Микробиология, понятия и характеристики

Иногда плотную среду из пробирки извлекают иначе. Пробирку слегка нагревают, всё время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным ланцетом и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Можно также вырезать их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Для получения изолированных колоний методом глубинного посева и методом разведений рекомендуется использовать осветленные питательные среды.

Когда хотят получить изолированные колонии облигатных анаэробных бактерий, характеризующихся особенно высокой чувствительностью

к кислороду (экстремальные анаэробы), используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Сущность этого метода заключается в следующем. Расплавленную агаризованную среду заражают при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя агаризованной среды в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом (рис. 53).

Рисунок 53. Изолированные колонии облигатных анаэробов в пробирках, заполненных газом (по Хангейту): 1 - агаризованная питательная среда; 2 - конденсационная вода; 3 - смесь газов Н и СО; 4 - колонии бактерий

В некоторых случаях бывает достаточно одного посева в плотную среду, чтобы получить чистую культуру. Однако чаще посев в плотную питательную среду повторяют два-три раза. В качестве посевного материала при этом используют культуру, полученную из отдельной колонии.

Выделение чистой культуры из одной клетки

Чистую культуру из одной клетки можно выделить капельным методом с помощью микроманипулятора или микроселектора.

Капельный метод Линднера используют при работе с крупными микроорганизмами: дрожжами, мицелиальными грибами, водорослями. Порядок работы следующий. Накопительную культуру разводят в стерильной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Затем на поверхность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят препарат «висячая капля». Нанесенные на покровное стекло капли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых обнаружена только одна клетка. После этого препарат помещают в термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Через 12-24 ч отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в которых наблюдается образование микроколоний, осторожно снимают с покровного стекла кусочками стерильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор (рис. 54) - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. Микроманипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлена влажная камера, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закреплены микропипетки (микропетли) , перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Микропипетки вводят во влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в висячей капле. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой.



Рисунок 54. Микроманипулятор со скользящими плоскостями конструкции Рейнерта: 1 - нижняя пластина штатива, 2 - колонка, 3 - общая подставка для микроскопа и микроманипулятора, 4, 5 - скользящая пластина с рукояткой, 6 - штатив микроманипулятора для крепления держателя микроинструментов (7)

Выделение отдельных клеток с помощью микроселектора Перфильева. Наиболее существенной частью микроселектора Перфильева является стеклянный микрокапилляр, имеющий строго прямоугольное сечение. Благодаря этому канал капилляра хорошо просматривается даже

с иммерсионным объективом. Стерильный капилляр заполняют исследуемой суспензией клеток в агаризованной питательной среде и при большом увеличении микроскопа находят участок с одной клеткой. Специальным приспособлением этот участок капилляра стерильно выбивают в приемник, из которого затем переносят в стерильную среду. Микроселектор Перфильева можно использовать для выделения как крупных, так и мелких микроорганизмов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ

Чистота выделенной культуры микроорганизмов должна быть тщательно проверена. Это осуществляется обычно несколькими способами - визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред.

Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролировать под микроскопом. Для этого следует приготовить препарат фиксированных окрашенных клеток и просмотреть его с иммерсионной системой или препарат живых клеток и просмотреть его, используя фазово - контрастное устройство. Чистая культура многих микроорганизмов, как правило, морфологически однородна; допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Однако необходимо помнить, что клетки некоторых бактерий, например, микобактерий, нокардий и др., очень полиморфны, поэтому определение частоты таких культур при микроскопировании вызывает некоторые затруднения. Чистоту культур микроорганизмов обязательно проверяют высевом на питательные среды. Прежде всего выделенную культуру высевают на плотную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний - свидетельство чистоты культуры. Обязателен посев на мясо-пептонный агар - среду, которая обеспечивает рост многих хемогетеротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний или, напротив, отсутствие роста, если данные микроорганизмы на мясо - пептонном агаре не развиваются. Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганизмов нельзя сделать только по результатам высева на МПА. Особенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также представителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганизмов проверяют высевом еще на ряд сред - сусло, мясо -пептонный бульон, картофельный агар и др. Набор сред и их состав определяются особенностями метаболизма выделенных микроорганизмов, а также их возможных спутников.

ЧАСТЬ 2. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЖИВЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: ознакомление с устройством микроскопа и приобретение навыков приготовления препаратов живых микроорганизмов.

Общие сведения

Микроскоп - это оптический прибор для получения увеличенных изображений очень малых предметов. Современными моделями биологического микроскопа являются микроскопы серии «Биолам».

Микроскоп состоит из оптической системы и механической части. Оптическая система предназначена для увеличения изображения предмета. Она включает увеличительную ( объектив и окуляр) и осветительную ( зеркало и конденсор с ирисовой диафрагмой и откидной линзой) системы.

Объектив представляет собой систему линз, заключенных в трубку. В микроскопах «Биолам» используются объективы с увеличением х3, х5, х8,х10, х20, х40, х60, х85, х90. Объективы малого увеличения применяют для предварительного просмотра препарата, объективы среднего увеличения( х20, х40,х60) - для изучения крупных клеток микроорганизмов, объективы большого увеличения (х85,х90) - иммерсионные- для изучения внутренних структур клеток. Объективы бывают сухие и погружные ( иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объективом исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает работу с ними при погружении фронтальной линзы объектива в однородную жидкую среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя.

При работе с иммерсионным объективом между покровным стеклом и линзами объектива помещают кедровое (касторовое) масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла. Лучи в оптически однородной гомогенной среде не меняют направления.

Окуляр служит для увеличения изображения, полученного от объектива.

Окуляры обычно имеют увеличение х7, х10, х15. Увеличение объектива и окуляра указано на их оправе.

Основными характеристиками объектива являются фокусное расстояние и разрешающая способность. Фокусное расстояние в отечественных микроскопах выражается в миллиметрах и, чем оно меньше, тем больше увеличение. Разрешающая способность объектива, то есть способность изображать мельчайшие детали препарата, определяется наименьшим расстоянием, при котором два близко расположенных штриха видны раздельно. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений окуляра и объектива.

Осветительное устройство состоит из зеркала и конденсора. Зеркало имеет плоскую и вогнутую отражающие поверхности. Обычно при работе зеркало повернуто к свету плоской стороной. Конденсор состоит из двух линз. Линзы собирают параллельные лучи света, отраженные от зеркала, в один пучок в плоскости исследуемого препарата. Конденсор укреплен на кронштейне и может передвигаться вверх и вниз с помощью рукоятки. На нижней части конденсора расположена ирисовая диафрагма, с помощью которой регулируют интенсивность освещения препарата.

Пучок лучей от источника света попадает на зеркало, отражается через диафрагму конденсора, проходит через нее, через исследуемый препарат и попадает в объектив. Объектив дает увеличенное изображение препарата в плоскости окуляра.

Механическая часть микроскопа состоит из основания и тубусодержателя, на котором укреплены предметный столик, кронштейн конденсора и зеркало. В верхней части расположены головка для насадки с окуляром и револьвер с объективами. Предметный столик служит для закрепления на нем исследуемого препарата.

Фокусировка осуществляется при перемещении тубуса с помощью механизма, приводимого в движение двумя винтами - макрометрическим ( грубая настройка) и микрометрическим ( тонкая настройка). Качество микроскопа определяется его увеличительной и разрешающей способностями. Теоретически микроскоп может дать увеличение 2000х раз и более. Однако следует различать полезное и бесполезное увеличение микроскопа. Пределы полезного увеличения в обычно используемых микроскопах достигают 1400х. При превышении границ полезного увеличения возникают дифракция и другие явления, обусловленные волновой природой света, которые незаметны в пределах полезного увеличения, но приводят к оптическим ошибкам в зоне бесполезных увеличений. Разрешающая способность микроскопа определяется главным образом объективом и конденсором.

Практическая часть

Знакомство с правилами работы с микроскопом

Сначала ставят объектив с малым увеличением (х8) и при этом увеличении устанавливают наилучшее освещение. Наилучшее освещение достигается при регулировке положения зеркала, конденсора и диафрагмы. При просмотре неокрашенных препаратов применяют суженную диафрагму и опущенный конденсор. При наблюдении окрашенных препаратов - открытую диафрагму и поднятый конденсор.

Затем помещают препарат на предметный столик микроскопа, под объектив, и укрепляют зажимами. Опускают объектив (х8) при помощи макрометрического винта почти до соприкосновения с предметным стеклом на расстояние около 0,5 см от предметного столика. Медленно вращают макровинт против часовой стрелки до появления четкого изображения препарата, после чего наводят резкость микрометрическим винтом, который вращают в пределах одного оборота макровинта. Повернув револьвер, устанавливают объектив со средним увеличением.

Исследование живых клеток микроорганизмов

Препараты готовят на предметных стеклах толщиной 1,2 - 1,4 мм.

Существенным моментом является подготовка поверхности предметных стекол при изготовлении препаратов. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу, а не собиралась в капельки. Наиболее надежный способ обезжиривания - обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом. В повседневной работе вполне достаточно бывает тщательно натереть сухое стекло мылом, после чего вытереть его чистой хлопчатобумажной тканью.

Живые клетки микроорганизмов исследуют методами «раздавленной» и «висячей» капли. Оба метода применяют для выявления подвижности клеток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образованием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их расположения и определения запасных веществ клетки.

В обоих случаях возможно окрашивание объекта «прижизненными» красителями - метиленовой синью или нейтральным красным в концентрациях от 0,001 до 0,0001%.

Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зрения, конденсор немного опускают, поступление света регулируют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением - объектив х8, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив х40.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, бактериологическая петля, предметные стекла, покровные стекла, спиртовки, пипетки, капельницы с водой, фильтровальная бумага.

Методика выполнения работы

Методами «раздавленная» и «висячая» капля готовят препараты крупных микроорганизмов, например дрожжей и микроскопических грибов.

Для приготовления препарата «раздавленная» капля на чистое предметное стекло нанести каплю водопроводной воды. В нее внести культуру микроскопических плесневых грибов, взятую бактериологической петлей с поверхности плесневого хлеба, смешать с водой. Накрыть каплю покровным стеклом, так чтобы под ним не образовались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижать покровное стекло к предметному и удалить избыток воды фильтровальной бумагой. Рассмотреть препарат под микроскопом.

Для микроскопирования дрожжей в химическом стакане с дистиллированной водой растворить щепотку прессованных дрожжей, помешивая стеклянной палочкой суспензию. Поместить суспензию в термостат или в водяную баню при температуре 30°С и выдержать 20 минут. На чистое предметное стекло нанести пипеткой каплю полученной дрожжевой суспензии и покровным стеклом накрыть смоченную поверхность, избыток воды убирают кусочком фильтровальной бумаги. Препарат рассматривают под микроскопом.

Препарат « висячая» капля применяют для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов. На чистое покровное стекло нанести препаровальной иглой негустую суспензию микроорганизмов, выращенных в физиологическом растворе (0,5% раствор NaCl). Покровное стекло переворачивают и помещают на стерильное предметное стекло с лункой посередине так, чтобы капля свободно свисала над лункой. Для герметичности края лунки смазывают вазелином.

Оформление работы Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму клеток дрожжей и микроскопических грибов, расположение клеток, строение грибницы и органов размножения грибов. Написать отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы

1.Что изучает морфология микроорганизмов?

2.В чем отличие прокариотой клетки от эукариотной?

3.Какое строение имеет дрожжевая клетка?

4.Какими способами размножаются дрожжи?

5.В чем отличие культурных и диких дрожжей?

6.Как происходит размножение микроскопических мицелиальных грибов?

7. Назовите признаки характерные для грибов и общие с растениями и животными.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ОКРАШЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Цель работы: приобретение навыков приготовления фиксированных окрашенных препаратов микроорганизмов.

Общие сведения

Изучение морфологии микроорганизмов в окрашенном состоянии является наиболее распространенным в микробиологии методом. Этот метод позволяет изучить морфологические особенности клеток микроорганизмов и дает возможность найти различия между ними, а иногда - точно определить изучаемый микроорганизм. Кроме того, этот метод удобен в практической работе и легко доступен благодаря простоте техники окрашивания.

Приготовление окрашенного препарата включает приготовление мазка, фиксацию мазка и окрашивание препарата.

!. Приготовление мазка. Мазок должен быть тонким, так как при этом условии он удобен для изучения микробов. Мазок можно приготовить различными способами. На чистое обезжиренное предметное стекло, например, наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее исследуемый материал с помощью прокаленной бактериологической петли. Исследуемый материал слегка растирают в капле воды, а остаток культуры в петле сжигают в пламени горелки. Остудив петлю, приступают к изготовлению мазка: сначала краем петли культуру равномерно размешивают в капле, а затем круговыми равномерными движениями распределяют каплю на площади, составляющей примерно 1/3 предметного стекла. Затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или слабо нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется, так как белки коагулируют, искажая структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют.

2. Фиксация мазка. Под фиксацией подразумевают такую обработку живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в нем, сохранив тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация нужна в случае работы с патогенными микроорганизмами для безопасности.

Существует несколько способов фиксации. Наиболее простым и самым распространенным в микробиологии является фиксация над пламенем горелки. В ряде случаев фиксация жаром оказывается слишком грубой. Тогда прибегают к фиксации препарата при помощи химических соединений. При этом фиксатор наливают на мазок или препарат погружают в сосуд с фиксирующей жидкостью на определенное время, а затем высушивают. Используют следующие фиксирующие жидкости метиловый спирт (2-3 минуты), этиловый спирт (10-15 минут), ацетон (5 минут), смесь равных объемов этилового спирта и эфира - по Никифорову (15 минут). Можно применять для фиксации также хромовые соединения, формалин, пары осмиевой кислоты ( несколько секунд).

3. Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания меняется от 1 до 5 минут, в отдельных случаях до 3 минут и дольше. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют. Окрашивание препаратов микробов не является механическим процессом проникновения краски в микробную клетку. Механизм окраски следует рассматривать как процесс физико-химический. Соединение протопласта микробной клетки с красителем является в большинстве случаев весьма прочным, не поддается разрушению или простому вымыванию водой. В ряде случаев различные составные части клетки избирательно окрашиваются различными красящими растворами.

Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основные красители. Первые вступают в реакцию с веществами основной, вторые - кислотной природы. Поскольку в белках есть основные группы (NH₂^Ї) и кислотные (COOHЇ) радикалы, клеточные структуры хорошо окрашиваются и теми и другими красителями.

Из основных красителей наиболее часто в микробиологии применяют: красные - нейтральный красный, сафранин, фуксин, синие - мителеновая синь, фиолетовые - генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, зеленые - метиленовый зеленый, малахитовый зеленый, коричневые - везувин, хризоидин, черные - индулин. Кислые красители могут быть следующие: красные и розовые - кислый фуксин, эритрозин, черные - нигрозин, желтые - конго, флуоресцин.

Практическая часть

Существуют простые и дифференцированные способы окраски фиксированных препаратов микроорганизмов. При простой окраске используется какой либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. Прокрашивается вся клетка.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы с растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки на 1 мл, спиртовки.

Методика выполнения работы. Для изучения морфологии бактерий приготовить окрашенные фиксированные препараты из кефира, йогурта и мясопродуктов.

При приготовлении мазки из кефира и йогурта материал прокаленной петлей нанести на середину предметного стекла. К капле придвинуть под углом 45° другое предметное стекло. Тотчас же, плотно прижимая это стекло в том же положении под углом, продвинуть его налево по предметному стеклу с исследуемым материалом. Получается равномерно распределенный по поверхности стекла мазок. Мазок высушить на воздухе. Затем зафиксировать в пламени спиртовки. Препарат захватить пинцетом и три - четыре раза медленно провести нижней стороной над пламенем (на границе светлой и темной его части). Окраску препарата провести с помощью метиленового синего. Количество краски должно покрыть всю поверхность мазка. Окраска проводится в течение 3 - 5 минут. По истечении срока окрашивания лишнюю краску слить с препарата и промыть его легкой струей водопроводной воды. Оставшуюся на стекле воду осторожно удалить фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен быть абсолютно сухим.

При приготовлении препарата из мясопродуктов кусочек мяса, колбасы, печени осторожно захватить стерильным пинцетом и слегка надавить им на чистое предметное стекло, стараясь не сдвинуть в сторону (препарат «отпечаток»). Мазок высушить на воздухе и зафиксировать в пламени спиртовки также, как и в предыдущем случае. Окраску препарата провести с помощью фуксина. Количество краски должно покрыть всю поверхность мазка. Окраска проводится в течение 1 - 2 минут. По истечении срока окрашивания лишнюю краску слить и промыть препарат легкой струей водопроводной воды. Оставшуюся на стекле воду осторожно удалить фильтровальной бумагой.

Приготовленные препараты поместить на предметный столик микроскопа и, пользуясь объективом х8, установить свет. Затем в центр препарата на мазок нанести каплю иммерсионного масла и заменить сухую систему иммерсионной (объектив х90). С помощью макрометрического винта опустить тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Пользуясь микрометрическим винтом, поднять тубус и, наблюдая в окуляр, найти появление изображения. Если изображение нерезкое, тусклое или плывет, что-то сделано неправильно : загрязнена фронтальная линза объектива, мешают пузырьки воздуха в масле, случайно закрыта диафрагма, сдвинуто зеркало. Причину некачественного изображения необходимо устранить.

По окончании микроскопирования поднять тубус, снять препарат и осторожно протереть фронтальную линзу объектива сухой хлопчатобумажной салфеткой. Загрязнение фронтальной линзы объектива можно устранить протерев ее салфеткой смоченной очищенным бензином или ксилолом.

Погружать в иммерсионную жидкость можно только иммерсионные объективы (не сухие)!

Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Написать отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы.

1. Какую форму и размеры клеток могут иметь бактерии?

2. Какое строение имеет бактериальная клетка?

3. Как размножаются бактерии?

Рекомендуемая литература

[1] c.33-43, [2] c.18-41

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ И НЕГАТИВНЫЕ СПОСОБЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ

Цель работы: приобретение навыков применения дифференцированных и негативных методов окраски препаратов микроорганизмов.

Общие сведения Сложные или дифференцированные способы окраски микроорганизмов основаны на особенностях физико-химичекого строения клетки. Они применяются для детального изучения клеточных структур и для характеристики и дифференциации данного микроорганизма. При дифференциальной окраске применяют несколько красителей. Наибольшее практическое значение в микробиологической практике имеют окраска по Грамму и по Циль-Нильсену.

Красители делят на позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают клетки (при комнатной температуре в течение 30-60 секунд), негативные - пространство, окружающее микроорганизмы. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

Некоторые микроорганизмы (спирохеты) и отдельные структуры (внеклеточная слизь, капсулы), плохо выявляемые при помощи позитивных красителей, становятся хорошо заметными при окрашивании препаратов негативными красителями. Споры без соответствующей обработки не окрашиваются, поэтому при окрашивании бацилл позитивными красителями они окрашиваются как бы негативным способом и имеют вид преломляющих свет включений в вегетативных клетках.

Практическая часть.

Окраска микроорганизмов по Грамму. Этот метод дифференциации микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем. У других видов это соединение неустойчиво и после обработки спиртом растворяется. Микроорганизмы первой группы относят к грамположительным, а второй - к грамотрицательным. Окраска по Грамму является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий.

Как правило, по Грамму окрашиваются клетки молодых, чаще всего суточных культур, так как способность удерживать красители зависит от физиологического состояния бактерий.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы с растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки.

Методика выполнения работы На хорошо обезжиренное предметное стекло нанести тонкий мазок исследуемого метериала (Bacillus mesentericus, Lactococcus lactis). Мазок высушить на воздухе, зафиксировать над пламенем спиртовки и окрасить в течение 1 минуты феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклонном положении. Слить краситель и, не промывая препарат водой, нанести на него раствор Люголя на 1 минуту (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае держать в наклонном положении. Слить раствор Люголя и, не промывая водой, обработать, непрерывно покачивая, 96% спиртом в течение 15 - 20 секунд. Время воздействия спирта очень существенно, так как при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат оказывается перекрашенным. Промыть водой препарат и окрасить фуксином Пфейфера в течение 1 минуты. Слить избыток краски и промыть водой. Высушить препарат фильтровальной бумагой и исследовать с иммерсионной системой. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные приобретают розовую окраску.

Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Отметить грамположительные и грамотрицательные бактерии. Написать отчет о проделанной работе.

Выявление кислотоустойчивости у бактерий. Кислотоустойчивость - свойство характерное для микобактерий, нокардий и некоторых актиномицетов. Оно связано с особенностями химического состава клеточных стенок, главным образом с наличием в них сложных липидов и миколовых кислот. Это свойство заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой.

Наибольшее распространение получил способ выявления кислотоустойчивости по Циль-Нильсену.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы с растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки, 5% раствор серной кислоты..

Методика выполнения работы На фиксированный приготовленный обычным способом мазок поместить полоску фильтровальной бумаги, обильно смочить бумагу карболовым фуксином Циля и нагреть препарат над пламенем 5 минут. Не допускать высыхания препарата, при необходимости в него добавить одну - две капли воды. Не доводить также краситель до кипения. Как только появятся пары, препарат отвести в сторону.

По окончании окрашивания и охлаждения препарата бумагу удалить, а мазок промыть слабой струей водопроводной воды до исчезновения краски в стоке. Затем препарат промокнуть фильтровальной бумагой и погрузить на 3 - 5 секунд в 5% раствор серной кислоты. Снова промыть водой, промокнуть бумагой и окрасить в течение 3 - 5 минут метиленовым синим Леффлера. Препарат тщательно промыть водой, высушить и исследовать с иммерсионной системой.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, а некислотоустойчивые - в синий.

Оформление работы Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Отметить кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии. Написать отчет о проделанной работе.

Негативный способ окраски препаратов При этом способе окраски исследуют микроорганизмы в неокрашенном виде, в то время как фон препарата окрашен каким-либо веществом, которое при приготовлении мазка распределяется на стекле вокруг микробных клеток. На окрашенном фоне микробные клетки выделяются ярко обрисованными контурами. Один из наиболее распространенных способов негативной окраски - способ Бурри.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы раствором черной туши, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки.

Методика выполнения работы Каплю туши поместить на хорошо обезжиренное предметное стекло , рядом с ней наносят каплю воды и в нее поместить прокаленной бактериологической петлей флору зубного налета. Обе капли быстро и тщательно перемешать . Из полученной смешанной капли приготовить мазок таким же способом, как из кефира и йогурта. Когда мазок высохнет, на него нанести каплю иммерсионного масла и рассмотреть с иммерсионной системой микроскопа. Микробные клетки обнаруживаются в виде ярко освещенных телец на темном фоне.

При негативном способе окраски микроорганизмы остаются в препаратах в живом виде (препарат не подвергается фиксации).

Оформление работы Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради форму и сочетание микробных клеток. Написать отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы

1. В каких случаях применяют дифференцированные способы окраски бактерий?

2. Чем отличается строение и состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий?

3. Какие свойства бактерий связывают с их принадлежностью к группам грамотрицательных и грамположительных?

4. На чем основан способ негативной окраски микроорганизмов?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4 ВЫЯВЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУР И ВКЛЮЧЕНИЙ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: приобретение навыков выявления некоторых структур и включений в клетках микроорганизмов.

Общие сведения Клетки многих микроорганизмов могут быть окружены капсулой или слизью. Эти структуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании живых клеток. Для выявления капсул применяют способ негативной окраски с помощью жидкой туши.

Многие микроорганизмы в определенных условиях образуют запасные вещества, которые обнаруживаются в клетке в виде гранулярных цитоплазматических включений. Природа запасных веществ различна. Чаще всего это полисахариды, липиды, полифосфаты. Некоторые бактерии накапливают в клетках серу. Запасные вещества выявляются в клетках разного возраста, используя те или иные микрохимические реакции.

Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают более высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представляют собой округлее, овальные или эллипсовидные образования. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это большой плотностью оболочки, низкой концентрацией свободной воды в ней и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах окрашенных простыми способами или по Грамму, споры остаются бесцветными. В случае выявления у микроорганизма способности к спорообразованию необходимо обратить внимание на тип спорообразования, расположение споры в клетке, форму свободных спор и определить их размеры. С этой целью просматривают клетки 2 - 3 суточной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий проходят за этот период времени все стадии развития - от вегетативной клетки до свободной споры. Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения на фоне споры.

Практическая часть

Окраска включений клеток микроорганизмов. Запасные вещества в клетках микроорганизмов (включения) могут быть представлены гранулами полисахаридов. В клетках дрожжей накаливаются включения гликогена. Для обогащения дрожжевых клеток гликогеном их выращивают на солодовой среде. Углевод гранулеза (крахмалоподобное вещество) накапливается в клетках маслянокислых бактерий. Объектом исследования может служить накопительная культура маслянокислых бактерий. Ее получают следующим образом на трое-четверо суток до занятия в пробирки помещают мелко нарезанный неочищенный картофель (1/3 пробирки), на кончике ножа вносят мел и доливают до верху водопроводной водой. Пробирки помещают на водяную баню при 70° С нагревают 10 минут, затем охлаждают и ставят в термостат при 30° С.

Запасное вещество микроорганизмов может быть представлено также полифосфатами - валютином. Валютин представляет собой запасное фосфор- и азотсодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты. Характерное его свойство - сродство к основным красителям и метахромазия, то есть способность приобретать иной цвет, чем цвет окрашиваемого вещества. В клетках прокариот валютин локализован в цитоплазме, в клетках эукариот - в вакуолях.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки, 1% раствор серной кислоты.

Методика выполнения работы Окраска гранул. К капле суспензии дрожжей на предметном стекле добавить каплю раствора Люголя. Препарат покрыть покровным стеклом и микроскопировать с сухими объективами х8, х40. Гранулы крахмалоподобных веществ окрашиваются в синий цвет, а гранулы гликогеноподобных - в красновато-коричневый.

Окраска валютина и метахроматина.

Для выявления валютина у дрожжей применяют следующий способ. Фиксированный в пламени спиртовки мазок окрасить метиленовым синим в течение 3 минут. Краситель слить, препарат промыть водой и не высушивая, нанести на мазок небольшую каплю 1% раствора серной кислоты. Мазок покрыть покровным стеклом и микроскопировать с сухими объективами х8, х40.

Для выявления валютина у бактерий используют метод Омелянского. Приготовить тонкий мазок клеток, высушить его на воздухе, зафиксировать в пламени спиртовки. На фиксированный мазок налить карболовый фуксин и окрашивать клетки в течение 1 минуты. Краску слить, промыть препарат водой и обесцветить 1% раствором серной кислоты в течение 20 - 30 секунд. Затем кислоту слить, препарат промыть водой и дополнительно окрасить 30 секунд метиленовым синим. Снова промыть водой, высушить и микроскопировать с иммерсионной системой. Гранулы валютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради включения полисахаридов и валютина в микробных клетках. Написать отчет о проделанной работе.

Окраска спор у бактерий. В связи с особенностями физико-химического состава и плотной малопроницаемой оболочки для окраски спор применяют сначала химические вещества, меняющие структуру оболочки. Однако при последующем прокрашивании споры одновременно прокрашивается и цитоплазма клетки, поэтому под микроскопом последняя выглядит однородно окрашенной. Чтобы добиться прокраски только споры, следует такой «перекрашенный» препарат частично обесцветить, отнимая краситель у цитоплазмы и оставляя его в споре. Это легко достигается, так как краситель, адсорбированный спорой, удерживается прочнее, чем адсорбированный цитоплазмой клетки. Поэтому все способы окраски спор основаны на едином принципе. Сначала споры протравливают разными веществами (хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода), затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и обесцвечивают цитоплазму, а потом дополнительно окрашивают ее контрастным красителем.

Приборы, реактивы, посуда: микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, фильтровальная бумага, капельница с водой, капельницы растворами красителей, иммерсионное масло, стерильные пипетки, спиртовки, 1% раствор серной кислоты, 5% раствор хромовой кислоты.

Методика выполнения работы Метод Циля-Нильсена в модификации Мюллера. До фиксации мазка на пламени препарат готовят обычным способом. Далее на фиксированный и остывший препарат нанести 5% раствор хромовой кислоты. Через 5 - 10 минут кислоту смыть водой. Препарат покрыть полоской фильтровальной бумаги, обильно смочить бумагу карболовым фуксином Циля. Подогреть препарат в пламени спиртовки до появления паров (не до кипения), отвести в сторону и добавить новую порцию красителя. Так в течение 7 минут. При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения бумагу снять, препарат промыть водой и тщательно промокнуть фильтровальной бумагой. Далее провести обесцвечивание цитоплазмы клеток, обработать препарат 1% раствором соляной или серной кислоты 16 -18 секунд для бактерий Bacillus mesentericus. При превышении этого времени может обесцветиться и спора.

Оформление работы. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать в тетради споры бактерий. Написать отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы.

1. Как происходит образование спор у бактерий?

2. Чем вызвано образование спор у бактерий?

3. Какие типы спорообразования вам известны?

Рекомендуемая литература

[1] c.44-61,[2] c.62-71

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: приобретение навыков приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Общие сведения

При составлении питательных сред необходимо учитывать потребность микроорганизмов в элементах питания. По составу среды подразделяют на естественные (натуральные) и синтетические.

Состав натуральных сред очень сложен и непостоянен, существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

Синтетические среды содержат в своем составе известные химически чистые вещества в строго указанных концентрациях. Синтетические среды широко используются для исследований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

Существуют также полусинтетические среды, относящиеся к средам с неопределенным химическим составом. В них на ряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Эти среды широко используются в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Практическая часть

Приборы, реактивы, посуда: йодный раствор (1 г йодистого калия растворить в 5 мл воды, к полученному раствору добавить 1 г йода и довести объем смеси дистиллированной водой до 300 мл), колбы для приготовления сред, стеклянные палочки, набор минеральных солей, глюкоза, пептон , желчь, водяная баня, весы, шпатель, термометр, фарфоровая чашка, пипетка, сахариметр, бумажные фильтры, агар-агар, полотно, вата.

Методика выполнения работы Приготовление картофельной среды. Нарезать в химический стакан на 150 мл ломтиками 20 г очищенного, промытого водой картофеля, залить 100 мл водопроводной воды, варить 30 минут. Отвар фильтровать через бумажный фильтр и добавить воду до первоначального объема. К полученной жидкости добавить 2 г агар-агара, кипятить до его растворения и установить нейтральную реакцию среды (рН 7). Среду стерилизуют 20 минут при 1 атм.

Приготовление сусла. Зерно ячменя замачить в холодной воде и прорастить при 35°С . После того, как ростки станут вдвое больше, чем длина зерна, зерно высушивают до воздушно-сухого состояния и получают солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и 250 г его берут на 1 л воды. Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57°С до прекращения окрашивания раствора при добавлении йодного раствора (йодная проба на содержание крахмала). Пробы на содержание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.

Сусло процедить через полотно, полученный фильтрат нагреть до кипения и кипятить 5 - 10 минут, затем фильтровать через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10 - 20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавить водой до концентрации сахара 6 - 8% и стерилизовать при 115°С и давлении 0,5 атм. 30 минут.

Приготовление сусло-агара. К приготовленному суслу добавить 2% агара, кипятить до расплавления агара, фильтровать через полотно и стерилизовать таким же способом, как сусло.

Приготовление молочно-солевого агара. Мерным цилиндром отмерить 100 мл 2% стерильного агара, содержащего 6,5% хлорида натрия. Добавить к нему 10 мл обезжиренного стерильного молока.

Приготовление среды Кесслера. Отмерить 1 л водопроводной воды, прибавить 10 г пептона и 50 мл желчи. Смесь прокипятить при помешивании в течение 20 - 30 минут на водяной бане. Затем профильтровать через слой ваты. В полученном фильтрате растворить 2,5 г глюкозы и довести объем до 1 л, рН среды довести до значения 7,4 - 7,6. Добавить 2 мл 1% водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разлить в прбирки с поплавками и стерилизовать при давлении 0,1 атм. В течение 10 минут.Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Приготовление дрожжевых сред.

Дрожжевой экстракт. 100 г прессованных дрожжей развести в 100 мл воды, смесь кипятить 1 ч, трижды фильтровать через бумажный фильтр и стерилизовать 30 минут при 115°С.

Дрожжевая вода. 5 г сухих дрожжей размешать в 100 мл воды , кипятить 10 минут, фильтровать через бумажный фильтр и стерилизовать по 30 минут текучим паром ежедневно в течение 3 суток.

Приготовление среды Чапека. Взять навески 2 г глюкозы, 0,2 г NaNO₃, 0,1 г K₂HPO₄, 0,05 г MgSO₄, 0,05 г KCL, 0,01 г FeSO₄, вода дистиллированная 100 мл.

Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы

1. Что такое питательная среда и для чего она предназначена?

2. На какие группы делятся питательные среды?

3. На какие группы делятся микроорганизмы в зависимости от типа питания?

4. Как питательные вещества попадают в клетку?

Рекомендуемая литература

[1]c.61-75,[2]c.106-114

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: приобретение навыков культивирования микроорганизмов.

Общие сведения С.Н. Виноградским в практику микробиологии введены элективные (избирательные) среды, предназначенные для определенных групп микроорганизмов. Такие среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы родственных микроорганизмов и менее пригодны или совсем непригодны для развития других.

Зная физиологические особенности соответствующей группы микробов, можно подобрать такие условия культивирования (состав, активную кислотность среды, условия аэрации, температуру и так далее), при которых будут развиваться лишь представители данной группы. Элективные среды позволяют вести биологические процессы в лаборатории и на производстве без предварительной стерилизации среды. Эти среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания и получения накопительных культур. Понятие «элективные среды» входит в более широкое понятие «элективные условия».

Дифференциально-диагностические среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления бактерий из группы кишечной палочки в естественных субстратах может служить агаризованная среда Эндо.

Практическая часть Среда Эндо имеет следующий состав, г: пептон - 10, лактоза - 10, K₂HPO₄ - 3,5, NaHSO₃ - 2,5, агар - 150, вода дистиллированная - 1000, рН 7,4. К среде добавляется 4 мл 10% спиртового раствора основного фуксина. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском.

При определении видовой принадлежности бактерий используют рН-индикаторные среды, в состав которых входит один из индикаторов - нейтральный красный (0,0005%), феноловый красный (0,005%) , бромтимоловый синий (0,0005%). Если развитие микроорганизма сопровождается образованием кислоты или щелочи, цвет индикатора изменяется. Дифференциально-диагностические среды особенно широко применяют в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

Приборы, реактивы, посуда: колбы для приготовления сред, химические стаканы на 100 мл, стеклянные шпатель, термометр, пипетка, бумажные фильтры, набор минеральных солей, глюкоза, среда Эндо в порошке, бактериологические петли.

Методика выполнения работы Приготовление глюкозо-аммонийной среды для культивирования дрожжей. В колбе на 100 мл приготовить среду следующего состава, г: глюкоза - 2,0, (NH₄)₂SO₄ - 0,5, KH₂PO₄ - 0,08, K₂HPO₄ - 0,02, MgSO₄ - 0,05, NaCl - 0,01, CaCl₂ - 0,01, вода водопроводная - 100 мл.

Приготовление среды Эндо. Среду приготовить в химическом стакане на 100 мл по прописи указанной на этикетке. После охлаждения среды до 50°С разлить в чашки Петри.

После приготовления питательных сред произвести посев микроорганизмов на эти среды.

Посев на плотные среды. Самым частым методом посева культуры микроорганизмов является посев на чашку Петри с агаризованной средой. Посев культуры осуществляется одним из трех способов:

· посев чертой - проводят петлю по прямой линии по середине питательной среды,

· посев штрихом - проводят зигзагообразную линию скользя петлей по поверхности среды от одного края чашки Петри к другому,

· сплошной посев - растирают материал непрерывными круговыми движениями по всей поверхности питательной среды.

Посев проводят непосредственно около зажженной горелки, в пламени которой стерилизуется петля. Быстро переносят петлю с взятым материалом в чашку Петри с питательной средой приоткрыв крышку. Затем закрывают крышку чашки Петри, а петлю тщательно прокаливают на пламени и ставят в штатив. Записанную чашку Петри подписывают, указав название посевного материала и дату посева. После этого ставят чашку Петри в термостат крышкой вниз.

При посеве на плотные среды нужно следить, чтобы не поцарапать среду петлей.

Техника посева на жидкие среды в основном такая же. Отличительные особенности посева на жидкие среды:

· недопустимо, чтобы жидкость питательной среды выливалась при горизонтальном положении пробирки,

· нужно следить, чтобы жидкость не смачивала краев пробирок и ватных пробок,

· при посеве жидкого материала можно пользоваться петлей или стерильной пипеткой.

Оформление работы. Написать отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы

1. Что такое элективные питательные среды?

2. Для чего предназначены дифференциально-диагностические и элективные среды?

3. Каким образом можно создать элективные условия для культивирования микроорганизмов?

Рекомендуемая литература

[1] c.61-75, [2] c.106-114

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7 ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: приобретение навыков получения накопительной культуры микроорганизмов.

Общие сведения При изучении физиолого-биохимических особенностей и цикла развития микроорганизмов, а также для установления их видовой принадлежности необходимо работать с чистой культурой микробов.

Выделение чистой культуры включает три этапа: получение накопительной культуры, выделение чистой культуры, определение ее чистоты.

Для получения накопительной культуры определенного вида бактерий сначала подбирают элективные условия среды, предложенные Виноградским С.Н. , обеспечивающие преимущественное развитие данных бактерий. Затем из мест обитания, в которых преобладают представители данной группы, делают посев на соответствующую элективную среду.

...