень |
|
|
JSH-23 (4-метил- N-(3-фенілпропіл) бензол-1,2-діамін) |
Інгібітор активації NF-кB |
“Santa Cruz Biotechnology”, ФРН |
в/о |
1 мг/кг [192], 2 рази на тиждень |
Примітка: в/о - внутрішньоочеревинно.
2.3 Біохімічні методи дослідження
Перелік біохімічних методів дослідження наведено в таблиці 2.3.
Таблиця 2.3. Біохімічні методи дослідження
|
№ |
Параметр, що вивчається |
Літературні джерела |
|
|
1 |
2 |
3 |
|
|
1. |
NOS, нітрит-йони |
Hevel J.M. (1991) |
|
|
2. |
Орнітиндекарбоксилаза |
Храмов В.А. (1997) |
|
|
3. |
Супероксидний аніон-радикал |
Цебржинский О.И. (2002) |
|
|
4. |
ТБК-реактанти |
Кайдашев І.П. та співавт. (2003) |
|
|
5. |
СОД |
Брусов О.С. и соавт. (1976) |
|
|
6. |
Каталаза |
Архипова О.Г. (1980) |
|
|
7. |
б-Амілаза |
Меньшиков В.В. и соавт. (1987) |
Визначення активності NO-синтаз та концентрації нітрит-аніонів. Сумарну активність NO-синтаз визначали за різницею концентрації нітрит-йонів (NO2-) до та після інкубації гомогенату слинних залоз у середовищі, що містить L-аргінін та НАДФН. Концентрацію NO2- визначали шляхом утворення діазосполук у реакції з сульфаніловою кислотою, а потім проводили реакцію з б-нафтилетилендіаміном, у результаті якої утворюються похідні червоного кольору [177].
Визначення активності орнітиндекарбоксилази. Активність ОДК визначали за зниженням вмісту орнітину в інкубаційному середовищі методом Чинарда [117]. Метод базується на нінгідриновій реакції при рH=1,0. Інтенсивність забарвлення розчину з продуктами взаємодії нінгідрину пропорційна концентрації орнітину в досліджуваному розчині. Оптичну щільність визначали при л=490 нм.
Визначення продукції супероксидного аніон-радикала. Утворення супероксидного аніон-радикала (.О) у гомогенаті піднижньощелепних СЗ оцінювали при проведенні тесту з нітросинім тетразолієм з такими індукторами: НАДH - для оцінки продукції .О мітохондріальним ЕТЛ; НАДФH - для оцінки продукції .О оксидоредуктазами ендоплазматичного ретикулума та NOS [118].
Визначення концентрації ТБК-активних продуктів. Рівень ПОЛ у гомогенаті піднижньощелепних СЗ оцінювали за утворенням у реакції тіобарбітурової кислоти (ТБК) з ТБК-активними сполуками забарвленого триметінового комплексу до і після 1,5-годинної інкубації у прооксидантному залізоаскорбатному буферному розчині [79]. Активність антиоксидантної системи оцінювали за приростом концентрації ТБК-активних сполук за час 1,5-годинної інкубації гомогенату у залізоаскорбатному буферному розчині.
Визначення активності супероксиддисмутази. Визначення активності СОД у гомогенаті піднижньощелепних СЗ проводили за методом О.С. Брусова і співавт. [13]. Принцип методу полягає в тому, що СОД пригнічує автоокиснення адреналіну. За різницею швидкості реакції без додавання біологічного матеріалу та з його додаванням обчислювали активність ферменту.
Визначення активності каталази. Метод базується на здатності каталази, що міститься в біоматеріалі, розкладати пероксид водню. Кількість пероксиду водню, що залишився в пробі, визначають титруванням 0,1 н розчином калію перманганату [78].
Визначення активності б-амілази. Активність б-амілази у тканинах піднижньощелепних СЗ визначали за методикою Каравея за допомогою набору реактивів фірми «Філісіт-Діагностика» (Україна, м. Дніпропетровськ). За наявності б-амілази крохмаль гідролізується до похідних, що не дають кольорової реакції з йодом. Зміна інтенсивності забарвлення йод-крохмального комплексу пропорційна активності ферменту в досліджуваній пробі [68].
2.5 Статистична обробка результатів експерименту
Для перевірки розподілу на нормальність було застосовано розрахунок критерію Шапіро-Вілка. Якщо дані відповідали нормальному розподілу, то для їх порівняння використовували t-критерій Ст'юдента для незалежних вибірок. У випадку, коли ряди даних не підлягали нормальному розподілу, статистичну обробку здійснювали, використовуючи непараметричний метод - тест Мана-Вітні.
Для множинного порівняння застосовували поправку Бонфероні, а при розподілі, який відрізняється від нормального, - критерій Краскела-Уоліса [21,91].
Статистичні розрахунки проводили з використанням програм "Microsoft Excel 2007" та "StatisticSoft 6.0".
РОЗДІЛ 3. СТАН ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНИХ ПРОЦЕСІВ І ФУНКЦІЇ СЛИННИХ ЗАЛОЗ БІЛИХ ЩУРІВ ЗА УМОВ ДІЇ МЕТИЛМЕТАКРИЛАТУ
3.1 Зміни активності NOS та орнітиндекарбоксилази в тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов дії метилметакрилату
У гризунів у СЗ експерсуються всі ізоформи NOS [256]. Показана висока чутливість СЗ на нестачу або надлишок NO, що утворюється за участю як ферментативних, так і неферментативних реакцій [16,52,58, 107].
Вплив метилметакрилату на функціональний ферментів NO-синтазного і аргіназного шляхів метаболізму L-аргініну залишається майже нез'ясованим. Показано лише здатність метилметакрилату збільшувати в організмі людини вироблення NO, що супроводжується вазорелаксацією [127,128,184]. Причому така відповідь пригнічується при введенні неселективного інгібітора NOS - метилового ефіру нітро-L-аргініну [209], що доводить участь NOS у цьому процесі.
Нами досліджено показники активності NOS та вмісту продуктів окиснення NO - нітрит-аніонів - в піднижньощелепних СЗ за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота.
Згідно з отриманими нами результатами, у тканинах піднижньощелепних СЗ інтактних тварин активність NOS становить - 4,25±0,24 мкмоль NО/г·хв., а вміст NО - 0,119±0,011 мкмоль/г (таблиця 3.1), що відповідає даним літератури [53,72,106].
Таблиця 3.1. Показники активності NOS та вмісту нітрит-аніонів в піднижньощелепних слинних залозах щурів за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=10)
|
Показники |
Серії дослідів |
||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
||
|
NOS, мкмоль NО/г·хв. |
4,25±0,24 |
9,02±0,42 * |
|
|
Вміст NО, мкмоль/г |
0,119±0,011 |
0,160±0,006 * |
Примітка (у табл. 3.1-3.6): * - р<0.05 у порівнянні з даними першої серії (інтактні щури).
За фізіологічних умов активність NOS у СЗ забезпечується головним чином функціонуванням сNOS (nNOS, eNOS) [236], а утворення нітрит-йонів може бути пов'язане як з окисненням NO при його взаємодії з О2 та церулоплазміном [206,208], а також при відновленні нітратів, зокрема, у реакціях, що каталізуються власними нітратредуктазами слини [136,157,207].
За умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота активність NOS у тканинах піднижньощелепних СЗ підвищується - до 9,02±0,42 мкмоль NО/г·хв. (у 2,12 рази, p<0,001), а вміст NО - до 0,160±0,006 мкмоль/г (на 34,5%, p<0,02) у порівнянні з даними першої серії.
Збільшення активності NOS супроводжується обмеженням у тканинах СЗ реакцій аргіназного шляху метаболізму L-аргініну, що підтверджується зменшенням активності ОДК (таблиця 3.2) - з 264,9±14,5 до 200,0±12,8 нмоль/г·хв. (на 24,5%, p<0,01) у порівнянні з даними першої серії.
Таблиця 3.2. Зміни активності орнітиндекарбоксилази в піднижньощелепних слинних залозах щурів за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=10)
|
Назва ферменту |
Серії дослідів |
||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
||
|
Орнітиндекарбоксилаза, нмоль/г·хв. |
264,9±14,5 |
200,0±12,8 * |
Таким чином, 30-денна аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота викликає у тканинах піднижньощелепних СЗ реципрокні зміни окисного (NOS) та неокисного (аргіназного) шляхів метаболізму L-аргініну: підвищення сумарної активності NOS і концентрації нітрит-йонів, з одного боку, та зменшення активності ОДК, з іншого боку.
3.2 Зміни продукції супероксидного аніон-радикала у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов дії метилметакрилату
Наявні на сьогодні дані дозволяють вважати, що перебіг багатьох патологічних процесів сполучений із інтенсифікацією процесів вільнорадикального окислення [76,175]. Це пов'язано з різким збільшенням продукції АФК, серед яких центральне місце належить супероксидному аніон-радикалу (.О) як основному індуктору окисного стресу [9,118,120,175]. Незважаючи на величезну кількість опублікованих робіт, у яких явно чи неявно передбачаються сигнальні функції .О або інших АФК, прямих доказів таких властивостей, порівнянних за достовірністю з такими, встановленими для інших сигнальних молекул (цАМР, йони Са2+, NO), до цього часу не отримано [28].
Практично будь-який екстремальний стан організму супроводжуються збільшенням продукції АФК, зокрема, .О. Можливість утворення останнього реалізується при взаємодії одноелектронних redox компонентів оксидоредуктаз (молібден, FeS центри, геми цитохромів, міцно зв'язані убісеміхінони) з молекулярним киснем [28,76,118].
Дихальний ланцюг мітохондрій визнається найпотужнішим джерелом АФК у більшості тканин [149]. «Головними» генераторами АФК в мітохондріях вважаються мітохондріальний ферментний комплекс (МФК) I і дигідроліпоаміддегідрогеназа (належить до великого сімейства флавін, тіол дисульфід-залежних оксидоредуктаз), на що значною мірою впливає redox потенціал матриксу - відношення НАД+/ НАДH [28,172,226]. Швидкості утворення АФК мітохондріями лінійно залежать від концентрації кисню. Константа швидкості першого порядку одно або двохелектронного відновлення кисню швидше за все визначається його дифузією до redox-компоненту (компонентам), що беруть участь в утворенні АФК, через «канали», що виникають в результаті динаміки білка.
Вважається, що головним центром генерації супероксиду в МФК I є FeS кластер N1a [172]. Нещодавно було показано, що МФК II у клітинах щура здатний з відносно високими швидкостями генерувати .О та / або пероксид водню. Центром генерації .О в комплексі III вважають убісеміхінон, що утворюється в центрі Q [28,149,156,172].
Генерація .О у помітних кількостях відбувається при активації цитохром Р-450-залежних оксидоредуктаз ендоплазматичного ретикулума, автоокиснення самого цитохрому Р450, функціонуванні різних мембранних оксидаз. При цьому АФК нерідко виникають не тільки спонтанно, але й ферментативно [120,183].
Значна кількість ферментів системи цитохрому Р-450 в процесі біотрансформації ксенобіотиків можуть напряму відновлювати молекулярний кисень (О2) у .О [65,175]. Альтернативний шлях окиснення, що каталізується цитохромом Р-450, включає в себе redox цикл, у якому субстрати - ксенобіотики акцептують по одному електрону з цитохрому Р-450 і перетворюються на проміжні вільно-радикальні сполуки. Потім ці проміжні речовини переносять електрон на О2, утворюючи .О, і при цьому самі регенерують у вихідну сполуку. Тобто під час цього циклу відбувається генерація .О з регенерацією субстрату й, отже, може починатися новий цикл продукції .О.
За нашими даними, у тканинах піднижньощелепних СЗ інтактних тварин загальний фон продукції .О становить 1.16±0.08 нмоль/г·с. Утворення .О НАДФН-залежними ЕТЛ (цитохром Р-450-залежними оксидоредуктазами ендоплазматичного ретикулума та NOS) і НАДН-залежним (мітохондріальним) ЕТЛ складає відповідно 14,8±0,44 нмоль/г·с та 16,13±0,39 нмоль/г·с (таблиця 3.3), що узгоджується з результатами інших дослідників [53,57,72,106].
Таблиця 3.3. Зміни продукції супероксидного аніон-радикала у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=10)
|
Показники |
Серії дослідів |
||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
||
|
Утворення .О, нмоль/г·с |
|||
|
Загальний фон продукції |
1,16±0,08 |
1,56±0,06 * |
|
|
НАДФН-залежні ЕТЛ (мікросомальний і NOS) |
14,8±0,44 |
23,07±1,26 * |
|
|
НАДН-залежний ЕТЛ (мітохондріальний) |
16,13±0,39 |
28,8±0,68 * |
30-денна аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота призводить до суттєвих змін генерації .О у піднижньощелепних СЗ. Так, загальний фон продукції .О підвищується до 1,56±0,06 нмоль/г·с (на 34,5%, p<0,01). Генерація .О НАДФН-залежними ЕТЛ збільшується - до 23,07±1,26 нмоль/г·с (на 55,9%, p<0,001), а мітохондріальним ЕТЛ - до 28,8±0,68 нмоль/г·с (на 78,5%, p<0,001) у порівнянні з даними першої серії.
Таким чином, 30-денна аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота супроводжується у тканинах піднижньощелепних СЗ збільшенням загального фону продукції .О, посиленням його утворення НАДФН-залежними (оксидоредуктазами ендоплазматичного ретикулума та NOS) ЕТЛ і НАДН-залежним дихальним ланцюгом мітохондрій.
3.3 Зміни процесів пероксидного окиснення ліпідів та антиоксидантного захисту в тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов за умов дії метилметакрилату
Механізми вільнорадикального пошкодження клітин розпочинаються на рівні біологічних мембран і поступово втягують інші субклітинні структури.
Порушення бар'єрної та матричної функції мембран не тільки супроводжує низку патологічних процесів, але і в багатьох випадках є тригером вільнорадикального некробіозу. Показана визначальна роль реакцій ПОЛ у канцерогенезі, розвитку атеросклерозу, хворобах печінки, інтоксикаціях [9,99,211], а також захворюваннях органів ротової порожнини [60,82] та СЗ [10,53,102].
Внаслідок високої реактивності АФК взаємодіють з ліпідами біологічних мембран не тільки ушкоджують структурну та функціональну цілісність останніх, але й генерують цілу низку жирнокислотних радикалів, які згодом взаємодіють з іншими ліпідами, білками, нуклеїновими кислотами, запускаючи тим самим каскад перенесення електронів, що і призводить до пошкодження цих структур - починаючи від підвищеної проникності до лізису клітин.
ПОЛ відіграє важливу роль як у нормальній життєдіяльності клітин, так і в розвитку патологічних процесів. Пероксиди ліпідів, що утворюються в нормі, можуть бути активними інтермедіатами клітинного метаболізму [30,71]. Значення ПОЛ пов'язують з регуляцією проникності мембран, швидкістю клітинного поділу, станом окисного фосфорилювання, гідроксилюванням стерольного ядра холестеролу тощо. Для цих процесів достатній рівень .О, як ініціатора ВРО, - 10-12-10-11 М. Показано, що ПОЛ може бути механізмом розбирання і поновлення мембран (особливо при порушенні мітохондріального окиснення та фосфорилювання) [34].
За фізіологічних умов утворення АФК та продуктів ПОЛ знаходиться під контролем АОС. У тканинах інтактних тварин підтримується низький рівень ендогенних продуктів ВРО, більша частина яких припадає на гідропероксиди фосфоліпідів мембран.
Зростання інтенсивності генерації АФК та виснаження АОС супроводжується розвитком в організмі окисного стресу з структурною перебудовою мембран, порушенням клітинного метаболізму та функцій органів [76]. Нещодавно показана роль окисного стресу у клітинних механізмах токсичної дії метилметакрилату [222].
За умов пероксидації збільшується утворення продуктів ПОЛ, зокрема, вторинних - малонового діальдегіду [30,279], який складає основну частину ТБК-активних сполук.
Згідно з отриманими нами результатами, концентрація ТБК-реактантів у тканинах піднижньощелепних СЗ інтактних щурів до та після 1,5-годинної інкубації у залізоаскорбатному буферному розчині складає відповідно - 25,96±0,90 та 35,58±0,90 мкмоль/кг (таблиця 3.4). Приріст концентрації цих речовин за час інкубації становить 9,62±1,52 мкмоль/кг.
30-денна аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота призводить до суттєвих змін показників ПОЛ. Так, концентрація ТБК-активних сполук в тканинах піднижньощелепних СЗ підвищується: до інкубації - до 40,38±0,90 мкмоль/кг (на 55,5%, p<0.001), після інкубації - до 59,62±1,59 мкмоль/кг (на 67,6%, p<0.001) у порівнянні з даними першої серії, що вказує на розвиток декомпенсованого ПОЛ.
Таблиця 3.4. Зміни концентрації ТБК-реактантів у гомогенаті піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=10)
|
Показники |
Серії дослідів |
||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
||
|
Концентрація ТБК-реактантів, мкмоль/кг |
|||
|
до інкубації |
25,96±0,90 |
40,38±0,90 * |
|
|
після інкубації |
35,58±0,90 |
59,62±1,59 * |
|
|
приріст |
9,62±1,52 |
19,23±2,01 * |
Величина приросту концентрації ТБК-активних сполук за час 1,5-годинної інкубації у залізоаскорбатному буферному розчині за умов експерименту збільшується в тканинах піднижньощелепних СЗ - до 19,23±2,01 мкмоль/кг, тобто на 99,9% (p<0,01) у порівнянні з даними першої серії, що підтверджує суттєве зменшення антиоксидантного потенціалу.
Останній висновок підтверджується значним зниженням активності АО ферментів у тканинах СЗ (таблиця 3.5).
За нашими даними, активність СОД зменшується з 0,29±0,03 од. акт. до 0,14±0,02 од. акт., тобто на 51,7% (p<0,01). Активність каталази - з 2,79±0,18 мккатал/кг до 1,80±0,16 мккатал/кг (на 35,5%, p<0,02).
Таблиця 3.5. Зміни активності антиоксидантних ферментів у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=10)
|
Назва ферменту |
Серії дослідів |
||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
||
|
СОД, од. акт. |
0,29±0,03 |
0,14±0,02 * |
|
|
Каталаза, мккатал/кг |
2,79±0,18 |
1,80±0,16 * |
Таким чином, 30-денна аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота викликає у тканинах піднижньощелепних СЗ активацію процесів декомпенсованого ПОЛ, що супроводжується зниженням антиоксидантного потенціалу, активності антиоксидантних ферментів - СОД і каталази.
3.4 Зміни активності б-амілази у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов дії метилметакрилату
Відомі три види амілаз, які розрізняються головним чином за кінцевим продуктам їхньої ферментативної дії: б-амілаза, в-амілаза і г-амілаза. б-Амілаза (КФ 3.2.1.1; 1.4-б-D-глюкан-глюканогідролаза) розщеплює у полісахаридах внутрішні б-1,4-зв'язки, тому її іноді називають ендоамілазою. Молекула б-амілази містить у своїх активних центрах йони Са2+, необхідні для ферментативної активності. Крім того, характерною особливістю б-амілази ссавців є здатність активуватися одновалентними аніонами, насамперед йонами хлору [145].
Під дією в-амілази від крохмалю відщеплюється дисахарид мальтоза, тобто в-амілаза є екзоамілазою. Вона виявлена ??у вищих рослин, де виконує важливу роль в мобілізації резервного (запасного) крохмалю, та може надходити в організм людини та тварин з продуктами рослинництва.
г-Амілаза відщеплює один за іншим глюкозні залишки від кінця поліглікозидного ланцюжка. Розрізняють кислі і нейтральні г-амілази в залежності від того, в якій області рН вони проявляють максимальну активність. В органах і тканинах людини і ссавців кисла г-амілаза локалізована в лізосомах, а нейтральна - в мікросомах і гіалоплазмі.
Амілаза слини є б-амілазою з оптимумом активності при pH 6,7-7,0. Під впливом цього ферменту відбуваються перші фази розпаду крохмалю (або глікогену) з утворенням декстринів (у невеликій кількості утворюється і мальтоза) [14,102].
Нами досліджувалася активність б-амілази в гомогенаті піднижньощелепних СЗ для оцінки їхньої білоксинтезуючої функції (таблиця 3.6)
Згідно з отриманими результатами, у тканинах СЗ інтактних тварин активність б-амілази складає 75,8±1,8 мг/год Ч г, що відповідає даними літератури [1,25,42,107].
30-денна аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота зменшує активність б-амілази у тканинах піднижньощелепних СЗ до 58,6±1,5 75,8±1,8 мг/год Ч г, тобто на 22,7% (р<0,001) у порівнянні з даними першої серії.
Таблиця 3.6. Активність б-амілази у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=10)
|
Назва ферменту |
Серії дослідів |
||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
||
|
б-Амілаза, мг/год Ч г |
75,8±1,8 |
58,6±1,5 * |
Таким чином, 30-денна аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота супроводжується істотним порушенням білоксинтезуючої функції піднижньощелепних СЗ щурів.
Матеріали цього розділу оприлюдненні в статтях і тезах:
1. Роль слинних залоз у механізмах ауторегуляції рівня оксиду азоту в організмі ссавців та їх порушень / В.О. Костенко, А.М. Єлінська, Л.І. Ляшенко, І.В. Нагорняк, О.А.Стасюк // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісн. Української мед. стоматол. академії. - 2013. - Т.13, 2. - C. 10-14.
2. Нагорняк И.В. Состояние нитроксидэргической системы и свободнорадикальных процессов в слюнных железах крыс при аппликации на слизистую оболочку полости рта метилового эфира метакриловой кислоты / И.В. Нагорняк, А.А. Левков, В.А. Костенко // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2015. - № 2. - С. 105-109.
3. Дизрегуляторні механізми ушкодження слинних залоз та пародонта за умов надлишкового утворення оксиду азоту / В.О. Костенко, О.В. Богданов, А.М. Єлінська, Л.І. Ляшенко, І.В. Нагорняк // Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів : наук.-практ. конф. (Тернопіль, 31 жовтня - 1 листопада 2013 р.) : мат. // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. - 2013. - №2. - С. 254.
4. Механізми патологічного системогенезу за умов надлишкового утворення оксиду азоту в організмі / В.О. Костенко, О.В. Богданов, О.М. Бойченко, І.О. Ковальова, І.В. Нагорняк, Д.О. Хміль // Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм : VIII наук.-практ. конф. (Тернопіль, 1-2 жовтня 2015 р.) : мат. - Тернопіль, 2015. - С. 39-40.
РОЗДІЛ 4. ВПЛИВ ІНГІБІТОРІВ NO-СИНТАЗ ТА ЇХ СУБСТРАТУ НА ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНІ ПРОЦЕСИ І ФУНКЦІЮ СЛИННИХ ЗАЛОЗ ЩУРІВ ЗА УМОВ ДІЇ МЕТИЛМЕТАКРИЛАТУ
4.1 Вплив інгібіторів і субстрату NO-синтаз та їх субстрату на активність NOS та орнітиндекарбоксилази в тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов дії метилметакрилату
Відомо, що у патогенезі уражень СЗ за умов механічного пошкодження та інтоксикацій важливу роль відіграє цитотоксична дія надлишкової кількості NO. Структури СЗ виявилися досить чутливими до дефіциту або надлишку NO, що утворюється за участю різних ізоформ NOS, нітритредуктаз, неферментативних реакцій відновлення нітрит-йонів [16,52,58,107].
У той же час ендогенний NO бере участь у забезпеченні процесу секреції слини, регуляції кровопостачання СЗ, нейротрансмісії, утворенні гістогематичного бар'єру, впливає на проліферацію та диференціювання гландулоцитів [58,203,236,271].
На підставі аналізу літературних даних можна припустити, що збільшення активності NOS і продукції NO може демонструвати як захисну, так і токсичну дію цього біорегулятора, що може позначитися на характері патологічних змін у СЗ. Неоднозначність впливу NO може бути пов'язаною з різними джерелами його утворення (сNOS або іNOS, нітритредуктази, неферментативні реакції), кількістю субстратів NOS, складними взаємовідносинами між NO-синтазним та аргіназним шляхом метаболізму L-аргініну, наявністю інших АФК, що призводить до генерації високоактивних АФН (зокрема, пероксинітриту) [55-57].
Показана здатність метилметакрилату збільшувати в організмі людини та тварин вироблення NO [127,128,184]. При цьому доведено, що джерелом останнього є NOS [209].
Ми дослідили вплив селективних інгібіторів nNOS та iNOS, а також субстрату NOS L-аргініну на сумарну активність NOS та концентрацію стабільного метаболіту NO - нітрит-аніонів - у тканинах піднижньощелепних СЗ за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (таблиця 4.1).
Таблиця 4.1. Вплив інгібіторів і субстрату NOS на показники активності NOS та вмісту нітрит-аніонів у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=25)
|
Показники |
Серії дослідів |
|||||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
|||||
|
Контроль |
+ 7-NI |
+ аміно-гуанідин |
+ L-аргінін |
|||
|
NOS, мкмоль NО/г·хв. |
4,25 ±0,24 |
9,02 ±0,42 * |
7,59 ±0,32 */** |
3,78 ±0,40 ** |
8,57 ±0,53 * |
|
|
Вміст NО, мкмоль/г |
0,119 ±0,011 |
0,160 ±0,006 * |
0,122 ±0,007 ** |
0,082 ±0,005 */** |
0,110 ±0,007 ** |
Примітка (у табл. 4.1-4.6): * - р<0.05 у порівнянні з даними першої серії (інтактні щури), ** - р<0.05 у порівнянні з даними другої серії.
При внесенні селективного інгібітора nNOS 7-NI за умов тривалої аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота активність NOS і концентрація NО у тканинах СЗ зменшуються - відповідно до 7,59±0,32 мкмоль NО/г·хв та 0,122±0,007 мкмоль/г, тобто на 15,9% (p<0,05) та 23,7% (p<0,01) у порівнянні з даними другої серії.
Застосування селективного інгібітора iNOS аміногуанідину за умов аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота зменшує активність NOS і концентрацію NО у тканинах СЗ - відповідно до 3,78±0,40 мкмоль NО/г·хв та 0,082±0,005 мкмоль/г, тобто на 15,9% (p<0,05) та 23,7% (p<0,01) у порівнянні з даними другої серії.
Введення L-аргініну за умов експерименту достовірно не впливає на активність NOS, проте на 31,2% (p<0,01) зменшує вміст нітрит-йонів, що, вочевидь, пов'язано з реакціями авторегуляції рівня NO в організмі при функціонуванні “циклу оксиду азоту” [89].
Введення 7-NI за умов аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота вірогідно не впливає на активність ОДК у порівнянні з даними другої серії (таблиця 4.2).
Застосування селективного інгібітора iNOS аміногуанідину за умов експерименту, навпаки, збільшує активність ОДК - до 277,2±19,1 нмоль/г·хв (на 38,6%, p<0,01).
Ці зміни можна розцінювати, як прояв конкурентних стосунків аргіназного та NO-синтазного шляхів метаболізму L-аргініну; пригнічення NOS (особливо потужної iNOS) сприяє підвищенню активності ферментів неокисного механізму, зокрема, ОДК.
Таблиця 4.2. Вплив інгібіторів і субстрату NOS на показники активності орнітиндекарбоксилази в піднижньощелепних слинних залозах щурів за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=25)
|
Назва ферменту |
Серії дослідів |
|||||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
|||||
|
Контроль |
+ 7-NI |
+ аміно-гуанідин |
+ L-аргінін |
|||
|
Орнітин- декарбоксилаза, нмоль/г·хв. |
264,9 ±14,5 |
200,0 ±12,8 * |
259,6 ±28,6 |
277,2 ±19,1 ** |
226,3 ±23,0 |
Таким чином, 1) підвищення сумарної активності NOS у тканинах піднижньощелепних СЗ за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота пов'язано, у значній мірі, з функціонуванням iNOS.
2) введення селективного інгібітора iNOS аміногуанідину за умов експерименту викликає збільшення активності орнітиндекарбоксилази - ферменту конкуруючого щодо NOS аргіназного шляху метаболізму L-аргініну;
3) введення субстрату NOS та аргінази L-аргініну суттєво не позначається за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота на активності NOS і орнітиндекарбоксилази у тканинах піднижньощелепних СЗ.
4.2 Вплив інгібіторів і субстрату NO-синтаз та їх субстрату на продукцію супероксидного аніон-радикала у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов дії метилметакрилату
Згідно із даними літератури, зміни функціональної активності NOS при токсичних, травматичних та реактивно-дистрофічних ураженням СЗ супроводжуються генерацією АФК НАДН- та НАДФН-залежними ЕТЛ [10,52,57,106]. Найбільша кількість .О за цих умов продукується у дихальному ланцюзі мітохондрій, складові якого (особливо МФК І) є мішенями дії нано- та мікромолярних концентрацій NO [226] або реагують на низьку (пікомолярну) кількість цього біорегулятора як сигнальної молекули [133].
Проте такі НАДФН-залежні механізми генерації .О як мікросомальний ЕТЛ, асоційований із цитохром Р-450-залежними оксидоредуктазами ендоплазматичного ретикулума, а також власне NOS, здатні за умов утворення надлишкової кількості NO із ендогенних та екзогенних попередників справляти суттєвий внесок у продукцію АФК у тканинах ушкоджених СЗ [52,57,106]. Так, дисфункція будь-якого з компонентів НАДФН-залежного ЕТЛ, що входить до складу NOS, а також дефіцит L-аргініну або хоча б одного з кофакторів (найчастіше - ВН4), викликає роз'єднання (uncoupling) переносу електронів в оксигеназних ферментах. При цьому кисень стає єдиним акцептором електронів, що призводить до генерації .О [131,132,161]. При зниженні кількості L-аргініну до 100 мкмоль/л, ініційоване НАДФH окиснення не сполучається із продукцією NO, що викликає утворення .О.
Ми дослідили вплив селективних інгібіторів та субстрату NOS на показники продукції .О у тканинах СЗ за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (таблиця 4.3).
Таблиця 4.3. Вплив інгібіторів NOS і субстрату на продукцію супероксидного аніон-радикала в тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=25)
|
Показники |
Серії дослідів |
|||||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
|||||
|
Контроль |
+ 7-NI |
+ аміно-гуанідин |
+ L-аргінін |
|||
|
Утворення .О, нмоль/г·с |
||||||
|
Загальний фон продукції |
1,16 ±0,08 |
1,56 ±0,06 * |
1,80 ±0,05 */** |
1,18 ±0,04 ** |
1,47 ±0,04 * |
|
|
НАДФН-залежні ЕТЛ (мікросомальний і NOS) |
14,8 ±0,44 |
23,07 ±1,26 * |
24,4 ±0,62 * |
16,67 ±0,73 ** |
19,87 ±0,44 */** |
|
|
НАДН-залежний ЕТЛ (мітохондріальний) |
16,13 ±0,39 |
28,8 ±0,68 * |
33,34 ±0,60 */** |
19,2 ±0,49 */** |
28,27 ±1,05 * |
Введення щурам 7-NI за умов аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота істотно підвищує загальний фон продукції .О (на 15,4%, p<0,02), його вироблення НАДН-залежним (мітохондріальним) ЕТЛ (на 15,8%, p<0,01) у порівнянні з даними другої серії, але не впливає на генерацію цієї АФК НАДФН-залежними ЕТЛ.
Застосування аміногуанідину за умов експерименту знижує загальний фон продукції .О та його вироблення НАДФН і НАДН-залежними ЕТЛ - відповідно на 24,4% (p<0,001), 27,7% (p<0,01) та 33,3% (p<0,001) у порівнянні з даними другої серії.
Одержані нами результати свідчать, що гіперпродукція .О у тканинах піднижньощелепних СЗ щурів за умов дії метилметакрилату пов'язана з функціонуванням іNOS.
Введення L-аргініну за умов експерименту істотно не впливає на загальний фон продукції .О та його генерацію НАДН-залежним (мітохондріальним) ЕТЛ, але знижує його вироблення НАДФН-залежними ЕТЛ - на 13,9% (p<0,05) у порівнянні з даними другої серії.
Таким чином, 1) з функціонуванням nNOS за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота пов'язано обмеження у клітинах піднижньощелепних СЗ утворення .О НАДН-залежним дихальним ланцюгом мітохондрій;
2) з функціонуванням iNOS за умов експерименту пов'язана гіперпродукція у клітинах піднижньощелепних СЗ .О НАДФН-залежними ЕТЛ (цитохром Р-450-залежними оксидоредуктазами ендоплазматичного ретикулума та NOS) і НАДН-залежним (мітохондріальним) ланцюгом;
3) введення L-аргініну за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота знижує у клітинах піднижньощелепних СЗ продукцію .О НАДФН-залежними ЕТЛ (цитохром Р-450-залежними оксидоредуктазами ендоплазматичного ретикулума та NOS), але не впливає на його генерацію дихальним ланцюгом мітохондрій.
4.3 Вплив інгібіторів і субстрату NO-синтаз та їх субстрату на процеси пероксидного окиснення ліпідів та антиоксидантного захисту в тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов дії метилметакрилату
NO неоднозначно впливає на процеси ПОЛ у тканинах СЗ [55,57]. У фізіологічних концентраціях він виступає скоріше як антиоксидант, який пригнічує розвиток радикальних окисних реакцій, зв'язуючись з вільними йонами Fe2+, або такими, що входять до складу гема, та інгібуючи розкладання пероксидів (реакція Фентона) [29,125,180]. Крім того, NO здатний пригнічувати розвиток вільнорадикальних реакцій шляхом перехоплення радикалів RO2. (ROO. + NO > ROONO). При цьому константа швидкості реакції пероксидних радикалів з NO складає (2Ч109 М-1с-1) порівнянна з такою для б-токоферолу, а фізіологічні концентрації останнього нижче [164].
У той же час, великі концентрації NO сприяють утворенню АФК (.О, гідроксильних радикалів та ін.) та АФН (зокрема, пероксинітриту), які виявляють потужну прооксидантну дію, що супроводжується ініціацією процесів ПОЛ [228,262].
Таким чином, труднощі прогнозування про- або антиоксидантних ефектів NO на тканини СЗ обґрунтовують необхідність з'ясування характера його дії при проведенні патофізіологічного експерименту.
Ми досліджували вплив селективних інгібіторів та субстрату NOS на концентрацію ТБК-реактантів у гомогенаті піднижньощелепних СЗ за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на с лизову оболонку порожнини рота (таблиця 4.4).
Таблиця 4.4. Вплив інгібіторів і субстрату NOS на концентрацію ТБК-реактантів у гомогенаті піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=25)
|
Показники |
Серії дослідів |
|||||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
|||||
|
Контроль |
+ 7-NI |
+ аміно- гуанідин |
+ L-аргінін |
|||
|
Концентрація ТБК-реактантів, мкмоль/кг |
||||||
|
до інкубації |
25,96 ±0,90 |
40,38 ±0,90 * |
46,63 ±1,23 */** |
34,62 ±1,23 */** |
36,06 ±0,76 */** |
|
|
після інкубації |
35,58 ±0,90 |
59,62 ±1,59 * |
64,9 ±1,08 */** |
44,23 ±1,63 */** |
46,63 ±1,63 */** |
|
|
приріст |
9,62 ±1,52 |
19,23 ±2,01 * |
18,27 ±1,44 * |
9,62 ±1,07 ** |
10,58 ±1,44 ** |
Застосування 7-NI за умов аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота підвищує концентрацію ТБК-активних продуктів до інкубації - на 15,5% (p<0,01), після інкубації у прооксидантному буферному розчині - на 8,9% (p<0,05) у порівнянні з даними другої серії. Це вказує на активацію ПОЛ у тканинах СЗ. Проте приріст концентрації цих сполук за час 1,5-годинної інкубації у залізоаскорбатному буферному розчині та величини активності СОД і каталази (таблиця 4.4) суттєво не змінюються (у порівнянні з даними другої серії).
Таблиця 4.5. Вплив інгібіторів NOS і субстрату на активність антиоксидантних ферментів у тканинах піднижньощелепних слинних залоз за умов 30-денної аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота (M+m, n=25)
|
Назва ферменту |
Серії дослідів |
|||||
|
Інтактні тварини |
Аплікація 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти |
|||||
|
Контроль |
+ 7-NI |
+ аміно-гуанідин |
+ L-аргінін |
|||
|
СОД, од. акт. |
0,29 ±0,03 |
0,14 ±0,02 * |
0,17 ±0,04 * |
0,27 ±0,03 ** |
0,24 ±0,04 |
|
|
Каталаза, мккатал/кг |
2,79 ±0,18 |
1,8 ±0,16 * |
1,67 ±0,24 * |
2,55 ±0,15 ** |
2,07 ±0,21 * |
Введення щурам аміногуанідину за умов експерименту зменшує концентрацію ТБК-активних продуктів до інкубації - на 14,3% (p<0,01), після інкубації у прооксидантному буферному розчині - на 25,8% (p<0,001) у порівнянні з даними другої серії (див. табл. 4.4). Величина приросту концентрації цих сполук за час 1,5-годинної інкубації у залізоаскорбатному буферному розчині - знижується на 50,0% (p<0,01) у порівнянні з даними другої серії. Це вказує на здатність селективного інгібітора iNOS обмежувати зниження антиоксидантного потенціалу, що підтверджується підвищенням у тканинах активності АО ферментів. Так, активність СОД і каталази збільшується - відповідно на 92,9% (p<0,01) та 41,7% (p<0,01) у порівнянні з даними другої серії (див. табл. 4.5).
Введення L-аргініну за умов експерименту також зменшує концентрацію ТБК-активних продуктів та їх приріст за час інкубації - відповідно на 10,7% (p<0,01) та 45,0% (p<0,01) у порівнянні з даними другої серії (див. табл. 4.4), проте не виявляє суттєвого впливу на активність СОД і каталази (див. табл. 4.5).
Таким чином, 1) селективне пригнічення nNOS за умов тривалої аплікації 1% розчину метилового ефіру метакрилової кислоти на слизову оболонку порожнини рота супроводжується активацією в піднижньощелепних СЗ пероксидного окиснення ліпідів без істотного впливу на активності антиоксидантних ферментів - супероксиддисмутази та каталази;
2) селективне пригнічення iNOS за умов експерименту обмежує в піднижньощелепних ...
Подобные документы
Рівень секреторної активності слинних залоз у пацієнтів до і після протезування знімними зубними протезами. Деякі показники гомеостазу ротової порожнини в людей з зниженою функціональною активністю слинних залоз. Рецептура гелю, що коригує слиновиділення.
автореферат [49,2 K], добавлен 18.03.2009Функції і типи слинних залоз, діагностика ряду захворювань. Методи дослідження секреторної функції. Цитологічне дослідження мазків слини. Контрастне рентгенологічне дослідження слинних залоз (сіалографія). Морфологічні методи, комп`ютерна томографія.
реферат [27,2 K], добавлен 12.01.2011Виникнення масажу, його вплив на системи організму, шкіру, суглоби, внутрішні органи. Вимоги до масажиста та кабінету масажу. Техніка післяопераційного масажу черевної порожнини, фізіотерапія після лапаротомії. Комплекс вправ лікувальної гімнастики.
дипломная работа [6,6 M], добавлен 26.08.2011Вміст свинцю в крові, аорті, печінці, серці та нирках щурів після введення ацетату свинцю. Зміни показників обміну оксиду азоту в організмі дослідних тварин. Вплив свинцю на скоротливу функцію судинної стінки на препаратах ізольованого сегменту аорти.
автореферат [49,0 K], добавлен 10.04.2009Щитовидна залоза - ключова ланка в організмі людини. Вплив гормонів щитоподібної залози на органи і обмін речовин організму. Основні функції щитоподібної залози. Патології щитоподібної залози та причини, що викликають їх. Дефіцит йоду і його наслідки.
реферат [33,5 K], добавлен 23.01.2011Ендокринні залози і гормональна регуляція. Причини та механізми розладів ендокринної регуляції. Захворювання щитоподібної залози. Дифузний токсичний зоб. Хронічна недостатність кори надниркових залоз (хвороба Аддісона). Характеристика цукрового діабету.
реферат [39,1 K], добавлен 24.11.2009Загальна характеристика, симптоми та клінічна картина ракових новоутворень в ротовій порожнині, головні причини її виникнення та етапи розвитку. Передракові стани та факультативні захворювання. Типи ракових утворень та принципи їх лікування, діагностика.
презентация [1,0 M], добавлен 13.01.2012Виникнення масажу та його вплив на організм людини. Особливості спортивного та косметичного видів масажу, способи та методи його виконання. Показання та протипоказання до застосування. Види операцій, після яких показаний масаж черевної порожнини.
дипломная работа [7,1 M], добавлен 07.09.2012Регуляція синтезу кортикостероїдів в корі надниркових залоз модуляторами адренокортикальної функції: кортикотропіном, естрогенами, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламінів, іонами калію. Можливість перенесення сигналу естрадіолу негеномним шляхом.
автореферат [739,9 K], добавлен 11.04.2009Види патології черевної порожнини. Посилення лікувального впливу на організм людини. Клініко-функціональне обґрунтування методів фізичної реабілітації при патології черевної порожнини. Показання і протипоказання до занять ЛФК в післяопераційному періоді.
курсовая работа [864,0 K], добавлен 11.05.2011Загальна характеристика захворювань ротової порожнини. Історія виникнення та розвитку засобів по догляду за порожниною рота. Загальна характеристика зубних паст. Зубні еліксири: основні складові та технологія виготовлення. Особливості зубних порошків.
курсовая работа [5,4 M], добавлен 13.06.2014Дослідження дії специфічних і неспецифічних модифікаторів гормонопоезу на гормональну активність органотипових культур щитоподібних залоз. Вплив експлантатів гіпофізу на гормональну активність та життєздатність тироцитів при комбінованому культивуванні.
автореферат [32,5 K], добавлен 18.03.2009Хірургічне захворювання надниркових залоз як стан, що загрожує життю хворого. Клінічний перебіг і гормональні характеристики злоякісних пухлин надниркових залоз, методи діагностики і лікування. Різниця у діагностиці злоякісних та доброякісних пухлин.
автореферат [87,4 K], добавлен 06.04.2009Характеристика захворювань та травм органів грудної та черевної порожнини, що потребують оперативного втручання. Проведення та основні задачі лікувальної фізкультури при операціях і післяопераційних станах на органах грудної та черевної порожнини.
контрольная работа [34,0 K], добавлен 22.11.2009Залози внутрішньої секреції, що виробляють біологічно активні речовини. Гормони: хімічний склад, рецептори, схема дії, вплив на діяльність органів. Анатомічна будова і функції гіпоталамуса, гіпофіза, наднирника, щитоподібної та підшлункової залоз.
презентация [4,1 M], добавлен 10.04.2015Метаболічни зміни у тканинах щурів при умовах коротко- та довготривалого експериментального свинцево-кадмієвого токсикозу і його корекції селенітом натрію та ліолівом. Доцільність використання даних препаратів з метою корекції метаболічних порушень.
автореферат [41,3 K], добавлен 24.03.2009Морфологічна та функціональна характеристика органів ендокринної системи людини. Ендокринна частина статевих залоз та підшлункової залози. Механізм дії гормонів. Гормони щитовидної залози. Епіфіз (шишковидна залоза). Гіпофіз - залоза внутрішньої секреції.
реферат [42,0 K], добавлен 21.01.2009Характеристика анатомо-фізіологічних особливостей та найпоширеніших патологій ендокринних залоз. Природа та механізм дії гормонів. Вплив гормонів щитовидної залози на ріст та розвиток дитячого організму. Профілактичні заходи щодо попередження патологій.
дипломная работа [125,4 K], добавлен 23.10.2014Оцінка інтенсивності еритропоезу у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом. Активність NO-синтази в еритроцитах щурів у нормі і за умов ЦД 1-го типу. Динаміка вмісту лігандних форм гемоглобіну та кисень-зв’язуюча функція пігмента крові.
автореферат [35,8 K], добавлен 29.03.2009Рання діагностика та вторинна профілактика раку грудної залози у закладах загальної лікувальної мережі шляхом організації мамологічної служби в поліклініці міської лікарні. Алгоритм селективного скринінгу жінок на виявлення захворювань грудних залоз.
автореферат [81,7 K], добавлен 04.04.2009
