К сожалению, сегодня нет четкого представления о том, какой риск является допустимым. В Европе и других развитых странах мира разработаны руководящие документы, определяющие требования к генамплификационному тестированию плазмы для фракционирования, согласно которым в минипуле должно быть обнаружено по крайней мере 10 000 МЕ/мл РНК ВИЧ и 5000 МЕ/мл РНК ВГС (при р<0,05) [http://www.who.int/bloodproducts/publications/WHO_TRS_924_A4.pdf; www.the-stationery-office.co.uk/nbs/rdbk2001/blood45.htm; http://www.pei.de].

С учетом рекомендаций ВОЗ, а также на основании полученных аналитических данных нами был разработан алгоритм входного контроля сырья для производства препаратов крови методами ИФА и ПЦР в формате минипулов, включающих 24+4 донации (рис.5).



Мультиплексные диагностические наборы (предел обнаружения РНК ВГС <100 МЕ/мл, РНК ВИЧ<менее 400 МЕ/мл, ДНК ВГВ<50 МЕ/мл).

Рис.5. Алгоритм контроля вирусной безопасности плазмы для фракционирования (на примере Нижегородского филиала ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России).

Эффективность процедуры контроля подтверждена экспериментально. С момента ее внедрения на предприятии исследовано 572 производственных пула плазмы на анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2, НВsAg, а также РНК ВГС, РНК ВИЧ и ДНК ВГВ. Положительных результатов не выявлено, что соответствует требованиям Национального стандарта Российской Федерации ГОСТ Р 52249-2009.

В то же время полученные данные свидетельствуют, что при первичном обследовании доноров с целью признания пригодности плазмы крови для использования в лечебно-профилактических учреждениях, а также, если технологический процесс не включает эффективных стадий элиминации и инактивации вирусов, специфика контроля должна быть следующей:

* ИФА-скрининг проводить только в формате индивидуальных донаций.

* ПЦР-тестирование минипулов возможно только при минимальном размере пула, вплоть до проведения исследований в формате индивидуальных донаций.

Несмотря на высокую стоимость исследований, такой алгоритм контроля оправдан, поскольку необходимо учитывать тяжелые медико-социальные последствия инфицирования пациентов гемотрансмиссивными вирусами.

Практическим результатом работы стали разработка и утверждение Методических рекомендаций “Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства лечебных препаратов из плазмы крови доноров”. Разработан нормативный документ, в котором определены обязательные тесты на вирусные маркеры, разработаны процедура минипулирования, позволяющая идентифицировать каждую инфицированную донацию, установлены требования к максимальному размеру минипулов и критерии обеспечения качества исследований. Документ гармонизирован с требованиями Европейской фармакопеи, ГОСТ Р 52249-2009, Технического регламента “О требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии”, утвержденного постановлением Правительства РФ №29 от 26.01.10, а также с рекомендациями ВОЗ и Европейского агентства медицинских продуктов.

Стандартизация генамплификационных методов исследования

ОСО РНК ВГС, предназначенный для стандартизации и контроля качества генамплификационных методов исследования, был получен путем разведения РНК ВГС-позитивной плазмы крови вирусоносителя (генотип 3a) плазмой крови здоровых доноров. Препарат разливали в дозе 0,5 мл с последующей лиофилизацией. При контроле точности розлива весовым методом коэффициент вариации составил 3,2 %, остаточная влажность-2 %.

Аттестацию ОСО относительно МСО осуществляли следующим образом: готовили серию пятикратных разведений испытуемого и референс-препарата, каждое разведение готовили независимо друг от друга и тестировали в трех повторах методом ПЦР с определением концентрации РНК ВГС в соответствии с инструкцией по применению диагностического набора. Полученные аналитические данные для МСО и ОСО подвергали совместной статистической обработке с помощью метода параллельных линий. Графики зависимости логарифма измеренного значения концентрации от логарифма дозы (титра) тестировали на линейность и параллельность, используя метод дисперсионного анализа. Затем определяли концентрацию РНК ВГС в ОСО на основе известной концентрации МСО, а также границы доверительного интервала (CI 95%) (табл. 6).

Графики зависимости концентраций МСО и ОСО от логарифма дозы (титра) представлены на рис.6. В данном случае при построении графиков использованы результаты измерений по всем циклам. Подобные графики строились также при обработке данных каждого цикла измерений.



Рис.6.Графики зависимости концентрации РНК ВГС от титра в МСО и ОСО.

C_{РНК ВГС} (log₁₀ МЕ/мл) - измеренное значение концентрации РНК ВГС, (log₁₀ МЕ/мл)

Таблица 6

Концентрация РНК ВГС в ОСО, рассчитанная относительно МСО методом параллельных линий (по четырем циклам исследований)

Цикл/титр	Концентрация РНК ВГС, log10 МЕ/мл (Xсред.+ s) (измеренные значения)	Концентрация РНК ВГС, log10 МЕ/мл
	Разведение ОСО	Разведение МСО	в ОСО отно-сительно МСО	CI 95%
	1:1	1:5	1:25	1:1	1:5	1:25
I	5,71±0,05	5,07±0,05	4,33±0,18	5,12±0,02	4,35±0,05	3,83±0,03	5,81	5,69-5,95
	5,68±0,04	5,05±0,03	4,36±0,09				5,81	5,73-5,89
II	5,59±0,07	5,11±0,05	4,36±0,09	4,94±0,08	4,31±0,03	3,79±0,02	5,94	5,83-6,07
	5,74±0,09	5,07±0,05	4,33±0,18				5,94	5,79-6,11
III	5,73±0,05	4,98±0,12	4,52±0,09	5,15±0,01	4,37±0,04	3,74±0,01	5,87	5,77-5,98
	5,75±0,01	5,02±0,06	4,39±0,08				5,83	5,76-5,89
IV	5,97±0,06	5,37±0,05	4,53±0,26	5,37±0,01	4,74±0,10	3,86±0,04	5,81	5,64-5,99
Общее	5,74±0,12	5,10±0,13	4,4±0,14	5,14±0,17	4,44±0,19	3,81±0,05	5,86	5,79-5,92

Разработанный препарат зарегистрирован в Реестре отраслевых стандартов (ОСО 42-28-366(1)-11П). Аттестованная характеристика содержания РНК ВГС в ОСО составила 7,2х10⁵ МЕ/мл или 3,6х10⁵ МЕ/флакон, что эквивалентно 5,86 lоg₁₀ МЕ/мл или 5,56 lоg₁₀ МЕ/флакон соответственно. Наличие линейности и параллельности графиков для МСО и ОСО свидетельствовало, что исследуемые объекты имели одинаковую природу, содержали одно и то же активное вещество.

Расчеты методом параллельных линий выполнены с использованием модуля в программе Microsoft Excel. Методологический подход может быть рекомендован для аттестации стандартных образцов второго уровня, включая контрольные или стандартные образцы предприятия, которые необходимы для ежедневного мониторинга качества исследований. В Европейской фармакопее, например, рекомендовано при исследовании производственных пулов тестироватьб контрольный образец с концентрацией РНК ВГС 100 МЕ/мл [Human Plasma for fractionation. (2008:2073) In.European Pharmacopoeia].

В целом стандартизация генамплификационных методов исследований направлена на снижение риска вирусной контаминации плазмы для фракционирования. Однако гарантировать безопасность готовых препаратов можно только в том случае, если при их изготовлении используются методы, позволяющие эффективно удалять и инактивировать вирусы.

Разработка вирусбезопасной технологии производства препаратов иммуноглобулинов

Новое поколение препаратов иммуноглобулина G для внутривенного введения на российском фармацевтическом рынке представлено, в основном, зарубежными производителями. Из отечественных препаратов применяется только “Имбиоглобулин”, разработанный в Нижегородском филиале ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России под руководством проф. В.В. Анастасиева (2000). Этот препарат представляет собой высокоочищенный концентрат “нативных” молекул IgG, близких по структуре и свойствам к иммуноглобулинам, циркулирующим в крови. Удаление и инактивация вирусов при производстве “Имбиоглобулина” осуществляется главным образом в процессе спиртового фракционирования и при обработке гидроксидом алюминия. Однако эти технологические приемы не гарантируют полную безопасность продукта. Поэтому технологический процесс был усовершенствован и дополнен сольвент-детергентной стадией инактивации вирусов.

Оптимизацию условий вирусинактивирующей обработки осуществляли на основании изучения изменений физико-химических и биологических свойств IgG и вирулицидной активности используемых реагентов в диапазоне концентраций от 0,015% до 0,6% ТБФ и от 0,01% до 0,4% натрия холата. В результате нами был разработан следующий вариант СД-обработки: раствор IgG с концентрацией белка 4,5-6,5%, рН 6,5-7,5, стабилизированный глицином до концентрации 1%, обрабатывали стерильной СД- смесью в конечной концентрации 0,3% и 0,2% соответственно. Смесь выдерживали в течение 6 ч при температуре от 30°С до 37°С. При сравнении физико-химических и биологических показателей качества СД-обработанного препарата с иммуноглобулином, не подвергнутым вирусинактивирующей обработке, достоверных различий не обнаружено.

Для очистки иммуноглобулина от реагентов использовали оригинальный способ очистки (патент RU 2352358), включающий экстракцию сольвента и детергента растительным маслом с температурой затвердевания не ниже 8°С, например, маслом какао, специально обработанным с целью удаления вредных примесей. Стерильное масло какао добавляли в обработанный растворителем и детергентом иммуноглобулин до концентрации 5-10%. Смесь выдерживали при температуре 37-45°С, постоянно перемешивая. Затем раствор охлаждали до 8°С и инкубировали в течение 10-15 ч для затвердевания масла. В конце инкубации температуру раствора понижали до 1,5-2,5°С, что создавало благоприятные условия для удаления масла. Окончательную очистку от вирусинактивирующих реагентов осуществляли с помощью ультрафильтрации с одновременным снижением рН до 4,4-4,8. При апробации технологии в условиях производства часть серий препарата получали без стадии масляной экстракции, используя только ультрафильтрацию с увеличенной кратностью отмывки. Преимуществом варианта технологии без использования масла какао было упрощение технологического процесса. Контроль качества очистки от реагентов оценивали методом газовой хроматографии.

Остаточное количество реагентов устанавливали на основании полученных аналитических данных, требований Европейской фармакопеи, сведений о токсичности реагентов и опыта зарубежных производителей: для ТБФ - не более 2 мкг/мл, для холата натрия - не более 100 мкг/мл.

Изучена стабильность физико-химических и биологических свойств СД-обработанного иммуноглобулина при хранении. Состав и свойства иммуноглобулина оставались стабильными в течение 2,5 года. Отсутствовала фрагментация препарата, не отмечено статистически значимого изменения содержания мономерной и димерной форм. Комплексная проверка серий препаратов по тестам, принятым Российским Фармакопейным Комитетом, позволила установить, что они полностью соответствовали требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения.

Разработанный вариант СД-обработки может быть использован в технологии производства препаратов иммуноглобулинов как для внутривенного, так и для внутримышечного введения. Технология легко встраивается на разных стадиях технологического процесса, не требует дорогостоящего оборудования.

Однако механизм действия СД-реагентов ограничивает область применения этой технологии и не решает проблему безопасности препаратов в отношении вирусов без липидной оболочки. Поэтому были предприняты попытки поиска новых химических соединений с другим механизмом вирулицидного действия. Критерии выбора были следующими: вещества не должны денатурировать белки и вызывать канцерогенного или тератогенного эффектов, должны быть изучены с точки зрения фармакологических свойств и применяться в фармацевтической промышленности (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика химических веществ, используемых для инактивации вирусов

Наименование соединения	Группа	Использование в технологии лекарств
Каприлат натрия	Производное жирной кислоты, детергент	При производстве альбумина
Бензалкониум хлорид	Смесь алкилбензилдиметиламмония хлорида (С6 до С18), ПАВ	Консервант в готовых лекарственных формах
Карбоплатин	Комплексное соединение платины, алкилирующее вещество	Лекарственный препарат. Цитостатик
Хлорамбуцил	Производное бис-в-хлорэтиламина, алкилирующее вещество	Лекарственный препарат. Цитостатик

Механизм действия каприлата натрия и бензалкониума хлорида заключается в связывании мембранных белков и разрушении липидной оболочки вирусов. Мишенью же нуклеофильных соединений, к которым относятся карбоплатин и хлорамбуцил, является геном вируса, и это делает эти вещества особенно перспективными для разработки новых технологий с расширенным спектром действия.

В модельных опытах in vitro и in vivo, а также на основании изучения физико-химических свойств IgG были определены дозы, обеспечивающие вирулицидный эффект, и оптимальные условия обработки. Результаты представлены в табл. 8.

Показано, что при использовании разных концентраций хлорамбуцила в водном растворе уровень редукции ВГС был невысоким. По-видимому, это связано с низкой растворимостью хлорамбуцила в воде. Предварительное растворение хлорамбуцила в димексиде или в ТБФ обеспечивало повышение уровня редукции.

Таблица 8

Вирусинактивирующие дозы и условия обработки IgG каприлатом натрия, бензалкониумом хлоридом, карбоплатином и хлорамбуцилом

Вещество/ изученный диапазон концентраций	Оптималь-ная кон-центрация в растворе IgG	Оптимальные условия обработки	Уровень редукции
		белок мг/мл	рН	t, єC	время, ч	ВГС, log10 РНК ВГС	ВГВУ, log10 ID50
Каприлат натрия/от 5 до 80 мМоль	10-40 ммоль (1,66-6,64 мг/мл)	20-70	4,0-5,0	18-37	1	? 3	? 5
Бензалкониум хло-рид/от 0,2 до 0,4 %	0,4% (~ 4 мг/мл)	20+1	6,5-7,5	37	1	? 3	? 5
Карбоплатин/ от 2,5 до 30 мг/мл	10-30 мг/мл	10+1	4,0	37	24	? 2	-
Хлорамбуцил/ от 2,5 до 10 мг/мл	2,5-10,0 мг/мл	10+1	4,0-5,0	37	24	? 0,5	-
Хлорамбуцил+димексид 1мг/10мг на 1мл	1 мг/мл+ 10 мг/мл	10+1	4,0-5,0	37	24	? 3,5	-
Хлорамбуцил+ТБФ 1мг/10 мг на 1 мл	1 мг/мл+ 10 мг/мл	10+1	4,0-5,0	37	24	? 3,5	-

В целом сочетание хлорамбуцила с растворителями, особенно с ТБФ, который, как известно, широко используется в составе СД-смесей, а также самостоятельно для вирусинактивирующей обработки, является наиболее интересным технологическим решением. Воздействуя одновременно на оболочку и геном вируса, такая смесь может обеспечить более эффективную вирусную инактивацию по сравнению с СД-обработкой. Детальное изучение эффективности этой технологии на модельных вирусах и оптимизация условий обработки должны стать предметом отдельного исследования.

Вирулицидный эффект бензалкониума хлорида был обнаружен только при концентрации последнего 4 мг/мл. Однако в этой дозе он вызывал агрегацию IgG. Содержание полимеров после вирусинактивирующей обработки увеличивалось до 15%. С целью уменьшения денатурации IgG был разработан вариант обработки при пониженной концентрации белка (20 мг/мл и менее) в присутствии стабилизатора глицина. В этих условиях содержание мономерной фракции IgG до и после обработки составило 90,4+5,9 и 91,1+4,8 % соответственно (изменения статистически незначимы при р?0,05).

Наилучшие результаты были получены в опытах с каприлатом натрия. В модельных опытах in vitro c использованием плазмы, содержащей РНК ВГС, и in vivo на модели ВГВУ выявлена высокая вирулицидная активность каприлата в концентрации более 10ммоль. Выбраны оптимальные условия обработки раствора иммуноглобулина, позволяющие обеспечивать стабильный вирулицидный эффект и сохранять физико-химические и биологические свойства препарата: концентрация каприлата натрия 20 ммоль, рН раствора от 4,0 до 5,0, температура от 18 до 29° С. Изготовлено 12 лабораторных и 4 экспериментально-производственных серий препарата. Подтверждено соответствие полученных препаратов требованиям НД. Проводится наблюдение за их качеством в процессе хранения.

Результатом выполненной работы стала разработка технологических схем производства препаратов IgG, дополненных сольвент-детергентной или каприлатной стадией инативации вирусов (рис.7). В качестве объекта сравнения использована классическая технология с применением пепсина.



Рис.7. Схема получения иммуноглобулина человека для внутривенного введения

Физико-химические и биологические свойства препаратов, полученных с использованием указанных технологических схем производства, представлены в табл. 9.

Таблица 9

	Иммуноглобулин для в/в введения ФСП 4201001316-01	Имбиоглобулин СД ФСП ЛС-000177-171011	Имбиоглобулин К (эксп.произ.серии)
	Норма по НД	Фактические n=20	Норма по НД	Фактические n=17	Фактические n=4
Прозрачность, ОП	ОП менее 0,05	0,021±0,006	ОП менее 0,05	0,017±0,004	0,003±0,002
Молекулярные параметры (%): полимеры (не более)/мономеры-димеры (не менее)/фрагменты (не более)	0/ 80,0/ 20,0	0,08±0,12 91,8±2,2 8,1±1,9	1,0/90,0/5,0	0,7±0,2 98,2±4,1 1,1±0,5	0,0±0,0 95,1±0,2 4,9±0,1
Фракционный состав: - дуги преципитации в ИЭФ	не более 2	1-2 дуги	не более 2	1 дуга	1 дуга
Специфическая активность: - антиальфастафилолизин (титр МЕ/мл) - антитела к вирусу кори (титр МЕ/мл) - антитела к HBsAg (МЕ/г) - антитела к ВГА (анти-ВГА) (Ме/мл)	не менее 2 не менее 25 не нормируется не нормируется	3,29±0,26 25,0±0,0 38,7±1,9 -	не менее 2 не менее 25 не менее 0,5 не нормируется	3,7±0,24 25,0±0,0 38,6±3,9 62,2±26,3	4,0±0,0 25,0±0,0 44,5±9,9 77,8±35,4
Антикомплементарная активность: - единица СН50 на 1 мг IgG	не более 1 единицы	0,17±0,05	не более 1 единицы	0,26±0,16	0,47±1,05
Осмоляльность (ммоль/кг Н2О)	не нормируется	-	не менее 240	286,0±25,1	275,2±26,2
Содержание IgA, мг/мл	не нормируется	0,34±0,05	не нормируется	менее 0,1	менее 0,1
Содержание IgM, мг/мл	не нормируется		не нормируется	0,15±0,11	менее 0,05
Распределение подклассов IgG (%) (IgG1/IgG2/Ig3/IgG4)	не нормируется	50,7±1,4 38,5±1,3 7,4±0,2 3,4±0,2	не нормируется	48,4±1,2 41,1±1,6 7,1±0,3 3,3±0,2	50,0±3,1 41,3±1,8 5,7±0,8 3,0±0,5
Трибутилфосфат (мкг/мл)	отсутствует	-	менее 2,0	От 0 до 0,9	-
Натрия холат (мкг/мл)	отсутствует	-	менее 100,0	От 0 до 39,6	-
Пирогенность	Апирогенен	Апирогенен	Апирогенен	Апирогенен	Апирогенен
Токсичность	Нетоксичен	Нетоксичен	Нетоксичен	Нетоксичен	Нетоксичен

Сравнительная характеристика качества препаратов иммуноглобулина G человека для внутривенного введения

Как видно из данной таблицы, препараты иммуноглобулинов нового поколения, инактивированные СД-методом или каприлатом натрия, соответствовали требованиям нормативных документов, а по ряду показателей, например, по содержанию мономеров IgG и примесей IgA, превосходили качество иммуноглобулина, полученного по классической технологии с использованием пепсина.

Усовершенствованная технология производства по уровню безопасности соответствует критериям ВОЗ, она включает 3 дополнительные стадии вирусинактивирующей обработки: адсорбцию гидроксидом алюминия, инкубацию при кислом значении рН и обработку СД-методом или каприлатом натрия.

Следует отметить, что СД- и каприлатный методы инактивации вирусов нами использованы в разных технологических схемах. С целью совмещения этих методов в одной технологической схеме обработку каприлатом натрия мы проводили на стадии спиртового фракционирования, а сольвент-детергентом, как указано в технологической схеме. Это обеспечивало не только высокий уровень вирусной безопасности получаемого продукта, но и дополнительную очистку IgG от балластных белков. Исследования в этом направлении планируется продолжить.

На следующем этапе необходимо было подтвердить эффективность разработанных технологических схем производства и их способность обеспечить надежный уровень безопасности полученных препаратов.

Валидация стадий элиминации и инактивации вирусов в производстве иммуноглобулина G человека для внутривенного введения

В РФ правила валидации вирусинактивирующих технологий не регламентированы. В отношении плазмы крови для фракционирования и лекарственных средств, получаемых из донорской крови или плазмы, обычно применяют соответствующие рекомендации ВОЗ [WHO Technical Report, Series N924, 2004] и нормативные документы Европейского агенства по оценке медицинских продуктов [CPMP/BWP/269/95; CPMP/BWP/268/95].

В настоящей работе был валидирован технологический процесс производства “Имбиоглобулина”, включающий стадию спиртового фракционирования и дополнительные технологические приемы удаления и инактивации вирусов, а именно неспецифическую сорбцию вирусов гидроксидом алюминия и СД-обработку.

Известно, что в процессе спиртового фракционирования плазмы крови происходит перераспределение вирусов по фракциям, но данные об уровнях редукции противоречивы [Mitra G. et al., 1988; Kempf C. et al., 2007; Yei S. et al., 1992; Piszkiewicz D. et al., 1985; Wells MA, 1986]. Чтобы оценить этот процесс для наиболее опасного контаминанта, каким является ВГС, нами было выполнено модельное фракционирование контаминированной плазмы крови (рис.1, см. “Методы”) и изучена динамика изменения концентрации РНК ВГС по стадиям технологического процесса. Уровень редукции рассчитывали с учетом изменения объемов продукта в ходе фракционирования, определяя общую вирусную нагрузку на каждой стадии процесса.

Показано, что на стадии получения осадка А (фракция II+Ш) уровень редукции РНК ВГС был невысоким и составил 0,95+0,21 log₁₀ МЕ/мл (точки отбора проб 1 и 2, см. “Методы”, рис.1). Последующие стадии осаждения (точки отбора 3, 4, 5, см. “Методы”, рис.1) приводили к перераспределению вирусов по стадиям процесса и в итоге к снижению концентрации РНК ВГС в осадке В (точка отбора 9, см. “Методы”, рис.1) более чем в 10³ раз. Суммарный уровень вирусной редукции ВГС при получении очищенной фракции IgG составил по результатам наших исследований 4,11+0,18 log₁₀ МЕ/мл. Аналогичные исследования, выполненные с плазмой крови, содержащей ДНК В19 V, показали, что многостадийный процесс производства иммуноглобулина обеспечивал снижение концентрации парвовируса В19 более чем в 10⁵ раз 5,69 ± 0,23 log₁₀ МЕ/мл._.

Дополнительная обработка раствора IgG гелем гидроксида алюминия в дозе 20 мл на 1 л раствора приводила к снижению концентрации РНК ВГС в 10² раз, а при увеличении дозы геля до 150 мл - в 10³ раз.

Таким образом, определение вирусного клиренса с помощью ПЦР является доступным и недорогим методом для оценки эффективности удаления вирусов, но, используя его, невозможно адекватно оценить эффективность инактивирующих технологий. Для этого необходимы методы, позволяющие оценивать жизнеспособность вирусных частиц.

Поэтому эффективность СД-обработки определяли в опытах in vivo, моделируя ВГВУ-инфекцию на утятах, и в опытах in vitro на культуре клеток с возбудителем вирусной диареи (модель ВГС).

Результаты с ВГВУ оценивали двумя способами: вначале в модельных опытах in vitro путем определения концентрации ДНК ВГВУ непосредственно в растворе иммуноглобулина до и после СД-обработки, затем в опытах in vivo путем введения этих же растворов восприимчивым к инфекции утятам. Для каждой концентрации реагентов было использовано по три группы животных из 10 особей.

Как и следовало ожидать, в опытах in vitro не было выявлено статистически значимого снижения концентрации ДНК в обработанных растворах иммуноглобулина, в то время как в опытах in vivо наблюдался выраженный вирулицидный эффект. Как показано на рис. 8, в группах утят, которым вводили контаминированный ВГВУ раствор иммуноглобулина, обработанный СД-смесью в конечной концентрации 0,15% ТБФ и 0,1% натрия холата и выше (продолжительность инкубации 6 ч), не регистрировались случаи инфекции. Отмеченная в группах убыль утят по сравнению с исходным количеством (8-9 против 10) связана с естественным падежом их в период наблюдения.



Рис.8. Выявление ДНК ВГВУ в группах утят через 3 недели после внутрибрюшинного введения СД-обработанного IgG, содержащего до обработки 5 log₁₀ ID₅₀ ВГВУ (по три группы в каждом опыте)

Полученные результаты подтвердили высокую эффективность стадии СД-обработки иммуноглобулина в отношении ВГВУ при концентрации ТБФ более 0,15% и натрия холата более 0,1% при температуре от 29 до 37єС °С и длительности инкубации 6 ч. Уровень редукции ВГВУ в этих условиях составил более 5 log ID₅₀. Отсутствие снижения концентрации ДНК ВГВУ в опытах in vitro связано с механизмом действия СД-смеси, которая, разрушая липидную оболочку вирусов, высвобождает ДНК и фрагменты, не обладающие инфекционными свойствами.

При выполнении исследований с ВВД-БС КРС вначале оценивали цитотоксичность СД-смеси. Для этого СД-смесь, разбавленную в питательной среде Игла МЕМ до конечных концентраций от 0,03% до 0,6% ТБФ и от 0,02% до 0,4% натрия холата, добавляли в лунки планшета с монослоем клеток коронарных сосудов теленка и культивировали при 36±1єС в СО₂-инкубаторе в течение 3 сут. Затем анализировали морфологию и целостность монослоя клеток. В результате было установлено отсутствие токсичности СД-смесей во всех исследованных концентрациях.

Уровень вирусной редукции при СД-обработке определяли при концентрации ТБФ от 0,03% до 0,6%, натрия холата от 0,02% до 0,4%, инкубации смеси в течение 6 ч при температуре от 29 до 37єС. Результаты наших исследований продемонстрировали, что даже при минимальной концентрации реагентов уровень редукции ВВД-БС КРС составил от 5,25+0,12 до 5,33+0,18 log₁₀ ТЦД_50/мл. Этого достаточно, чтобы признать стадию СД-обработки эффективной [WHO Technical Report, Series N924, 2004]. С увеличением концентрации ТБФ и натрия холата эффективность инактивации повышалась и по данным наших исследований составила более 6 log₁₀ ТЦД_50/мл. При этом условия обработки в исследованном диапазоне, включая концентрацию белка, рН, температуру инкубации, практически не влияли на результат.

Кинетику инактивации ВГВУ изучали для двух вариантов концентраций реагентов: 0,15% /0,3% ТБФ, 0,1% /0,2% натрия холата, а ВВД-БС КРС только для концентрации ТБФ 0,3%, а натрия холата 0,15%. Определяли долю инфицированных ВГВУ (%) особей в группах, получивших СД-обработанные препараты, или концентрацию ВВД-БС КРС в растворах иммуноглобулина, инкубированных с СД-смесью в течение 1, 3 и 6 ч. Результаты исследований представлены на рис. 9 а, б.



Рис.9. Кинетика инактивации ВГВУ и ВВД-БС КРС при СД-обработке иммуноглобулина

Таким образом, экспериментально подтверждена эффективность СД-обработки IgG при следующих условиях: концентрация ТБФ 0,3%, натрия холата 0,2%, температура инкубации от 29 до 37 єС, концентрация белка в растворе от 4,5% до 5,5 %, рН от 6,5 до 7,5. Требуемый уровень редукции (более 4 log₁₀) был достигнут в течение 3 ч инкубации. По истечении этого времени препарат считают вирусинактивированным и в соответствии с рекомендациями ВОЗ перемещают в так называемую “безопасную зону”, свободную от вирусов.

Дальнейшая инкубация раствора с СД-смесью усиливала эффект и гарантировала дополнительную безопасность полученных препаратов, по крайней мере, в отношении ВГВ и ВГС.

Валидационные исследования с адекватным моделированием технологического процесса впервые были выполнены в РФ.

Подтверждена эффективность технологии производства IgG для внутривенного введения и определен суммарный уровень вирусной редукции, который составил более 11 порядков, что существенно выше, чем возможный уровень вирусной нагрузки в производственном пуле (табл.10).

Таблица 10

Уровень редукции патогенных и модельных гемотрансмиссивных вирусов при производстве IgG человека для внутривенного введения

Шаги снижения вирусной нагрузки	ВГС	ВГВУ	ВВД-БС КРС
Спиртовое фракционирование	>4,0	-	-
Обработка гидроокисью алюминия	>2,0	-	-
СД-обработка	-	> 5,0	>6,0
Суммарный уровень редукции	> 11,0

В целом первый отечественный опыт по валидации нового технологического процесса с использованием разных типов патогенных и модельных гемотрансмиссивных вирусов и способов их детекции, может быть полезен при разработке соответствующих нормативных документов, необходимых для повышения вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров. Разработка и внедрение в РФ обязательных требований к подтверждению эффективности вирусной инактивации, гармонизированных с международными директивами, позволят повысить уровень вирусной безопасности отечественных препаратов из плазмы крови человека.

Контроль вирусной безопасности готовых лекарственных форм иммуноглобулинов

В РФ в соответствии с требованиями НД контроль иммуноглобулинов на НВsAg, анти-ВГС, анти-ВИЧ1,2 является обязательным, при этом условия проведения тестов не определены. В то же время, некоторые показатели качества, например, уровень анти-НВs, в отечественных препаратах не определяют. Не оценена также роль молекулярно-генетических тестов для контроля готовых лекарственных форм. Обсуждению этой проблемы и посвящена последняя глава диссертации.

Препараты иммуноглобулинов представляют собой концентрат антител различной специфичности, при этом уровень анти-НВs нормируется Европейской фармакопей и составляет не менее 0,5 МЕ/г IgG [Human Normal immunoglobulin 2007:0338 In. Eur. Ph. 6st ed.]. В связи с этим целесообразность тестирования препаратов иммуноглобулинов на НВsAg нами была подвергнута сомнению. Даже в случае контаминации иммуноглобулинов антигеном существует возможность нейтрализации последнего специфическими антителами. Необходимо было определить уровень связывания (нейтрализации) НВsAg специфическими антителами и оценить какой реальный вклад в повышение вирусной безопасности может внести контроль иммуноглобулинов методами ИФА и ПЦР.

Вируснейтрализующая способность анти-НВs изучена в опытах in vitro с использованием разведений ОСО НВsAg и раствора IgG. Показано, что 1 МЕ анти-НВs связывал не менее 50 нг НВsAg до неопределяемого методом ИФА уровня. Аналогичные результаты были получены в модельных опытах с плазмой крови донора-вирусоносителя, которую добавляли в определенных соотношениях к препаратам иммуноглобулинов. Результаты опытов показали, что уровень нейтрализации в расчете на 1 МЕ анти-НВs составил 34,6+0,9 нг через 2 ч инкубации и 70,7+1,8 нг НВsAg через 24 ч инкубации при температуре 37°С. При этом было выявлено, что нейтрализация НВsAg специфическими антителами не оказывала влияния на способность метода ПЦР выявлять ДНК ВГВ.

Полученные данные показали, что обязательный контроль препаратов иммуноглобулинов на НВsAg не является информативным. В НД на препараты иммуноглобулинов представляется целесообразным заменить этот тест на контроль уровня анти-НВs.

Для определения концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов нами была разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения анти-НВs “МикрАТ-НВs”, в основу которой положен принцип одностадийного прямого ИФА с использованием реагентов на основе НВsАg, выделенного из плазмы крови вирусоносителей. Предел обнаружения анти-НВs при использовании тест-системы составил 8+2 МЕ/л.

В период с 2003 по 2010 г. c использованием разработанной тест-системы нами было исследовано 725 серий препаратов иммуноглобулина G человека для внутривенного введения. Средние значения концентраций специфических антител составили от 12,6 ± 3,5 до 60,2 ± 16,9 МЕ/г иммуноглобулина. При оценке данных было обнаружено заметное увеличение концентрации анти-НВs в препаратах иммуноглобулинов после 2004 г. Возможно, это связано с достижением донорского возраста лицами, массовая вакцинация которых осуществлялась в школах и других учебных заведениях страны в середине 90-х годов.

Полученные данные свидетельствовали, что уровень анти-HBs в препаратах иммуноглобулинов целесообразно увеличить, и установить минимальный предел 5 МЕ на 1 г иммуноглобулина.

Для дополнительной гарантии безопасности препараты иммуноглобулинов рекомендуется исследовать на ДНК ВГВ. Однако следует учитывать, что метод ПЦР не различает живой вирус, поэтому может быть рекомендован только для препаратов, не подвергающихся стадии дополнительной инактивации вирусов в процессе производства [CPMP/BWP/269/95].

На следующем этапе работы нами была оценена чувствительность и специфичность метода ИФА для определения анти-ВГС в препаратах иммуноглобулинов. Показано, что при исследовании их на диагностических наборах, предназначенных только для плазмы крови, частота выявления неспецифических (ложноположительных) реакций составляла от 1,4 до 4,3% на разных тест-системах. Поэтому нами была разработана иммуноферментная тест-система “ИФА-анти-ВГС”, предназначенная для контроля иммуноглобулинов и других препаратов крови. Специфичность и чувствительность диагностических наборов были обеспечена благодаря оптимизации условий сорбции иммунологических планшет антигенами ВГС (синтетическими и рекомбинантными) и разработке оригинального состава раствора для разведения исследуемых проб. Оптимальный уровень разведения иммуноглобулинов был установлен на основании результатов тестирования препаратов иммуноглобулинов, полученных в лабораторных условиях из пулов плазмы крови доноров, контаминированных анти-ВГС-позитивными образцами с разным уровнем активности антител (КП от 1,00 до 3,49). Препараты исследовали без разведения или в разведении в 5, 20, 100 и 200 раз. Анализируя полученные данные, мы определили, что для контроля иммуноглобулинов методом ИФА с использованием диагностических наборов “ИФА-анти-ВГС” оптимальным будет разбавление препаратов IgG до концентрации белка 5-10 мг/мл, что приблизительно равно нормальному содержанию IgG в плазме крови человека.

Выводы

1. На основании изучения закономерностей выявления серологических и молекулярно-генетических маркеров гемотрансмиссивых вирусов в индивидуальных донациях и пулах плазмы разработан научно-обоснованный алгоритм входного контроля безопасности сырья на предприятиях по переработке плазмы крови доноров, гарантирующий безопасность производственных пулов плазмы. Утверждены Методические рекомендации “Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров”, в которых регламентирована процедура минипулирования, установлен максимальный размер минипулов и требования к обеспечению качества исследований. Разработанный алгоритм контроля вирусной безопасности сырья внедрен в Нижегородском и Пермском филиалах ФГУП “НПО Микроген” Минздравсоцразвития России.

2. Разработан и утвержден Отраслевой стандартный образец содержания РНК ВГС (ОСО 42-28-366(1)-11П). Разработана методология аттестации стандартных образцов содержания НК вирусов относительно Международных стандартов, основанная на статистической обработке данных с помощью метода параллельных линий. В программе Microsoft Excel создан модуль для выполнения расчетов.

3. Разработан и внедрен в производство препарат иммуноглобулина человека для внутривенного введения нового поколения, инактивированный сольвент-детергентным методом, по показателям качества и безопасности соответствующий требованиям отечественных НД и Европейской фармакопеи. Разработана и утверждена в установленном порядке НД на “Имбиоглобулин” (Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для инфузий, 50 мг/мл/ ЛС-000177).

4. Создана перспективная технология производства иммуноглобулина человека для внутривенного введения с применением каприлата натрия, вирулицидная активность которого в концентрации более 10 ммоль подтверждена экспериментально. Для усиления вирулицидного эффекта предложено совмещать обработку каприлатом натрия и сольвент-детергентом в одном технологическом цикле.

5. Разработана методология валидации технологических стадий инактивации и элиминации вирусов. Эффективность элиминации вирусов рекомендуется определять с использованием метода ПЦР с количественной детекцией результатов, эффективность инактивации вирусов - в опытах in vivo на восприимчивых животных или в опытах in vitro на культурах клеток.

6. Экспериментально доказана нецелесообразность обязательного тестирования иммуноглобулинов на содержание НВsAg по причине иммунной нейтрализации антигена специфическими антителами.

7. Для количественного определения анти-НВs в сыворотке/плазме крови и препаратах иммуноглобулинов разработана и внедрена в производство иммуноферментная тест-система “МикрАт-НВs”, защищенная патентом РФ ФСР 2009/05914 от 07.07.2009). Разработана и внедрена в производство тест-система “ИФА-анти-ВГС”, валидированная для исследования препаратов крови, включая иммуноглобулины (ФСР 2009/05264 от 24.03.2009).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать включить парвовирус В19 в перечень актуальных для РФ вирусных инфекций и внедрить скрининговое исследование донорской плазмы с целью исключения донаций с высокой концентрацией ДНК В19 V.

2. При регистрации новых препаратов из плазмы крови доноров и при внесении изменений в действующие технологические процессы в обязательном порядке подтверждать экспериментально и документировать эффективность технологических стадий удаления и инактивации вирусов.

3. Исключить тест на НВsAg в нормативной документации на препараты иммуноглобулинов и заменить его на определение антител к НВsAg. Обоснована целесообразность повышения минимально допустимого уровня анти-НВs с 0,5 до 5 МЕ/г иммуноглобулина.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Зубкова, Н.В. Эффективность тепловой инактивации вирусов в производстве внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, В.Н.Мазепа, К.А. Орлова// Вестник службы крови России.- 2002. - №1.- С.31-33.

2. Зубкова, Н.В. Оценка специфичности и чувствительности метода ИФА для определения анти-ВИЧ-1,2 в препаратах внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, С.В. Зубов, М.А.Моисеева// Вестник службы крови России.- 2006.- №4.- С.31-33.

3. Зубкова, Н.В. Нейтрализация поверхностного антигена вируса гепатита В препаратами иммуноглобулинов/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, М.А.Моисеева, С.В. Зубов// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2006.-№ 2.-С.60-65.

4. Зубкова, Н.В. Организация входного контроля пулов плазмы для фракционирования на маркеры вирусных гепатитов В и С/ Н.В. Зубкова, Е.В.Филатова, В.В.Анастасиев, М.А.Моисеева// Вестник новых медицинских технологий.- 2007.- №4.- С.100-102.

5. Зубкова, Н.В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулинов/Н.В.Зубкова (обзор литературы)// Гематология и трансфузиология. - 2010.-№2.-С. 39-44.

6. Зубкова, Н.В. Серологические и молекулярно-генетические маркеры вируса гепатита С у инфицированных доноров/ Н.В.Зубкова, Е.В.Филатова, С.В.Зубов//Вопросы вирусологии.-2010.-№5.-С.34-36.

7. Филатова, Е.В. Выявление маркеров парвовируса В19 в образцах крови доноров/ Е.В. Филатова, Н.В. Зубкова, Н.А. Новикова, Л.Н. Голицына, К.В.Кузнецов//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2010.- №5.- С. 67-70.

8. Филатова, Е.В. Оценка изменения концентрации ДНК парвовируса В19 при модельном фракционировании плазмы крови доноров/ Е.В. Филатова, Н.В. Зубкова, Т.В. Короткова, С.А. Гальговская, В.В. Анастасиев //Гематология и трансфузиология.- 2011.-№3.- C.10-14.

9. Зубкова, Н.В. Оценка роли серологических и молекулярно-генетических методов при выявлении маркеров вируса гепатита В в плазме крови доноров/Н.В.Зубкова, М.А.Моисеева, С.В.Зубов, Е.В.Филатова//Вестник службы крови России. - 2011. - №3. - С.5-9.

10. Зубкова, Н.В. Разработка и аттестация национального лиофилизированного отраслевого стандарта содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК ВГС)/Н.В.Зубкова, Р.А.Волкова, Е.В.Филатова, Е.В.Эльберт, Е.В.Силин, А.К. Лобастова, И.В. Красильников//Вестник Службы крови России.-2012.-№1.- С.41-44.

11. Зубкова, Н.В. Алгоритм входного контроля вирусной безопасности плазмы при производстве лечебных препаратов из плазмы крови доноров/Н.В.Зубкова, А.В. Казьянин, А.М. Николаева, Л.К. Лаптева, Е.В. Силин//Гематология и трансфузиология.- №1.- 2012. - С. 9-13.

12. Филатова, Е.В. Оценка безопасности производства препаратов альбумина в отношении парвовируса В19/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова, Т.В.Короткова, С.А.Гальговская//Вестник Нижегородского университета им.Н.И.Лобачевского.-2012.-№1(1).- С.106-109.

Патенты

13. Анастасиев В.В. Способ получения иммуноглобулинового препарата/ В.В.Анастасиев, Т.Б.Змачинская, Т.А.Крайнова , Н.В.Зубкова// Патент №2192279 от 07.09.2000. http//www.emea.europa.eu

14. Моисеева М.А. Тест-система для количественного определения анти-НВs в биологическом образце/ М.А.Моисеева, С.В.Зубов, Н.В.Зубкова// Патент RU 2290642 от 27.12.2006. http//www.emea.europa.eu

15. Зубкова Н.В. Способ приготовления вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов”/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, Т.В.Короткова// Патент RU 2352358 от 20.04.09/ http//www.emea.europa.eu

Методические рекомендации и пособия

16. Зубкова, Н.В. Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров/Н.В.Зубкова, Л.К.Лаптева, Р.А.Волкова, А.В.Казьянин, И.С.Горлова, Н.В.Шалунова, М.С.Воробьева, Е.В.Филатова, Н.А.Спиридонова, А.Б.Перевозчиков//Методические рекомендации. Утверждены ФГБУ “ГИСК им.Л.А.Тарасевича” Минздравсоцразвития России №59-ОД от 21.07. 2011.

Статьи, опубликованные в сборниках научных трудов и других центральных и региональных журналах

17. Зубкова, Н.В. Применение сольвент-детергентного метода для инактивации вирусов при получении иммуноглобулина// Проблемы гематологии и переливания крови.- 2001.- №3.- С.51.

18. Зубкова, Н.В. Эффективность методов тепловой инактивации в производстве внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, К.А. Орлова// Мир вирусных гепатитов.-2002.-№1.- С.3-7.

19. Зубкова, Н.В. Методы инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулиновых препаратов/ Зубкова Н.В., Анастасиев В.В.// Новое в трансфузиологии. - Вып.33.- 2002.- С.52-59.

20. Зубкова, Н.В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулина/Н.В.Зубкова, О.В.Миловидова// Сб. “Здоровье населения Нижегородской области”, Итоги региональной программы, Н.Новгород.- 2002.- С.123-128.

21. Зубкова, Н.В. Использование иммуноферментной тест-системы “ИмБио анти-НВs” для количественного определения антител к вирусу гепатита В/ Н.В.Зубкова, С.В.Зубов, М.А.Моисеева //Мир вирусных гепатитов.- 2003.- № 9.- С.9-13.

22. Зубкова, Н.В. О возможности отбора сырья для производства специфического иммуноглобулина против гепатита А/ Н.В. Зубкова, Н.А.Спиридонова, Е.В. Филатова, С.В.Зубов//Мир вирусных гепатитов.- 2009.-№1.- С.23-25

Опубликованные научные сообщения и тезисы научных докладов

23. Зубкова, Н.В. Влияние солей на стабильность иммуноглобулина при пастеризации/ В.В.Анастасиев, Н.В.Зубкова, Т.А.Крайнова, Т.Б.Змачинская// Russian Journal of Immunology. -1999.-т.4, №1.- P.70.

24. Zubkova, N.V. The use of the method of polimerase chain reaction for an estimation of efficacy of virus inactivation in model experiment/N.V.Zubkova, V.N. Mazepa, K.A.Orlova// Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems.- 2000.- V.4, №1.- P.175.

25. Zubkova, N.V. Anti-HBs content in the intravenous Immunoglobulin preparation at different viruses inactivation methods/ N.V. Zubkova N.V., M.A. Moiseyeva // Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. - 2002. - т.6, №1.- С.189.

26. Моисеева, М.А. Оценка специфического иммунитета против гепатита В у персонала, работающего с кровью/ М.А.Моисеева, Н.В. Зубкова, С.В.Зубов//Тезисы докладов II научной конференции с международным участием “Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера”. Новосибирск, 2002.- С.43.

27. Зубкова, Н.В. Разработка ИФА-тест-системы для количественного определения анти-HBs в сыворотке крови и препаратах иммуноглобулинов/ Н.В.Зубкова, С.В.Зубов, М.А.Моисеева// Тезисы докладов международного конгресса “Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы”. С.-Пб., 2003.- С.12-13.

28. Моисеева, М.А. Определение антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов/ М.А.Моисеева, Н.В.Зубкова// Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых от 27 февраля 2004 г.: Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии.- Уфа, 2004 г.- С.235-236.

29. Зубкова, Н.В. Проблема вирусной безопасности препаратов из плазмы крови: входной и выходной производственный контроль на маркеры вирусных гепатитов/ Н.В.Зубкова, Н.А.Спиридонова, М.А.Моисеева//Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых от 27 февраля 2004 г.: Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии.- Уфа, 2004.-С.238-240.

30. Моисеева, М.А. Выявление маркеров парентеральных вирусных гепатитов среди различных групп детей Нижегородской области/ М.А.Моисеева, Н.В.Зубкова, С.В.Зубов// Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний. Мат. конф., посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ 28-29 октября 2004 г., Н.Новгород.- С.38-43.

31. Худякова, Н.Е. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения суммарных антител к вирусу иммунодефицита 1-го и 2-го типов/ Н.Е.Худякова, С.В.Зубов, Н.В.Зубкова//Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний. Мат. конф., посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ 28-29 октября 2004 г., Н.Новгород.- С.173-177.

32. Моисеева, М.А. Определение маркеров гемотрансмиссивных инфекций в препаратах крови/ М.А. Моисеева, Н.В.Зубкова, Н.А.Спиридонова, С.В.Зубов// VI Российская научно-практическая конференция с международным участием “Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики”: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005г..-С.212-214.

33. Зубкова, Н.В. Определение уровня нейтрализации поверхностного антигена вируса гепатита В специфическими антителами/ Н.В.Зубкова, М.А.Моисеева, С.В.Зубов, В.В.Анастасиев// VI Российская научно-практическая конференция с международным участием “Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики”: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005г.-С.116-118.

34. Зубов, С.В. Распределение концентрации HBsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей/ С.В.Зубов, Н.И.Егорова, М.А.Моисеева М.А., Н.В. Зубкова, К.В. Кузнецов // VI Российская научно-практическая конференция с международным участием “Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики”: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005.-С.118-120.

35. Зубкова, Н.В. Распределение концентраций антител к вирусу гепатита А у доноров/ Н.В.Зубкова, Н.А.Спиридонова// Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н.Блохиной “Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний”.- Н.Новгород.- 2006.- С.216-217.

36. Моисеева, М.А. Особенности выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВsAg) в пулах плазмы для фракционирования/ М.А.Моисеева, Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, С.В.Зубов// Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н.Блохиной “Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний”.- Н.Новгород.- 2006.- С.197-198.

37. Зубкова, Н.В. Основы вирусбезопасной технологии производства иммуноглобулиновых препаратов/ Н.В.Зубкова, В.В.Анастасиев, Т.В. Короткова, Е.В.Филатова// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции “Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней”.- С.43.

38. Зубкова, Н.В. Определение антител к вирусу иммунодефицита человека в препаратах иммуноглобулинов/ Н.В.Зубкова, С.В.Зубов, М.А.Моисеева// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции “Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней”.- С.44.

39. Филатова, Е.В. Опыт организации входного контроля отдельных фракций плазмы на ВИЧ и гепатит С/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова, И.В.Губанов, Ю.К.Пискарева, Л.М.Ефремова// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции “Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней”.- С.113.

40. Зубкова, Н.В. Распределение РНК вируса гепатита С при фракционировании инфицированной плазмы/ Н.В.Зубкова, Е.В.Филатова, Л.М.Ефремова, С.В.Зубов// Материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием “Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика”: Тезисы докладов.- М., 29-31 мая 2007г.-С.30-31.

41. Зубкова, Н.В. Эффективность элиминации вирусов при использовании фильтров CUNO ZETA PLUS серии VR в технологии производства препаратов из плазмы крови/ Н.В.Зубкова, М.Ю.Фирсова// Материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием “Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика”: Тезисы докладов.- М., 29-31 мая 2007г.-С.31-32

42. Филатова, Е.В. Параллельное скринирование минипулов плазмы для фракционирования методом ИФА и ПЦР на маркеры вирусного гепатита С/ Е.В.Филатова, Н.В.Зубкова//Материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием “Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика”: Тезисы докладов.- М., 29-31 мая 2007г.-С.74-75.

43. Зубкова, Н.В. Влияние химических вирусинактивирующих реагентов на свойства препаратов внутривенного иммуноглобулина/ Н.В.Зубкова, М.Ю.Фирсова, Н.Е.Худякова, О.В.Миловидова//Тезисы Всероссийской научно-практической конференции “Вакцинология 2008”. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней”, 11-12 ноября 2008 г.- С.56.

...