Изучение реакции специфической иммунной системы на вирусный гепатит В и С

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Ключевые слова: антиген, антитела, вирусный гепатит.

Объект исследования: концентрация антител и наличие антигена в крови при вирусном гепатите.

Предмет исследования: варьирование содержания антител и антигена при вирусных гепатитах.

Методы исследования: иммунологический метод с применением меченых антител ? иммуноферментный анализ, основу которого составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител. Исследование проводилось в соответствии с инструкциями по применению набора для определения и подтверждения поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке или плазме крови и инструкциями по применению набора для определения и подтверждения наличия антител к вирусу гепатита С в сыворотке или плазме крови, утвержденными Министерством здравоохранения Республики Беларусь 09.07.2009 года, с применением полуавтоматического фотометра для микропланшетов ELx800 (BioTek, США).

Цель работы: изучение реакции специфической иммунной системы на вирусный гепатит В и С.

Полученные результаты: При исследовании показателей сыворотки крови жителей города Светлогорска, входящих в группу риска инфицирования вирусным гепатитом, обследовано 938 человек маркёры ПВГ выявлены у 37 человек, инфицированность HBsAg составила 15 человек(1,4%), инфицированность anti-HСV 22 человека (2,0%) Обследование пациентов четырех лечебных учреждений показало, что из наибольшая частота встречаемости вирусных гепатитов среди пациентов инфекционного отделения.

Анализируя частоту выявления вирусных гепатитов, можно отметить что гепатит С, обладающий высоким хрониогенным потенциалом, обнаруживается значительно чаще, чем вирус гепатита В. В структуре заболеваемости по полу мужчины составили ВГВ - 10 человек ВГС - 13 человек, женщины ВГВ - 5 человек, ВГС - 9 человек.

Содержание

Реферат

Перечень условных обозначений и сокращенийВведение

1. Обзор литературы

1.1 Противовирусный иммунитет

1.2 Неспецифический иммунитет

1.3 Иммунный ответ

1.4 Вирусный гепатит В

1.5 Эпидемиология

1.6 Патогенез гепатита В

1.7 Маркёры вируса гепатита В

1.8 HBsAg (поверхностный антиген)

1.9 Антитела к поверхностному антигену (anti-HBs)

1.10 Антитела к сердцевинному антигену

1.11 Антиген HBeAg

1.12 Антитела к антигену HBe (anti-HBe)

1.13 Антиген X

1.14 ДНК вируса

1.15 Вирусный гепатит С (ВГС)

1.16 Антитела к вирусу (anti-HCV tot)

1.17 РНК вируса (HCV RNA)

2. Объект, программа и методика исследований

2.1 Объект и программа исследований

2.2 Метод определения

2.3 Методика исследований

3. Результаты исследований и их обсуждение

Заключение

Список использованных источников

Перечень условных обозначений и сокращений

АГ - антиген

АПК - антигенпрезентирующие клетки

Anti - HBs- антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В

Anti - НВс - суммарные антитела к ядерному антигену вируса гепатита В

Anti-HCV - суммарные антитела к вирусу гепатита С

ВГ - вирусный гепатит

ВГВ (HBV) - вирус гепатита В

ВГС (HCV) - вирус гепатита С

ВГВ - вирусный гепатит В

ИА - ифекционный агент

ИЛ - интерлейкин

ИНФ - интерферон

ИО - иммунный ответ

ИС - иммунная система

MHC - главный комплекс гистосовместимости

NK - натуральные киллеры

Th - т- хелперы

ИФА - иммуноферментный анализ

ОП - оптическая плотность

ПГ- парантеральный гепатит

Введение

Достижения в области физиологии человека свидетельствуют о том, что иммунологическая система ? важное звено в сложном механизме адаптации человеческого организма, а его действие в первую очередь направленно на сохранение антигенного гомеостаза, нарушение которого может быть обусловлено проникновением в организм чужеродных антигенов или спонтанной мутации.

В современное время широко используют методы, основанные на взаимодействии антиген - антитело. Они широко используются для определения антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, сравнения известных антигенов и антител с неизвестными. Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных.

Актуальность работы: проблема вирусных гепатитов одна из самых значимых в современной медицине, решение которой имеет огромное значение для всего человеческого общества. Особую важность в последние 10-15 лет приобрела проблема парентеральных гепатитов В и С. В РБ к концу 90-х годов уровень заболеваемость достиг 60 на 100 000 населения, а по отдельным регионам - 130 на 100 000 населения, что было связано в первую очередь с циркуляцией вирусов в среде парентеральных наркоманов и последующим распространением инфекции на общую популяцию. И это лишь "видимая часть айсберга", ибо большинство случаев острого гепатита В и С протекает без желтухи и, как правило, не попадает в поле зрения врачей. Ежегодно в мире умирает около 1 млн. человек от цирроза и рака печени, индуцированных данными вирусами. Проведение вакцинации против вирусного гепатита В позволило за последние 10 лет снизить уровень заболеваемости острым гепатитом В (ОГВ) в 4,8 раза (с 5,9 до 1,22), и рассматривать в настоящее время Беларусь, как страну с низким уровнем распространения острого вирусного гепатита В (менее 2 % населения). В целях повышения осведомленности населения и привлечения внимания общественности к проблеме и профилактике ПВГ Министерством здравоохранения Республики Беларусь ежегодно 28 июля организуются мероприятия в рамках «Международный день борьбы с гепатитами», утвержденного Решением Всемирной ассамблеи здравоохранения.

Требуется совершенствование диагностики заболевания для раннего выявления вирусного гепатита.

Цель работы: изучить реакции специфической иммунной системы на вирусную инфекцию на примере парантеральных гепатитов В и С.

Задачи:

· получить экспериментальные данные по обследованию определенных групп населения на ВГ.

· установить зависимость титра антител от вида инфекции.

· установить частоту выявления ПГ в группах риска.

· определить если зависимость выявления ПГ по полу.

Практическое значение: Иммуноферментный анализ является самым распространенным современным методом диагностики вирусных гепатитов. С помощью ИФА выявляют наличие или антигенов вируса, или антител к нему. По сравнению с другими подобными методами ИФА обладает рядом преимуществ: высокой чувствительностью, простотой постановки реакции и экономичностью. Однако ИФА в зависимости от определяемого агента (антигена или антитела) имеет различную диагностическую ценность. Так, результаты исследования на присутствие вируса более достоверны при обнаружении в крови его антигенов. Диагностика вирусных гепатитов С по ИФА пока еще основывается на выявлении антител к вирусу гепатита С (анти-HCV), что само по себе менее достоверно, поскольку не подтверждает наличие вируса в организме обследуемого.

Однако этот метод позволяет осуществить раннюю диагностику заболевания, когда еще отсутствуют клинические появления инфекции, и тем самым предупредить распространение вирусных гепатитов.

гепатит антиген вирус инфекция

1. Обзор литературы

1.1 Противовирусный иммунитет

Основой противовирусного иммунитета является клеточный иммунитет. Клетки-мишени, инфицированные вирусом, уничтожаются цитотоксическими лимфоцитами, а также NK-клетками и фагоцитами, взаимодействующими с Fc-фрагментами антител, прикрепленных к вирусспецифическим белкам инфицированной клетки. Противовирусные антитела способны нейтрализовать только внеклеточно расположенные вирусы, как и факторы неспецифического иммунитета -- сывороточные противовирусные ингибиторы. Такие вирусы, окруженные и блокированные белками организма, поглощаются фагоцитами или выводятся с мочой, потом и др. (так называемый «выделительный иммунитет»). Интерфероны усиливают противовирусную резистентность, индуцируя в клетках синтез ферментов, подавляющих образование нуклеиновых кислот и белков вирусов. Кроме этого, интерфероны оказывают иммуномодулирующее действие, усиливают в клетках экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС). Противовирусная защита слизистых оболочек обусловлена секреторными IgA, которые, взаимодействуя с вирусами, препятствуют их адгезии на эпителиоцитах [2].

1.2 Неспецифический иммунитет

Неспецифический, направленный против любого чужеродного вещества (антигена). Он проявляется в виде гуморального, за счет продукции бактерицидных веществ, и клеточного, в результате которого осуществляется фагоцитоз и цитотоксический эффект.

Под неспецифическим иммунитетом подразумевают систему предсуществующих защитных факторов организма, присущих данному виду, как наследственно обусловленное свойство. К этим элементам относятся кожа и секреты слизистых оболочек, содержащие муциновые вещества являющиеся первыми барьерами на пути инфекционных агентов. Иммунитет, создаваемый анатомическими, физиологическими, клеточными и молекулярными факторами, которые являются естественными составляющими элементами организма, иначе называют конституционным.

К неспецифической защите организма относится непроницаемость здоровой кожи и слизистых оболочек для микроорганизмов; непроницаемость гистогематических барьеров; наличие бактерицидных веществ в биологических жидкостях организма (слюна, слеза, спинномозговая жидкость, кровь); выделение вирусов почками; фагоцитарная система (макрофаги, нейтрофилы); гидролитические ферменты; интерферон; лимфокины; система комплемента и др. Неспецифические защитные факторы обеззараживают даже вещества, с которыми организм ранее не встречался. Специфические начинают действовать после первичного контакта с антигеном [2].

Клеточные неспецифические факторы

Клетками «неспецифической» иммунной защиты являются клетки (фагоциты), способные к фагоцитозу (поглощению и перевариванию патогенных чужеродных частиц) - нейтрофилы, эозинофилы, тканевые макрофаги, моноциты (предшественники макрофагов). Частично к ним относят и лимфоциты, тучные клетки и фибробласты, но в этих случаях производится только захват чужеродных агентов без переваривания. На следующей стадии чужеродные агенты переводятся в межклеточное пространство, где захватываются и уничтожаются фагоцитами.

Гуморальные неспецифические факторы

Представлены субстанциями, растворенными в жидкостях организма и обеспечивающими подавление и уничтожение. К ним относят фермент лизоцим, который содержится в секретах организма (слезная жидкость, слюна и т.д.) и разрушает определенные химические структуры стенок чужеродных организмов.

К неспецифическим гуморальным факторам относят также систему комплемента (сложный белковый комплекс; постоянно присутствует в крови и является важным фактором не только врожденного, но и приобретенного иммунитета). Система комплемента состоит из 20-ти взаимодействующих белковых компонентов (синтезируются в основном в печени), которые могут активироваться неспецифическим способом (без участия антител), образовывать мембраноатакующий комплекс с последующей атакой мембраны чужеродной бактериальной (или другой) клетки, приводящей к ее разрушению.

Дополнительный неспецифический гуморальный фактор - интерфероны (циркулируют в крови), которые могут включаться в клетки и повышают их устойчивость против вирусов[3].

1.3 Специфический иммунный ответ (клеточный и гуморальный)

Специфический иммунитет тоже реализуется в двух формах - гуморальный (продукция антител В-лимфоцитами и плазматическими клетками) и клеточный, который реализуется главным образом с участием Т-лимфоцитов (рис.1).

Иммунный ответ при ГВ имеет характерные особенности, обусловленные тем, что реакция со стороны иммунной системы на инфицирование ВГВ является не иммунопротективной, а иммунопатологической. Это означает, что сам вирус клетки печени не разрушает, а лизис инфицированных ВГВ гепатоцитов происходит за счет атаки цитотоксических Т-клеток иммунной системы. Таким образом, подавление репликативной активности вируса в организме человека достигается ценой гибели собственных инфицированных печеночных клеток [3].

Широко известна обратная зависимость угрозы хронизации инфекции от тяжести течения острой фазы ГВ. При адекватном иммунном ответе массивная гибель инфицированных клеток приводит к тяжелому течению болезни, но вместе с тем способствует более полной элиминации вируса, исключающей вероятность хронизации.

При слабом иммунном ответе цитолиз вируссодержащих гепатоцитов происходит недостаточно активно, и наблюдается легкое или стертое течение острой фазы ГВ. Печень от вируса «очищается» не полностью, поэтому инфекционный процесс приобретает затяжное течение с длительным персистированием ВГВ и угрозой хронизации. Вероятность трансформации острого ГВ в хронический намного выше у лиц с иммунодефицитными состояниями [4].

Рисунок 1 - Схема клеточного и гуморального иммунитета

1.4 Вирусный гепатит В

Вирус гепатита В (HBV) относится к ДНК-содержащим вирусам семейства Hepadnаviridae.

Вирусный гепатит В - одна из самых сложных по патогенезу и разнообразная по своим проявлениям вирусная инфекция. Острый вирусный гепатит В в большинстве случаев заканчивается выздоровлением, и только у 5-10% больных переходит в хроническую форму. Хронический вирусный гепатит В имеет две стадии - репликативную и интегративную. Дифференцировка между формами ВГВ определяется обнаружением специфических антигенных (HBs-, HBe-антигены), иммунологических (антитела класса IgM и IgG к HBs-, HBcor-, HBe антигенам) или генетических (нуклеотидные последовательности ДНК ВГВ) маркеров этой инфекции в крови, лимфе и других биологических жидкостях организма, а также в клетках и тканях различных органов [2].

Вирион ВГВ выглядят сферической частицей диаметром 42 - 45 нм, имеет наружную липопротеидную оболочку, внутреннюю оболочку и нуклеокапсид (рис. 2). Внешняя оболочка образована поверхностным антигеном - HBsAg, с распределенными на внешней стороне вируса preS1- и preS2 протеинами. Эти белки ответственны за прикрепление и проникновение вируса в клетки печени. Нуклеокапсид включает ДНК, фермент ДНК-полимеразу и несколько протеинов: HBcorAg, HBeAg и HBxAg. Геном вируса представлен кольцевой молекулой ДНК, включающей участки как однонитевой, так и двунитевой структуры. Вирусная ДНК состоит из 3200 нуклеотидов и объединяет четыре гена (Р, С, S и X). Существует не менее 6 генотипов ВГВ (А, B, C, D, E, F). Каждый из антигенов ВГВ вызывает гуморальный иммунный ответ, проявляющийся выработкой соответствующих антител (анти-HBs, анти-НВс, анти-НВе) [4].



Рисунок 2 - Структура вируса гепатита В

ВГВ обладает мутационной изменчивостью, с чем могут быть связаны случаи ациклического течения заболевания. Так, кроме нормального "дикого" HBV-варианта, существуют мутантные формы: вариант Сенегал, при котором сохраняется продукция HBsAg, но не определяются антитела к HBcorAg; HBVe(-), при котором не определяется HBеAg, и др. Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, т.е. его ДНК может частично встраиваться в геном гепатоцитов.

Основой лабораторной диагностики инфекции HBV является определение серологических маркеров: HBsAg, HВeAg, anti-НВcor класса IgM и IgG, anti-НВе и anti-HBs, ДНК HBV [1].

Вирус гепатита В отличается чрезвычайно высокой устойчивостью к различным физическим и химическим факторам: низким и высоким температурам, многократному замораживанию и оттаиванию, длительному воздействию кислой среды. Он инактивируется при автоклавировании ром (180°С) - 1 ч, при комнатной температуре сохраняется в течение 3 мес., в замороженном виде - 15-20 лет.

ВГВ имеет сродство к различным тканям: чаще всего он поражает печень, однако, ДНК и белки вируса обнаруживаются также в почках, селезенке, поджелудочной железе, коже, костном мозге и мононуклеарах периферической крови.

Концентрация HBsAg в крови больных варьирует в очень широком диапазоне - от 0,01 нг/мл до 500 мкг/мл. Столь высокое содержание HBsAg практически приближается к концентрации собственных сывороточных белков больного. Следует отметить, что только часть HBsAg, образующегося при репликации ВГВ, используется для построения новых вирусных частиц, основное же его количество поступает в кровь инфицированных лиц в форме сферических частиц диаметром 22 нм и палочковидных форм длиной до 200 нм. Количество таких частиц в крови превышает число инфекционных вирионов ВГВ в десятки и сотни тысяч раз [5].

1.5 Эпидемиология

ГВ является одной из самых распространенных инфекций человека, ежегодно от различных клинических форм этой инфекции умирает свыше 1 миллиона человек.

Источником инфекции являются больные как манифестными, так и бессимптомными формами острого и хронического ГВ. Больной манифестной формой острого ГВ может быть заразен уже за 2 - 8 нед до появления признаков заболевания. У большинства таких больных вирусемия прекращается с наступлением клинического выздоровления. Однако у части заразившихся возбудитель может присутствовать в крови в течение нескольких лет. Наибольшую эпидемическую опасность представляют больные бессимптомным ГВ, особенно в фазе активной вирусной репликации. Число выявляемых таких лиц ежегодно в несколько раз превышает число больных манифестным ГВ. В свою очередь, больные хроническим ГВ могут сохранять эпидемическое значение в течение всей жизни. Длительное сохранение возбудителя в организме инфицированных обеспечивает существование вируса как биологического вида.

Механизм заражения ГВ - парентеральный. Выделяют естественные пути передачи ВГВ (от матери к ребенку - вертикальный и перинатальный; при половых контактах с инфицированным человеком - половой; при других контактах с инфицированным человеком - горизонтальный) и искусственные (при нарушении целостности кожных покровов и слизистых оболочек) [2].

1.6 Патогенез гепатита В

При проникновении вируса внутрь гепатоцита происходит высвобождение вирусной ДНК, которая, попадая в ядро гепатоцита и исполняя роль матрицы для синтеза нуклеиновых кислот, запускает ряд последовательных биологических реакций, чьим итогом становится сборка нуклеокапсида вируса. Нуклеокапсид мигрирует через ядерную мембрану в цитоплазму где и происходит окончательная сборка частиц Дейна - полного вируса гепатита В.

Следует, однако, отметить, что при заражении гепатоцита процесс может пойти двумя путями - репликативным и интегративным. В первом случае развивается картина острого или хронического гепатита, а во втором - вирусоносительство.

Итогом репликативного взаимодействия становятся сборка структур коровского антигена (в ядре) и сборка полного вируса (в цитоплазме) с последующей презентацией полного вируса или его антигенов на мембране или в структуре мембраны гепатоцитов (рис. 3) [3].

Парентеральный путь передачи возбудителя обеспечивает его гематогенный занос в печень. Вирусу не свойственно прямое повреждающее действие на гепатоциты. Их цитолиз осуществляется иммуноопосредовано, главным образом, за счет реакции со стороны клеточного звена иммунитета через цитотоксические Т-лимфоциты.

Установлено, что при ГВ усиливается продукция гамма-интерферона, который активизирует систему антигенов гистосовместимост. В результате происходит экспрессия молекул гистосовместимости 1 класса в совокупности с пептидными антигенами на мембране гепатоцитов, которые распознаются «наивными» цитотоксическими Т-лимфоцитами. Последние пролиферируют и образуют клоны антиген-специфических киллеров, поражающих вирусинфицированные гепатоциты. В меньшей степени происходит экспрессия молекул гистосовместимости 2 класса с последующей пролиферацией Т-хелперов 1 типа, которые активируют бактерицидность и цитотоксичность макрофагов. Последние в свою очередь поглощают остатки некротизированных интралобулярных и перипортальных гепатоцитов [7].

Реакция со стороны гуморального звена менее значима в иммунопатогенезе и заключается в продукции специфических антител к антигенам ВГВ, их связывании с образованием иммунных комплексов и прекращении циркуляции в крови в свободном виде. Однако значимость гуморального ответа повышается при развитии аутоиммунных процессов, которые принимают участие в генезе хронического гепатита.

Иммунопатогенез ГВ схематично может быть представлен следующим образом. У взрослых заболевание протекает как с клиническими симптомами (30 - 40%), так и латентно (60 - 70 %), но заканчивается, как правило, выздоровлением, что свидетельствует об адекватном иммунном ответе. Хронический гепатит развивается только у 6 - 10 % взрослых, перенесших острую инфекцию, причем либо латентно, либо в легкой форме, что связано с неполноценным иммунным ответом. Педиатры реже видят острый ГВ, так как имеется прямая корреляция между возрастом человека и наличием клинических проявлений в острой стадии болезни.



Рисунок 3 - Основные звенья патогенеза гепатита В

У детей иммунная система еще "недостаточно зрелая" для распознавания ВГВ как "чужого" и не проявляет достаточной активности для избавления организма от возбудителя. Вот почему острый ГВ у большинства детей обычно протекает бессимптомно (90 - 95 %), но очень часто приводит к развитию хронического “носительства” HBV (70 - 90 %), а следовательно, и хронического гепатита (30 - 50 %) [4].

Таким образом, адекватному иммунному ответу, обеспечивающему купирование инфекционного процесса, соответствует острый ГВ циклического течения с полным выздоровлением. Следует заметить, что хотя иммунному ответу и принадлежит доминирующая роль в патогенезе ГВ, не всегда конечный исход инфекционного процесса определяется состоянием иммунной системы макроорганизма. Необходимо учитывать и биологический цикл развития самого возбудителя, в частности, активность вирусной репликации. Например, при высокой репликативной активности и адекватном ей иммунном ответе развивается типичный клинически манифестный острый ГВ. В свою очередь низкая активность вирусной репликации обусловливает слабую защитную реакцию организма, что приводит к легкому или бессимптомному течению ГВ с быстрым купированием инфекционного процесса и выздоровлением. При этом относительно слабо выраженные проявления Т-клеточной цитотоксичности могут рассматриваться как адекватные [4].

В разгар ВГ поражение печени характеризуется цитолизом (повреждением гепатоцитов, нарушением структурно-функциональной целости мембран, разрушением органелл клетки), холестазом и мезенхимально-воспалительной реакцией (повреждением стромы и клеток ретикулогистиоцитарной системы). В основе цитолиза лежит нарушение внутриклеточных метаболических процессов, активация прооксидантных и угнетение антиоксидантных систем клеток. В результате на мембранах гепатоцитов происходит накопление свободных радикалов, усиливается перекисное окисление липидов, что приводит к повышению их проницаемости, выходу из гепатоцитов внутриклеточных ферментов (аминотрансфераз и др.), ионов калия. Последние заменяются натрием и кальцием, что ведет к задержке жидкости и набуханию клеток, изменению их рН, нарушению окислительного фосфорилирования со снижением биоэнергетического потенциала гепатоцитов. В результате нарушаются их весьма разнообразные функции, в том числе детоксицирующая, синтетическая, ухудшаются утилизация глюкозы [5].

Схема лабораторной диагностики ВГВ

1. Первичное массовое обследование на ВГВ -- определение методом ИФА в сыворотке крови HBsAg (инфицированность).

2. Определение панели серологических маркеров для уточнения стадии заболевания и активности инфекции.

3. ПЦР-анализ -- определение генетического маркера ДНК ВГВ для подтверждения диагноза ВГВ, мониторинга хронического течения, оценки эффективности проводимой терапии [8].

1.7 Маркёры вируса гепатита В

В организме больного ГВ могут быть обнаружены вирусные антигены HBsAg и HBeAg, а также антитела к ним и HBcore- белку: анти-HBcore, анти-HBe, анти-HBs. Данные антигены и антитела в совокупности представляют комплекс специфических маркёров ВГВ, который находится в динамическом изменении и отражает вирусную репликацию и иммунную реакцию пациента (рис. 4). Комплексное определение маркёров позволяет правильно установить стадию инфекции ВГВ и прогнозировать ее дальнейшее развитие [4].

Рис. 4 - Динамика серологических маркёров при остром гепатите В

1.8 HBsAg (поверхностный антиген)

HBsAg - основной серологический маркёр ГВ. При остром гепатите HBsAg может быть выявлен в крови обследуемых в инкубационный период ГВ и в первые 4 - 6 недель клинического периода. Присутствие HBsAg более 6 мес. рассматривается как фактор перехода болезни в хроническую стадию. Концентрация HBsAg в сыворотке больных обычно колеблется от 1 до 50 мкг/мл, редко - до 500 мкг/мл.

НВs-антиген существует в виде трех морфологически различных вариантов:

- представляет суперкапсид цельного вириона;

- в большом количестве встречается в виде малых сферических белковых частиц диаметром 20 - 22 нм. Эти частицы внутри полые, не содержат ДНК вируса, следовательно, неинфекционные и, главным образом, состоят из НВs-антигена с небольшим содержанием preS2-антигена.

- в виде нитей длиной 230 нм.

С точки зрения имуногенности выделяют различные серотипы HBsAg (adw, adr, ayw, ayr), образующиеся путем сочетания основной антигенной детерминанты «а» с двумя субдетерминантами, попарно исключающими друг друга (d/y, w/r) [4].

Выявление HBsAg указывает на инфицированность вирусом гепатита В. Обнаруживается и при остром гепатите В, и при хроническом гепатите В, поэтому этот маркер не может быть использован для дифференциальной лабораторной диагностики острых и хронических форм инфекции.

HBsAg является наиболее ранним маркером острого вирусного гепатита В, появляется в крови в инкубационном периоде, начиная с 3-5-й недели заражения. HBsAg циркулирует при остром течении заболевания в среднем 70 - 80дней (очень редко до 5 - 6 месяцев). Обнаружение HBsAg в крови более 6 месяцев может указывать на начало хронизации процесса. При хроническом гепатите В HBsAg циркулирует в крови больного на протяжении многих лет[4].

1.9 Антитела к поверхностному антигену (anti-HBs)

Для оценки течения инфекционного процесса и его исхода важное клиническое значение имеет динамический контроль за системой HBsAg - анти-HBs. В большинстве случаев у больных острым ГВ анти-HBs начинают обнаруживаться спустя длительное время после исчезновения HBsAg. Период, в который отсутствуют и HBsAg, и анти-HBs, называется фазой серологического «окна». Сроки появления анти-HBs зависят от особенностей иммунологического статуса больного. Продолжительность фазы «окна» чаще составляет 3-4 мес. с колебаниями до года [8].

Антитела к HBsAg (anti-НВs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета. При острой инфекции anti-HBs IgM появляются в период выздоровления, через 4 недели после начала заболевания, определяются в течение 1 - 2 месяцев, затем они исчезают. Anti-HBs IgG достигают максимальной концентрации через 1-2 года, сохраняются в течение 10 лет и более с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. В некоторых случаях anti-HВs могут циркулировать пожизненно.

Поскольку эти антитела являются вируснейтрализующими, их исчезновение через 10 лет, у части пациентов перенесших инфекцию, означает, что постинфекционный иммунитет при гепатите В не всегда является пожизненным. Не исключена возможность развития повторных случаев гепатита В у одного и того же человека [4].

Быстрое исчезновение HBsAg (в первые дни желтухи) с появлением anti-НВs - плохой прогностический признак, указывающий на развитие гепатодистрофии. Появление anti-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком [6].

1.10 Антитела к сердцевинному антигену

HBcorAg антиген (сердцевинный) обнаруживается только в ткани печени, в крови не циркулирует. Он обладает высокой иммуногенностью, с которой связан адекватный иммунный ответ организма при циклическом течении острого гепатита В в виде образования антител (anti-HBcor) [3].

Особая диагностическая роль принадлежит антителам (anti-HBcor). Антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В класса M (anti-НВcor IgM) - маркер активной репликации НВV и острой инфекции. Выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. Появление их в крови является подтверждением острого гепатита В. Поскольку данный диагноз чаще ставится на основании клинической картины, повышения активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) сыворотки крови и обнаружения HBsAg в крови, диагностическое значение anti-HBcor IgM особенно велико в следующих случаях:

а) когда специфическая диагностика гепатита В по каким-либо причинам производится поздно; при этом HBsAg в крови может уже отсутствовать;

б) при остром гепатите у больного хроническим гепатитом В. Если такой гепатит связан с суперинфицированием другими гепатотропными вирусами (картина, часто наблюдающаяся в эндемичных по гепатиту В районах), то характерным будет отсутствие или низкий титр anti-HBcor IgM.

При хроническом вирусном гепатите В anti-НВcor IgM выявляются в стадию репликации, указывая на обострение заболевания. Причем выявляются они в меньших титрах, чем при острой инфекции.

Антитела к HBcorAg класса IgG (anti-НВcor IgG) появляются практически одновременно с anti-НВcor IgM. Они остаются пожизненно у всех лиц, переболевших гепатитом В (маркер пастинфекции).

Значимость anti-HBcor IgG как маркера перенесенной инфекции выше, чем anti-HBs, так как:

а) anti-HBs могут появиться в результате вакцинации;

б) anti-HBs при остром гепатите В не развиваются у 15 % реконвалесцентов;

г) в течение 6 лет после острого гепатита В anti-HBs могут исчезать у 20 % переболевших;

Аnti-НВcor IgG также выявляются у носителей HBsAg и больных хроническим гепатитом В.

Службы крови ряда зарубежных стран (например, США) включили в перечень обязательных исследований всей донорской крови тестирование на наличие anti-HBcor. При этом выявляются суммарные антитела (total) без идентификации отдельного класса иммуноглобулинов. Для выбраковки крови достаточно просто наличия в ней anti-HBcor [4].

1.11 Антиген HBeAg

При остром гепатите В HBeAg обнаруживается в крови в инкубационный период и при первых проявлениях болезни. HBeAg представляет собой вид сердцевинного белка, он не является, как полагали раньше, продуктом распада HBcorAg. Ген, кодирующий синтез HBeAg, расположен в непосредственной близости к гену синтеза HBcorAg и насчитывает 29 кодонов. Установлено, что наличие HBeAg в крови является характеристикой экспрессии его зрелым вирусом так называемого дикого типа (нормальный, наиболее распространенный вариант) [9].

HBeAg характеризует высокую инфекционность крови, являясь показателем активной репликации вируса и высокой ДНК-полимеразной активности. Появляется в крови больных острым и хроническим гепатитом В обычно в фазе вирусемии. В первую неделю желтушного периода он выявляется у 85 - 95 % больных. Исчезновение HBeAg из крови через 2 - 4 недели с начала болезни и появление антител к нему (сероконверсия) указывает на благоприятное течение заболевания. Напротив, длительное сохранение HBeAg (в течение двух и более месяцев) указывает на высокий риск хронизации гепатита В. У больных ХВГ В с высокой активностью HBeAg сохраняется длительное время [4].

Тестировать на наличие HBeAg имеет смысл только HBsAg-положительные сыворотки, так как обнаружение его в HBsAg-отрицательных образцах весьма редко и большей частью представляет собой ложноположительный результат [10].

1.12 Антитела к антигену HBe (anti-HBe)

В случае благоприятного развития ГВ у больных постепенно происходит замещение в крови HBеAg на антитела к нему (сероконверсия HBеAg - анти-HBе). На ранней стадии сероконверсии оба эти маркёра могут обнаруживаться одновременно.

Исчезновение HBeAg и быстрое нарастание титра анти-HBе у больного практически исключает угрозу хронизации ГВ. Отсутствие такой динамики и выявление монотонно низких концентраций анти-НВе, наоборот, может свидетельствовать о развитии хронического ГВ с невысокой репликативной активностью (HBeAg-негативный хронический ГВ).

Длительное сохранение HBеAg в крови больного и отсутствие анти-HBе может быть показателем угрозы развития хронического гепатита с высокой репликативной активностью ВГВ (HBеAg-позитивный хронический ГВ). Таким образом, динамический контроль за системой HBeAg - антиНВе позволяет уже в острую стадию ГВ надежно прогнозировать его исход. Установлено, что после перенесенного гепатита В анти-HBe могут сохраняться в крови человека от 5 мес. до 3 - 5 лет [4].

1.13 Антиген X

HBxAg состоит из 159 аминокислот и представляет собой регуляторный белок, хотя возможна и роль его как структурного вирусного белка. Полагают, что он активирует экспрессию всех вирусных генов и усиливает синтез вирусных протеинов. Играет особую роль в развитии первичной гепатокарциномы, т.к. наиболее активно функционирует в клетках первичного рака печени. Антитела к антигену X выявляются в крови больных хроническим, но не острым гепатитом В[8].

1.14 ДНК вируса

ДНК вируса гепатита В обнаруживается в сыворотке или плазме крови методом полимеразной цепной реакции. Методы генодиагностики, к которым относится ПЦР, существенно расширяют возможности лабораторной диагностики вирусного В, позволяя непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе на фоне противовирусной терапии.

Выявление ДНК HBV означает вирусемическую стадию процесса и свидетельствует о высокой репликативной активности вируса. При остром гепатите В содержание ДНК HBV в крови быстро возрастает в течение инкубационного периода и становится максимальным в начале периода разгара. Циркуляция ДНК вируса более 5 - 6 месяцев является неблагоприятным прогностическим признаком и часто свидетельствуе о хронизации гепатита В. При интегративной форме хронического гепатита В ДНК HBV в сыворотке крови не выявляется [4].

1.15 Вирусный гепатит С (ВГС)

Вирус гепатита С выявлен относительно недавно, в 1989 году. Занимая небольшую долю среди других гепатитов (около 15%), ВГС обладает наиболее высокой частотой хронизации (75 - 80%) и является основной причиной хронического гепатита, цирроза и первичного рака печени. Вирус гепатита С является гепатотропным и лимфотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae, представляя в нем третий самостоятельный род.

Характерными особенностями ВГС-инфекции являются циркуляция вируса в минимальных концентрациях и высокая гетерогенность и изменчивость вируса, что, во-первых, является причиной его слабой иммуногенности, не приводящей к выработке полноценного протективного иммунитета и хронизации, и, во-вторых, невозможности, по крайней мере, в настоящее время, создания вакцины. Сравнительная частота хронизации ВГ:

- гепатит В - 5 - 10%

- гепатит В+D - 60 - 70%

- гепатит С - 75-85%.

Вирус гепатита С является РНК-содержащим флавивирусом диаметром 55 - 65 нм, покрытым липидсодержащей оболочкой. Геном его представлен одноцепочечной РНК, содержащей около 9500 нуклеотидов, и кодирует синтез вирусного протеина-предшественника, который затем расщепляется клеточными пептидазами и вирусными протеазами на структурные и неструктурные белки. К структурным протеинам относятся сердцевинный (нуклеокапсидный) белок (Сor) и оболочечные белки Е1 и E2. К неструктурным - белки с ферментативной активностью, необходимые для репликации вируса NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. К каждому из этих белков вырабатываются антитела, циркулирующие в крови [4].

Важной особенностью возбудителя ГС является его генетическая неоднородность. В процессе репликации вируса происходят ошибки в его генетическом строении, в результате образуется большое число разных генотипов, субтипов и квазивидов. Процесс постоянной мутации помогает вирусу противостоять иммунной системе организма, именно этот факт объясняет наличие большого числа людей с хроническим гепатитом. По классификации Simmonds разграничивают 11 типов (генотипы 1 - 11), подразделяющихся, в свою очередь, на 70 подтипов HCV, обозначаемых буквами (например: 1а, 1b, 1с). Считается, что для целей клинической практики необходимо различать следующие генотипы HCV: la, lb, 2a, 2b и 3а. На территории РБ преобладают 1b и 3а генотипы [13].

Лабораторная диагностика HCV-инфекции основана на обнаружении специфических антител и определении РНК вируса. В отличие от ВГВ, в диагностике которого учитываются антигены и антитела, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела, что связано с низкой концентрацией ВГС в крови.

Схема лабораторной диагностики ВГС

1. Первичное массовое обследование на ВГС - определение методом ИФА в сыворотке крови антител к вирусу класса IgG.

2. Определение спектра антител к отдельным протеинам ВГС.

3. Обнаружение в крови РНК ВГС, определение генотипа вируса и вирусной нагрузки [6].

1.16 Антитела к вирусу (anti-HCV tot)

Anti-HCV tot свидетельствуют о контакте пациента с вирусом и обнаруживаются как при остром, так и при хроническом гепатите. В большинстве случаев их наличие совпадает с присутствием в крови РНК HCV. Существует несколько поколений диагностических тест-систем для выявления anti-HCV tot, отличающихся своей чувствительностью и специфичностью.

Наиболее совершенны тест-системы 3-го и 4-го поколения, использующиеся в клинической практике начиная с 1995 года. Тест-системы 3-го и 4-го поколения позволяют выявить anti-HCV в 99,7% случаев. В некоторых случаях антитела к HCV могут не обнаруживаться, например, при запаздывании иммунного ответа, применении иммуносупрессивной терапии или иммуносупрессии на фоне онкологического заболевания, приема наркотических веществ и т.д. Очень редко наблюдаются ложноположительные результаты. Современные методы серодиагностики являются достаточно чувствительными и информативными, а их внедрение в практику повысило частоту выявления лиц, инфицированных ВГС. Однако наличие суммарных антител к HCV лишь констатирует факт контакта пациента с ВГС, но не позволяет судить ни об инфицированности, ни о репликации вируса, ни, тем более, о давности процесса либо его завершенности [14].

Поэтому положительный результат исследования обязательно должен быть проверен путем перестановки анализа в двух параллельных пробах. Если хотя бы одна из двух проб данной сыворотки при этом снова дает положительный результат, образец считают первично положительным и исследуют в подтверждающей ИФА тест-системе Анти-HCV СПЕКТР или на основе иммуноблота RIBA HCV SIA. Подтверждающая тест-система Анти-HCV СПЕКТР позволяет выявить антитела к нанесенным отдельно белкам вируса - corе, NS3, NS4, NS5.

При остром ВГС из антител первыми появляются анти-HCV core, сначала IgM и вскоре IgG. Это происходит большей частью спустя 15-20 недель после заражения. Появление антител к неструктурным белкам вируса NS4 и NS5 может свидетельствовать о хронизации процесса.

При благоприятном исходе острого ГС с выздоровлением анти-HCV core IgM исчезают в ранние сроки (до двух месяцев), а анти-HCV core IgG продолжают циркулировать в крови в течение 1 - 4, реже 10 - 15 лет. Это учитывается при установлении HCV-пастинфекции. Но наличие данных антител не предотвращает от повторного инфицирования ВГС.

Истинных реконвалесцентов после острого ГС не много, 15 - 20%. У значительной части больных острая фаза сменяется латентной с постепенным формированием хронического гепатита. При хроническом гепатите в крови закономерно обнаруживаются анти-HCV IgG ко всем протеинам вируса - corе, NS3, NS4, NS5.

1.17 РНК вируса (HCV RNA)

РНК HCV обнаруживается методом полимеразной цепной реакции в сыворотке/плазме крови, лейкоцитах и пункционных биоптатах печени.

Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является золотым стандартом диагностики, характеризующим виремию, свидетельствующую о продолжающейся активной репликации HCV в гепатоцитах. Выявление вирусной РНК всегда указывает на текущую инфекцию. Однако существуют случаи, когда:

* на фоне высокого уровня противовирусных антител при остром гепатите С вирусная РНК может не выявляться, что не гарантирует ни ее появления в дальнейшем, ни перехода гепатита в хроническую форму;

* при хроническом гепатите С виремия может быть преходящей, в связи с этим вирусная РНК обнаруживается непостоянно;

* после перенесенной инфекции РНК может не выявляться, а противовирусные антитела продолжают определяться, в таком случае выздоровление должно быть подтверждено многократным отрицательным результатом определения вирусной РНК.

Выявление РНК HCV является основанием диагноза гепатита С в случаях серонегативности, например, на ранней стадии инфекции (РНК HCV обнаруживается в сыворотке крови уже в течение первой недели после инфицирования) а также у пациентов с иммунодепрессией, у которых антителогенез подавлен. Качественный ПЦР-анализ на РНК ВГС необходим также для мониторинга противовирусной терапии, так как исчезновение вирусной РНК в процессе лечения является одним из критериев его эффективности.

Методом ПЦР возможно также определение генотипов ВГС: 1а, 1b, 1с, 2а, 2b, 2с, 3а, что необходимо для выбора схем противовирусной терапии. При инфицировании 2 либо 3 генотипом вируса доза препарата ниже и продолжительность лечения может быть меньше, чем при 1 генотипе. При 1b генотипе рекомендуется комбинированная противовирусная терапия двумя препаратами. При инфицировании более чем одним генотипом вируса ответ на лечение и течение болезни будет иным, чем при инфицировании одним генотипом [8].

2. Объект, программа и методика исследований

2.1 Объект и программа исследований

Объектами исследования являлись образцы сывороток крови различных групп населения города Светлогорска: пациенты кожно-венерологический диспансера, пациенты наркологический диспансера, пациентов инфекционного отделения и медицинские работники.

Объектом исследований являются показатели сыворотки крови жителей города Светлогорска, входящих в группы риска инфицирования вирусным гепатитом.

Экспериментальные исследования по изучению показателей специфической иммунной системы 938 пациентов Светлогорской ЦРБ за период с 1.10.2014 г. по 25.12.2014 г. были выполнены в лаборатории серодиагностики инфекционных заболеваний УЗ «Светлогорская ЦРБ». Лаборатория имеет разрешение на работу с инфекциями второй группы патогенности. Методом ИФА оценивалось наличие или отсутствие антител ВГС, поверхностного антигена к вирусу гепатита В, титр антител, титр антигена в сыворотке крови пациентов.

Программа исследования включала в себя следующие задачи:

1) составление обзора литературы по теме исследования;

2) сбор экспериментальных данных;

3) анализ и статистическая обработка полученных данных.

2.2 Метод определения

Иммуноферментный анализ - метод выявления антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с меткой-ферментом (пероксидазой хрена, р-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале.

Наиболее распространен твердофазный ИФА - вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (стандартные диагностические антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках микропанели (планшета для реакций) из полистирола.

2.3 Методика исследований

Исследование начиналось с эпидемиологического обследования пациентов врачами Светлогорской ЦРБ на первичном приеме с помощью анкеты, включающей следующие основные вопросы: парентеральные вирусные гепатиты (ВГ и ВГС) в анамнезе, донорство, получение травм в течение года; посещение стоматолога в течение последнего года, количество половых партнеров, употребление наркотиков; нахождение в местах лишения свободы, также наличие судимости, татуировок на теле, знакомых, употребляющих наркотики; родственников с установленными ВГ, знакомых с установленными ВГ и ВИЧ-инфицированных знакомых. Для скрининговой диагностики вирусного гепатита HBV использовали иммуноферментный анализ.

Подготовка исследуемых проб

Для анализа следует использовать неразведенную сыворотку или плазму крови. Забор крови, получение образцов сыворотки и плазмы должны производиться в соответствии с действующими нормативно правовыми актами.

Образцы сыворотки и плазмы крови не должны подвергаться нагреванию и могут храниться до исследования при температуре от плюс 2 до плюс 8°С не более 3 суток, более длительное хранение допустимо в замороженном состоянии при температуре минус 20±2°С. Нельзя использовать сыворотку (плазму), замороженную и размороженную более одного раза, а так же сыворотку крови с явлениями гемолиза, гиперлипидемии или консервированную азидом натрия.

Инструкция по применению тест-системы для выявления HBs-Ag методом иммуноферментного анализа

Тест-система для выявления HBs-Ag методом ИФА предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке крови и препаратах, приготовленных из сыворотки (плазмы) крови человека.

Состав тест-системы:

1. Иммуносорбент ? планшет полистироловый, в лунках которого сорбированны моноклональные антитела мыши к HBs-Ag.

2. Коньюгат-1-моноклональные антитела мыши к HBs-Ag конъюгированные с биотином.

3. Конъюгат-2 -стрептавидин. Конъюгированный с пероксидазой хрена.

4. Раствор для разведения коньюгата-1 (РРК1).

5. Раствор для разведения коньюгата-2 (РРК2).

6. Положительный контрольный образец (ПК) - очищенный HBs-Ag с концентрацией(0,02±0,01)МЕ/мл в сыворотке крови человека, не содержащей антитела к HBs-Ag.

7. Слабоположительный контрольный образец (ПК2).

8. Отрицательный контроль (ОК).

9. ТМБ-3,3-тетрометилбензидин.

10. Фосфотно-солевой твиносодержащий буферный раствор (ФСТБ).

11. Субстратный буферный раствор (СБ).

12. Стоп-реагент.

Ход исследования

Внесение контрольных и исследуемых образцов по100мкл согласно карте. Покрытый липкой лентой или крышкой планшет выдержать в инкубаторе в течение 60 минут при температуре 37,0°С.

Не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипа внести по 50 мкл рабочего раствора коньюгата-1.При этом содержимое лунок изменяет свой цвет. Содержимое лунок тщательно перемешать осторожным постукиванием по краям планшета, после чего покрытый липкой лентой или крышкой планшет выдержать в инкубаторе в течение 60 минут при температуре 37,0°С.

Не удаляя содержимое лунок и не промывая планшет, во все лунки стрипа внести по 50 мкл рабочего раствора коньюгата-2. Содержмое лунок тщательно перемешать осторожным постукиванием по краям планшета, после чего покрытый липкой лентой или крышкой планшет выдержать в инкубаторе в течение 30 минут при температуре 37,0°С.

Удалить содержимое лунок и промыть планшет 5 раз рабочим отмывающим раствором.

Во все лунки планшета внести по 100мкл субстратной смеси. Планшет выдержать в защищенном от света месте при температуре от 18 до 24°С.

Реакцию останавливают добавлением во все лунки по 150 мкл стоп-реагента и через 2 - 3 минуты провести учет результатов.

Учет результатов

Фотометрию проб проводят при следующих условиях: длина волны измерения-450 нм, фоновой волны ? 620 ? 680 нм. Присутствие или отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита HBs-Ag определяется отношением оптической плотности.

Результаты анализа, учитывать, если значение ОП в лунке с контрольным положительным образцом не менее 0,6, а среднее значение в лунках с Ок не более 0,12.пк-2 должен давать положительную реакцию. ОП критическая рассчитывается по формуле: ОПкрит.= ОПОК_ср+0,06

Где 0,06 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА на предприятии-изготовителе.

Исследуемые образцы расцениваются как отрицательные, если ОП образца < ОПкрит; как положительные, если ОП образца > ОПкрит.

Положительные образцы должны быть исследованы повторно в двух лунках для подтверждения первоначального результата. Если при повторном исследовании величина ОП образца в обеих лунках меньше ОПкрит., то проба расценивается как негативная по HBs-Ag.Если при повторном анализе величина ОП образца в одной из лунок равна или больше ОПкрит., то исходный результат подтверждается.

Все повторно положительные образцы должны быть протестированы в подтверждающем конфирматорном - тесте.

Набор реагентов для подтверждения наличия поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке или плазме крови человека методом иммуноферментного анализа - ИФА-HBsAg-П

Назначение - подтверждение наличия поверхностного антигена вируса гепатита В (HВsAg) в сыворотке или плазме крови человека «in vitro» 2 методом непрямого и конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа.

Состав тест-системы:

1. Иммуносорбент - планшет полистироловый, в лунках которого сорбированны моноклональные антитела мыши к HBs-Ag.

2. Коньюгат-1 - моноклональные антитела мыши к HBs-Ag конъюгированные с биотином.

3. Конъюгат-2 - стрептавидин. Конъюгированный с пероксидазой хрена.

4. Раствор для разведения коньюгата-1 (РРК1).

5. Раствор для разведения коньюгата-2 (РРК2).

6. Положительный контрольный образец (ПК) - очищенный HBs-Ag с концентрацией(0,02±0,01)МЕ/мл в сыворотке крови человека, не содержащей антитела к HBs-Ag.

7. Слабоположительный контрольный образец (ПК2).

8. Отрицательный контроль (ОК).

9. Раствор для нейтрализации.

10. ТМБ-3,3-тетрометилбензидин.

11. Фосфотно-солевой твиносодержащий буферный раствор (ФСТБ).

12. Субстратный буферный раствор (СБ).

13. Стоп-реагент.

Ход исследования

I - внесение исследуемых образцов и контролей в планшет согластно карте, инкубация образцов сыворотки (плазмы) крови человека с белками иммуносорбента и подтверждающим агентом при температуре (37±1) °Св течение 80 мин.

II - инкубация с конъюгатом при температуре (37±1) °Св течение 40 мин.

III - инкубация с хромогеномпри температуре (37±1)°С в течение 20 мин.

IV - остановка реакции и учет результатов.

Клинический материал - сыворотка или плазма крови человека.

Время инкубации - 2 ч 20 мин.

V - обработка полученных результатов.

Набор рассчитан на проведение 6 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка - 2 стрипа (16 лунок). Всего - 48 определений, включая контрольные образцы.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы «Excel».

Инструкция по применению тест-системы для выявления HCV методом иммуноферментного анализа

...