Клинико-генетическая диагностика и диетотерапия метаболического синдрома у женщин репродуктивного возраста

При анализе SstI полиморфизма гена APOC3 у более, чем 5000 участников Фремингемского исследования, Russo G.T. с соавт. (2001) обнаружили, что у мужчин-носителей S2 аллеля были достоверно более низкие уровни ХС ЛПВП и более высокий уровень базального инсулина, а у женщин - более высокий уровень общего ХС, ХС ЛПНП и ароВ плазмы крови [190]. Во многих исследованиях сообщается о взаимосвязи носительства минорного аллеля S2 с гипертриглицеридемией [30, 60, 60]. Так, Shoulders с соавт. (1991) обнаружили взаимосвязь носительства S2 аллеля с повышенным уровнем ТГ как у мужчин, так и у женщин, причем у мужчин также отмечался достоверно более высокий уровень АроВ плазмы крови [198]. В работе Salas с соавт. (1998) выявлен более высокий уровень инсулина в плазме крови после проведения ПГТТ у носителей S2 аллеля гена APOC3 [193], однако в исследовании Kozlitina J. С соавт. (2011) взаимосвязи между изучаемым полиморфизмом и наличием инсулинорезистентности у мужчин и женщин североамериканской популяции обнаружено не было [122].

Одним из генов-кандидатов развития ИР и СД 2 типа является ген PTPN-1B (PTP1-B, PTPN1), кодирующий протеиновую тирозинфосфатазу 1, которая ингибирует тирозиновое фосфорилирование инсулинового рецептора и субстрата инсулинового рецептора-1 (IRS-1), что приводит к нарушению сигнального каскада инсулина [77]. Ген расположен на длинном плече хромосомы 20 в хромосомной области 20q13.1-13.2 [77]. В экспериментах показано, что у мышей с нарушенной функцией гена PTPN-1B выявляется повышенная чувствительность тканей к инсулину, а также устойчивость к набору веса на фоне высокожировой диеты [K116]. Однонуклеотидная замена цитозина на тимин в гене PTPN-1B приводит к замене пролина на лейцин в 387 позиции белка PTP-B (Pro387Leu, rs16995309). Распространенность мутантного аллеля в европейской популяции составляет 0,5-1% [77, 90]. В клинических исследованиях, ряд исследователей выявил повышенный риск развития СД 2 типа у носителей Leu аллеля [77], однако в других работах подобной взаимосвязи не получено, что в ряде случаев было связано с низкой распространенностью данной мутации [53, 90].

Не вызывает сомнения роль наследственной предрасположенности в формировании МС, в связи с чем актуален поиск информативных генетических маркеров, позволяющих не только своевременно выявить пациентов, относящихся к группе высокого риска развития МС, и соответственно проводить превентивные мероприятия на доклинической стадии синдрома, но и выявлять соответствующие нарушения обмена веществ, приводящие к его развитию. Вместе с тем, роль генетических факторов в развитии компонентов МС неоднозначна, что говорит о существенном вкладе факторов внешней среды, таких как перинатальное развитие, структура питания, степень физической активности, вредные привычки, стрессовые воздействия в развитии симптомокомплекса МС. Необходимы исследования как отдельных групп (этнических, возрастных), так и общей популяции для поиска взаимосвязи между генетическими и средовыми факторами с развитием МС.

1.3 Современные подходы к диетотерапии метаболического синдрома

Многочисленные исследования показывают, что фактор питания наряду с генетической предрасположенностью, возрастом, низкой физической активностью, курением, стрессом вносит существенный вклад в развитии ИР [115, 143, 229]. В литературе широко обсуждается вопрос о роли отдельных пищевых веществ и диетического рациона в целом в развитии ИР и возможном улучшении чувствительности к инсулину при целенаправленном изменении структуры питания.

Как известно, длительное высококалорийное питание сопровождается гиперинсулинемией и ИР вследствие стимуляции секреции инсулина, синтеза триглицеридов и аккумуляции преимущественно висцерального жира с нарушением рецепторных и пострецепторных механизмов действия инсулина [229]. О роли висцерального жира в развитии ИР свидетельствуют данные S.Klein и соавт., которые не отметили улучшение инсулиновой чувствительности при уменьшении одной только подкожной жировой ткани после проведения липосакции [117]. По данным ряда авторов, голодание также ухудшает чувствительность к инсулину и снижает толерантность к глюкозе у больных СД 2 типа и ожирением [76].

Результаты многих исследований свидетельствуют, что калорическая редукция диеты и коррекция массы тела являются эффективным методом воздействия на периферическую ИР и гиперинсулинемию [115, 180, 215]. Снижение массы тела сопровождается улучшением чувствительности к инсулину, как при резком ограничении калорийности диеты (800 ккал/день и менее) [13, 14, 104], так и при умеренной калорической редукции [15, 139], что связано преимущественно с уменьшением массы висцерального жира, снижением содержания лептина и резистина, индуцирующего печеночную ИР [15, 139]. Azabdakht et al. [45] сравнили 2 группы пациентов, одна из которых получала гипокалорийную диету с добавлением молочных продуктов с пониженным содержанием жира, овощей, фруктов, цельнозерновых и бобовых продуктов, а вторая - гипокалорийную диету без учета макронутриентного состава (калорическая редукция в обеих группах составила 500 ккал по сравнению с контрольной группой). Через 6 месяцев наблюдения в обоих группах наблюдалось схожее снижение показателей массы тела, окружности талии и уровня триглицеридов плазмы крови по сравнению с контрольной группой, однако в первой группе также было выявлено значительное повышение уровня липопротеидов высокой плотности, снижение систолического и диастолического артериального давления и уменьшения гликемии натощак. Эти данные говорят о том, что само по себе снижение массы тела положительно влияет на разные компоненты МС, однако при коррекции макронутриентного состава рациона можно добиться более значимых результатов.

В настоящее время получены достаточно убедительные доказательства, что избыточное потребление жира, особенно насыщенных жиров и транс-изомеров жирных кислот, ассоциируется с развитием ИР [51, 115, 181] и субклинического воспаления (повышение уровня IL-6, IL-18, TNF-a) как у здоровых лиц, так и у пациентов с СД типа 2 [78]. Ухудшение действия инсулина под влиянием избыточного потребления жира может быть связано с накоплением в скелетных мышцах триглицеридов, снижением активности тирозинкиназы, уменьшением числа транспортеров глюкозы GLUT4, нарушением активности гликогенсинтетазы [138, 229]. Однако данные о взаимосвязи различных типов жирных кислот с развитием ИР и других компонентов МС неоднозначны и требуют дальнейшего изучения.

Показано, что полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) омега-3 обладают профилактическим действием в условиях развития ИР, обусловленной высокожировой диетой, за счет воздействия на сниженную активность фосфотидил-инозитол-3-киназы, уменьшенный уровень GLUT-4 в мышечной ткани и сниженную экспрессию GLUT-4 в жировой ткани [69]. Также, обогащение рациона ПНЖК омега-3 приводит к значительному повышению уровня эйкозопентаеновой (ЭПК) и докозогексаеновой (ДГК) кислот и снижению арахидоновой кислоты в клеточных мембанах, особенно тромбоцитов, эритроцитов, нейтрофилов, моноцитов и гепатоцитов, и напротив, диеты, обогащенные омега-6 ПНЖК, ингибируют встраивание ЭПК в в клеточные мембраны [106]. Повышенный уровень ПНЖК омега-3 в скелетных мышцах ассоциировано с улучшением чувствительности к инсулину [141], а высокое соотношение омега-6/омега-3 ПНЖК в мембранах миоцитов - с повышенным уровня инсулина натощак [206]. Несмотря на имеющиеся экспериментальные данные об улучшении действия инсулина под влиянием омега-3 ПНЖК, а также их положительном влиянии на липидный спектр крови и артериальное давление [106, 141], результаты клинических наблюдений, касающиеся эффектов ПНЖК омега-3 на чувствительность тканей к инсулину, неоднозначны. Многими авторами показана прямая зависимость между потреблением насыщенных жирных кислот (НЖК) и уровнем инсулина натощак и после еды [168]. Vessby B. c соавт. изучили эффекты двух изокалорийных диет, обогащенных НЖК и ПНЖК соответственно, у здоровых добровольцев [219]. Выявлено ухудшение чувствительности к инсулину в группе, получавшей диету богатую НЖК. Изокалорийная замена НЖК на ПНЖК приводит к улучшению чувствительности к инсулину, снижению абдоминального жира без изменения соотношений ОТ-ОБ и процентного содержания жировой массы. Также показано улучшение чувствительности к инсулину у здоровых лиц, находящихся на диете, обогащенной мононенасыщенными жирными кислотами (МНЖК), по сравнению с диетой с высоким содержанием НЖК [14].

Широко обсуждается роль углеводного состава рациона в развитии и прогрессировании ИР [46, 66, 143, 229]. В экспериментах продемонстрировано развитие ИР при избыточном потреблении сахарозы и фруктозы (более 60% и 35% от энергетической ценности рациона соответственно) [46, 66]. Возможными механизмами развития ИР при избыточном потреблении фруктозы являются изменение активности траспортеров фруктозы GLUT-5, уменьшение числа инсулиновых рецепторов в скелетной мускулатуре и печени, снижение инсулинстимулированного аутофосфорилирования, повышенная секреция триглицеридов [14]. При проведении гиперликемического клемпа инфузия фруктозы в количестве 16,7 мкмоль/кгмин вызывала печеночную и внепеченочную ИР у здоровых лиц [72]. При исследовании, включившем в себя 2500 добровольцев, Yoshida с соавт. [233] показали положительную корреляцию между употреблением сладких безалкогольных напитков (с высоким содержанием фруктозы и глюкозы), уровнем инсулина натощак и индексом инсулинорезистентности HOMA-IR. Однако, в более ранних исследованиях [119] был обнаружен положительный эффект диеты с высоким содержанием сахарозы и фруктозы на чувствительность к инсулину. C.Lau и соавт. [127] при обследовании 5675 лиц в возрасте 30-60 лет показали, что потребление лактозы положительно ассоциируется с ИР, тогда как потребление глюкозы, фруктозы и общего количества углеводов отрицательно взаимосвязано с ИР. Необходимы дальнейшее исследование роли моно- и дисахаридов в развитии ИР.

В ряде исследований показано, что потребление различных видов пищевых волокон (ПВ) и резистентного крахмала оказывает положительное действие на чувствительность к инсулину [186, 227]. Влияние ПВ на секрецию и действие инсулина обусловлено их действием на моторно-эвакуаторную функцию толстой кишки, активность ферментов поджелудочной железы, секрецию гастроинтестинальных гормонов, образование короткоцепочечных жирных кислот, подавляющих глюконеогенез в печени [14, 229]. В большинстве исследований подтверждается влияние растворимых ПВ на улучшение чувствительности тканей к инсулину [115]. Однако, M.O.Weickert и соавт. [227] показали, что потребление хлеба с повышенным содержанием нерастворимых ПВ сопровождается улучшением действия инсулина по сравнению с потреблением пшеничного хлеба, при этом изменений в уровне липидов, магния, грелина и адипонектина в плазме и сыворотке крови отмечено не было. M.D.Robertson и соавт. [186] сообщили об улучшении чувствительности к инсулину при 4-х недельном потреблении резистентного крахмала, который, как известно, не подвергается воздействию гидролитических ферментов, не переваривается в тонкой кишке и является субстратом для образования короткоцепочечных жирных кислот в толстом кишечнике [14].

При изучении влияния диеты с повышенным содержанием белка у пациентов с ожирением и гиперинсулинемией, было выявлено, что применение высокобелковой гипокалорийной диеты приводит к более значимому снижению уровня глюкозы, ТГ и жировой массы тела при меньшем снижении тощей МТ по сравнению со стандартными гипокалорийными диетами [7, 79] и диетой с высоким содержанием углеводов [157]. Однако, диеты с повышенным содержанием белка не рекомендуется использовать при выявленном нарушении функции почек. Так, при наличии микроальбуминурии содержание белка в рационе пациентов с развившимся СД 2 типа не должно превышать 12-15% от калорийности рациона (не более 1 г белка на 1 кг МТ) [10]. Особый интерес представляют работы, посвященные роли белка растительного происхождения в рационах питания. Показано, что замена животных белков на белок сои приводит к снижению уровня ЛПНП у пациентов с ССЗ [33], а у больных СД 2 типа к достоверному снижению уровня глюкозы и ТГ плазмы крови [23].

Применение гипокалорийных рационов сопровождается ограничением поступления не только макронутриентов (белков, жиров, углеводов), но и может приводить к снижению обеспеченности организма рядом незаменимых пищевых веществ, в том числе ПНЖК, витаминов, макро- и микроэлементов, недостаточное потребление которых относится к числу наиболее распространенных отклонений от рекомендуемых норм питания для взрослого населения [11]. Одним из наиболее эффективных путей оптимизации микронутриентного статуса пациентов является использование в комплексе лечебных мероприятий продуктов диетического питания, сбалансированных по макро- и микронутриентному составу, с целью восполнения дефицита нутриентов в редуцированных по калорийности диетических рационах [7, 37]

Работа проводилась на базе клиники ФГБУ “НИИ питания” РАМН (директор - акад. РАМН, проф. Тутельян В.А.): отделении болезней обмена веществ (зав. отд. - д.м.н. Шарафетдинов Х.Х.), отделении сердечно-сосудистой патологии (зав. отд. - к.м.н., Богданов А.Р.), отделении профилактической и реабилитационной диетологии (зав. отд. - к.м.н., Гаппарова К.М.), отделении гастроэнтерологии и гепатологии (зав. отд. - д.м.н., проф. Исаков В.А.). Лабораторные исследования выполнены в лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии ФГБУ НИИ питания РАМН (зав. лабораторией - д.м.н., профессор Сенцова Т.Б.) и лаборатории медицинской геномики ФГБУ "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича" РАМН (зав. лабораторией - к.б.н. Воронько О.Е.).

В исследование включено 211 женщин репродуктивного возраста (средний возраст 31,4±0,6 лет). Все пациенты, включенные в исследование, подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

Критериями не включения в исследование являлись: сахарный диабет 1 или 2 типа, прием препаратов для снижения веса, гипогликемических или липидснижающих препаратов, глюкокортикоидов, наличие острого или хронического заболевания в период обострения, отказ от участия в исследовании.

Для диагностики МС использовались критерии Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК) второго пересмотра [4], согласно которым диагноз МС у женщин устанавливается при наличии абдоминального ожирения (ОТ более 80 см), и двух или более из следующих признаков: повышение уровня ТГ в крови более 1,7 ммоль/л, снижение уровня ХС ЛПВП менее 1,2 ммоль/л, повышение уровня ХС ЛПНП более 3,0 ммоль/л, САД более 130 мм рт. ст. или ДАД более 85 мм рт. ст., гипергликемия натощак (глюкоза в плазме крови натощак более 6,1 ммоль/л) или нарушение толерантности к глюкозе (глюкоза в плазме крови через 2 часа после нагрузки глюкозой в пределах от 7,8 до 11,1 ммоль/л).

В зависимости от наличия МС все пациентки были разделены на две сопоставимые по возрасту (p=0,23) группы: основную группу - женщины репродуктивного возраста с МС (n=109, средний возраст по группе 32,2±0,9 лет) и группу сравнения - женщины репродуктивного возраста без МС (n=102, средний возраст по группе 30,5±0,8 лет).

Обследование включало в себя изучение пищевого статуса, ультразвуковое исследование сонных артерий, молекулярно-генетическое исследование полиморфизмов генов FABP2, PPARG2, LEP, LEPR, APOC3 и PTPN1B.

С целью изучения эффективности оптимизированной диетотерапии у больных МС, из основной группы методом случайной выборки были выделены 2 подгруппы: подгруппа 1 получала гипокалорийную диету с включением специализированного пищевого продукта для энтерального питания, подгруппа 2 получала гипокалорийную диету.

2.2. Клиническая характеристика пациентов

В исследование включено 211 женщин в возрасте от 18 до 52 лет. Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Антропометрические показатели обследованных женщин (M±m).

Рисунок 1. Распределение пациентов в зависимости от степени ожирения.

При исследовании компонентов МС, в основной группе наиболее часто встречалось повышение уровня ХС ЛПНП (78%) и снижение уровня ХС ЛПВП (57%), гипертриглицеридемия отмечалась у 44% пациентов, артериальная гипертония - у 53%, нарушение углеводного обмена (гипергликемия натощак или НТГ) у 45% обследованных (рис. 2).

По структуре сопутствующей патологии не было обнаружено существенных отличий в основной группе и группе сравнения. Наиболее часто при МС выявлялись хронический гастрит (35,2%), язвенная болезнь желудка или 12-перстной кишки (22,8%), хронический пиелонефрит (23,1%), реже - хронический некалькулезный холецистит (21,7%), неалкогольная жировая болезнь печени (18,5%), ИБС (11,1%), желчекаменная болезнь (10,2%), хронический бронхит или бронхиальная астма (9%), мочекаменная болезнь (6,7%) и синдром раздраженного кишечника (6,2%). Все хронические заболевания были в стадии ремиссии.

Рисунок 2. Частота выявления основных компонентов МС у пациентов основной группы.

Пациенты получали адекватную своему клиническому состоянию медикаментозную терапию - гипотензивные препараты (ингибиторы АПФ, блокаторы рецепторов ангиотензина, в-адреноблокаторы, диуретики, блокаторы кальциевых каналов), антиагреганты.

2.3 Описание методов исследования

Оценку пищевого статуса производили с использованием методики “Нутритест ИП-3”, разработанной в ФГБУ “НИИ питания” РАМН (2008).

2.3.1.1 Клиническое обследование

Клиническое обследование включало в себя возраст пациентов, сбор анамнеза и физикальный осмотр.

В антропометрические параметры исследования включались МТ, рост, ОТ, ОБ, расчёт ИМТ и соотношения ОТ/ОБ. ОТ измеряли на середине расстояния между нижним краем реберной дуги и гребнем подвздошной кости по среднеподмышечной линии, ОБ - на уровне подвздошного гребня. Для диагностики ожирения использовался ИМТ, определяемый как отношение МТ в килограммах к квадрату роста в метрах: ИМТ = вес (кг)/рост (м)2. ИМТ в диапазоне от 25,0 до 29,9 соответствовал категории избыточного веса; от 30,0 до 34,9 - ожирению первой степени; от 35,0 до 39,9 - ожирению второй степени; ИМТ более 40 - ожирению третьей степени.

Уровень АД определялся ручным методом стандартным сфигмо-манометром на правой и левой руках пациента в положении сидя после пяти минут покоя. Учитывали средний результат троекратных измерений с интервалом 3-5 минут на руке с более высоким уровнем АД.

После проведения клинического обследования в группу по исследованию эффективности оптимизированной диетотерапии с включением специализированного пищевого продукта для энтерального питания из основной группы было отобрано 60 пациентов. По принципу случайной выборки пациенты разделены на 2 сопоставимые по возрасту подгруппы: подгруппу 1 (30 чел.) и подгруппу 2 (30 чел.). Все пациенты в течение трех недель получали низкокалорийный вариант стандартной диеты (1500 ккал/сут). У пациентов подгруппы 1 рацион модифицировался за счет замены ужина на готовый к употреблению специализированный продукт для энтерального питания Нутридринк в количестве 200 мл. Суточная энергоценность рациона при этом не изменялась и составила 1500 ккал. Применение специализированного продукта для энтерального питания позволило модифицировать микронутриентный состав гипокалорийной диеты за счет обогащения рациона витаминами (С, В1, В2, В6, А, Е, ниацин, пантотеновая и фолиевая кислоты) и микроэлементами (селен, хром, цинк, медь, марганец). У всех больных в процессе диетотерапии проводилась ежедневная оценка общего состояния, определялись показатели гемодинамики (уровень САД и ДАД, частота сердечных сокращений), при поступлении и выписке проводилось измерение антропометрических показателей (измерение роста, МТ, определение ОТ и ОБ, расчет ИМТ, соотношения ОТ/ОБ), исследование состава тела методом биоимпедансометрии (содержание жировой массы, тощей массы, активной клеточной массы, общей жидкости) и биохимических показателей в сыворотке крови (глюкозы, общего ХС, ХС ЛПВП, ХС ЛПНН, ТГ, мочевой кислоты, общего белка, общего билирубина, щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ).

2.3.1.2 Оценка фактического питания

Оценка фактического питания проводилась методом анализа частоты потребления пищи с использованием программного обеспечения “Анализ состояния питания человека” (версия 1.2 ГУ НИИ питания РАМН, 2003-2005 гг.).

2.3.1.3 Определение состава тела

Показатели состава тела оценивались с использованием метода биоимпедансометрии, позволяющего по измеренному импедансу (электрическому сопротивлению) оценить количественно различные компоненты состава тела [22, 25]. Оценка показателей состава тела (жировая масса, процент жировой массы, масса скелетной мускулатуры, тощая масса, общее количество воды в организме) проводилась с помощью биоимпедансных анализаторов “Inbody 520” и “Inbody 720” фирмы Biospace Technology (Корея).

2.3.2 Лабораторные методы исследования

Забор крови осуществляли из локтевой вены натощак в стандартные одноразовые пробирки Vacuette для биохимических исследований.

Исследование биохимических показателей крови, включавшее определение содержания в сыворотке крови глюкозы (норма 3,89-6,38 ммоль/л), общего ХС (норма 3,3-5,2 ммоль/л), ХС ЛПВП (норма от 1,20 ммоль/л), ХС ЛПНП (норма до 3,0 ммоль/л), ТГ (норма до 1,70 ммоль/л), общего белка (норма 64-83 г/л), мочевой кислоты (норма 240-320 ммоль/л), общего билирубина (норма 0-20 мкмоль/л), АЛТ (норма 0-40 Ед/л), АСТ (норма 0-40 Ед/л), щелочной фосфатазы (норма 42-98 Ед/л) проводилось на биохимическом анализаторе “Konelab 30i” (Финляндия). Исследование высокочувствительного С-реактивного белка (СРБ, норма 0,1-8,2 мг/л) проводилось с использованием стандартных наборов фирмы “Monobind Inc.” (США) на иммуноферментном анализаторе “MultiScan+” (Финляндия).

Пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ) проводился натощак, после периода 10-12-часового голодания по стандартной методике. Дозу глюкозы для проведения теста рассчитывали по формуле: 1,75 г глюкозы 1 кг массы тела, но не более чем 75 г глюкозы. Измерение глюкозы сыворотки крови до и через 120 мин после приема раствора глюкозы осуществляли на биохимическом анализаторе “Konelab 30i” (Финляндия). Результаты теста оценивались по критериям Экспертного комитета по диагностике и классификации сахарного диабета ВОЗ (1999 г.) [230]. Показатели гликемии расценивались как нормальные, если уровень глюкозы плазмы натощак составлял менее 6,1 ммоль/л, через 2 часа после нагрузки глюкозой - менее 7,8 ммоль/л. При уровне глюкозы плазмы натощак от 6,1 ммоль/л до 6,9 ммоль/л диагностировалась нарушенная гликемия натощак. Если уровень гликемии через 2 часа после проведения ПГТТ находился в пределах от 7,8 до 11,0 ммоль/л, это состояние классифицировалось как нарушенная толерантность к глюкозе.

Исследование показателей гормонального статуса: содержание инсулина (норма 0,7-9,0 мкМЕ/мл), С-пептида (норма 0,7-1,9 нг/мл) определяли с использованием стандартных наборов фирмы “Monobind Inc.” (США), лептина (норма 3,7-11,1 нг/мл) и ГСПГ (норма 15-120 нмоль/л) - наборов “DBC” (Канада) проводилось на иммуноферментном анализаторе “MultiScan+” (Финляндия).

Индекс инсулинорезистентности (НОМА-IR) определялся по формуле:

Инсулинорезистентность диагностировалась при значениях индекса НОМА-IR более 2,77 ед.

2.3.3 Ультразвуковое исследование сонных артерий

УЗИ общих и внутренних сонных артерий проводилось на приборе GE Logic 7 (США) линейным датчиком с частотой излучения 7,5-12 мГц. Исследование выполнялось по стандартной методике в В-режиме со спектральным анализом кровотока и цветным доплеровским картированием. Измерение ТИМ ОСА проводилось на 1-1,5 см проксимальнее бифуркации, ВСА - на 1-1,5 см дистальнее бифуркации на наиболее удаленной от датчика стенке артерии. При различных значениях ТИМ правой и левой сонных артерий использовалось максимальное из двух значение.

2.3.4 Молекулярно-генетические методы

Проводилось исследование полиморфизмов Ala54Thr гена FABP2 (rs1799883), Pro12Ala гена PPARG2 (rs1801282), G-2548A гена LEP (rs7799039), Arg223Gln гена LEPR (rs1137101), S1/S2 (SstI) гена APOC3 (rs5128) и Pro387Leu гена PTPN1B (rs16995309).

Забор венозной крови на генетическое исследование производили натощак в количестве 10 мл в стандартные одноразовые пробирки Vacuette, содержащие EDTA.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции. 200 мкл венозной крови человека смешивали с равным объёмом лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН=8,0; 20 мМ ЭДТА; 150 мМ NaCl; 1% додецилсульфат натрия), затем добавляли протеиназу К в концентрации 20 мкг/мл и инкубировали полученную смесь либо при 37°С в течение ночи, либо при 65°С три часа. Затем материал последовательно обрабатывали 400 мкл фенола с дальнейшим центрифугированием 5 минут при 12000 об./мин., смесью 200 мкл фенола и 200 мкл хлороформа (центрифугирование 5 минут с той же скоростью) и 400 мкл хлороформа (центрифугирование 5 минут с той же скоростью). ДНК осаждали добавлением 500 мкл 100% этилового спирта с последующей инкубацией при -20°С в течение 1 часа и последующим центрифугированием на микроцентрифуге “Eppendorf” при 14000 об./мин. в течение 15 минут. Осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом, сушили на воздухе и растворяли в 200 мкл бидистиллированной воды. Препараты ДНК хранили при - 20°С.

Выявление аллельных вариантов Pro12Ala гена PPARG2 и Arg223Gln гена LEPR осуществлялось на амплификаторе “Tetrad 2” (“BioRad”, USA) с помощью аллель-специфической ПЦР с использованием диагностических наборов “Мутация PPARG2 (Pro12Ala)” и “Мутация рецептора лептина (Arg223Gln)” НПО “Литех” (Москва) по рекомендованной производителем методике.

Выявление полиморфизмов генов FABP2, LEP, APOC3 и PTPN1B осуществляли с помощью ПЦР в 25 мкл смеси, содержащей 2,5 мкл 10хбуфера для Таq-полимеразы с сульфатом аммония (“Диалат”, Москва), 1 мкл 1,5 мМ MgCl2 (“Диалат”, Москва), 0,3 мкл 200 мкМ смеси dNTPs (“Диалат”, Москва), по 10 пкмоль каждого праймера (“Синтол”, Москва), 1 ед. BioТаq-полимеразы (“Диалат”, Москва) и 100 нг геномной ДНК.

ПЦР проводилась на амплификаторе “Tetrad 2” (“BioRad”, USA) по следующей программе: начальная денатурация 94° - 4 мин, далее 35 циклов по схеме: 94° - 25 сек, температура отжига (Tотж) - 25 сек, 72° - 30 сек. Tотж праймеров варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса (Табл.3).

Далее продукты амплификации генов FABP2, LEP, APOC3 и PTPN1B обрабатывали рестриктазами: HspAI для полиморфизмов Ala54Thr гена FABP2 и G-2548A гена LEP, EcoICRI для полиморфизма S1/S2 гена APOC3, и Bsc4I для полиморфизма Pro387Leu гена PTPN1B (“Сибэнзим”, Новосибирск). Амплифицированный участок гена FABP2 длиной 375 пар нуклеотидов расщеплялся на фрагменты длиной 200 и 175 пар нуклеотидов при генотипе Ala. Амплифицированный участок гена LEP длиной 242 пар нуклеотидов расщеплялся на фрагменты длиной 181 и 61 пар нуклеотидов при генотипе G. Амплифицированный участок гена APOC3 длиной 596 пар нуклеотидов расщеплялся на фрагменты длиной 371 и 225 пар нуклеотидов при генотипе S2. Амплифицированный участок гена PTPN1 длиной 327 пар нуклеотидов расщеплялся на фрагменты длиной 290 и 37 пар нуклеотидов при генотипе Leu, и на фрагменты длиной 189, 101 и 37 пар нуклеотидов при генотипе Pro.

Таблица 3.

Последовательности праймеров, длина амплифицируемых фрагментов и температура отжига праймеров для генов FABP2, PPARG2, LEP, APOC3, PTPN1.

Визуализация фрагментов ДНК после амплификации или рестрикции производилась с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле в горизонтальной камере с использованием в качестве электродного буфера 1хТАЕ при напряженности поля 8 В/см. По окончании электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и просматривали в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.

2.4 Характеристика используемых диетических рационов

Характеристика низкокалорийного варианта стандартной диеты.

Диетотерапия редуцированным по калорийности рационом является наиболее эффективным способом коррекции избыточной массы тела, гипергликемии и липидного обмена у взрослых и детей с ожирением в условиях стационара. В этой связи, у наблюдаемых больных применялся низкокалорийный вариант стандартной диеты с редукцией калорийности до 1500 ккал/сут. Содержание белка в диете составило 18,3%, жира - 29,4%, углеводов - 52,3% от энергетической ценности рациона. В жировом компоненте диеты 46,8% приходилось на долю жиров растительного происхождения. Содержание витаминов группы В и витамина А в диете было несколько ниже рекомендуемых норм потребления в связи с ограничением продуктов, являющихся их источником (хлебобулочные изделия, крупяные блюда, сливочное масло и др.). Количество витаминов С, Е, минеральных веществ и микроэлементов соответствовало физиологическим потребностям в этих микронутриентах. Химический состав и энергетическая ценность низкокалорийного варианта стандартной диеты представлен в табл.4.

Таблица 4

* - в процентах от энергетической ценности рациона

** - Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации МР 2.3.1.2432 -08 (для лиц 30-59 лет I-II групп физической активности).

Характеристика специализированного продукта с заданным химическим составом.

Компания Nutricia Advanced Medical Nutrition (Нидерланды) разработала готовый к употреблению специализированный продукт для лечебного питания “Нутридринк”, который может быть использован в качестве единственного или дополнительного источника энергии, макро- и микронутриентов. Продукт характеризуется повышенным содержанием белка, витаминов (группы В, С, Е, каротиноидов) и микроэлементов (хром, селен, медь), а также имеет оптимальное соотношение полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейства омега-6 и омега-3, равное 4:1. “Нутридринк” содержит в расчете на 100 мл продукта: белок - 6,0 г, жиры - 5,8 г, насыщенные жирные кислоты - 0,7 г, линолевая кислота - 1,36 г, б-иноленовая кислота - 0,28 г, углеводы - 18,4 г, из них полисахариды - 11,3 г, витамины: А - 123 мкг-RE, каротиноиды - 0,30 мг, Д₃ - 1,1 мкг, Е - 1,9 мг- бТЕ, К - 8 мкг, С - 15 мг, В₁ - 0,23 мг, В₂ - 0,24 мг, В₆ - 0,26 мг, В₁₂ - 0,32 мкг, РР - 2,7 мг, пантотеновая кислота - 0,8 мг, фолиевая кислота - 40 мкг, биотин - 6,0 мкг, холин - 55 мг, минеральные вещества и микроэлементы: натрий - 90 мг, калий - 159 мг, хлориды - 87 мг, кальций - 91 мг, фосфор - 78 мг, магний - 23 мг, железо - 2,4 мг, цинк - 1,8 мг, марганец - 0,5 мг, медь - 270 мкг, йод - 20 мкг, селен - 8,6 мкг, хром - 15 мкг, молибден - 8,6 мкг; энергетическая ценность - 150 ккал (630 кДж). Продукт не содержит лактозу, пищевых волокон, глютен, холестерин, генетически модифицированные компоненты. В РФ зарегистрированы 6 вкусов “Нутридринка”: апельсиновый, ванильный, клубничный, банановый, шоколадный и нейтральный (свидетельство о регистрации №77.90.19.7.У.6933.8.07 от 23.08.2007).

2.5 Статистические методы обработки данных

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы SPSS 17,0. Результаты представлены в виде средних величин и стандартной ошибки средней величины (M±m). Сравнение двух групп проводилось с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Парную взаимосвязь между двумя и более признаками определяли методом корреляционного анализа Спирмена. Достоверными считались результаты при р<0,05.

Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием МС использовался точный двусторонний критерий Фишера. Достоверными считали различия при p<0,05. Распределения аллелей и генотипов всех маркеров подчиняются закону Харди-Вайнберга. Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR). Как отсутствие ассоциации рассматривали OR=1; как положительную ассоциацию ("предрасположенность") - OR>1; как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (пониженный риск развития заболевания) считали OR<1. Доверительный интервал (CI) представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение OR.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

При анализе рациона питания пациентов с МС до поступления в стационар было установлено, что их питание характеризовалось повышенной калорийностью (в среднем 2797±156 ккал/сут, что достоверно выше рекомендуемых значений), избыточным потреблением жиров (в среднем 138,3±8,7 г/сут) и недостаточным потреблением ПВ (в среднем 17,0±5,4 г/сут). При этом, у пациентов основной группы по сравнению с группой сравнения отмечено достоверно более высокое потребление как общего жира, так и НЖК и холестерина (р<0,05). Потребление белка пациентами обоих групп превышало рекомендуемые нормы и составило, в среднем, 92,6±5,4 г/сут в группе пациентов с МС и 83,6±4,7 г/сутки в группе сравнения. Потребление общих углеводов в обеих группах было в пределах рекомендованных норм [26], достоверных различий между группами обследованных выявлено не было. Однако выявлено избыточное потребление моносахаридов (в среднем 167,1±15,9 г/сут для основной группы и 166,9±25,5 г/сут для группы сравнения) и недостаточное потребление крахмала (в среднем 108,9±11,6 г/сут для основной группы и 92,2±9,3 г/сут для группы сравнения).

При оценке потребления витаминов было выявлено избыточное потребление витаминов А и С в обоих группах, при этом более выраженное превышение потребления витамина А отмечено в основной группе. Также выявлено недостаточное потребления ниацина (в среднем, 16,3±0,9 мг/сут в основной группе и 14,2±0,9 мг/сут в группе сравнения, р<0,05) и витамина В1 в обеих группах (в среднем, 1,2±0,1 мг/сут в основной группе и 1,1±0,1 мг/сут в группе сравнения).

Результаты оценки фактического питания представлены в табл. 5.

Таблица 5.

Оценка фактического питания пациентов с МС (М±m).

Примечание: ¹ “Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации”, Методические рекомендации, Москва 2008 г. (для женщин 18-59 лет I-II групп интенсивности труда); р - достоверность различий между группами, * р<0,05.

Таким образом, анализ структуры фактического питания пациентов с МС свидетельствует о достаточно выраженных отклонениях в потреблении отдельных пищевых веществ от рекомендуемых величин. Наиболее характерными нарушениями химического состава диеты были избыточная калорийность рациона, высокое потребление жира, НЖК, холестерина, недостаточное потребление сложных углеводов и ПВ, а также избыточное содержание в диете натрия, калия и фосфора.

При оценке показателей состава тела у пациентов обеих групп выявлено повышение содержания жировой массы, при этом в основной группе отмечалось достоверно более высокое содержание жировой массы (в среднем 48,4±1,4 кг и 31,4±1,8, соотв.), тощей массы (в среднем 55,2±0,7 кг и 48,7±0,8 кг, соотв.), массы скелетной мускулатуры (в среднем 30,7±0,5 кг и 26,4±0,5 кг, соотв.) и общей жидкости в организме (в среднем 40,4±0,5 кг и 35,6±0,6 кг, соотв.) по сравнению с группой сравнения (p<0,001). Результаты проведенного биоимпедансометрического исследования представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Показатели состава тела у пациентов с МС (M±m).

В основной группе выявлена положительная корреляционная зависимость между жировой массой и уровнем мочевой кислоты (r=0,404, p<0,001), С-пептида натощак (r=0,338, p<0,02) и после нагрузки глюкозой (r=0,389, p<0,02), уровнем инсулина после нагрузки глюкозой (r=0,397, p<0,02), а также уровнем СРБ (r=0,593, p<0,001) и лептина (r=0,649, p<0,001). Также выявлена положительная зависимость массы скелетной мускулатуры и тощей массы с уровнем мочевой кислоты (r=0,517, p<0,001 и r=0,312, p=0,001, соотв.), индексом HOMA-IR (r=0,483, p<0,001 и r=0,275, p<0,01, соотв.), уровнем инсулина натощак (r=0,524, p<0,001 и r=0,330, p<0,01, соотв.) и С-пептида натощак (r=0,483, p<0,001 и r=0,385, p<0,01, соотв.), а также уровнем инсулина после нагрузки глюкозы (r=0,446, p<0,01 и r=0,403, p<0,05, соотв.), С-пептида после нагрузки глюкозой (r=0,512, p<0,01 и r=0,468, p<0,01, соотв.), и лептина (r=0,474, p<0,01 и r=0,462, p<0,01, соотв.) и отрицательная взаимосвязь с уровнем ГСПГ (r=-0,399, p<0,02 и r=-0,340, p<0,02, соотв.).

3.2 Клинико-лабораторные показатели у женщин репродуктивного возраста

При оценке биохимических показателей в сыворотке крови у обследованных женщин (табл. 7.) отмечено, что у пациентов основной группы показатели липидного спектра крови были достоверно выше по сравнению с таковыми в группе сравнения: содержание общего ХС составило в среднем 5,44±0,09 ммоль/л и 4,64±0,09 ммоль/л соотв. (р<0,001), ХС ЛПНП - 3,48±0,08 ммоль/л и 2,71±0,08 ммоль/л соотв. (р<0,001), ТГ - 1,69±0,07 ммоль/л и 0,94±0,04 ммоль/л соотв. (р<0,001). Уровень ХС ЛПВП был достоверно выше у пациентов группы сравнения относительно основной группы (1,55±0,04 ммоль/л против 1,20±0,04 ммоль/л соотв., р<0,001).

Таблица 7.

Биохимические показатели в сыворотке крови у обследованных женщин (M±m).

Кроме того, в основной группе выявлены более высокий уровень мочевой кислоты (341,7±9,1 мкмоль/л против 286,0±9,8 мкмоль/л в группе сравнения, р<0,001) и СРБ (5,5±0,5 мг/л против 2,8±0,5 мг/л в группе сравнения, р<0,001). Выявлена корреляционная зависимость между уровнем СРБ и содержанием общего ХС (r=0,380, p<0,01) и ХС ЛПВП (r=-0,330, p<0,01).

Оценивая состояние углеводного обмена у обследованных женщин (табл. 7), следует отметить, что базальный и постпрандиальный уровень гликемии был достоверно выше у пациентов основной группы по сравнению с группой сравнения (5,52±0,09 ммоль/л и 6,86±0,21 ммоль/л против 4,79±0,06 ммоль/л и 5,15±0,15 ммоль/л соотв., р<0,001), при этом, несмотря на то, что у 71% пациентов основной группы уровень глюкозы натощак был в пределах нормы, после проведения ПГТТ у 22% из них выявлено НТГ, что позволяет рекомендовать проведение ПГТТ женщинам репродуктивного возраста при выявлении у них симптомокомплекса МС.

Таблица 8.

Показатели гормонального статуса у обследованных женщин (M±m).

При оценке показателей гормонального статуса установлено, что уровень инсулина и С-пептида натощак в сыворотке крови у обследованных женщин с МС (табл. 8) был достоверно выше по сравнению с таковым у женщин без МС (18,4±1,5 мкМЕ/мл и 2,7±0,2 пмоль/л против 9,3±0,9 мкМЕ/мл и 1,6±0,1 пмоль/л соотв., p<0,001). Через 2 часа после нагрузки 75 г глюкозы у пациентов основной группы отмечено повышение содержания инсулина и С-пептида в сыворотке крови до 53,1±6,0 мкМЕ/мл и 7,1±0,5 пмоль/л, соотв., а у пациентов группы сравнения - до 23,7±2,9 мкМЕ/мл и 4,6±0,3 пмоль/л, соотв. (p<0,001). Индекс инсулинорезистентности HOMA-IR значительно превышал норму у пациентов основной группы и достоверно отличался от значения в группе сравнения (4,77±0,43 и 2,09±0,28 соотв., p<0,001). Полученными нами данные согласуются с результатами других исследований, свидетельствующими об увеличении инсулинорезистентности при нарастании массы тела [13, 17].

Также, выявлено повышение содержания лептина в сыворотке крови у обследованных женщин, более выраженное у больных основной группы по сравнению с контролем (51,8±3,1 нг/мл против 32,8±3,7 нг/мл, p<0,001). Уровень ГСПГ у пациентов основной группы был достоверно ниже, чем у женщин группы сравнения (49,5±3,9 нмоль/л против 92,4±8,3 нмоль/л соотв., p<0,001), что согласуется с данными, полученными в работе Чубриева С.Ю. (2009) [35].

Проведенный корреляционный анализ выявил наличие положительной зависимости между уровнем инсулина, С-пептида, лептина и ИМТ (r=0,289, r=0,355, r=0,568 соотв., p<0,01), а также между уровнем этих гормонов и ОТ (r=0,362, r=0,450, r=0,479 соотв., p<0,001). Уровень лептина в плазме крови у женщин репродуктивного возраста коррелировал с содержанием в сыворотке крови мочевой кислоты (r=0,559, p<0,001), СРБ (r=0,399, p<0,01), постпрандиальным уровнем глюкозы (r=0,391, p<0,05), индексом инсулинорезистентности НOMA-IR (r=0,425, p<0,01), а также уровнем инсулина и С-пептида натощак (r=0,479...