Микробиология, понятия и характеристики

После начала парообразования удаляют воздух из стерилизационной камеры. Это необходимое условие стерилизации, так как при одном и том же давлении температура чистого пара выше температуры смеси пара и воздуха. Поэтому если в автоклаве останется воздух, материал может не простерилизоваться. Наиболее простой и очень распространенный способ обезвоздушивания автоклава - вытеснение воздуха паром. Пар и конденсат отводят либо в сосуд с водой, либо в специальное устройство, соединенное с канализацией. В первом случае на кран (2) надевают резиновый шланг, который опускают в воду. Началом продувания считают появление устойчивой непрерывной струи чистого пара. Пока в автоклаве еще имеется воздух, смесь воздуха и пара, проходя через воду, издаст сильный треск. Чистый пар выходит с равномерным шипящим звуком. Его пропускают в течение 10 мин. В целом вся операция с момента появления пара с воздухом должна занимать не более 15 - 20 мин. иначе в автоклаве останется мало воды и он может испортиться. Чтобы уменьшить расход пара (воды), кран открывают не полностью. Степень открывания крана устанавливают на практике при эксплуатации автоклава. В наиболее совершенных автоклавах воздух из стерилизационной камеры удаляют с помощью вакуумного насоса.

Kогда воздух вытеснен, закрывают пароотводный кран, и давление пара доводят до показания, соответствующего pежиму стерилизации. Режим автоклавирования часто выражают в единицах избыточного давления, указывая при этом продолжительность его поддержания. Например: стерилизация при 1 атм в течение 20 мин. На манометре автоклава обозначается именно то дополнительное давление, которое создается в автоклаве сверх нормального. Нередко режим автоклавирования характеризуют температурой и временем. Как только стрелка манометра дойдет до указателя oпределённого дополнительного давления и, следовательно, температура пара достигнет соответствующего значения, поддерживают давление на этом уровне необходимое время путем ручного или автоматического регулирования подачи пара. В автоклавах с огневым обогревом подачу пара регулируют интенсивностью горения, в автоматических автоклавах - электроконтактным манометром.

По окончании времени стерилизации выключают нагрев автоклава. Давление в автоклаве постепенно падает и сравнивается с атмосферным. Лишь после этого открывают кран, выводящий пар. Преждевременное открывание крана недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала. Когда пар выйдет, открывают крышку (дверь) автоклава, соблюдая при этом осторожность во избежание ожога паром лица и рук. Удаление пара из стерилизационной камеры автоклавов, оснащенных вакуумным насосом, осуществляют с помощью насосa. Одновременно происходит подсушивание стерильного материала.

Поскольку автоклав является аппаратом, работающим при высоких давлениях и температурах, неправильное обращение с ним может быть причиной несчастных случаев. Установка автоклава и работа с ним производятся при строгом и точном выполнении правил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица.

Подготовка сред к стерилизации. При автоклавнровании 3 - 5%

жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию.

Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками. Они предохраняют cpeдy от заражения микрофлорой, находящейся в окружающем воздухе. Пробки должны быть дocтаточно плотными, чтобы выполнить эту функцию, но с равномерным распределением волокон ваты, так как через них происходит газообмен культуры с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом.

Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки должна быть около 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5 - 2,0 см (рис 34). Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой.

Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном. Фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. При использовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их завёртывают в двойной слой обёрточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Пробки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки.

Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практнке стерилизация в автоклавах осуществляется при температуре в пределах 111-138°С, т. е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111°С не может считаться надежной; температура выше 138°С, как правило, не является необходимой,к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации aвтоклава. При использовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными считаются следующие режимы стерилизации: 15 - 45 мин при 121°С (1 атм) и 10 - 30 мин при 126 (1,5 атм).

Микробиологи чаще всего стерилизуют при 0,5 и 1 атм.

Рисунок 34. Ватные пробки: А - приготовлена правильно, Б и В - приготовлены неправильно

Таблица 2 - Зависимость продолжительности стерилизации жидкостей от объёма сосудов

Температура и длительность автоклавирования питательных сред

определяются прежде всего их составом, термоустойчивостыо или термолабильностыо компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (сусло пивное, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 атм в течение 15-30 мин. Мясо-пептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, потому что стерилизация начинается фактически после того, как агар расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации вдвое больше времени, чем тот же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например, тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 в течение 2 ч или 1 ч при 170°С. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см.

Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью. К ним относится почва, причём она, кроме того, и нагревается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 атм либо 1 раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда при 2 атм 2 ч.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать pH среды. При кислой реакции многие вещества, входящие в её состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение рН, выше температура и больше продолжительность стерилизации, тем интенсивнее происходит гидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатином и даже с aгаpoм. Если среда щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа, карамелизуются и становятся непригодными для использования бактериями сахара. В некоторых случаях в процессе стерилизации изменяется рН среды. Так, если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Особенно часто это наблюдается в присутствии ксилозы. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется углеводы, фосфаты, соли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концентрированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации растворы стерильно объединяют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизовать одним и тем же способом.

Режим автоклавирования в значительной степени зависит от объема стерилизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения

надежности стерилизации. Имеет значение толщина стенок и форма

емкостей. Это нужно учитывать в практической работе. Например, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одновременно в пробирках и больших бутылях. Если среда стерилизуется по режимам, рекомендованным для малых объемов, содержимое бутыли может не простерилизоваться. Если же стерилизация проводится с расчётом на большой объем, среда в пробирке прогревается значительно дольше, чем требуется, и может испортиться.

После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2-3 суток в термостате при 30°С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

· Дробная стерилизация (тиндализация)

Дробная стерилизация применяется для обеззараживания сред, разрушающихся под действием температур выше 100°С. Этот прием был введен английским ученым Тиндалем. Принцип тиндализации заключается в том, что прогревают среду или ее компоненты без избыточного давления несколько раз, и в период между прогреваниями дают прорасти жизнеспособным спорам. Предполагается, что развивающиеся из спор клетки погибают при последующем прогревании, не успев образовать новые споры. Прогревание можно осуществлять в парах кипящей воды, т. е. при 100°С или, как говорят, текучим паром. Обработку текучим паром проводят 3-4 раза по 20-40 мин в aвтоклаве с незакрытой крышкой, в кипятильнике Коха или на водяной бане с хорошо пригнанной крышкой. Время прогревания отмечается с момента энергичного выделения пара.

Кипятильник Коха представляет собой металлический цилиндр, обычно накрытый теплоизолирующим слоем, чаще всего - асбестом. Внутри цилиндра находится сетчатое ведро или подставка на ножках, куда помещают стерилизуемый материал, прикрыв его клеёнкой для защиты от конденсационной воды. На дно цилиндра наливают воду так, чтобы уровень ее не доходил до дна подставки. Кипятильник закрывают крышкой, в которой имеется отверстие для выхода пара, и нагревают с помощью газовой горелки или электричества. В современных аппаратах Коха имеются терморегуляторы.

В промежутки между прогреваниями среды помещают на сутки в термостат, отрегулированный на 30°С, для проращивания спор. Субстраты, не выдерживающие нагревания при 100°С, прогревают более осторожно: при 70-80°С по 1 ч ежедневно в течение 3 дней или при 60-65°С в течение 5 дней. Между нагреваниями их выдерживают при температуре от 25 до 37°С.

Тиндализация обеспечивает стерильность лишь в том случае, если среда, в которой находятся споры и поддерживаемая между прогреваниями температура обеспечивает их прорастание, и с другой стороны, если появившиеся вегетативные клетки вновь не образуют термостойкие споры. Существенным недостатком дробной стерилизации является и то, что она требует большой затраты времени. Вот почему практическое значение тиндализации в настоящее время весьма ограничено. Этим способом пользуются преимущественно для стерилизации некоторых термолабильных лекарственных веществ и иногда - желатины.

· Стерилизация фильтрованием

Стерилизация фильтрованием широко используется в микробиологической практике. Она применяется для субстратов, не выдерживающих нагревания, например, для жидких сред и растворов, содержащих термолабильные белки, витамины, сахара, некоторые антибиотики, а также для сывороток, летучих веществ, например некоторых углеводородов и других. Этим способом освобождают культуральную жидкость от клеток микроорганизмов, когда необходимо сохранить содержащиеся в ней продукты обмена в неизменном виде.

Способ заключается в пропускании жидкостей через специальные мелкопористые фильтры, называемые бактериальными. Микробные клетки задерживаются фильтрами главным образом механически, поскольку они крупнее диаметра пор фильтра, а также потому, что поры идут через фильтр чрезвычайно извилисто и на всём протяжении имеют разную форму и неодинаковый размер. Если же фильтр изготовлен из положительно заряженного материала, то имеет место и притягивание бактерий к стенкам пор, поскольку большинство микроорганизмов в водной суспензии имеет на своей поверхности отрицательный заряд. Такой фильтр может эффективно задерживать даже те микроорганизмы, средние размеры которых несколько меньше среднего диаметра пор. Тем не менее поры фильтров должны быть достаточно мелкими не только затем, чтобы обеспечить механическую задержку клеток, но и для того, чтобы микроорганизмы оказались в сфере действия электрического заряда стенок.

Диаметр пор определяет область применения фильтров. Стерилизующими бактериальными фильтрами теоретически можно считать такие, размер пор которых не превышает 0,75 мкм. В практике пригодность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной фильтрации через них суспензии какого-либо мелкого микроорганизма, например Pseudomonas aeruginosa. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высеивают на питательную среду. Если в течение 5 дней тест - организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации. Как правило, бактериальные фильтры пропускают L - формы бактерий, вирусы и бактериофаги.

Типы бактериальныx фильтров. Бактериальные фильтры изготавливаются из разных материалов. Они различаются по форме и диаметру пор, обычно указанному на упаковке фильтра или в прилагаемом паспорте. Нередко фильтры выпускаются под определёнными номерами и марками.

Мембранные (коллоидные) фильтры готовят на основе нитроцеллюлозы. Отечественная промышленность выпускает мембранные фильтры диаметром 35 мм. Они представляют собой диски - разного диаметра толщиной 0,1-0,5 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются номерами от 1 до 5.

Во Франции и США фирма «Миллипор» выпускает фильтры с размером пор от 0,01 до 14 мкм.

В последнее время получили распространение мембранные фильтры фабрики «Синпор» ЧССР.

Мембранные фильтры задерживают микроорганизмы почти исключительно благодаря малым размерам своих пор. Адсорбция здесь играет незначительную роль. Через эти фильтры пропускают небольшие объемы жидкости, так как при фильтровании больших объемов происходит закупорка пор и оно затрудняется. Кроме того, при длительном фильтровании возможно прорастание микроорганизмов внутри пор и попадание их в фильтрат. Мембранные фильтры, имеющие диаметр пор 0,1 мм или меньше, называют ультрафильтратами. Их используют для фильтрации вирусов и высокомолекулярных белков.

Асбестовые фильтры известны под названием фильтров Зейтца. Их изготавливают из смеси асбеста с целлюлозой в виде больших плотных (4-6 мм толщиной) листов, которые затем разрезают на диски или квадраты разной величины. Верхняя поверхность пластин флокулирована. Плотность фильтров тем выше (т. е. меньше пористость), чем больше в них асбеста. На пористость фильтров указывают обозначения, имеющиеся на пластинах: индекс ЕК соответствует диаметру пор 1,5-1,8 мкм; EKS - 1,2-1,5; EKS-l - 1-1,2; ЕКП 0,8-1 мкм. Кроме того, в СССР выпускаются асбестовые фильтры, обозначаемые марками Ф2 и СФ. Стерилизующими являются пластины СФ-3 и СФ-4.

Асбестовые фильтры имеют ряд недостатков. Один из основных связан с их химическим составом: при фильтровании из них могут вымываться щелочи, соли щелочных металлов, а иногда и соли железа.

Фильтрат загрязняется нежелательными примесями и приобретает щелочную реакцию. Это затруднение можно преодолеть путем предварительного промывания фильтра последовательно разведенной кислотой

и дистиллированной водой или удалением первых порций фильтрата.

Другой существенный недостаток фильтров Зейтца состоит в том, что

асбест, будучи отрицательно заряженным, может адсорбировать значителъные количества различных веществ из фильтруемой жидкости.

И, наконец, асбестовые фильтры нередко загрязняют фильтрат волокнами. Асбестовые пластины относительно, мягкие, они легко искривляются и разрываются. Помятые фильтры, а также пластики с надломами и трещинами для работы непригодны.

Фарфоровые фильтры были впервые предложены Пастером и Шамберланом в 1884 году. Впоследствии они получили название «свечи

Шамберлана». Их изготавливают из смеси кварцевого песка и каолина, прокалённых на огне. Они имеют форму полого цилиндра, закрытого на одном конце. Верхняя часть цилиндра глазурованна. Особенно часто применяются свечи трех размеров: 10 Х 55, 15 Х 105 и 25 Х 205 мм. Пористость их обозначается буквой L с цифрами от 1 до 13, соответственно увеличению плотности фильтра, т. е. уменьшению диаметра его пор - от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые свечи обозначаются также маркой «В», крупнопористые - маркой «F». Последние используются только для фильтрации воды и отделения мелких микроорганизмов от крупных. Свечи Шамберлана имеют положительный заряд.

Фильтры из инфузорной земли готовят из диатомита или кизельгура, нередко с добавлением асбеста или других материалов. В России выпускается несколько типов таких фильтров под различными названиями. Чаще всего их называют «свечи Беркефельда». Это замкнутые с одного конца цилиндры 5-26 Х 1,5-5 мм, имеющие в верхней части фарфоровую или металлическую головку «Свечи Беркефельда» имеют обозначения W, N, и V, что соответствует диаметрам пор 3 - 4, 5 - 7, 8 - 12 мкм.

Фильтры из стекла. Стерилизующие стеклянные фильтры представляют собой двуслойные диски, изготавливаемые из фрагментов стекла «Пирекс» путем их сплавления. Нижний слой, имеющий пористость в пределах 15-40 мкм, служит подставкой. На ней лежит бактерионепроницаемый верхний слой. Это тонкая мелкопористая пластинка. По пористости такие пластинки разделяются на три типа: P- диаметр пор меньше 1 мкм, М - от 1 до 1,7 мкм, С - больше 1,7 МКМ. Но, поскольку стеклянные фильтры отличаются нестандартностью пор, в паспорте, прилагаемом к каждому фильтру, обычно указывается средний диаметр пор данного фильтра. Диски впаяныв стеклянные воронки-держатели. Форма их может быть разной. Особенно широкое распространение получили фильтры Нутча и воронки Бюхнера ( рис. 35) с диаметром пластин от 30 до 120 мм.

Стеклянные фильтры имеют отрицательный заряд. Но они не столь активно адсорбируют вещества при фильтровании, как асбестовые, и не загрязняют фильтрат, поскольку материал фильтра из них не вымывается. Из-за нестандартности пор фильтры из стекла перед употреблением обязательно должны быть проверены на стерилизующий эффект.

В настоящее время из всех типов бактериальных фильтров для стерилизации наиболее широко применяются мембранные и асбестовые фильтры.

Рисунок 35. Свеча Беркефельда

Рисунок 36. Стеклянный фильтр (воронка Бюхнера), вмонтированная в колбу Бунзена

Работа с бактериальными фильтрами включает ряд этапов:

1.Подготовка фильтров. Фильтр должен быть закреплен в держателе, который вставляется в приемник фильтрата. Обычно приемником является колба Бунзена.

Для мембранных фильтров имеются многочисленные держатели. Есть, например, прибор, изготовленный целиком из стекла, в котором в качестве опоры фильтра используется крупнопористый стеклянный диск (рис. 37, А). Чаще применяются металлические и пластмассовые держатели. Все они приспособлены для дисков различного диаметра и рассчитаны на фильтрование разных объемов жидкостей.

Асбестовые фильтры монтируют в металлические основы, которые известны под названием «приборы Зейтца» (рис. 37, Б). Асбестовая пластина крепко зажимается винтами между верхней (цилиндр без дна) и нижней (воронкообразный тубус) частями держателя. Опорой для асбестового диска служит сетка или пористая пластинка из нержавеющей стали. Трубка держателя, по которой стекает фильтрат, через резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде называют фильтром Зейтца.

Узкие свечи монтируют в стеклянные трубки с помощью резиновой пробки, которую вставляют в колбу Бунзена (рис. 38). Жидкость фильтруется из трубки внутрь свечи. Узкие свечи можно вставлять и непосредственно в резиновую пробку, закрывающую колбу Бунзена (рис. 39). В этом случае фильтрование происходит изнутри наружу.

Широкие свечи соединяют с колбой Бунзена резиновой трубкой (рис. 40). Свечу помещают в сосуд, куда наливают фильтруемую жидкость. Фильтрование при этом идет снаружи, а приемником является внутренняя полость свечи.

Рисунок 37. Приборы для стерилизации фильтрованием: А- со стеклянным держателем; Б - с металлическим держателем

8

Рисунок 38. Керамический фильтр, соединенный с колбой Бунзена при помощи наружного стеклянного цилиндра

Стеклянные фильтры, имеющие форму воронки, вставляют в резиновую пробку колбы Бунзена .

Перед использованием фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы. А мембранные фильтры стерилпзуют, поместив их в дистиллированную воду, кипячением в течение 30 мин или автоклавированием при 1 атм 15 мин. Сосуд с фильтрами должен быть закрыт ватной пробкой. Иногда мембранные фильтры стерилизуют химическими средствами: окисью этилена в смеси с углекислотой в течение 6 ч или парами формальдегида в течение 24 ч. В последнем случае фильтры помещают в эксикатор с разряженным воздухом, на дно которого наливают 2%-ный раствор формальдегида. Стерилизацию окисью этилена проводят в специальных аппаратах. После химической стерилизации фильтры проветривают в стерильных условиях не менее 5 ч.

Металлические и стеклянные держатели мембранных фильтров заворачивают в бумагу вместе с резиновой пробкой и автоклавируют при 1 атм 20-30 мин. Способ и режим стерилизации пластмассовых держателей определяется их термостойкостью. Стерилизация мембранных фильтров вместе с держателем не рекомендуется, так как это может привести к повреждению фильтра. Колбу Бунзена стерилизуют горячим воздухом или в автоклаве при 1 атм 20-30 мин. Предварительно горлышко колбы Бунзена закрывают ватной пробкой, а в отводную трубку, которая в дальнейшем присоединяется к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. Весь прибор собирают непосредственно перед работой. Мембранные фильтры закладывают в держатель в стерильных условиях.

Рис 39. Керамический фильтр, вмонтированный в колбу Бунзена с помощью резиновой пробки

Рисунок 40. Керамический фильтр, соединенный с колбой Бунзена резиновой трубкой; 1 - фильтруемая жидкость, 2 - фильтр

Фильтры Зейтца стерилизуют в автоклаве при 1-1,5 атм 20 мин или горячим воздухом при 160°С в течение 1 ч в собранном виде, то есть вместе с асбестовыми пластинками. Не рекомендуется перед стерилизацией туго завинчивать винты держателя. Их подтягивают сразу после стерилизации.

Свечи чаще всего стерилизуют в автоклаве при 0,5-1 атм в течение 15 мин либо вместе с приемником, либо отдельно. В том случае, если свечи не соединены с резиновыми деталями, их можно стерилизовать горячим воздухом. Для сохранения стерильности свечи защищают от соприкосновения с воздухом тем или иным способом. Последнее зависит от того, как будет монтироваться прибор и в каком направлении пойдет фильтрование.

Стеклянные фильтры, вставленные в резиновые пробки, стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин вместе с колбой-приемником или отдельно. В первом случае на воронку фильтра, закрытую ватной пробкой, надевают бумажный колпачок, во втором - фильтр с пробкой заворачивают в пергамент или алюминиевую фольгу. Стеклянные фильтры, не соединенные с резиновой пробкой, можно стерилизовать горячим воздухом.

2.Фильтрование. Через бактериальные фильтры жидкости проходят медленно, а длительное фильтрование нежелательно, поскольку при этом, как уже отмечалось, возможно прорастание микроорганизмов в порах фильтров и загрязнение ими фильтрата. Поэтому обычно фильтрование ускоряют путем создания на фильтре перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата. Чаще применяют откачивание воздуха. При этом происходит легкое разбухание клеток, чем облегчается их задержка на фильтре. Но в то же время в условиях вакуума возможно вспенивание фильтрата, содержащего белок, поэтому фильтрация под давлением, исключающая это явление, считается более благоприятной, хотя, вероятно, и менее удобной в техническом отношении. Не исключено, что при сильном положительном давлении бактериальная клетка сжимается и может проходить через фильтр. Слишком большое разрежение и высокое давление ускоряют закупорку пор.

Рисунок 40. Прибор для фильтрования под вакуумом в собранном виде: А - держатель с фильтром; Б - приемник фильтрата; В - предохранительная склянка; Г - водоструйный насос; 1 - свеча; 2 - стеклянный сосуд; 3 - трубка из толстой резины; 4- резиновая пробка; 5 - ватный тампон; 6 - вакуумный насос

Фильтрование под вакуумом осуществляют следующим образом. Непосредственно перед работой ватную пробку колбы Бунзена, если она стерилизовалась отдельно, быстро заменяют держателем с фильтром, а отводной конец колбы соединяют с предохранительной склянкой, находящейся перед водоструйным насосом (рис. 41). Тампон из отводного конца не вынимают, чтобы сохранить стерильность приемника. По окончании фильтрования насос выключают постепенно, так как при резком изменении давления вода из крана может быстро заполнить предохранительную колбу и попасть в фильтрат. Профильтрованные жидкости разливают в стерильных условиях в заранее простерилизованную посуду. Так же, как и при термической стерилизации, их выдерживают 2-3 суток при 30°С и, если в них появится рост микроорганизмов, готовят вновь.

Важно помнить, что состав жидкостей, прошедших через бактериальные фильтры, может меняться вследствие вымывания из фильтров или, напротив, адсорбции на них ряда веществ, и фильтрат (среда) станет непригодным для культивирования данных микроорганизмов. Из асбестовых фильтров, как уже отмечалось, могут вымываться щелочи и различные соли. Адсорбируются же на фильтрах некоторые жирные кислоты, белки, полисахариды. Возможность и степень адсорбции веществ на фильтрах определяются химической природой фильтра, размерами его пор, продолжительностью фильтрования. Большую поглотительную ёмкость (до 30 и более процентов) имеют керамические (свечи) и асбестовые фильтры. Это важно учитывать при работе с малыми объёмами жидкостей.

Эффективность фильтрования определяется не только качествами фильтра, но и свойствами фильтруемой жидкости: её вязкостью, pH, температурой и др. Жидкости с низкой вязкостью фильтруются легче, поэтому при возможности вязкие жидкости разводят. Скорость фильтрации возрастает с повышением температуры, так как при этом снижается вязкость. Поэтому многие жидкости фильтруют подогретыми. Летучие жидкости нельзя фильтровать с помощью вакуума. Щелочная реакция среды (рH 7,2 - 8,0) и наличие капиллярно - активных веществ (бульон) облегчают фильтрацию. Некоторые вещества,

понижающие поверхностное натяжение, например, сыворотка, желчь, мыла, кислоты, способствуют проникновению бактерий через материалы, содержащие кремний. Трудно фильтруются гетерогенные системы, поэтому предварительно их осветляют пропусканием через свечи Шамберлана L1 или L2 через крупнопористые мембранные или даже бумажные фильтры.

3.Очистка бактериальных фильтров. Мембранные и асбестовые фильтры используются только один раз; после употребления их выбрасывают. Если стерилизации подвергалась жидкость, содержащая патогенные микроорганизмы, то фильтры, прежде чем выбросить, стерилизуют или выдерживают в дезинфицирующем растворе. Свечи Шамберлана и Беркефелъда, а также стеклянные фильтры можно использовать повторно. При употреблении они загрязняются не только бактериями, но и органическими веществами. Для очистки фильтров применяют различные способы.

Фарфоровые свечи (Шамберлана) сначала промывают дистилированной водой, пропуская ее через стенки фильтра в направлении, обратном фильтрованию. Затем фильтры заливают на ночь концентрированной серной кислотой, содержащей небольшие количества нитрата натрия и хлорнокислого калия. На следующий день их многократно промывают дистиллированной водой, а затем кипятят в воде для удаления растворенного воздуха. Свечи Шамберлана можно обрабатывать и другим способом. Их промывают в течение 10 ч в 3%-ном растворе фенола, затем в воде и 2%-ной жавелевой воде (КСlО) в течение 2 ч и, наконец, моют щеткой в 10%-ной соляной кислоте также 2 ч. От кислоты фильтры отмывают в проточной воде в течение суток до исчезновения реакции на хлор, затем оставляют на ночь в дистиллированной воде. Третий вариант очистки заключается в следующем. Свечи сначала промывают теплой водой для удаления осадка и протирают мягкой щеткой, затем моют 2-3%-ным раствором формалина и, наконец, 15 % -ным раствором хлорной извести. Потом свечи выдерживают 30 мин в растворе соляной кислоты (1:10), кипятят в водопроводной воде 1 ч и отмывают водой. Свечи Беркефельда мягче фарфоровых, поэтому обработку щеткой они не выдерживают. При их чистке следует также избегать кислот. Они хорошо отмываются растворами гипохлорита. Промытые тем или иным способом свечи должны быть выcyшены. Хранить их во влажном состоянии нельзя, так как при этом в их порах могут размножиться микроорганизмы, то есть появляется опасность загрязнения фильтра биомассой. Очищать свечи от частиц органического происхождения можно также прокаливанием их в муфельной печи.

Стеклянные фильтры обычно промывают раствором соляной кислоты или горячей концентрированной серной кислотой (80-100°С) при добавлении небольшого количества нитрата калия или смеси нитрата натрия и перхлората натрия и азотной кислоты. Фильтры рекомендуется держать в этой смеси в течение ночи. Затем их промывают дистиллированной водой до исчезновения ионов .

Бактериальные фильтры нельзя мыть смесью двухромовокислого калия с серной кислотой, так как хромат адсорбируется на фильтре, что может повредить фильтр и испортить фильтрат. Свечи не следует также обрабатывать, концентрированными растворами щелочей, поскольку это моет увеличить размеры их пор.

ГЛАВА 4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для их жизнедеятельности.

ПРИНЦИПЫ СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах, поэтому питательная среда должна содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред.

По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы.

Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту - соединение, содержащее углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация углекислоты в воздухе не превышает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффузии недостаточно для интенсивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (NаНС) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (СаС). В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный 1-5% углекислоты.

Потребности гетеротрофных микроорганизмов не могут быть удовлетворены только углекислотой. Для их развития среда должна содержать органические соединения. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения yглepoдa - кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. При этом потребности некоторых микроорганизмов, например ряда бактерий из семейства Pseudoтonadaceae, могут быть удовлетворены широким набором различных органических веществ, тогда как другие микроорганизмы характеризуются высокой специализацией и способностью использовать лишь немногие соединения углерода, Так, некоторые метанокисляющие бактерии используют только метан и метанол.

Вторым основным компонентом питательной среды является источник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме - в виде амино(-N) или имино(-NН)-групп. Тем не менее потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды вносят NCl или (N)S. Следует, однако, помнить, что аммонийные соли - физиологически кислые соли, так как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион соответствующей кислоты. Что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие микроорганизмов. Гидроксид аммония (NНОH) в качестве источника азота используют редко, пocкoльку он вызывает сильное подщелачивание питательных сред.

Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирования таких микроорганизмов содержат КNО или NaNО. В отличие от солей аммония нитраты - физиологически щелочные соли, так как при использовании аниона NО- в среде накапливаются катионы К+ или Na+. Нитриты в кислых условиях для многих микроорганизмов токсичны, поэтому в качестве источника азота почти не используются.

Питательные среды для культивирования микроорганизмов, более требовательных к азоту и соответственно обладающих меньшими биосинтетическими способностями, должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- или DL- форме добавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г на 100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, пролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллированной воде, фенилаланин и триптофан - в дистиллированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокислоты - в дистиллированной воде, подкисленной HCl. Аминокислоты - цистин и цистеин, а также амиды - глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин.

Потребности микроорганизмов в нескольких аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, казеин) или растительного (семена сои, подсолнечника) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолитических ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с терпкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще других используют гидролизат казеина, который готовят в лабаратории, как правило, кислотным гидролизом. Для этого 20 г казеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентрированной HSO и выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 атм. Однако при этом подвергается коррозии оборудование автоклава, поэтому чаще гидролизат казеина получают иначе. К 200 г казеина добавляют 280 мл 6н раствора НСl, и смесь кипятят с обратным холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют 50%-ным раствором NaOH до рН 7, фильтруют; через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Содержание аминного азота в гидролизате, полученном таким способом, составляет 700 - 1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в таком количестве, чтобы концентрация по аминному азоту составляла 10-30 мг на 100 мл. Следует иметь в виду, что при кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, в достаточно большой степени цистеин и незначительно серин и треонин. Имеется готовый препарат гидролизата казеина. Его вносят в среды от 0,1 до 1,0 г на 100 мл в зависимости от потребностей микроорганизмов.

Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления- пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солей и микроэлементов. Их получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного (соевая мука) происхождения. В отечественных лабораториях чаще всего используют ферментативный пептон, выпускаемый Семипалатинским заводом. Это гигроскопический порошок светло-желтого цвета, полностью растворимый в воде; 1 %-ный раствор пептона имеет нейтральную или слабокислую реакцию. В питательные среды пептон добавляют от 1-2 до 20 г на 1 л.

Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорганизмы могут использовать не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии.

Некоторые бактерии способны использовать в качестве единственного источника азота молекулярный азот - N. Это азотфиксаторы. В среды для культивирования таких микроорганизмов соединений азота можно не вносить. Снабжение азотфиксаторов газообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота.

Помимо источников углерода и азота многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокнслоты. Для того чтобы подчеркнуть потребность, микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термины «прототрофы» и «ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Этими терминами особенно широко пользуются в литературе по генетике. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин (витамин В), пантотенат Са, рибофлавин (витамин B), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, кобаламин (витамин B) - по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кислота и n-аминобензойная кислота - по 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин - 0,005 мкг на 1 мл среды.

Витамины добавляют к стерильной среде непосредственно перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать растворы, в которых концентрация витамина превышает его содержание в питательной среде в 100 раз. Paстворы готовят в стерильной посуде и используют стерильную дистилированную воду. Исключение составляют рибофлавин и фолиевая кислота. Рибофлавин растворяют в 0,02 н уксусной кислоте, а фолиевую кислоту - в 0,01 н NaOH, доводя затем концентрацию NaOH в растворе до 0,001 н. Полученные растворы стерилизуют прогреванием в кипящей водяной бане 3 мин. Раствор тиамина рекомендуется стерилизовать фильтрованием, так как при нагревании тиамин разрушается. При температуре +4 растворы витаминов сохраняются не менее месяца. Растворы фолиевой кислоты. пиридоксина и рибофлавина сохраняют в темноте, так как они светочувствительны.

Примерами смесей, содержащих факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный экстракт. Дрожжевой экстракт вносят в среду для культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автолизат - в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота составляла 5-30 мг на 100 мл среды. Дрожжевой экстракт

имеется в продаже. Дрожжевой автолизат готовят следующим образом: 40 г свежих прессованных или 10 г сухих дрожжей заливают водой и перемешивают до получения гомогенной массы, затем добавляют несколько кристаллов тимола или 1-2 мл хлороформа и выдерживают в термостате при 50-55 3 суток. За это время клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и гидролизуют белки, а также другие биополимеры. Через 3 суток полученный автолизат после тщательного перемешивания кипятят на слабом огне 20 мин и фильтруют через бумажную пульпу, используя воронку Бюхнера. Содержание аминного азота определяют формальным титрованием. Дрожжевой автолизат стерилизуют при 0,5 атм 15 мин и сохраняют в холодильнике.

Кукурузный экстракт - готовый продукт заводов крахмало-паточной промышленности. Он содержит аминокислоты, витамины, достаточно большое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт вносят в среды от 0,5 до 5 г на 10 мл; стерилизуют при 0,5 атм.

Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроорганизмам для построения веществ клетки необходимы сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других зольных элементах удовлетворяются обычно за счет минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для культивирования многих микроорганизмов может быть близким по составу. Так, потребности подавляющего большинства микроорганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп. Значительно реже встречаются микроорганизмы, требующие наличия в среде восстановленной серы. В этом случае в среду вносят сульфиды, чаще всего NaS, или органические соединения, содержащие сульфгидрильные группы, например цистеин.

Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганизмов в фосфоре. Все необходимые металлы - К, Na, Са, Mg, Fe, Мn, Co, Сu - и другие элементы микроорганизмы получают в форме катионов или анионов неорганических солей. Например, источником магния служит MgSO источником натрия и хлора - NaCl, кальция - СаСОили CaCl. Железо добавляют к средам в виде хлорида, сульфата или цитрата.

Для того чтобы избежать выпадения осадка в результате образования нерастворимых комплексов фосфатов с некоторыми катионами, особенно с железом и кальцием, к средам рекомендуется добавлять от 0,001 до 1 г/л этилендиаминтeтраацетат (ЭДТА) или гексаметафосфат натрия в концентрации 4 г/л. Комплексы, образуемые этими соединениями с катионами, служат резервом, из которого в результате диссоциации в раствор поступают свободные катионы.

Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно больших количествах, поэтому их соли, как правило, включают в состав питательных сред. Потребности микроорганизмов в марганце, молибдене, цинке, меди, кобальте очень малы. Эти элементы, часто называемые микроэлементами, вносят в среды от 1 мг дo l мкг на 1 л; более высокие концентрации могут быть токсичны. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред, которые готовятся на дистиллированной воде, их следует вносить. Об оптимальных концентрациях микроэлементов для разных микроорганизмов известно мало, поэтому предложены различные по составу смеси микроэлементов.

Смесь микроэлементов по Дрюсу (Drews, 1976), мг: ЭДТА Na-800; MnCl*4HO-10; CoCl*6HO-4; CuSO-1; NaMoO*2НО - 3;ZnCl-2; LiCl - 0,5; SnCl*2H0;- 0,5; НВО - 1, КВг-2; KJ -2; BaCl-0,5; вода дистиллированная-1000 мл; рН 6,0. На 1 л среды добавляют от 5 до 10 мл этого раствора.

Cмесь микроэлементов по Пфеннигу (Pfennig, 1965), мг: ЭДТА-500; FeSO*7 HO-200; ZnSO*7 HО-10; МnСl.4 HО-3; НВО-30; CoCl*2 HO - 20; CuCl*2 HO - 1; NiCl*6 HO - 2; NaMoO*2 HО - 3; вода дистилированная - 1000 мл. На 1 л среды добавляют от 1 до 10 мл этого раствора. Растворы микроэлементов рекомендуется стерилизовать отдельно и вносить в среду непосредственно перед ее засевом.

Питательные среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетический материал. По способу получения энергии все микроорганизмы принято делить на две основные группы: хемотрофы и фототрофы.

Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата (донора водорода) среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Первые окисляют неорганические соединения, такие как HS, S или другие не вполне окисленные соединения серы, H, NH+, NO- или Fe. Эти соединения в средах для культивирования хемолитотрофных бактерий выполняют прежде всего функцию энергетического материала. Для хемоорганотрофов энергетическим субстратом служат органические вещества, которые обычно играют двоякую роль, являясь одновременно и источником углерода и источником энергии. Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и энергетических процессов нуждаются в разных соединениях. Например, гомоферментативные молочнокислые бактерии получают энергию при сбраживании сахаров, но почти не используют их в процессах биосинтеза. Для конструктивных целей им необходимы готовые аминокислоты, пуриновые или пиримидиновые основания, витамины.

Фототрофы используют энергию света. Чтобы удовлетворить потребности этих бактерий в энергии, их культивируют при дневном или искусственном освещении.

По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.

Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, разведенная кровь, молоко, воды морей, озер и минеральных источников, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, таких как мясо, почва, навоз, различные части растений, клетки микроорганизмов.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и малопригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей. К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной практике, относятся мясо-пептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенный экстракт.

Мясо - пептонный бульон (МПБ). Основой для его приготовления служит мясная вода, которую обычно готовят следующим образом: 500 г мяса, освобожденного oт костей, жира и сухожилий, мелко нарезают или пропускают через мясорубку, заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 ч или в термостате при 30 на 6 ч, а при 37 - на 2 ч. За это время из мяса экстрагируются различные вещества, в том числе водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объёма. К мясной воде добавляют 1 % пептона и 0,5% NaCl.

МПБ - богатая питательная среда, но она почти не содержит углеводов. В случае необходимости их добавляют к МПБ чаще всего в количестве 1-2 г на 100 мл. МПБ стерилизуют при 1 атм.

Солодовое (неохмеленное пивное) сусло - хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, микроскопических грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов. Основные компоненты сусла - углеводы (до 90% от общей массы сухого остатка) и азотсодержащие соединения (до 6-7% от общей массы сухого остатка). Из углеводов в наибольшем количестве содержатся мальтоза и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимущественно группы В, органические кислоты и минеральные соли.

Сусло готовят следующим образом. 250 г размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48 - 50 и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие Полчаса температуру поднимают до 55-58 и поддерживают на этом ypовне до полного осахаривания крахмала, т. е до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через бумажную пульпу или вату. В фильтрате определяют концентрацию caхapa, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в сусле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаще всего используют 3 - 4Б сусло, для дрожжей - 6-8Б , а для наиболее требовательных молочнокислых бактерий - 8-12Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Дрожжевая среда используется в основном для культивирования ряда гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды - дрожжевая вода. Для её приготовления 70 - 100 г свежих прессованных или 7 - 10 г сухих дрожжей 30 мин кипятят в 1 л воды и после осаждения клеток дрожжей жидкость декантируют или фильтруют через вату. К фильтрату добавляют 1 л воды, ещё раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожжевой воды добавляют 1-2 г углеводов и минеральные соли, чаще всего KHPO (0,1г) и NaCl (0,5 г). Доводят pH среды до 6,8-7,2. Среду стерилизуют при 0,5 атм 20 - 30 мин.