Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов: методология, производство, стандартизация

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.04.01- технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора

фармацевтических наук

Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов:

методология, производство, стандартизация

Зубкова Наталия Васильевна

Пермь - 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования “Пермская государственная фармацевтическая академия” Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в филиале ФГУП НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России в г. Нижний Новгород, “Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов “ИмБио”

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Казьянин Александр Викторович

Официальные оппоненты:

Сульдин Александр Владимирович, доктор фармацевтических наук, профессор,

ГБОУ ВПО “Пермская государственная фармацевтическая академия” Минздравсоцразвития России, профессор кафедры фармацевтической технологии

Быстрицкий Леонид Дмитриевич, доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО “Сибирский государственный медицинский университет” Минздравсоцразвития России, профессор кафедры технологии производства лекарственных средств

Устинова Ольга Юрьевна, доктор медицинских наук, ФБУН “Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения”, г. Пермь, заместитель директора по лечебной части

Ведущая организация: ГБОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия” Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится “25” декабря 2012 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО “Пермская государственная фармацевтическая академия” Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО “Пермская государственная фармацевтическая академия” Минздравсоцразвития России по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации www.mon.gov.ru “24”сентября 2012 г., на сайте ПГФА www.pfa.ru “24 “ сентября 2012 г.

Автореферат разослан “____”__________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

Зубкова Наталия Васильевна (Россия)

Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов: методология, производство, стандартизация

Работа посвящена актуальной проблеме - повышению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов и охватывает все ее аспекты: обеспечение безопасности плазмы для фракционирования, стандартизацию исследований на маркеры гемотрансмиссивных вирусов, разработку современных технологий производства и их валидацию, контроль качества готовых лекарственных форм. На основании изучения закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров в индивидуальных донациях и пулах плазмы разработан научно-обоснованный алгоритм входного контроля плазмы для фракционирования, обеспечивающий безопасность производственных пулов плазмы на уровне международных стандартов. Разработана современная технология производства препарата иммуноглобулина G для внутривенного введения, включающая валидированные стадии инактивации вирусов. Доказано, что препараты, полученные по этой технологии, превосходят по ряду показателей качества препараты иммуноглобулина, полученные по традиционной технологии с использованием гидролитических ферментов. Разработаны рекомендации и диагностические наборы для контроля вирусной безопасности готовых препаратов.

Biotechnological aspects of virus safety of immunoglobulin preparations: methodology, production, standardization

This work is devoted to the relevant issue - to increase viral safety of immunoglobulin preparations and it covers all aspects of it: providing of plasma safety for fractionation, standardization of researches on markers of blood-borne viruses, development of modern production technologies and their validation, quality control of the finished products. The effective and scientifically-proved algorithm of plasma control for fractionation is developed by results of studying of the patterns of serological and molecular-genetic markers identification in individual donations and plasma pools. It provides safety of manufacturing plasma pools according to the international standards. The modern technology is developed to produce the intravenous immunoglobulin G preparation including additional stages of viruses' inactivation which efficiency has been confirmed experimentally. It is proved that the preparations obtained by this technology are superior in some indicators of quality to immunoglobulin preparations obtained by the traditional technology with the enzymatic digestion. Recommendations and diagnostic kits for the control of viral safety of the immunoglobulin medicines have been developed.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Плазма крови человека является источником более 100 различных белков и биологически активных соединений, часть которых получают промышленным способом и используют в качестве лечебных препаратов для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний [WHO, 2007]. Глобальный рынок лекарственных препаратов из плазмы крови доноров за период с 2000 года увеличился в 2 раза и имеет постоянную тенденцию к росту. При этом производство препаратов иммуноглобулинов обеспечивает более 50% данного сегмента рынка и является движущей силой фракционирования плазмы крови в целом [http://marketpublishers.com/report/medicine_pharmaceuticals_biotechnology].

Потребность в препаратах иммуноглобулинов, особенно для внутривенного введения, постоянно растет. В России она удовлетворена только на 5-15%, а обеспеченность страны препаратами из плазмы крови доноров обычно рассматривается с позиций экономического развития и мобилизационной готовности страны [Селиванов Е.А.,2010]. Поэтому усовершенствование технологии производства отечественных препаратов иммуноглобулинов и более полное удовлетворение в них потребности здравоохранения - это государственная проблема национальной безопасности и актуальность ее не вызывает сомнения.

Основным сырьем для получения препаратов иммуноглобулинов является плазма для фракционирования, представляющая собой жидкую часть крови из индивидуальных порций, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом плазмафереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров, прошедших процедуру карантинизации, и предназначенную для объединения в производственный пул [European Pharmacopoeia//2008:0853; ФС 42-0091-02]. Являясь уникальной биологической субстанцией - живой тканью человеческого организма, плазма крови доноров может содержать различные инфекционные агенты, наиболее опасными из которых признаны бактерии и вирусы. В ходе технологической переработки бактериальное загрязнение легко устраняется, а вирусы, относящиеся к наноструктурам, могут проникать в полупродукты и готовые препараты.

В последние годы ухудшение эпидемической ситуации в отношении основных гемотрансмиссивных вирусов, появление новых инфекционных агентов обострили проблему вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров [Голосова Т.В., Никитин В.К., 2003; Жибурт Е.Б., 2004; Карякин А.В., 2005; Оприщенко С.А., Захаров В.В., Русанов В.М., 2008]. Случаи инфицирования пациентов вирусом гепатита С (ВГС) после применения препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения привели к активизации исследований, направленных на разработку новых методологических и технологических подходов к повышению вирусной безопасности препаратов [Edwards C., 1987; Horowitz B. et al., 1993; Rabenau H. et. al., 1996; Biesert L., 1996; Uemura Y. et al., 1994; Yap P.L., 1996; Barin F., 2008; Ballow M., 2002; Dichtelmьller H., 2009; Burnouf T. et al., 2004, 2007; Grцner A., 2008]. В Европе, США и других странах мира под контролем Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) были разработаны и приняты к исполнению национальные директивы в области безопасности гемотрансфузий и производства препаратов из плазмы крови доноров [Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation No. R (95) 15; CPMP/BWP/269/95; CPMP/BWP/268/95; WHO Expert Committee on biological standardization, 2007; WHO Technical Report, Series № 924, Annex 4, 2004; DIRECTIVE 2002/98/EC].

В России нормативная база, регламентирующая работу в этой области, несовершенна и противоречива. Несмотря на то, что на технологическую переработку поступает плазма крови доноров, разрешенная для использования в лечебно-профилактических учреждениях, сущестует риск получения инфицированных донаций [Карякин А.В., 2005]. При этом производство лечебных препаратов ориентировано главным образом на метод спиртового фракционирования по Кону, а дополнительные стадии инактивации вирусов не используются или применяются устаревшие технологии. Не разработаны также методы валидации вирусинактивирующих стадий, а главный упор делается на контроль готовых лекарственных форм, хотя диагностические наборы, предназначенные для этой цели, отсутствуют.

Комплексные исследования в этой области позволят повысить безопасность отечественных препаратов иммуноглобулинов, привести их качество в соответствие с рекомендациями ВОЗ и повысить конкурентоспособность на рынке лекарственных средств.

Цель работы - разработка методологической базы и технологических подходов к обеспечению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов.

Задачи исследования:

1. Определить закономерности выявления вирусных маркеров в индивидуальных образцах и пулах плазмы крови доноров и разработать научно-обоснованный алгоритм входного контроля вирусной безопасности сырья на предприятиях по фракционированию плазмы крови доноров.

2. На примере стандартного образца содержания РНК ВГС разработать методологию создания стандартных образцов содержания нуклеиновых кислот (НК) гемотрансмиссивных вирусов, необходимых для контроля качества генамплификационных методов исследования.

3. Создать современную вирусбезопасную технологию производства иммуноглобулина G (IgG) человека для внутривенного введения.

4. Разработать методологические основы валидации вирусинактивирующих и вирусэлиминирующих технологий.

5. Разработать рекомендации по контролю вирусной безопасности готовых лекарственных форм препаратов иммуноглобулинов.

Научная новизна работы. Впервые в РФ применен комплексный подход к проблеме обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов, направленный на повышение требований к качеству сырья, разработку современных технологий, валидацию методов вирусной инактивации и усовершенствование методов контроля готовых препаратов.

Изучено распределение вирусной нагрузки и коэффициентов позитивности (КП) антител у доноров, инфицированных ВГС и вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Установлено, что отсутствует корреляция между концентрацией РНК ВГС и активностью антител к ВГС (анти-ВГС), концентрацией РНК ВИЧ и активностью антител к ВИЧ (анти-ВИЧ1,2), а также концентрацией ДНК вируса гепатита В (ВГВ) и поверхностного антигена ВГВ (НВsAg).

Выявлен высокий уровень распространенности парвовируса В19 (В19 V) среди доноров и установлена вероятность контаминации этим вирусом производственных пулов плазмы.

Создана вирусбезопасная технология производства препаратов иммуноглобулина G человека, включающая стадию удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и сольвент-детергентную (СД) обработку с использованием три-n-бутилфосфата (ТБФ) и натрия холата. Оптимизированы условия СД-обработки, разработан оригинальный способ очистки от вирусинактивирующих реагентов. Научная новизна исследований подтверждена патентами на изобретение (RU 2192279 и RU 2352358).

Разработана перспективная технология производства иммуноглобулина G, включающая стадию обработки каприлатом натрия, вирулицидная активность которого подтверждена экспериментально.

Впервые для инактивации вирусов апробированы алкилирующие соединения (карбоплатин, хлорамбуцил). На примере хлорамбуцила продемонстрировано усиление вирулицидного действия при использовании его с реагентами, разрыхляющими оболочку вирусов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана универсальная методика аттестации стандартных образцов содержания НК, основанная на параллельном тестировании Международного стандартного образца (МСО) и исследуемого препарата с последующей статистической обработкой данных методом параллельных линий, реализованным в виде программного модуля в среде Microsoft Excel. Разработан и утвержден отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО РНК ВГС) 42-28-366 (1) -11(П).

Разработаны методы определения ТБФ и натрия холата в препаратах иммуноглобулинов и обоснованы предельно допустимые нормы их остаточного содержания. Технология СД-обработки унифицирована и рекомендована для внедрения в процесс производства нормальных и специфических иммуноглобулинов для внутримышечного и внутривенного введения.

Разработана методология валидации вирусинактивирующих и вирусэлиминирующих технологий с использованием модельных гемотрансмиссивных вирусов, включающая контаминацию объекта исследования, моделирование технологического процесса и определение уровня вирусной редукции по стадиям производства.

Экспериментально доказана нецелесообразность тестирования иммуноглобулинов на наличие HBsAg по причине иммунной нейтрализации последнего избытком специфических антител. В нормативной документации (НД) на препараты иммуноглобулинов рекомендовано тест на НВsAg заменить на определение антител к поверхностному антигену ВГВ (анти-НВs), при этом обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня концентрации последних с 0,5 до 5 Международных единиц (МЕ) на 1 г иммуноглобулина.

Для количественного определения анти-НВs разработана оригинальная технология изготовления иммуноферментной тест-системы “МикрАт-НВs” (патент RU 2290642). Для определения антител к ВГС в препаратах иммуноглобулинов разработана иммуноферментная тест-система “ИФА-анти-ВГС”.

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены приказом №59-ОД от 21.07.2011 ФГБУ “ГИСК им. Л.А. Тарасевича” Минсоцздравразвития России Методические рекомендации “Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров”. Процедура контроля плазмы для фракционирования, включающая тестирование минипулов плазмы методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) на маркеры ВГВ, ВГС и ВИЧ, внедрена в практику в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 01.12.2011; акт внедрения от 19.08.2011) и утверждена в регламентах производства на лекарственные средства, получаемые из плазмы крови доноров (ПР № 01898718-10-09; ПР № 01898718-27-08; ПР № 01898718-28-11).

Технология СД-обработки иммуноглобулинов внедрена в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 18.08.2010; акт внедрения от 21.05.2010). Разработана и утверждена в установленном порядке НД на “Имбиоглобулин” (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ ЛС-000177). Стадия удаления вирусов с помощью гидроксида алюминия и СД-обработка включены в промышленный регламент производства (ПР № 01898718-28-11).

ОСО РНК ВГС 42-28-366 (1)-11(П) используется в учреждениях практического здравоохранения для оценки качества коммерческих диагностических наборов для выявления и количественного определения РНК ВГС (Акт внедрения “Сургутский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями” от 16.11.2011 №2703, Сургут, Тюменской области; акт внедрения Бюджетное учреждение Чувашской Республики “Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями” от 28.08.2012 №01-10/379, Чебоксары).

Разработаны технические условия, промышленные регламенты и получены регистрационные документы на производство и реализацию следующих диагностических препаратов:

1. Набор реагентов “МикрАт-НВs” Тест-система иммуноферментная для определения антител к поверхностному антигену к вируса гепатита В / ФСР 2009/05914 от 07.07.2009.

2. Набор реагентов “ИФА-анти-ВГС” Тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05264 от 24.03.2009.

3. Набор реагентов “СПЕКТР-4” Тест-система иммуноферментная для подтверждения положительных результатов при выявлении антител к вирусу гепатита С / ФСР 2009/05263 от 24.03.2009.

4. Набор реагентов “ИФА-НВsAg” Тест-система иммуноферментная для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В / ФСР 2000/05265 от 15.03.2010.

Разработанные диагностические наборы используются в практическом здравоохранении.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Входной контроль вирусной безопасности плазмы для фракционирования обеспечивает снижение риска вирусной контаминации сырья для изготовления лечебных препаратов крови.

2. Аттестованные стандартные образцы содержания НК гемотрансмиссивных вирусов предназначены для стандартизации генамплификационных методов исследования и ратификации требований к вирусной безопасности плазмы для фракционирования.

3. Технология производства препаратов иммуноглобулинов, включающая дополнительные стадии инактивации вирусов (обработка сольвент-детергентом или каприлатом натрия), обеспечивает получение безопасных препаратов, соответствующих по физико-химическим и биологическим показателям качества требованиям отечественных НД и Европейской фармакопее.

4. Валидация технологических стадий инактивации и элиминации вирусов подтверждает адекватность технологических режимов и гарантирует безопасность готовых препаратов.

5. Состав и биологические свойства иммуноглобулинов определяют специфику контроля готовых лекарственных форм на маркеры гемотрансмиссивных вирусов.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа соответствует основным направлениям научных исследований ГБОУ ВПО “Пермская государственная фармацевтическая академия” Минздравсоцразвития России (номер государственной регистрации темы: 01.9.50.007426) и ФГУП НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Международном конгрессе “Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы”, С.-Петербург, 2003; на Российской научно-практической конференции с международным участием “Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики”, Москва 2005, 2007, 2009; на Всероссийской конференции по вакцинологии “Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней”, Москва, 2006, 2008, 2010; на VII Всероссийской научно-практической конференции “Молекулярная диагностика”, Москва, 2010; на Всероссийских научно-практических конференциях в Уфе, 2004, Нижнем Новгороде, 2006, Кирове, 2010; на Международном конгрессе “Биотехнология - состояние и перспективы развития”, Москва, 2012.

Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации данные были получены под руководством и при личном участии автора на базе Нижегородского филиала ФГУП НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России. Исследования по валидации вирусинактивирующих технологий были выполнены на базе ФГБУ “Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. Н.П.Чумакова” РАМН и ГНУ “Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока” Россельхозакадемии по программам, разработанным лично автором. Методы определения остаточного содержания трибутилфосфата и натрия холата разработаны при личном участии автора на базе НИИ молекулярной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им.И.М.Сеченова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 научные работы, в том числе 12 в изданиях, рекомендованных ВАК, получено 3 патента РФ, разработаны и утверждены Методические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 29 рисунками. Библиография включает 287 источников, в том числе 71 - отечественный, 216 - зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач был разработан следующий дизайн исследований (рис. 1).



Рис.1. Дизайн исследований.

Основными объектами исследования были плазма крови доноров, осадки (фракции плазмы II+III, II, III), полученные методом спиртового фракционирования, и готовые лекарственные препараты из плазмы крови доноров. Объем исследований указан в табл. 1.

Таблица 1

Объем серологических и молекулярно-генетических исследований на маркеры гемотрансмиссивных вирусов

№ п/п	Наименование материала	Количество образцов	Исследуемые маркеры
			серологические	молекулярно-генетичекие
1	Плазма крови здоровых доноров, всего	81 594
1.1	- “ -	7 4750	анти-ВГС	РНК ВГС
1.2	- “ -	2 702	НВsAg, aнти-НВs, анти-НВс	ДНК ВГВ
1.3	- “ -	1 000	анти-В19	ДНК В19 V
1.4	- “ -	260	анти-ВГА	-
1.5	- “ -	1 000	-	РНК ВГА
1.6	- “ -	250	анти-HLTV1.2	-
1.7	- “ -	1 632	-	РНК вируса лихорадки Западного Нила (ВЗН)
2	Плазма крови инфицированных доноров:	382
2.1	- ВГС	185	анти-ВГС, антиВГС/НСсAg, КП анти-ВГС	РНК ВГС, концентрация РНК ВГС, генотипы ВГС
2.2	- ВГВ	125	НВsAg, концен-трация НВsAg, анти-НВс	ДНК ВГВ, концентрация ДНК ВГВ
2.3	- ВИЧ	72	анти-ВИЧ1,2, КП анти-ВИЧ1,2	РНК ВИЧ, концент-рация РНК ВИЧ
3	Минипулы плазмы для фракционирования (24+4 донации)	40 274	НВsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2	ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ (n=21 708)
4	Модельные пулы (24+4 донации):	293
4.1	- контаминированные ВГВ	96	НВsAg	ДНК ВГВ
4.2	- контаминированные ВГС	128	анти-ВГС	РНК ВГС
4.3	- контаминированные ВИЧ	69	анти-ВИЧ1,2	РНК ВИЧ
5	Производственные пулы (котловые загрузки)	572	НВsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2	ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ, РНК ВЗН (n=15)

Референс-материалы. Отраслевые стандартные образцы: ОСО НВsAg 42-28-311-03П; ОСО анти-ВГА 42-28-314-00. Международные стандартные образцы: 2-й Международный стандарт антител к НВsAg (анти-НВs), код 07/164; 3-й Международный стандарт РНК ВГС, код 06/100.

Раствор иммуноглобулина получали в Нижегородском филиале ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России из плазмы крови здоровых доноров по промышленному регламенту на “Имбиоглобулин”. Корректировали рН до 4,5-7,5 и концентрацию белка, добавляли стабилизатор. Раствор стерилизовали, используя мембранные шприцевые насадки Millex.

Готовые лекарственные формы иммуноглобулина (ФСП4201001316-01; ЛС-000177-171011) получали в Нижегородском филиале ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России.

Растворы для инактивации. СД-смесь готовили, используя ТБФ, натрия холат (Sigma-Aldrich) и дистиллированную апирогенную воду (воду для инъекций). Указанные компоненты использовали в таких соотношениях, чтобы получить концентрацию ТБФ и натрия холата в смеси, необходимую для создания вирусинактивирующей дозы в растворе при разбавлении в 10 раз. Аналогично готовили раствор натрия каприлата (200 ммоль). Раствор гидроксида алюминия, содержащий 1,0-1,5 г Al₂O₃ в100 г суспензии, готовили в соответствии с промышленным регламентом производства.

Вируссодержащие материалы. Для моделирования вирусной контаминации in vitro использовали плазму крови доноров-носителей ВГВ, ВГС и ВИЧ.

Для экспериментального моделирования инфекции вируса гепатита В утят (ВГВУ) in vivo использовали пул плазмы крови уток, инфицированных ВГВУ (штамм “Уфа-04”). Титр вируса, выраженный в инфицирующих дозах, вызывающих развитие болезни у 50% зараженных экспериментальных животных (ID₅₀), определяли по методу Рида и Менча [Reed L., Muench H, 1938]. Для опытов использовали концентрацию ВГВУ не менее 5,5 log₁₀ ID_50.

Для модельных опытов с возбудителем вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВВД-БС КРС) использовали цитопатогенный штамм ВК-1. Концентрация тест-вирусной суспензии составляла не менее 6,5 log₁₀ тканевых цитопатогенных доз для 50% зараженных клеток (ТЦД_50/мл)_.

Методы

Серологические маркеры (НВsAg, антитела к ядерному антигену вируса гепатита В (анти-НВc), ядерный антиген вируса гепатита С (НСсAg), анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2, антитела к вирусу гепатита А (анти-ВГА) в плазме крови выявляли методом ИФА с использованием наборов реагентов производства Нижегородского филиала ФГУП “НПО “Микроген”, ООО “Диагностические системы”, (Н.Новгород); ЗАО “Вектор-Бест” (Новосибирск); “Био Рад” (Франция). Концентрацию антител к парвовирусу В19 (анти-В19) определяли с использованием количественных наборов “RIDASCREEN Parvovirus IgG” и “RIDASCREEN Parvovirus IgМ” (R-Biopharm AG, Германия). Антитела к антигенам Т-лифотропного вируса 1 и 2 типов (анти-HTLV1,2) определяли с использованием диагностических наборов “ИммуноКомб II HLTV I&II” (ЗАО “Биоград”, С.-Петербург). Концентрацию НВsAg определяли в серии кратных разведений с использованием соответствующих референс-материалов с помощью метода параллельных линий в программе Microsoft Excel.

Активность антител (анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2) в положительных образцах определяли по КП, как отношение значения оптической плотности образца (ОПобр.) к критическому значению оптической плотности (ОПкрит). Для проб, имеющих значение ОП более 2,0, готовили серию 10-кратных разведений, определяя КП с учетом фактора разведения.

Молекулярно-генетические маркеры вирусов (РНК ВГС, ДНК ВГВ, РНК ВИЧ, ДНК В19 V) выявляли в ПЦР с использованием диагностических наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва), ЗАО “Вектор Бест” (Новосибирск), ООО “ДНК-технологии" (Москва).

Физико-химические свойства. Повреждения структуры IgG оценивали по изменению молекулярного состава, определяемого методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Белковый состав изучали методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) с использованием диагностического набора “Поли-ИЭФ” (Филиал ФГУП “НПО “Микроген”, Нижний Новгород).

Содержание иммуноглобулинов класса А (IgA) и класса М (IgM) определяли с использованием диагностических наборов производства “Seramun Diagnostica GmbH” (Германия) и в реакции иммунодиффузии по Манчини.

Содержание подклассов IgG определяли методом ИФА с использованием диагностических наборов “Подклассы-IgG-ИФА-Бест” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск).

Осмомолярность раствора иммуноглобулина определяли криоскопическим методом с использованием осмометра МТ-4 (НПП “Буревестник”, С.-Петербург). Определение проводили по ГФ ХII, ч.1, с.78.)

Биологические свойства. Изменения функциональной активности IgG в области Fc-фрагментов оценивали по изменению антикомплементарной активности [МУ 3.3.2.1063-01], в области Fab-фрагментов - по активности специфических антител. Содержание противокоревых антител определяли в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом (НИИЭМ им.Л.Пастера, С.-Петербург). Содержание антиальфастафилолизина определяли в реакции нейтрализации с использованием токсина стафилококкового (ГУ НИИЭМ им. Н.И.Гамалеи, Москва) [ФСП 42-0504-4266-04]. Содержание анти-НВs определяли методом ИФА с коммерческими диагностикумами “MONOLISA ANTI HBS” (БиоРад, Франция) и “МикрАт-НВs” (филиал ФГУП “НПО “Микроген”, Нижний Новгород).

Остаточное содержание ТБФ и натрия холата определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890N с использованием капиллярной колонки НР-5, 0,32, 0,25 мкм, 30 м. Разработка методов определения выполнена совместно со специалистами НИИ молекулярной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им.И.М.Сеченова.

Модельное фракционирование осуществляли по модифицированному методу Кона-Онклея в лабораторных условиях с использованием центрифуги “Optima L-90K” (“Beckman Coulter”, США). Полная технологическая схема производства препаратов иммуноглобулинов представлена на рис.2.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Технологическая схема получения IgG человека для внутривенного введения (1,2,3,4,5,6,7,8,9 - точки отбора проб).

Моделирование технологического процесса. В растворы иммуноглобулина добавляли вируссодержащий материал в соотношении 1/10-1/20. Затем опытные пробы обрабатывали с целью удаления или инактивации вирусов, задавая параметры процесса: концентрацию белка, наличие или отсутствие стабилизатора, рН, температуру, продолжительность процесса. Затем отбирали пробы и тестировали на остаточную инфекционность.

Для выполнения опытов использовали оборудование и материалы, позволяющие максимально приблизить изучаемый процесс к условиям производства. Отрицательный (К-) и положительный (К+) контроли обрабатывали аналогично, но К- без добавления вируса, а К+ без добавления вирусинактивирующих агентов.

Уровень вирусной редукции оценивали по динамике изменения концентрации вирусов на стадиях технологического процесса. Для расчета использовали специальную шкалу логарифмического уменьшения вирусной нагрузки в начале и конце процесса [http//www.emea.europa.eu]:

, где R - фактор редукции; V₁ - объем исходного материала, мл; V₂ - объем материала после обработки, мл; Т₁ - концентрация (титр) вируса в исходном материале; Т₂ - концентрация (титр) вируса в материале после обработки.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel и STATISTICA 6.0. Описание количественных признаков по выборке проводилось с помощью среднего значения и его 95% доверительного интервала (confidence interval, CI). Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Для оценки корреляции между показателями в образцах плазмы рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_s) [Гланц С., 1998].

Результаты исследований и их обсуждение

Распространенность и закономерности распределения маркеров ВГС, ВИЧ и ВГВ у доноров

Исследование распространенности гемотрансмиссивных вирусов в популяции доноров, изучение закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров у инфицированных лиц необходимы для разработки обоснованного с научной и экономической точки зрения методологического подхода к организации контроля вирусной безопасности плазмы крови доноров, как объекта для трансфузий, так и сырья для получения лечебных препаратов.

Гетерогенность популяции ВГС, а также разнообразная конструкция диагностических наборов, для изготовления которых используют как рекомбинантные белки, так и синтетические пептиды, часто приводят к противоречивым результатам при скрининге донорской плазмы. В связи с этим проведено комплексное исследование образцов плазмы крови методами ИФА и ПЦР с использованием тест-систем разных производителей и исследована корреляция между активностью анти-ВГС, генотипами вируса и концентрацией РНК ВГС у доноров-вирусоносителей.

Всего исследовано 74 750 образцов донорской плазмы. Выявлено 185 донаций, содержащих маркеры ВГС. Дополнительное исследование этих образцов с использованием иммуноферментных тест-систем трех производителей, включая набор “Монолиза ВГС Аг-Aт Ультра” для одновременного выявления НСсAg и анти-ВГС, показало, что 158 образцов (85,4% от количества инфицированных) были положительными во всех тестах, при этом в 128 образцах РНК ВГС выявлена, в 30 - не выявлена. В 26 образцах (14,1% от количества инфицированных) обнаружены дискордантные (несовпадающие у разных производителей иммуноферментных тест-систем) результаты. Характерно, что в этих образцах были выявлены низкие КП антител (менее 3), а в 2 образцах была обнаружена РНК ВГС в концентрации 1,0 х10³ и 2,1х10⁷. Наконец, была выявлена одна серонегативная плазма (0,5%), отрицательная при исследовании с использованием всех тест-системам, но имеющая концентрацию вирусного генома 2,3х10⁷ МЕ/мл. Это свидетельствовало, что плазма была получена от донора, находящегося в периоде “серологического окна”. Несмотря на высокую концентрацию РНК, что должно сопровождаться наличием в плазме HCcAg, результат исследования этого образца с помощью тест-системы “Монолиза ВГС Аг-Aт Ультра”, предназначенной для одновременного выявления антител и антигена, также был отрицательным.

Концентрация РНК ВГС в положительных образцах колебалась от 5х10² до 7,5х10⁷ МЕ/мл. Распределение концентраций РНК ВГС по частоте встречаемости, в том числе по двум основным генотипам, представлено на рис. 3,а.

В РНК ВГС-позитивных образцах активность специфических антител находилась в диапазоне от 2 до 19 235 КП и была достоверно выше, чем в РНК ВГС- негативных донациях, активность антител у которых находилась в пределах от 1 до 5078 КП (р?0,001). Выявлено также статистически значимое различие (р?0,001) активности антител у доноров, инфицированных генотипом 1в (12? КП ?19355) по сравнению с таковой у доноров, инфицированных генотипом 3а (2? КП ?8655). При этом между активностью анти-ВГС и концентрацией вирусного генома в РНК ВГС-позитивных донациях корреляции не выявлено (рис. 3,б).



а - распределение концентраций РНК ВГС доноров-вирусоносителей по частоте встречаемости (n=128)	б - связь между концентрацией РНК ВГС и КП анти-ВГС (n=128)

Рис. 3. Особенности распределения маркеров ВГС у инфицированных доноров.

Полученные данные подтверждают, что для реципиентов плазмы и ее препаратов серьезную опасность представляют сероконверсионные донации и образцы с низкой активностью анти-ВГС, которые при обследовании доноров могут давать ложноотрицательные результаты. Такая плазма может поступать в лечебные учреждения и на предприятия фракционирования как соответствующая требованиям безопасности. По результатам наших исследований частота выявления донаций, полученных в период “серологического окна”, составляет 1 случай на 74 750 исследованных единиц плазмы. Частота встречаемости образцов с низким уровнем КП анти-ВГС, которые часто определяются как серонегативные, составляет 0,035% от общего числа обследованных доноров, при этом в 1 случае из 37375 такая плазма содержит РНК ВГС.

С целью изучения закономерностей выявления маркеров ВИЧ у доноров нами было исследовано 72 образца плазмы крови, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц. Показано, что 95,8% анти-ВИЧ-позитивных образцов содержали РНК ВИЧ, при этом в 4 образцах (5,6% от общего количества исследованных образцов) концентрация РНК ВИЧ составляла менее 1000 копий/мл, в 5 образцах (6,9%) образцах - от 1000 до 5000 копий/мл, в 5 (6,9%) образцах - от 5000 до 10000 копий/мл и в 55 (76,4%) образцах - более 10000 копий/мл (1 копия ~1,75 МЕ). Корреляции между активностью анти-ВИЧ1,2 и концентрацией РНК ВИЧ не выявлено.

Следует отметить, что активность специфических антител у ВИЧ-инфицированных была достоверно выше, чем у ВГС-инфицированных доноров (р?0,001): 409 ? КП_{анти-ВИЧ1,2} ? 943 750 и 2 ? КП_{анти-ВГС} ?19235. Однако из-за отсутствия количественных стандартов показатель КП анти-ВИЧ1,2 и анти-ВГС, представленный в наших исследованиях, относителен и складывается главным образом из уровня иммунного ответа, специфической активности диагностических наборов, а также способности эффективно выявлять вирусный маркер при разбавлении (“dilution sensitivity”), что особенно важно при контроле плазмы для фракционирования [EMEA Workshop on the Plasma Master File//CPMP/BWP/1737/02].

На следующем этапе работы были изучены особенности распределения маркеров ВГВ у доноров: анти-НВc, анти-НВs, НВsAg и ДНК ВГВ, а также корреляция между концентрацией ДНК ВГВ и НВsAg у доноров-вирусоносителей. Для этого исследовали 2702 образца плазмы крови здоровых доноров и 125 образцов, отбракованных на станциях переливания крови по НВsAg и анти-НВс.

В первой группе выявлено 92 (3,4%) образца, содержащих анти-НВс, но не содержащих анти-НВs. При исследовании этих же образцов методом ПЦР, в том числе с дополнительным ультрацентрифугированием, обеспечивающим предел обнаружения ДНК ВГВ на уровне 50 копий/мл (1,7 копий ~ 1 МЕ), вирусный геном не был выявлен.

Результаты исследований на НВsAg, анти-НВс, ДНК ВГВ образцов второй группы разделили на несколько категорий. Для удобства статистической обработки концентрацию НВsAg и ДНК ВГВ представили в логарифмическом масштабе (табл.2).

Таблица 2

Распределение серологических и молекулярно-генетических маркеров ВГВ у инфицированных доноров (n=125)

№ п/п	Категория	n	Концентрация НВsAg (log10 нг/мл)	Концентрация ДНК ВГВ (log10 копий/мл)	Анти-НВс (+), n	Aнти-НВс (-), n
			М+m	диапазон	М+m	диапазон
1	НВsAg (-) ДНК ВГВ (-)	16	-	-	-	-	10	6
2	НВsAg (+) ДНК ВГВ (-)	13	0,75+1,26	От -1,04 до 4,13	-	-	11	2
3	НВsAg (+) ДНК ВГВ (+/-)	12	1,83+0,89	От -1,70 до 3,75	-	Предел детекции	12	0
4	НВsAg (+) ДНК ВГВ (+)	24	2,97+0,42	От 0,64 до 4,45	-	Предел детекции	24	0
5	НВsAg (+) ДНК ВГВ (++)	60	3,59+0,20	От 1,39 до 5,04	3,89+0,19	От 2,47 до 8,44	60	0

Примечание. НВsAg (+) -результат положительный (предел детекции 0,05 нг/мл);

ДНК ВГВ (+/-) - результат положительный только при дополнительном концентрировании НК (предел детекции 50 копий/мл или 1,7 log₁₀ копий/мл);

ДНК ВГВ (+) - результат положительный в качественном тесте (предел детекции 100 копий/мл или 2,0 log₁₀ копий/мл);

ДНК ВГВ (++) - результат положительный в количественном тесте (предел детекции более 300 копий/мл (2,5 log₁₀ копий/мл).

Установлено, что в 36 из 96 ДНК ВГВ-позитивных образцов уровень вирусной нагрузки низкий, при этом концентрация НВsAg в этих образцах составляла от 4,3 нг/мл до 30 мкг/мл. Особенности распределения НВsAg и ДНК ВГВ у доноров-носителей представлены на рис.4,a и 4,б.



а- связь между концентрацией НВsAg и ДНК ВГВ (n=96)	б- распределение вирусной нагрузки у доноров-вирусоносителей (n=60)

Рис.4. Графическая иллюстрация особенностей распределения маркеров ВГВ у инфицированных доноров

Результаты генамплификационного тестирования НВsAg-позитивных образцов показали, что в образцах с низкой концентрацией антигена, составляющей менее 100 нг/мл (n=19), при стандартной процедуре тестирования ДНК ВГВ была выявлена только в 6 (31,5%) случаях, из них в 2 с концентрацией около 1000 копий/мл. При дополнительном концентрировании НК (31 000 g, 2 ч) эффективность выявления ДНК ВГВ в образцах этой группы составила 57,9 %. В образцах с высокой концентраций НВsAg, составляющей более 100 000 нг/мл (n=2), концентрация ДНК ВГВ не превышала 5000 копий/мл.

Таким образом, относительно высокая эффективность выявления НВsAg и низкая - ДНК ВГВ у инфицированных доноров свидетельствует о недостаточной чувствительности стандартной процедуры исследования методом ПЦР, особенно если тест выполняется в формате минипулов. Такой скрининг может быть направлен только на выявление классических форм острого гепатита В в период “серологического окна” или ранней сероконверсии, когда нарастание концентрации НВsAg и ДНК ВГВ происходит в линейной прогрессии. Эту особенность важно учитывать не только при контроле плазмы для фракционирования, но и при обследовании доноров на ДНК ВГВ, которое также осуществляется в формате минипулов.

Выявление маркеров “неактуальных” гемотрансмиссивных вирусов в плазме крови доноров

Вирусы без липидной оболочки, к которым относятся вирус гепатита А (ВГА) (семейство Picornaviridae) и парвовирус В19 (семейство Parvoviridae) - предмет особой обеспокоенности производителей препаратов крови. Эти вирусы чрезвычайно устойчивы к химическим и физическим факторам инактивации [CPMP/BWP/295/95, WHO Technical Report, 2004]. Требует также внимания изучение распространенности на территории РФ некоторых экзотических вирусов, включая Т-лимфотропный вирус 1-го и 2-го типов (семейство Retroviridae) и вирус лихорадки Западного Нила (семейство Flaviviridae). Учитывая, что обследование доноров на эти вирусы не является обязательным, уровень вирусной нагрузки в производственных пулах может зависеть только от распространенности их в популяции доноров, а риск заражения- от степени патогенности и устойчивости к вирусинактивирующим и вирусэлиминирующим процедурам.

Распространенность маркеров этих вирусов в популяции доноров Приволжского федерального округа представлена в табл. 3. Показано, что парвовирус В19 является наиболее распространенным контаминантом плазмы для фракционирования: виремия обнаружена в 1 % донаций, из них в 0,3% концентрация вирусного генома превышала установленный для доноров уровень инфекционности, равный 1,0х10⁴ ГЭ/мл [www.fda.gov]. Наличие вируснейтрализующих антител класса IgG во всех ДНК - позитивных образцах, безусловно, является положительным фактором. Средний уровень анти-В19 в ДНК-позитивных донациях составил 107,3 МЕ/мл (CI 95% 55,7ч158,9 МЕ/мл), и был достоверно выше, чем в ДНК-негативных образцах, а именно 27,5 МЕ/мл (CI 95% 19,6ч35,4 МЕ/мл).

Таблица 3

Распространенность маркеров “неактуальных” гемотрансмиссивных вирусов у доноров

Вирус	Характеристика вируса (диаметр, оболочка, структура НК)	Исследуемый маркер	Частота выявлния у доноров, %	Диапазон концентраций
ВГА	Диаметр 28-30 нм, без оболочки, ssRNA	Анти-ВГА	61,0	0,025 - 60,0 МЕ/мл
		РНК ВГА	0,0	-
В19 V	Диаметр 18-26 нм, без оболочки, ssDNA	АнтиВ19/IgG	30,4	19,6-158,9 МЕ/мл
		АнтиВ19/IgM	0,1	-
		ДНК В19 V	1,0	103 - 106 ГЭ/мл
Т-лимфо-тропный вирус 1,2	Диаметр 50-90 нм, липидная оболочка, диплоид, 2ssRNA	Анти-HTLV1.2	0,5	-
ВЗН	Диаметр 40-50нм, липидная оболочка, ssRNA	РНК ВЗН	Не выявлен	-

Однако при пулировании плазмы происходит изменение соотношений уровня антител и концентрации вирусного генома. Поэтому вирусная безопасность плазмы для фракционирования в отношении парвовируса В19 - это актуальная проблема, которую производителям препаратов крови необходимо будет решить в ближайшее время. Следует также обратить внимание на выявление у доноров антител к Т-лимфотропному вирусу 1-го и 2-го типов. В Службе крови должна присутствовать настороженность в отношении этой инфекции, а производители препаратов крови должны оценивать уровень безопасности лечебных препаратов с учетом полученных данных.

Относительно ВГА результаты наших исследований показали, что у доноров обнаружен высокий уровень иммунитета против этого вируса. Анти-ВГА выше защитного уровня были выявлены у 61% обследованных доноров в диапазоне концентраций от 25 мМе/мл до 60 МЕ/мл. У 28% лиц уровень антител не превышал 10 МЕ/мл, в 25 % он составлял 11-20 МЕ/мл, в 23% - 21-30 МЕ/мл, в 13% - 31-40 МЕ/мл, в 11% - 41-60 МЕ/мл. Несмотря на то, что Приволжский федеральный округ не является благополучным по гепатиту А, вирусоносителей мы не выявили, в том числе и среди доноров с высоким титром антител.

Методологические подходы к повышению вирусной безопасности плазмы для фракционирования

Первый этап безопасности плазмы для фракционирования обеспечивается при заготовке ее от доноров и включает отбор доноров, карантинизацию и исследование на маркеры вирусных инфекций в учреждениях Службы крови. Обязательными тестами при заготовке плазмы крови от доноров являются определение НВsAg, антител к ВГС, антител и антигена р24 к ВИЧ [ГОСТ Р 52249-2009].

Обследование доноров на РНК ВГС, РНК ВИЧ и ДНК ВГВ методом ПЦР, несмотря на утверждение приказа Минздравсоцразвития №261 от 6.06.2008, внедрено не повсеместно по причине отсутствия необходимого оборудования и относительно высокой стоимости анализов. Как следствие, часть плазмы крови доноров, разрешенной к применению в РФ, не исследовано методом ПЦР. Недостаточно эффективно также контролируется качество исследований методом ИФА. Это повышает риск поступления на переработку донаций, полученных в период “серологического окна”, а также с ложноотрицательными результатами серологических тестов.

Поэтому организация производственного процесса, предполагающего пулирование плазмы от большого числа доноров, требует разработки специальных методологических подходов к организации контроля вирусной безопасности плазмы для фракционирования. Наиболее распространенным является алгоритм контроля, когда методом ИФА исследуют индивидуальные донации, а методом ПЦР- минипулы плазмы. Однако такая форма контроля трудоемка и экономически не обоснована. Оптимальным для контроля сырья на предприятиях является тестирование минипулов плазмы методами ИФА и ПЦР.

Размер минипула, подлежащий входному контролю, обычно определяют производители, исходя из технологических особенностей производства. Однако пулирование может снижать эффективность выявления вирусных маркеров в пулах плазмы. Поэтому в модельных опытах было изучено влияние размера минипула и чувствительности используемых диагностических наборов на эффективность выявления инфицированных образцов. Исследования выполнены для минипулов 24+4 донации. Для формирования модельных пулов было использовано 293 образца, положительных по ВГВ, ВГС или ВИЧ, имеющих случайное распределение серологических и молекулярно-генетических маркеров: 128 образцов с КП_{анти-ВГС} от 2 до 19 235 и концентрацией РНК ВГС от 5 Ч 10² до 7,5 Ч 10⁷ МЕ/мл; 69 образцов с КП_{анти-ВИЧ1,2} от 751 до 943 750 и концентрацией РНК ВИЧ от 5,7 Ч 10² до 4 Ч 10⁷ копий/мл; 96 образцов с концентрацией НВsAg от 4,4 нг/мл до 110 мкг/мл и ДНК ВГВ от 50 копий/мл до 2,8 Ч 10⁸ копий/мл.

Модельные минипулы готовили в лабораторных условиях путем смешивания в равных объемах 19-27 отрицательных образцов и 1 образца, положительного по ВГВ, ВГС или ВИЧ. Модельные пулы исследовали методами ИФА и ПЦР.

Эффективность выявления соответствующих маркеров оценивали как долю положительных результатов от общего количества исследованных пулов. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Эффективность выявления маркеров ВГВ, ВГС и ВИЧ в модельных минипулах плазмы

Вирусные маркеры	Количество модельных пулов	Результат исследования методами
		ИФА	ПЦР в режиме реального времени
		аналитическая чувствительность	эффектив- ность вы-явления, %	аналитичес-кая чувстви-тельность	эффектив- ность выявления, %
Анти-ВГС/ РНК ВГС	128	100% на контрольной панели	91,4	150-200 МЕ/мл	96,4
- “ -	- “ -	-	-	100 МЕ/мл	98,3
- “ -	- “ -	-	-	10 МЕ/мл*	100,0
Анти-ВИЧ1,2/ РНК ВИЧ	69	100% на контрольной панели	100,0	200 МЕ/мл	93,4
- “ -	- “ -	-	-	20 МЕ/мл*	99,2
НВsAg/ ДНК ВГВ	96	0,05 нг/мл	93,8	100 копий/мл	60,4
- “ -	- “ -	-	-	15 копий/мл*	84,9

* Дополнительное концентрирование НК

Показано, что исследование минипулов методом ИФА на анти-ВИЧ1,2 позволяло эффективно выявлять инфицированные донации. При исследовании минипулов, контаминированных анти-ВГС-позитивными образцами, эффективность обнаружения антител в них составила 91,4%, при этом в модельных пулах, контаминированных положительными образцами с низкими КП (КП_{анти-ВГС}< 24), только 14,2-21,4%. Полученные результаты были закономерными и связаны с различиями в характере распределения КП антител при гепатите С и ВИЧ-инфекции.

При исследовании модельных пулов, контаминированных ВГВ-позитивными образцами, в 6 из 96 исследованных проб НВsAg не был выявлен, при этом исходная концентрация антигена в образцах, используемых для контаминации, варьировала от 4,4 до 57 нг/мл. Учитывая полученные данные, мы предположили, что, кроме фактора разбавления, причиной снижения эффективности выявления НВsAg в пулах плазмы было присутствие анти-НВs, которые нейтрализовали НВsAg, исключая его из реакционной смеси.

Эффективность выявления вирусного генома в пулах плазмы методом ПЦР нами была оценена для разных уровней аналитической чувствительности метода. Выявлена зависимость между эффективностью скрининга, чувствительностью диагностических наборов и размером минипула.

Полученные данные были использованы для определения остаточного риска контаминации производственных пулов плазмы. Расчеты выполнены с учетом следующих факторов: 1) особенностей распределения вирусных маркеров у инфицированных доноров; 2) вероятности поступления на предприятие серопозитивных вируссодержащих образцов; 3) вероятности получения донаций в период “серологического окна” (по данным собственных исследований и данным литературы [Stramer S.L. et al., 2011; Offergeld R, 2005]); 4) аналитической чувствительности используемых тестов. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Остаточный риск контаминации производственных пулов (1000 донаций) ВГВ, ВГС и ВИЧ

Вирус	Вероятность поступления инфицированных донаций*, 1/n	Частота контаминации производственных пулов (1/n1) в случае, если
		входной контроль не проводить	входной контроль в формате минипулов 24+4 донации
			ИФА	ИФА/ПЦР
ВГВ	1/29 916	1/39	1/242	1/303-1/709
ВГС	1/11 987	1/19	1/47	1/1656 и менее
ВИЧ	1/1 000 000 и менее	1/597	1/2308	1/4616 и менее

* С учетом донаций, полученных в период “серологического окна”

Подтверждено, что в случае формирования производственных пулов только на основании результатов серологического обследования доноров, выполненного на этапе заготовки плазмы крови, риск контаминации их вирусами гепатитов будет высоким. При этом анти-ВГС в таких пулах выявляться не будут, а концентрация РНК ВГС может достигать 10⁶ МЕ/мл и более. Входной контроль методом ИФА снижает риск. Наиболее эффективным ИФА-тестирование минипулов оказалось для выявления ВИЧ-серопозитивных донаций, наименее эффективным - для ВГС-серопозитивных донаций. Характерно, что дополнительное ПЦР-тестирование минипулов на РНК ВГС снижало риск контаминации производственных пулов в 35 раз и более, а аналогичный контроль на ДНК ВГВ - только в 1,2-2,9 раза.

...