Клинико-патогенетические особенности хронических вирусных гепатитов В и/или С у больных туберкулезом легких

Анализ показателей периферической крови (содержание эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, скорости оседания эритроцитов) установил отсутствие существенных различий во всех группах наблюдения. Лишь в контрольной группе, отмечалась достоверная разница в положительной динамике показателей СОЭ (p<0,001).

В оценке неспецифической иммунологической реактивности организма, при характеристике функциональных сдвигов в системе клеток крови высокую диагностическую информативность имеют интегральные лейкоцитарные показатели. Несмотря на то, что в отдельности изменения показателей лейкоцитов и СОЭ могут быть незначительными, при введении специальных индексов их диагностическая ценность увеличивается [Федорова О.И., 2008]. Существует достаточно широкий спектр интегральных гематологических показателей [Жухоров Л.С., Вороная Ю.Л., 2002]. В литературе имеются данные об исследовании их при различных видах патологии [Мустафина Ж.Г. и др., 1999; Атарбаева В.Ш. и др., 2002; Кажина М.В. и др., 2003; Эмануэль В.Л., 2005]. Однако мы не встретили данных об использовании этих показателей при микст-патологии - хронические вирусные гепатиты и туберкулез легких.

Таблица 3 - Сравнительная характеристика показателей астеновегетативного и респираторного синдромов у больных изолированным туберкулезом легких и в сочетании с гепатитами В и С

Таблица 4 - Сравнительная характеристика показателей диспепсического синдрома у больных изолированным туберкулезом легких и в сочетании с гепатитами В и С

Таблица 5 - Сравнительная характеристика основных клинических проявлений хронических вирусных гепатитов у больных туберкулезом легких в сочетании с гепатитами В и С и в контрольной группе

Полученные при изучении интегральных показателей лейкоцитограмм индексы у здоровых и у пациентов исследуемых групп представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Интегральные показатели лейкоцитограммы периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и/или С в сочетании с впервые выявленным туберкулезом легких

Примечание: достоверность различий между показателями здоровых (норма) и больных - * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001; достоверность различий между показателями группы ХВГ и пациентов групп сравнения - # - p<0,05; ## - p<0,01; ### - p<0,001; p - достоверность различий между показателями средних значений при сравнении с соответствующими исходными данными

Установлено, что по сравнению со здоровыми у больных всех исследуемых групп имели место более высокие средние значения ЛИИ, в динамике нарастающие в группе больных с моноинфекцией ТВС (p<0,01) и с тенденцией к нарастанию у больных с сочетанными формами инфекции - ХГВ+ТВС и ХГС+ТВС (p>0,05). Изменениям значений ЛИИ соответствовали показатели ИЛСОЭ. Наблюдалось повышение значений ИСНЛ во всех группах сравнения со снижением в динамике за счет некоторого уменьшения нейтрофилов. Показатели ЛИ несколько уменьшились в группе больных с туберкулезом и имели тенденцию к нарастанию в группах больных с сочетанной патологией из-за нарастания лимфоцитов и снижения нейтрофилов. При отсутствии статистически значимых изменений ИСНМ в группах больных с ТВС, ХГВ+ТВС и ХГС+ТВС, отмечалось его повышение у больных с хроническими вирусными гепатитами В+С в сочетании с туберкулезом легких за счет относительного уменьшения процентного содержания моноцитов по сравнению с нейтрофилами (p<0,05).

Несмотря на то, что значения показателей функциональных проб печени находились практически во всех группах исследования в пределах нормальных значений, в динамике наблюдения внутри групп и между группами сравнения в ряде случаев имели место различия. В динамике наблюдения за больными хроническими вирусными гепатитами В и С с сопутствующим туберкулезом легких, а также туберкулезом легких с HBV-инфекцией было выявлено повышение показателей трансаминазы (AЛT) - 0,24+0,05 мккат/л и 0,80+0,12 мккат/л, p<0,001; 0,15+0,02 мккат/л и 0,29+0,06 мккат/л, p<0,05 соответственно относительно исходного уровня при поступлении в стационар. Кроме того, у больных с ХГС+ТВС и ХГВ+ХГС+ТВС отмечаются значимо высокие показатели АЛТ по сравнению с группой контроля (ТВС) (p<0,05; p<0,001 соответственно) и пациентами с туберкулезом легких в сочетании с HBV-инфекцией (p<0,05; p<0,001 соответственно). Наиболее высокие показатели АЛТ отмечены в группе пациентов с ХГС+ТВС - 0,70+0,46 мккат/л и 1,47+0,55 мккат/л в динамике (p>0,05).

Тимоловая проба была изменена достоверно чаще при динамическом контроле в группах больных хроническими вирусными гепатитами в сочетании с туберкулезом легких (В, С и В+С) (соответственно р<0,05, р<0,001 и р<0,05). У пациентов с маркерами HCV-инфекции показатели тимоловой пробы статистически значимо были выше в сравнении с группой больных с туберкулезной моно-инфекцией (ХГС+ТВС, р<0,001 и ХГВ+ХГС+ТВС, р<0,01).

С целью изучения иммунологического и цитокинового статуса у больных с сочетанной инфекцией - хронические вирусные гепатиты В и/или С и туберкулез легких нами было обследовано 204 больных с впервые выявленным туберкулезом легких. Все больные были обследованы на вирусные гепатиты В и С. По результатам чего были сформированы две группы: с маркерами вирусных гепатитов В и С (162 человека) - основная группа, и без маркеров вирусных гепатитов (42 человека) - I группа сравнения. Больные хроническими вирусными гепатитами (52 человека) без отягощенного туберкулезом фона составили II группу сравнения. В качестве контроля использовали результаты иммунологического обследования 30 практически здоровых лиц в возрасте от 19 до 39 лет, в анамнезе не страдавших туберкулезом легких и вирусными гепатитами, и проживавших в г.Алматы.

В группах наблюдения с моноинфекциями нами не было установлено достоверных изменений относительного количества лимфоцитов (33,44+1,58% в I группе сравнения, 30,36+1,76% во II группе сравнения, р>0,05) по отношению к величинам контрольной группы (28,62+2,85%). При сравнении данного показателя в основной и I группе сравнения выявлена достоверная разница (27,57+0,84% и 33,44+1,58% соответственно, р<0,01). В группе больных туберкулезом без сочетания с вирусными гепатитами абсолютное количество лимфоцитов соответствовало норме (2,17±0,2 х10⁹/л), а у пациентов с вирусными гепатитами, как в виде моноинфекции (1,59±0,22 х10⁹/л, р<0,05), так и в сочетании с туберкулезом (1,91±0,07 х10⁹/л, р>0,05) отмечалось снижение показателя по сравнению с контролем. Между группами сравнения достоверной разницы не отмечалось. Проведенный субпопуляционный анализ лимфоцитов показал, что относительное количество CD3+ клеток снижалось на 17,5 - 18,5% (р<0,001) по сравнению с группой здоровых лиц. В то же время достоверно значимое (р<0,01) снижение абсолютного количества CD3+ лимфоцитов в сравнении с контролем (1,19+0,04 х10⁹/л) установлено во II группе сравнения (0,84+0,11 х10⁹/л) и основной группе (1,02+0,04 х10⁹/л). При этом пациенты II группы исследуемых имели более низкие показатели (р<0,01) при сопоставлении с больными I группы сравнения. Дефицит общих Т-лимфоцитов в основной и I группе сравнения был обусловлен также достоверным снижением относительных и абсолютных показателей CD4+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми лицами (31,62+0,35%, 0,32+0,01 х10⁹/л и 31,88+0,73%, 0,38+0,04 х10⁹/л соответственно, р<0,001). Отмечалось также достоверное снижение уровня абсолютного количества CD8+ лимфоцитов (р<0,05). Одновременно с вышеописанными изменениями во всех группах наблюдения не отмечалось повышения содержания относительного количества натуральных киллеров - NK клеток (CD16+). Абсолютные значения NK-клеток были достоверно выше в группах пациентов с ТВС-инфекцией и ХВГ+ТВС (0,34+0,05 х10⁹/л и 0,29+0,01 х10⁹/л соответственно) по сравнению с контролем (0,23+0,02 х10⁹/л, р<0,05). Причем в группах сравнения исследуемых с вирусными гепатитами (моноинфекция) (0,21+0,03 х10⁹/л) и микст-патологией (0,29+0,01 х10⁹/л) отмечена значимая разница величин CD16+ лимфоцитов (р<0,01). Во всех группах исследуемых больных было зарегистрировано достоверное увеличение относительного количества лимфоцитов с фенотипом CD25+ в сравнении с контрольной группой, достоверно более значимое в группах больных с моноинфекцией ТВС и в сочетании ее с ХВГ (p<0,001), чем у пациентов с изолированной гепатотропной вирусной инфекцией (р<0,05). Этот факт, очевидно, может свидетельствовать об активационном ответе иммунной системы, более выраженном в случае сочетания хронического вирусного гепатита с впервые выявленным туберкулезом легких. Изменения относительного количества клеток периферической крови, экспрессирующих на себе маркер апоптоза CD95+, соответствовали характеру нарушений абсолютных показателей этих клеток. Так, значения CD95+ в I группе сравнения пациентов (13,62+1,13%) и в основной группе (13,00+0,48%) были достоверно выше (p<0,01 и p<0,001 соответственно) по сравнению с контрольной группой. Относительное количество клеток с маркером CD95+ у больных II группы сравнения (11,28+0,95%) не имело достоверных различий с нормой, p>0,05. Между группами сравнения также не отмечалось значимой разницы, p>0,05.

Изменения в В-клеточном звене иммунитета у больных основной группы, также как и в I группе сравнения, характеризовались более выраженной ее активизацией. Так, в группе больных туберкулезом без отягощенного ХВГ фона относительное содержание CD20+ лимфоцитов составило 14,24+0,78% (р<0,05 по сравнению с нормой), абсолютное количество - 0,30+0,04 х10⁹/л (р<0,001). В основной группе больных данные показатели составили соответственно 15,09+0,45%, р<0,05 и 0,29+0,01 х10⁹/л, р<0,001. При этом относительное и абсолютное содержание CD20+ клеток у больных с микст-инфекцией достоверно превышало эти показатели при ХВГ-моноинфекции (р<0,001).

Как показали результаты изучения содержания иммуноглобулинов четырех классов (IgA, IgМ, IgG, IgЕ) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сравниваемых группах больных в гуморальном звене иммунитета также наблюдались нарушения. Так, при содержании иммуноглобулина IgA, достоверно не отличающимся от показателей контрольной группы, имеется значимая разница в уровне IgМ во всех группах сравнения (1,66+0,11 г/л в I группе сравнения, p<0,001; 1,44+0,05 г/л - во II группе, p<0,01 и 1,62+0,05 г/л - в основной группе наблюдения, р<0,001). Содержание IgG характеризовалось нормальными показателями у пациентов с вирусными гепатитами (11,86+0,55 г/л) и достоверно повышенными значениями у больных туберкулезной инфекцией, как изолированной (12,97+0,61 г/л, p<0,01), так и в сочетании с вирусными гепатитами (13,53+0,61 г/л, p<0,001). Уровень IgЕ во II группе сравнения(78,62+13,18 МЕ/мл) соответствовал норме (72,30+7,50 МЕ/мл), тогда как в основной группе (193,54+8,68 МЕ/мл) значительно превышал контрольные (р<0,001) показатели. Значения IgЕ в I группе сравнения (156,84+16,33 МЕ/мл) имели достоверную разницу как со здоровыми лицами (р<0,001), так и с группами сравнения (со II группой р<0,001; с основной - р<0,05).

Увеличение концентрации общего IgE отмечено при некоторых инфекциях: вирусном гепатите и бруцеллезе [Курманова Г.М., 2004]. Считают, что продукция антител данного класса является распространенным феноменом при инфекционных заболеваниях [Biet F., 2005; Luo Y., 2004]. Полученные рядом авторов результаты иммуноблоттинга с IgЕ-положительными сыворотками больных туберкулезом позволили выявить микобактериальные белки, являющиеся иммунодоминантными по IgЕ-ответу при туберкулезе и несущими специфические для МБТ антигенные детерминанты, которые стимулируют лимфоциты Th-2-типа [Авдеенко В.Г. и др., 2002] и вызывают тем самым угнетение активности Th-1-лимфоцитов [Ярилин А.А., 1999; Тюлькова Е.У. и др., 2003].

Во всех группах наблюдения отмечалось достоверное, по сравнению с группой контроля (33,1+3,2 усл.ед., р<0,01) усиление комплексообразования. Так, уровень ЦИК составил в I группе больных - 47,65+3,09 усл.ед.; во II - 54,48+2,3 усл.ед.; в основной группе - 59,95+3,62 усл.ед. (р^1,2>0,05; р^1,3<0,01; р^2,3>0,05).

Оценка функционально-метаболической активности нейтрофилов показала, что во всех группах наблюдения в НСТ-тесте отмечалось снижение степени активации фагоцитов на 31,8 - 36,2% относительно контроля (р<0,001). Кроме того, имело место достоверное падение функциональных резервов фагоцитирующих клеток в индуцированном НСТ-тесте (р<0,001). Что касается индекса стимуляции, то достоверное его снижение (р<0,05) в сравнении с контрольной группой было отмечено лишь в основной группе (1,52+0,2 при норме 1,78+0,09).

При исследовании уровня сывороточных цитокинов у больных туберкулезом легких в сочетании с парентеральными гепатитами В и С нами были зарегистрированы следующие изменения. Так, во всех группах наблюдения отмечалось повышение по сравнению с нормой уровней гINF (p<0,001), IL1в (p<0,05 в I группе; p<0,001 во II и основной группах), IL4 (p<0,001). Уровень IL2 также характеризовался повышением показателей - в I группе (p<0,05), во II группе (p>0,05), в основной - p<0,001. Значения TNFб во всех сравниваемых группах были несколько повышенными (в 1,2 - 1,4 раза), однако статистически значимых различий с контролем не было отмечено.

При изучении характера иммунологических нарушений в группах больных с сочетанной инфекцией в зависимости от вида гепатита выявлены изменения, соответствующие вышеописанным в основной группе. При сравнительном анализе более выраженные изменения отмечены в группе больных с ХГВ+ХГС+ТВС и ХГВ+ТВС. Фаза репликации вируса как при HBV-, так и при HCV-инфекции в сочетании с туберкулезом характеризовалась более выраженными статистически значимыми сдвигами в иммунном и цитокиновом статусе пациентов (p<0,05, p<0,01).

Исследование генетического полиморфизма у больных хроническими вирусными гепатитами В/С и туберкулезом легких

Наследственная подверженность к инфекционным агентам связана с двумя факторами: относительно редкие генетические дефекты, приводящие к иммунодефицитам, а также (более распространенный вариант) сочетание у индивида «нормальных» аллелей генов, по отдельности имеющих слабый эффект, но совокупность которых приводит к формированию особенностей иммунитета, предрасполагающих к развитию инфекционного заболевания [Casanova J.-L., Abel L., 2002]. Согласно данным ряда исследователей, в развитии большинства инфекционных заболеваний существенную роль играют гены, кодирующие факторы иммунной системы: цитокины, их рецепторы, транспортеры антигенов, молекулы антигенного распознавания и т.д. Это вполне объяснимо, учитывая, что, по-видимому, иммунная система во многом сформировалась как система защиты против инфекционных агентов [Ройт А. и др., 2000].

С целью изучения ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов IL-1в и TNF-б с предрасположенностью к хроническим вирусным гепатитам нами обследованы две группы - пациенты с хроническими вирусными гепатитами В и/или С (ХВГ) (IL1B, n = 64; TNFA, n = 82) и контрольная группа, представленная лицами, не имеющими в анамнезе хронических заболеваний печени вирусной этиологии (n = 255). По возрасту, полу и национальному составу исследуемые группы были сопоставимы.

Распределение частот генотипов по полиморфному варианту С+3953Т IL-1в в группе пациентов с ХВГ достоверно не отличалось от такового в группе популяционного контроля (чІ=0,01; df=1; р=0,94278). Частоты генотипов С/С, С/Т и Т/Т составили: 59,2+3,08%, 37,3+3,03% и 3,5+1,16% в контрольной группе и 59,4+6,14%, 37,5+6,05% и 3,1+2,17% в группе больных (p>0,05). Наши данные по распределению частот аллельных вариантов полиморфизма C+3953T гена IL1B соответствуют литературным данным [Terwilliger J.D., Goring H.H. 2000; Имангулова М.М. и др., 2005; Шабалдин А.В. и др., 2007].

При анализе распределения частот генотипов и аллелей гена TNFA (G-308A) у больных хроническими вирусными гепатитами не отличалось от контрольной группы (чІ=0,02; df=1; р=0,87611). Частота редкого аллеля А у больных и здоровых лиц находилась на уровне 14,0% и 14,5% соответственно (p>0,05). Популяционные исследования полиморфизма -308G ->А, проведенные ранее в других популяциях, показали, что частоты аллеля TNF -308А варьировали в диапазоне 7,35 (Испания) - 19% (Южная Англия) [Middleton D. et al., 2003]. По результатам наших исследований частоты генотипов G/G, G/A и A/A составили: 72,5%, 25,9% и 1,6% среди лиц контрольной группы и 74,4%, 23,2% и 2,4+% в группе пациентов с хроническими вирусными гепатитами В и/или С (p>0,05).

В группе больных с ХВГ пациенты, в зависимости от этиологического фактора, распределились следующим образом: больные с HBV-инфекцией - 47 человек, в группе больных с микст-гепатитами (n=35) у 19 человек была диагностирована HCV-инфекция и в 16 случаях пациенты страдали сочетанной патологией (HBV- и HCV-инфекциями одновременно).

Анализ особенностей распределения альтернативных аллельных вариантов в позиции -308 TNFA у больных с ХВГ в зависимости от этиологии гепатита показал наличие различий, в частности, повышение частоты гетерозигот (чІ=4,35; df=1; р=0,03698), а также генотипов, в состав которых входил минорный аллель -308А, в группе пациентов с микст-гепатитами (ХГ-В+С и ХГ-С) по сравнению с группой больных HBV-моноинфекцией (чІ=4,26; df=1; р=0,03894).

Таким образом, сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей IL-1в среди больных ХВГ и здоровых лиц г.Алматы показал отсутствие достоверных ассоциаций полиморфизма С+3953Т IL-1в с хроническими вирусными гепатитами В и/или С. Установлено, что носители аллеля А в случае заболевания хроническим гепатитом С и микст-гепатитом (ХГ-В+С) могут быть предрасположены к более агрессивному течению заболевания ввиду гиперпродукции цитокина TNFб.

С целью изучения генетической предрасположенности к туберкулезу легких жителей г. Алматы нами было обследовано 190 больных туберкулезом легких и 255 лиц контрольной группы, ранее и на момент обследования не страдавших туберкулезом. По возрасту, полу и национальному составу исследуемые группы были сопоставимы.

По изученному полиморфному варианту D543N гена SLC11A1 как у больных, так и в контрольной группе не отмечено отклонения распределений генотипов от ожидаемых при равновесии Харди-Вайнберга. Результаты анализа полиморфизма D543N гена SLC11A1 представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Частотное распределение генотипов и аллелей гена SLC11A1 (D543N) у больных туберкулезом легких и в контрольной группе

В результате проведенных нами исследований установлено, что генотип DD наиболее распространен как в группе больных, так и в группе здоровых лиц и составляет 87,4+2,41% и 78,4+2,58% соответственно, р<0,05. Генотип NN в обеих группах встречается значительно реже, чем DD и составляет в обеих группах по 1%, р>0,05. При сравнительном анализе частоты распространенности генотипов гена SLC11A1 в группе больных туберкулезом легких и здоровых лиц обнаружены достоверно значимые различия (OR=0,500; C.I.=[0,292-0,856]; чІ=6,53, p=0,01059).

Анализ частотного распределения аллелей данного гена выявил, что наиболее распространенным аллелем в группе больных и здоровых лиц является аллель D (93,2+1,30% и 88,8+1,4% соответственно, р<0,05). Более редкий аллель N статистически значимо чаще регистрировался в группе контроля. При сравнительном анализе частотного распределения аллеля N между группами больных туберкулезом легких и здоровых лиц также выявлены достоверно значимые различия (OR=0,584; C.I.=[0,360-0,947]; чІ=4,84, p=0,02784). Данные литературы противоречивы. Одни авторы выявили ассоциацию аллеля N с развитием туберкулеза [Ryu S., et al., 2000; Hsu Y.H. et al., 2006; Shirakawa T. et al., 2000]. В то же время отсутствие такой связи отмечают в Дании, Марокко, Таиланде, Мексике, Индонезии [Soborg C. et al., 2002; El Baghdadi J. et al., 2003; Vejbaesya S. et al., 2007; Niсo-Moreno P. et al., 2007; Sahiratmadja E. et al., 2007]. Японские исследователи предположили, что вариации в локусах D543N и 3'UTR гена SLC11A1 ассоциированы с развитием мультирезистентного туберкулеза [Takahashi K. et al., 2008].

Наиболее частая регистрация аллеля N полиморфного локуса SLC11A1-D543N в группе контроля предполагает, что данный аллель проявляет себя как протективный фактор при заболевании туберкулезом легких жителей г.Алматы. Тестирование данного полиморфизма может иметь значение для досимптоматической диагностики туберкулеза легких в группах высокого риска.

У больных легочным туберкулезом в мокроте, бронхоальвеолярном лаваже и пораженных тканях легкого отмечена высокая концентрация IL-1, что подтверждает участие этого цитокина как в местном, так и в системном воспалении при туберкулезе легких [Воронкова О.В. и др., 2007; Свистунова А.С. и др., 2005].

Анализ распределения частот генотипов С+3953Т гена IL1В не выявил статистически достоверных различий между контрольной и исследуемой группами (OR=0,762; C.I.=[0,510-1,141]; чІ=1,75, p=0,18640). При этом установлено, что генотип С/С наиболее распространен как в группе больных, так и в группе здоровых лиц и составляет 64,7+3,47% и 59,2+3,08% соответственно. При сравнительном анализе частотного распределения аллелей между группами больных туберкулезом легких и здоровых лиц достоверно значимых различий не выявлено (OR=0,864; C.I.=[0,622-1,199]; чІ = 0,77, p=0,38164).

Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что полиморфизм С+3953Т гена IL1В не вносит существенного вклада в общую подверженность к туберкулезу у населения г.Алматы.

TNFА, провоспалительный цитокин, регулирует широкий спектр биологических процессор, включая пролиферацию клеток, их дифференцировку и апоптоз. Известно, что TNFА играет ключевую роль в формировании и поддержании гранулем.

Распределение частот генотипов в исследуемых выборках соответствовало распределению Харди-Вайнберга (р=0,619092-контрольная выборка и р=0,758401 -туберкулез). В результате исследования частот генотипов полиморфного ДНК-локуса было обнаружено, что наиболее частым в обеих выборках оказывался генотип G/G (74,7+3,15% и 72,5+2,79% среди больных и здоровых лиц соответственно, p>0,05). Гетерозиготы встречалась реже в обеих группах (23,2+3,06% и 25,9+2,74% соответственно, p>0,05).

В локусе G-308A в исследуемых группах наиболее распространенным оказался аллель G (86,3+1,76% и 85,5+1,56% соответственно в группе больных туберкулезом и в контроле). Сравнительный анализ распределения частот аллелей (G-308A) гена TNFА не выявил достоверное различие по данному параметру между обследованными группами (OR=0,934; C.I.=[0,637-1,369]; чІ=0,12, p=0,72674).

Результаты проведенного анализа свидетельствуют о вероятном отсутствии существенной взаимосвязи исследованного полиморфизма G-308A гена TNFА с заболеванием туберкулезом среди жителей г.Алматы.

Согласно литературным данным ряд генов-кандидатов, в том числе IL1В и TNFА, не только вносят определенный вклад в предрасположенность к тому или иному заболеванию, но и оказывают влияние на особенности клинического течения [Ben-Ari Z. et al., 2003; Wai T.C. et al., 2003]. Аллельные варианты промоторных участков генов цитокинов не влияют на аминокислотную последовательность белка, но могут приводить к изменению уровня продукции цитокина и, как следствие, выраженности иммунологических реакций [Giedreitis V. et al., 2001; Насыхова Ю.А. и др., 2007]. Поэтому несмотря на отсутствие различий между группами больных и здоровых по частотам аллелей и генотипов полиморфизмов (С+3954Т) гена IL1В и (G-308A) гена TNFA, мы исследовали связь уровня продукции цитокинов с генотипами и аллелями изучаемых полиморфизмов.

Так как целью данной работы является изучение особенностей течения микст-патологии - хронические вирусные гепатиты В и/или С и туберкулез легких, то для определения влияния полиморфизма генов цитокинов IL1В и TNFА на уровень секреции соответствующих белковых продуктов, представляло интерес выявить возможные различия иммунологических показателей в зависимости от этиологии вируса гепатита. В связи с этим группы сравнения были сформированы следующим образом: 1 группа - больные туберкулезом легких без сопутствующей вирусной гепатотропной патологии (34 человека), 2 группа - пациенты с ХГВ+ТВС (56 человек), 3 группа - больные с ХГС+ТВС (46 человек), 4 группа - больные с ХГВ+ХГС+ТВС (51 человек). Внутри каждой группы выделены подгруппы в зависимости от уровня соответствующего цитокина в сыворотке крови, границей показателей сывороточного уровня белка считали данные контрольной группы (n=30 человек).

При анализе распространенности аллельного полиморфизма (-3954С->Т) гена IL1В в зависимости от уровня повышения концентрации соответствующего цитокина в сыворотке крови в исследуемых группах установлены статистически значимые различия в группе пациентов с сочетанием HBV-инфекции с туберкулезом легких. Оценка аллельного полиморфизма (С+3954Т) гена IL1В выявила, что аллель Т достоверно чаще ассоциирован с высоким уровнем продукции IL-в у пациентов данной группы (OR=3,807; C.I.=[1,052-13,780]; чІ=4,61; p=0,03184) (рисунок 3). Наши результаты согласуются с данными других исследователей. Для нуклеотидной замены С+3954Т в 5 экзоне гена IL1В показана связь различных аллелей с продукцией соответствующего цитокина in vitro после стимуляции [Pociot F. et al., 1992]. В других группах сравнения статистически значимых различий не выявлено.

При анализе различий в распределении генотипов и аллелей полиморфного участка -308G->A гена TNFA было выявлено повышение частоты встречаемости генотипа G/A по сравнению с генотипом G/G (OR=5,357; C.I.=[1,063-26,999]; чІ=4,74; p=0,02949) также среди больных с хроническим гепатитом В в сочетании с туберкулезной инфекцией. В этой же группе пациентов установлена положительная ассоциация аллельного варианта TNFA-308А с повышенным уровнем экспрессии гена (OR=5,895; C.I.=[1,297-26,781]; чІ=6,42; p=0,01126) по сравнению с аллелем G.

На рисунках 3 и 4 представлены вышеописанные данные о влиянии полиморфизмов С+3954Т гена IL1В и G-308A гена TNFA на уровень содержания IL-1в и TNF-б в сыворотке крови у больных с хроническими вирусными гепатитами В и/или С в сочетании с туберкулезом легких, указанные в долях от общего числа лиц с одинаковым генотипом (аллелем) в соответствующей выборке.

Таким образом, полиморфизм генов цитокинов, в частности, в промоторном регионе может быть одним из механизмов, участвующих в формировании индивидуальной вариабельности уровня продукции белка. При патологии этот феномен имеет важное значение, так как цитокины являются ключевым фактором формирования эффективного иммунного ответа.

Рисунок 3 - Распределение аллелей полиморфного локуса С+3954Т гена IL1В у больных хроническими вирусными гепатитами В и/или С в зависимости от уровня IL-1в в сыворотке крови

Рисунок 4 - Распределение аллелей полиморфного локуса G-308A гена TNFA у больных хроническими вирусными гепатитами В и/или С в зависимостиот уровня TNF-б в сыворотке крови

Оценка эффективности усовершенствованной технологии для диагностики и генотипирования ВГС с использованием ДНК чипов

В Казахстане, так же как и во всем мире, проблема вирусного гепатита С стоит особенно остро. В целом отмечается отчетливое снижение показателей заболеваемости острым вирусным гепатитом С (3,1 ⁰/₀₀₀₀ в 2001 году и 0,9 ⁰/₀₀₀₀ в 2008 году). Согласно данным официальной статистики в течение данного периода в стране наблюдается неуклонная тенденция к росту заболеваемости хроническими вирусными гепатитами, преимущественно за счет гепатита С.

Широкое распространение малосимптомных и латентных форм инфекции, высокий хрониогенный потенциал (до 70-85%), неблагоприятные исходы, отсутствие эффективной специфической профилактики предопределяют особую значимость решению проблем ранней диагностики заболевания, генотипирования и эпидемиологического мониторинга.

На территории Казахстана для клинической практики достаточно выявить и различить три основных генотипа ВГС (1, 2 и 3) и соответствующие шесть субтипов (1а, 1b, 2а, 2b, 3а и 3b) [Шуратов И.Х. и др, 2001; Margolis H.C., 2005; ].

Ранее в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, Россия) был разработан способ выявления анализируемой последовательности ДНК с использованием высокоселективных олигонуклеотидных зондов на основе модифицированных («мостиковых») олигонуклеотидов [Пышный Д.В., Иванова Е.М., Пышная И.А., Зарытова В.Ф., 2005].

С помощью предложенного нами, совместно с разработчиками ДНК-чипа, способа диагностики вирусного гепатита С с использованием ДНК-чипов, в основе которых лежит вышеописанный способ выявления последовательности ДНК, было протестировано 65 образцов крови от больных вирусным гепатитом С (в том числе в сочетании с туберкулезом легких), проживающих в г.Алматы.

На рисунке 5 приведены сканированные изображения ДНК-биочипов после проведения анализа на семи ПЦР-образцах. Отнесение результатов каждого анализа проводили, сравнивая шаблоны со сканированным изображением ДНК-биочипа. При сопоставлении с шаблоном субтип вируса гепатита С устанавливался по колориметрическому проявлению полимеров, несущих соответствующие типоспецифические зонды.

Рисунок 5 - Сканированные изображения ДНК-биочипов после проведения анализа на ПЦР-образцах 1, 2, 5, 7, 8, 9, 11

Результаты генотипирования с использованием новой тест-системы (метод III) сопоставлены с данными, полученными референс-методами - прямого секвенирования нуклеотидной последовательности 5'-UTR HCV (метод I); коммерчески доступными тест-системами «ДНК-технология», «АмплиСенс HCV-генотип» (г.Москва, Россия)(метод II) (таблица 8).

Таким образом, тест-система на основе ДНК-чипов дает адекватное референс-методам определение генотипа HCV. Кроме того, использование предлагаемого способа диагностики вирусного гепатита С позволяет одновременно проводить процедуру выявления и генотипирования HCV. Отработанная нами процедура значительно сокращает трудозатраты на проведение анализа и существенно повышает его эффективность.

С целью проверки устойчивости компонентов тест-системы для генотипирования вируса гепатита С (на основе сконструированных ДНК-биочипов) при неблагоприятных условиях температурного и временного режимов хранения нами был проведен дополнительный эксперимент. Установлено, что все компоненты испытуемой тест-системы на основе ДНК-биочипов для детекции и генотипирования вируса гепатита С выдерживают изменения температурного режима (выдерживание при температуре (+ 4^оС, + 40^оС, - 20^оС (контроль)) и временных сроков хранения (до 8 месяцев при комнатной температуре).

Таблица 8 - Генотипы анализируемых изолятов вируса гепатита С

Примечание:

¹ - генотипирование HCV с использованием тест-системы «ДНК-технология» ² - генотипирование HCV с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-генотип»

Использование биологического микрочипа «ТВ-биочип» для определения мутаций в геноме M.tuberculosis, ответственных за развитие лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду

Так как на встречаемость мутаций в устойчивых к рифампицину и/или изониазиду изолятах M.tuberculosis могут существенно влиять географические особенности регионов их выделения, мы предприняли исследование возможности использования в Казахстане биочипа «ТВ-биочип», разработанного в Институте молекулярной биологии РАН (ИМБ РАН, Москва).

С этой целью нами было протестировано 160 штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных от больных хроническими формами туберкулеза легких из различных регионов Казахстана. Моноустойчивость только к рифампицину определялась у 3 больных (1,87%), моноустойчивость к изониазиду - у 2,5%. Штаммы, одновременно устойчивые к рифампицину и изониазиду, выявлены у 139 больных (86,8%). Лишь в 10,6% случаев выявлены штаммы M.tuberculosis, чувствительные к рифампицину и изониазиду.

Совпадение результатов микробиологической и молекулярно-биологической методик определения лекарственной чувствительности микобактерий к рифампицину составило 81,3% (в 130 случаях). Совпадением результатов двух использованных методик считали, если резистентные к рифампицину изоляты имели мутацию в гене rроВ. В ДНК чувствительных изолятов мутаций найдено не было.

Всего у изученных изолятов обнаружено 10 различных типов мутаций, локализованных в 5-ти кодонах. В одном случае была обнаружена двойная мутация Ser531>Leu+Leu533>Pro. Во всех остальных случаях одиночных мутаций наиболее часто выявлялись мутации в 531 кодоне (78,1%). Доминирующей является мутация Ser>Leu - 96,6%. Второй по частоте встречаемости является мутация в 526 кодоне - 14,0%. В кодоне 526 выявлено 4 различных типа мутаций. Среди них: His526>Asp - 2,6%, His526>Leu - 6,1%, His526>Arg - 1,8%, His526>Tyr - 3,5%. Мутация в кодоне 516 (Asp516>Val) имела место в 4,2% случаев. Мутации в 511 и 533 кодонах встречались реже и составили по 1,7% среди всех рифампицин-устойчивых штаммов МБТ. Специфичность определения чувствительности к рифампицину с помощью биочипов составила 81,3%.

Анализ данных литературы показывает, что в мире наиболее распространены штаммы Mycobacterium tuberculosis с мутацией в 3 кодонах: 531, 526 и 516. Частота встречаемости отдельных мутаций в этих кодонах в разных странах различная. По данным ряда авторов, аминокислотные замены в кодонах 531, 526, 516 приводят к рифампицинрезистентности высокого уровня [Bodmer T., Zurcher G., Imboden P. et al., 1995]. В регионах с высоким уровнем MDR-устойчивости (10-14% среди первичных случаев) корреляция между MDR и устойчивостью к рифампицину может достигать 80-90%, а среди повторных случаев превышает 90% при встречаемости MDR более 20% [WHO, 1997.].

Из 160 образцов ДНК M.tuberculosis мутации, ответственные за устойчивость к изониазиду, выявлены в 143 случаях. В данной выборке мутации генов katG и inhA встречались у 133 (83,1%) и 18 (4,2%) штаммов соответственно, среди них сцепленные мутации в обоих генах (katG и inhA) были обнаружены в 11 (7,0%) образцах ДНК M.tuberculosis. В гене katG доминировала мутация Ser315>Thr (129 или 97,7%). Специфичность определения чувствительности к изониазиду с помощью биочипов составила 89,4%.

Таким образом, результаты проведенного исследования дают основание утверждать, что метод биологических микрочипов может успешно использоваться на территории Казахстана для быстрого выявления множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. Использование тест-системы «ТБ-биочип» (ИМБ РАН, Москва) позволяет сократить время анализа с 2-2,5 месяцев до 2 дней и определить устойчивость к рифампицину и изониазиду, что дает возможность с самого начала лечения подобрать больному адекватную схему химиотерапии или своевременно ее корректировать.

Профилактика заражений вирусными гепатитами В и С во фтизиатрической практике остается серьезной проблемой. Как уже отмечалось, в настоящее время в противотуберкулезных стационарах лабораторная диагностика парентеральных вир...