Основы молекулярной биологии и генной инженерии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лекции 1-2. Введение в курс. Предмет и методы исследования. Этапы развития молекулярной биологии и генной инженерии. Структура биополимеров

Определение предмета молекулярная биология

После атомной бомбежки Хиросимы и Нагасаки в 1945г. началось бегство ученых из физики, а в 1947г. Нобелевский лауреат физик Эрвин Шредингер написал книгу "Что такое жизнь с точки зрения физика?", которая привлекла в биологию многих физиков и математиков.

Определение: Mолекулярная биология - это наука о механизмах хранения, воспроизведения, передачи и реализации генетической информации, о структуре и функциях нерегулярных биополимеров - нуклеиновых кислот и белков.

Начав с изучения биологических процессов на молекулярно-атомном уровне, молекулярная биология перешла к сложным надмолекулярным клеточным структурам, а в настоящее время успешно решает проблемы генетики, физиологии, эволюции и экологии.

Основные этапы развития молекулярной биологии

1. Романтический период 1935-1944гг.

Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия занимались изучением репродукции фагов и вирусов, представляющих собой комплексы нуклеиновых кислот с белками

В 1940г. Джордж Бидл и Эдуард Татум сформулировали гипотезу - "Один ген - один фермент". Однако, что такое ген в физико-химическом плане тогда еще не знали.

2. Второй романтический период 1944-1953гг.

Была доказана генетическая роль ДНК. В 1953 г. появилась модель двойной спирали ДНК, за которую ее создатели Джеймс Уотсон, Френсис Крик и Морис Уилкинс были удостоены Нобелевской премии.

3. Догматический период 1953-1962гг.

Сформулирована центральная догма молекулярной биологии:

Перенос генетической информации идет в направлении

В 1962 г. был расшифрован генетический код.

4. Академический период с 1962г. по настоящее время, в котором с 1974 года выделяют генно-инженерный подпериод.

Основные открытия

1944г.	Доказательство генетической роли ДНК. Освальд Эйвери, Колин Мак-Леод, Маклин Мак-Карти
1953г.	Установление структуры ДНК. Джеймс Уотсон, Френсис Крик
1961г.	Открытие генетической регуляции синтеза ферментов. Андре Львов, Франсуа Жакоб, Жак Моно
1962г.	Расшифровка генетического кода Маршалл Нирнберг, Генрих Маттеи, Северо Очоа
1967г.	Синтез in vitro биологически активной ДНК. Артур Корнберг (неформальный лидер молекулярной биологии)
1970г.	Химический синтез гена. Гобинд Корана
1970г.	Открытие фермента обратной транскриптазы и явления обратной транскрипции. Говард Темин, Дэвид Балтимор, Ренато Дульбеко
1974г.	Открытие рестриктаз. Гамильтон Смит, Даниэль Натанс, Вернер Арбер
1978г.	Открытие сплайсинга. Филипп Шарп
1982г.	Открытие автосплайсинга " Томас Чек

Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот

• 1928г. Опыты Фредерика Гриффита.

Гриффит работал с пневмококками - бактериями, вызывающими пневмонию. Он брал два штамма пневмококков: капсульный и бескапсульный. Капсульный - патогенный (вирулентный), при инфицировании таким штаммом мыши погибают, бескапсульный - непатогенный. При введении мышам смеси убитых нагреванием (и, следовательно, потерявших вирулентность) капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных бактерий, животные погибали в результате размножения капсульных вирулентных форм. Обнаруженное явление Гриффит интерпретировал как трансформацию. Бескапсульные невирулентные пневмококки приобрели некоторые свойства убитых капсульных бактерий. Произошла трансформация. Определение: Трансформация - это приобретение одним организмом некоторых признаков другого организма за счет захвата части его генетической информации.

В 1944г. этот эксперимент был повторен Освальдом Эйвери, Колином Мак-Леодом и Маклином Мак-Карти в варианте смешивания бескапсульных пневмококков с взятыми от капсульных белками, полисахаридами или ДНК. В результате этого эксперимента была выявлена природа трансформирующего фактора.

Трансформирующим фактором оказалась ДНК.

2. 1952г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз.

Фаги (бактериофаги) - это вирусы, размножающиеся в бактериях.

E. сoli - кишечная палочка (эубактерия).

Суть опыта: фаги, у которых белковая оболочка была мечена радиоактивной серой (S³⁵), а ДНК - радиоактивным фосфором (Р³²), инкубировали с бактериями. Затем бактерии отмывали. В смывных водах не обнаруживали Р³², а в бактериях - S³⁵ Следовательно, внутрь попала только ДНК. Через несколько минут из бактерии выходили десятки полноценных фагов, содержащих и белковую оболочку, и ДНК. Отсюда следовал однозначный вывод о том, что именно ДНК выполняет генетическую функцию - несет информацию как о создании новых копий ДНК, так и о синтезе фаговых белков.

3. 1957г. Опыты Френкеля - Конрата

Френкель-Конрат работал с вирусом табачной мозаики (ВТМ). В этом вирусе содержится РНК, а не ДНК. Было известно, что разные штаммы вируса вызывают разную картину поражения листьев табака. После смены белковой оболочки "переодетые" вирусы вызывали картину поражения, характерную для того штамма, чья РНК была покрыта чужим белком. Следовательно, не только ДНК, но и РНК может служить носителем генетической информации.

На сегодняшний день существуют сотни тысяч доказательств генетической роли нуклеиновых кислот. Приведенные три являются классическими.

Структура нуклеиновых кислот

У эукариотических организмов ДНК локализована преимущественно в ядрах клеток; у прокариот она образует довольно компактный нуклеоид, в котором содержится вся хромосома бактериальной клетки. Такие клеточные органеллы, как митохондрии и хлоро- пласты, имеют свою собственную ДНК- Кроме того, в цитоплазме многих прокариот и низших эукариот обнаруживаются внехромо- сомные ДНК -- плазмиды.

Рибосомные, транспортные и информационные РНК локализованы и функционируют в цитоплазме про- и эукариотических клеток. У эукариот они синтезируются в клеточном ядре, где и обнаруживаются их предшественники. Кроме того, в ядрах и цитоплазме клеток имеется множество так называемых малых РНК-

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексе с белками (т. е. в виде нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол -- вода в присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом.

Среди множества методов фракционирования нуклеиновых кислот отметим здесь электрофорез в гелях, высокая разрешающая способность которого позволяет получить любую ДНК или РНК в индивидуальном состоянии.

Нуклеиновые кислоты являются нерегулярными полимерами, мономеры которых - нуклеотиды.

1. Нерегулярность. Существует регулярный сахарофосфатный остов, к которому присоединены азотистые основания. Их чередование нерегулярно. 2. Антипараллельность. ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, ориентированных антипараллельно. 3`-конец одной расположен напротив 5`-конца другой. 3. Комплементарность (дополнительность). Каждому азотистому основанию одной цепи соответствует строго определенное азотистое основание другой цепи. Соответствие задается химией. Пурин и пиримидин в паре образуют водородные связи. В паре A-Т две водородные связи, в паре Г-Ц - три. 4. Наличие регулярной вторичной структуры. Две комплементарные, антипараллельно расположенные полинуклеотидные цепи образуют правые спирали с общей осью.

Формы двойной спирали ДНК

В основной - В-форме на виток приходится 10 комплементарных пар. Плоскости азотистых оснований перпендикулярны оси спирали. Соседние комплементарные пары повернуты друг относительно друга на 36. Диаметр спирали 20Е, причем пуриновый нуклеотид занимает 12Е, а пиримидиновый - 8Е. А-форма - 11 пар азотистых оснований на виток. Плоскости азотистых оснований отклонены от нормали к оси спирали на 20. Отсюда следует наличие внутренней пустоты диаметром 5Е. Высота витка 28Е. Такие же параметры у гибрида из одной цепи ДНК и одной цепи РНК.

Существуют несколько форм двойной спирали ДНК.

С-форма - шаг спирали 31Е, 9.3 пар оснований на виток, угол наклона к перпендикуляру 6.

Все три формы - правозакрученные спирали.

Есть еще несколько форм правых спиралей и всего одна левая спираль (Z -форма). Высота витка в Z-форме -44.5 Е, на виток приходится 12 пар нуклеотидов. Ни А-, ни Z- формы не могут существовать в водном растворе без дополнительных воздействий (белки или суперспирализация).

Функции ДНК

1. ДНК является носителем генетической информации.

Функция обеспечивается фактом существования генетического кода.

2. Воспроизведение и передача генетической информации в поколениях клеток и организмов.

Функция обеспечивается процессом репликации.

3. Реализация генетической информации в виде белков, а также любых других соединений, образующихся с помощью белков-ферментов.

Функция обеспечивается процессами транскрипции и трансляции.

Аминокислоты

В природе существуют две формы стереоизомеров: L (левовращающие) и D (правовращающие). Помимо L - аминокислот, входящих в белки, в организме есть и D-аминокислоты, которые в белки не включаются.

Общая формула аминокислоты показана на рисунке.

	Она верна для 19 из 20 аминокислот, встречающихся в белках. В состав белков, кроме этих 19 аминокислот, входит одна иминокислота - пролин. Во всех аминокислотах имеется -аминогруппа. Отсюда и название - "- аминокислоты". В пролине - -иминогруппа.

Классификация аминокислот, входящих в состав белков, по принципу полярности (неполярности) радикала

1. Неполярные или гидрофобные радикалы.

Алифатические - аланин, валин, лейцин, изолейцин.

Серусодержащий метионин.

Ароматические - фенилаланин, триптофан.

Иминокислота пролин.

2. Полярные, но незаряженные радикалы.

Глицин.

Оксиаминокислоты - серин, треонин, тирозин.

Содержащий сульфгидрильную группу цистеин.

Содержащие амидную группу: аспарагин, глутамин.

3. Отрицательно заряженные радикалы.

Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота.

4. Положительно заряженные радикалы.

Лизин, аргинин, гистидин.

Первичная структура белка

Определение: первичная структура белка - это последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи.

Аминокислоты соединяются в полипептид с помощью ковалентных пептидных (амидных) связей.

У трипептида, состоящего из трех разных аминокислот, возможно 3! = 6 различных первичных структур.

У олигопептида, состоящего из двадцати разных аминокислот, разнообразие первичных структур 20!, это ? 2х10¹⁸.

Разнообразие первичных структур среднего по размеру белка (примерно 500 аминокислот) составляет уже ? 20⁵⁰⁰ вариантов (если все аминокислоты представлены в эквимолярных соотношениях).

На Земле не было, нет и не будет двух людей с полностью одинаковым набором белков.

Вторичная структура белка

Определение: Вторичная структура белка - это упорядоченное строение полипептидных цепей, обусловленное водородными связями между группами С=О и N-H разных аминокислот.

	Вторичная структура может быть регулярной - спиралью и нерегулярной -складчатой структурой. В -спирали NH группа n-ого аминокислотного остатка взаимодействует с С=О группой (n-4)-ого аминокислотного остатка. На один виток -спирали с диаметром 10.1 A приходится 3,6 аминокислотных остатков. Период идентичности регулярной -спирали - 18 аминокислот (5 витков). Нарушителем регулярной a-спирали в первую очередь является пролин. Второе по значению влияние оказывают одинаково заряженные, рядом расположенные радикалы.

	-складки могут образовывать не только одиночные, но и рядом расположенные полипептиды, входящие в один белок.

Чистых природных альфа - или бета - белков не существует.

Третичная структура белка

Определение: третичная структура белка - это пространственная конформация полипептида, имеющего вторичную структуру, и обусловленная взаимодействиями между радикалами.

Существует четыре типа взаимодействий между радикалами:

• Ковалентные связи между остатками двух цистеинов(дисульфидные мостики).

• 2. Ионные (электростатические) взаимодействия между противоположно заряженными аминокислотными остатками (три радикала со знаком "+" и два со знаком "-").

• Например, положительно заряженная е-аминогруппа лизина (-NH₃+ ) притягивается отрицательно заряженной карбоксильной группой - (СОО-) глутаминовой или аспарагиновой кислоты.

• 3. Водородные связи.

• Участвуют все аминокислоты, имеющие гидроксильные, амидные или карбоксильные группы.

• 4. Гидрофобные взаимодействия .Образуются между неполярными радикалами в водной среде. Участвуют 8 аминокислот (первый класс).

Третичная структура полностью задается первичной.

Определяющими являются гидрофобные взаимодействия в силу неизбирательности (неспецифичности) и многочисленности.

Гидрофобное ядро существует у большинства белков.

Четвертичная структура белка

Определение: четвертичная структура белка - это агрегация двух или большего числа полипептидных цепей, имеющих третичную структуру, в олигомерную функционально значимую композицию.

Связи, образующие и поддерживающие четвертичную структуру, те же самые, что и при образовании третичной структуры, кроме гидрофобных. Четвертичной структурой обладает около 5% белков, в том числе гемоглобин, иммуноглобулин, инсулин. Почти все ДНК- и РНК- полимеразы имеют четвертичную структуру.

Серповидно-клеточная анемия, как пример влияния первичной структуры на третичную и четвертичную.

В эритроцитах содержится гемоглобин - комплекс белка глобина с небелковой железосодержащей частью - гемом.

Глобин имеет четвертичную структуру.

Он состоит из двух альфа- и двух бета- полипептидных цепей (это названия цепей, не имеющие отношения к их вторичной структуре). В сумме это 574 аминокислоты. У всех здоровых людей на 6-ом месте от N-конца в бета-цепи находится полярная глутаминовая кислота ("-" заряженная). У больных серповидно-клеточной анемией вместо нее - неполярный валин.

Из 574 аминокислот заменено 2.

Такой гемоглобин теряет растворимость, образуется волокнистый осадок, деформирующий эритроцит.

Серповидно-клеточная анемия - заболевание генетическое. Причина - замена всего одного нуклеотида в гене, кодирующем Я-цепь гемоглобина. Дети - рецессивные гомозиготы по такому аллелю не доживают до двух лет. У гетерозигот 85% нормальных и 15% дефектных эритроцитов. Доминантные гомозиготы болеют малярией, гетерозиготы - не болеют.

Глобулярные и фибриллярные белки.

95% белков имеют гидрофобное ядро.

5% фибриллярные белки.

Подавляющее число глобулярных белков растворимо. Большинство фибриллярных - нерастворимо ( б-кератины - на их долю приходится почти весь сухой вес волос, шерсти, рогов, копыт, ногтей, чешуи, перьев; коллаген - белок сухожилий, хрящей; фиброин - белок шелка).

Фибриллярные белки содержат большую долю заряженных аминокислот, чем глобулярные - отдельные цепи растворимы, а их комплексы неполярны и нерастворимы.

Определение: Белок - это отдельный полипептид или агрегат нескольких полипептидов, выполняющий биологическую функцию.

Полипетид - понятие химическое. Белок - понятие биологическое.

Например, иммуноглобулин состоит из четырех полипептидных цепей, которые по отдельности не являются белками, белок - только их функциональный агрегат.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Структурная функция.

1. Белки входят в состав всех клеточных органелл: мембранных - плазмалемма, ядерная оболочка, эндоплазматическая или ретикулярная сеть (ЭР), комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы, вакуоль, митохондрии, пластиды - и немембранных - хромосомы, рибосомы, клеточный центр (центриоли), реснички и жгутики, микрофиламенты.

2.Каталитическая функция.

Все ферменты - белки. Эта функция в 1982 году перестала считаться уникальной. Выяснилось, что некоторые РНК тоже обладают каталитической активностью. Их называют РНКзимами.

3.Защитная функция (пока уникальна).

Антитела - это белки. Иммуноглобулины "склеивают" антигены и образуется преципитат

4. Регуляторная функция.

На клеточном уровне: белки - репрессоры и белки - активаторы транскрипции.

На организменном уровне: некоторые гормоны - белки.

Например, инсулин - гормон поджелудочной железы. Регулирует переход глюкозы через плазмалемму. При недостаточной секреции инсулина развивается тяжелое заболевание - сахарный диабет.

Соматотропин - гормон роста. Образуется в передней доле гипофиза.

Там же образуется и адренокортикотропный гормон (АКТГ). Он действует на кору надпочечников, регулируя синтез стероидных гормонов.

5. Трансформация энергии.

Белки сечатки глаза родопсин и ретинен трансформируют световую энергию в электрическую. Актино-миозиновые комплексы в мышцах преобразуют энергию химических связей в механическую.

6. Транспортная функция.

Гемоглобин осуществляет транспорт О₂, СО₂.

Трансферрин - транспорт железа.

Системы пермеаз - это мембранные белки, которые переносят полярные соединения через мембрану как по, так и против градиента концентрации.

7. Энергетическая функция.

11 из 20 аминокислот, входящих в состав белков, в организме человека "сгорают" с выделением энергии. Это - заменимые аминокислоты. Они могут быть синтезированы в клетке из продуктов расщепления углеводов и липидов

8. Питательная функция.

а) Поставка незаменимых аминокислот. У человека 9 из 20 аминокислот не могут быть синтезированы в организме. Они должны поступать извне.

Понятие "заменимые и незаменимые аминокислоты" - видоспецифическое и касается только животных и грибов.

б) Запасные белки для развития зародыша и вскармливания младенца. Например, казеин - белок молока, овальбумин - яичный белок, глиадин - белок зерен пшеницы.

9. Буферная функция.

Любой белок - амфотерный полиэлектролит. Белки способствуют поддержанию определенных значений рН в разных отсеках клетки, обеспечивая этим компартментализацию.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Определение: Генетический код - это система записи информации о последовательности расположения аминокислот в белках с помощью последовательности расположения нуклеотидов в ДНК.

Поскольку ДНК непосредственного участия в синтезе белка не принимает, то код записывается на языке РНК. В РНК вместо тимина входит урацил.

Лекции 3-4. Биосинтез НК. Репликация ДНК. Основные принципы и механизмы у про- и эукариот. Репарация ДНК

Способность генетического материала, ДНК, к самовоспроизведению (репликации) лежит в основе размножения живых организмов, передачи наследственных свойств из поколения в поколение и развития многоклеточного организма из зиготы. Настоящая глава посвящена молекулярным механизмам самовоспроизведения ДНК.

• Матричный синтез

Модель ДНК Уотсона и Крика сразу же позволила понять принцип удвоения ДНК. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную другой цепи, т. е. их информационное содержание идентично, представлялось вполне логичным, что при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых состоит из одной цепи исходной родительской молекулы ДНК и одной новосинтезированной цепи. Экспериментально показано, что именно так, по полуконсервативному механизму, происходит репликация ДНК. Несмотря на простоту основного принципа, процесс репликации сложно организован и требует участия множества белков. Эти белки, как и все другие, закодированы в последовательности нуклеотидов ДНК. Таким образом, возникает важнейшая для жизни петля обратной связи: ДНК направляет синтез белков, которые реплицируют ДНК.

ДНК-полимеразы

Комплементарное копирование матрицы осуществляют ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы или просто ДНК-полимеразы. Первый фермент этого типа был открыт в 1956 г. у Е. coli, затем ДН К-полимеразы были обнаружены в других организмах. ДНК- полимеразы ведут синтез ДНК на одноцепочечной матрице, если имеется затравка -- комплементарный матрице фрагмент растущей цепи ДНК. ДНК-полимеразы последовательно наращивают конец затравки, шаг за шагом присоединяя к нему следующие нуклеотиды, причем выбор очередного нуклеотида для присоединения к концу затравки диктуется матрицей.

Очередной нуклеотид, субстрат для ДНК-полимеразы, поступает в реакцию в активированной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата. В этом отношении синтез ДНК напоминает синтез всех других биополимеров: поскольку полимеризация мономеров в полимер энергетически не выгодна, мономеры всегда поступают в реакцию синтеза в активированной форме. В случае синтеза ДНК присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что и делает реакцию в целом энергетически выгодной. Наличие в клетке пирофосфатазы обеспечивает расщепление пирофосфата и делает реакцию практически необратимой. При полимеризации растет всегда З'-конец затравки, т. е. синтез происходит в направлении 5'>3'. З'-ОН-группа концевого нуклеотида затравки атакует б-фосфат очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата (но только в том случае, если он комплементарен очередному нуклеотиду матрицы!), в результате чего отщепляется пирофосфат, а дезоксирибонуклеозидмонофосфат оказывается связанным фосфодиэфирной связью с растущей цепью ДНК, удлиняя ее на одно звено.

Затравка антипараллельна матрице. Естественно, эта полярность сохраняется и при ее дальнейшем росте, так что результатом работы ДНК-полимеразы на одноцепочечной матрице является антипараллельная двойная спираль ДНК.

Необходимая для полимеризации геометрия химических группировок в активном центре ДНК-полимераз задается с помощью координационного взаимодействия определенных атомов матрицы, затравки и субстрата с ионами металлов. Субстраты поступают в реакцию синтеза ДНК в виде комплексов (хелатов) с ионами Mg^2-. Ионы Zn²⁺, входящие в активный центр почти всех матричных ферментов, как ДНК-, так и РНК-полимераз, обеспечивают правильную взаимную ориентацию З'-ОН-группы затравки, б-фосфата субстрата и очередного нуклеотида матрицы. Возможно, это обстоятельство отражает историю возникновения первых систем матричного синтеза полинуклеотидов; показано, что ионы цинка способны и без ферментов в ограниченной степени катализировать образование комплементарных матрице олигонуклеотидов из активированных субстратов. ДНК-полимеразы безразличны к последовательности нуклеотидов матрицы; задача этих ферментов -- снять точную копию с матрицы, с какой -- неважно.

Точность синтеза ДНК и коррекция

Нормальное размножение клеток требует высокой точности копирования ДНК-матрицы. Генетический материал живых организмов имеет огромные размеры. Даже у бактерий ДНК-полимераза должна практически безошибочно скопировать молекулу ДНК длиной около 3•10⁶ п. н. Оказывается, у всех организмов точность работы репликативной машины как раз такова, чтобы обеспечить безошибочное воспроизведение всего генома или допустить лишь малое число ошибок. Так, у бактерий ошибки синтеза ДНК происходят не чаще чем один раз на много миллионов нуклеотидов. Молекулярные взаимодействия, на которых основаны ферментативные реакции, в частности синтез ДНК, не могут быть абсолютно надежными, кроме того, точность процесса связана с его скоростью. Для того чтобы обеспечить высокую точность наряду с высокой скоростью репликации, природе пришлось прибегнуть к специальным механизмам, один из которых -- механизм коррекции.

ДНК-полимеразы проверяют комплементарность каждого нуклеотида матрице дважды: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если последний (З'-концевой) нуклеотид затравки комплементарен матрице. Если же на предыдущей стадии полимеризации произошла ошибка (например, из-за того, что нуклеотид в момент полимеризации находился в необычной таутомерной форме), то репликация останавливается до тех пор, пока неправильный нуклеотид не будет удален. Некоторые ДНК-полимеразы обладают не только полимеризующей, но и 3'-экзонуклеазной активностью, которая отщепляет не спаренный с матрицей нуклеотид затравки, после чего полимеризация восстанавливается. Этот механизм, коррекция, заметно увеличивает точность работы ДНК-полимераз.

ДНК-полимеразы бактерий

Репликация лучше всего изучена у Е. coli. У этого организма есть три ДНК-полимеразы (I, II и III). Все три фермента и их аналоги из других бактерий обладают корректирующей экзонуклеазной активностью.

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков. Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. coli наличием 5'-экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I -- это два фермента на одной полипептидной цепи: ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I обладает полимеризующей и З'-экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет 5'-экзонуклеазную активность. 5'-экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5'-конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5'-экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза «расчищает дорогу» для полимеразы. Подобные свойства ДНК- полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке: эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной полимеразой при репликации ДНК, удаляя PHК-затравки.

ДНК-полимераза II -- полипептид с Молекулярным весом (Mr) около 120 000Да, обладающий полимеразной и З'-экзонуклеазной активностями. Его содержание в бактериальной клетке в несколько раз ниже, чем ДНК-полимеразы I. Эта полимераза лучше всего работает на двуцепочечной ДНК с одноцепочечными брешами в несколько десятков нуклеотидов длиной. На этом основании можно предположить,что ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК.

Главную роль в репликации ДНК у Е. coli играет большой мультисубъединичный фермент--ДНК-полимераза III. В клетке всего несколько таких мультимеров, приблизительно столько же, сколько репликативных вилок. ДНК-полимераза III состоит из 7 типов субъединиц и имеет суммарную молекулярную массу около 500 кД. Полимеразной активностью in vitro обладают различные неполные агрегаты субъединиц, но репликацию проводит полная форма фермента -- холофермент, содержащий все субъединицы. Полимеразная активность присуща б-субъединице, З'-экзонуклеазная -- е-субъединице, в-субъединица имеет АТРазную активность. Отличительная черта холофермента ДНК-полимеразы III -- исключительно высокая процессивность синтеза ДНК (количество нуклеотидов, присоединяемых ферментом к растущей цепи между двумя последовательными актами диссоциации с матрицы).

Для образования комплекса холофермента с матрицей-затравкой необходим АТР. Сначала АТР образует комплекс с холоферментом (с в-субъединицей), затем активированный холофермент связывается с матрицей-затравкой, что сопровождается гидролизом АТР до ADP и фосфата. Образованный таким образом комплекс характеризуется практически неограниченной процессивностью синтеза. Видимо АТР обеспечивает необратимость присоединения к матрице (до конца копирования). Для элонгации (удлинения затравки) тоже необходим АТР, но лишь в качестве аллостерического эффектора, позволяющего ДНК-полимеразе «чувствовать» состояние энергетического баланса клетки и проводить репликацию лишь при условии достаточного энергообеспечения. При оптимальных условиях скорость синтеза ДНК холоферментом ДНК-полимеразы III in vitro составляет около 1000 нуклеотидов в секунду, что соответствует скорости репликации in vivo.

ДНК-полимеразы эукариот

В клетках эукариотических организмов обнаружены четыре ДНК- полимеразы: б, в, г и у. ДНК-полимераза б считается основным ферментом ядерной репликации. Содержание этого фермента заметно возрастает во время S-фазы клеточного цикла, когда происходит активный синтез ДНК. Только эта ДНК-полимераза подавляется афидиколином--ингибитором синтеза ДНК эукариот. Фермент состоит из нескольких субъединиц разного размера. Например, у дрозофилы молекулярные массы субъединиц составляют 148, 58, 46 и 42 кД. Полимеразная активность присуща самой большой из субъединиц. Молекулярная масса нативной эукариотической ДНК-полимеразы б составляет около 500 кД. Так же как в случае ДНК-полимеразы III E.coli, эффективность и высокая процессивность работы полимеразы б зависят до дополнительных субъединиц, которые сами по себе полимеризующей активностью не обладают. Одна из субъединиц ДНК-полимеразы б оказалась ДНК-праймазой -- ферментом, необходимым для инициации новых цепей ДНК ; ассоциация с праймазой не характерна для ДНК-полимераз бактерий.

ДНК-полимераза в состоит из одного полипептида размером около 40 кД. Действие этого фермента, видимо, не процессивно. Наибольшая активность наблюдается на двуцепочечной ДНК с короткими брешами. Можно думать, что основная роль этой полимеразы состоит в репарации ДНК.

ДНК-полимераза г, по-видимому, состоит из нескольких идентичных субъединиц с молекулярной массой около 50 кД. Это митохондриальный фермент, который осуществляет синтез ДНК митохондрий.

ДНК-полимераза у имеет молекулярную массу около 150 кД и состоит из двух неидентичных субъединиц. Этот фермент обладает сопряженной З'-экзонуклеазной активностью. Его роль в синтезе ДНК не ясна.

• Основные принципы репликации

Принципы репликации:

1. Комплементарность.

2. Антипараллельность.

3. Униполярность.

4. Потребность в затравке.

5. Прерывистость.

6.Полуконсервативность.

Первые три принципа можно сформулировать в одной фразе:

Синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно матричной цепи и всегда в направлении 5' 3'.

Потребность в затравке (Инициация цепей ДНК)

ДНК-полимеразы не способны инициировать новые цепи ДНК. Они могут лишь достраивать уже имеющуюся затравку. Это свойство, по-видимому, связано с предъявляемым к синтезу ДНК требованием высокой точности. Как уже говорилось, безошибочная работа ДНК- полимераз в существенной степени определяется их неспособностью удлинять затравку, последний нуклеотид которой не спарен с матрицей. Так как свободные нуклеотиды с матрицей не спариваются_г то соединение самого первого нуклеотида цепи ДНК со следующим аналогично присоединению нуклеотида к не спаренному с матрицей концу затравки и оказывается невозможным. Как же, в таком случае, начинается синтез цепей ДНК?

Оказывается, новосинтезированные цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов. Иными словами, синтез ДНК начинается с синтеза РНК. РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фермент, называемый ДНК-праймазой (от англ, праймер--затравка). Праймаза может быть отдельным ферментом, как у бактерий, или входить в качестве субъединицы в ДНК-полимеразу (как у ДНК-полимеразы б животных). В любом случае праймаза -- это фермент, отличный от РНК-полимераз, синтезирующих разнообразные клеточные РНК и тоже способных инициировать синтез новых полинуклеотидных цепей. Почему же в таком случае для инициации цепей ДНК используются рибонуклеотиды? Возможное объяснение состоит в том, что в ходе эволюции праймазы произошли из РНК-полимераз. Но есть и другое, функциональное, объяснение. Поскольку требования инициации и безошибочности синтеза противоречат друг другу, затравку, синтезированную инициирующим (а значит, неточным) ферментом, необходимо как-то отличить от остальной новосинтезированной цепи. Можно думать, что именно поэтому она и состоит из рибонуклеотидов. После того как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравки удаляются и образовавшиеся бреши застраиваются ДНК- полимеразой, т. е. с высокой точностью.

Расплетание двойной спирали ДНК в ходе репликации

Нативные ДНК двуспиральные, следовательно, перед репликацией цепи родительской молекулы, матричные цепи ДНК, должны быть разделены. Эту реакцию осуществляют два типа белков: хеликазы и SSB-белки (от англ, single strand binding -- белки, связывающиеся с однонитевой ДНК). Хеликазами называют ДНК-зависимые АТРазы, использующие энергию гидролиза АТР для расплетания двойной спирали (helix) ДНК- Считается, что хеликаза, движимая гидролизом АТР, однонаправленно «едет» по одной из цепей ДНК, расплетая перед собой двойную спираль. Есть хеликазы, которые едут от 5'-конца к З'-концу цепи ДНК, и есть другие, перемещающиеся в обратном направлении. В результате работы хеликаз возникает «вилка» из двуспирального участка ДНК и двух одноцепочечных ветвей. Ренатурации одноцепочечных участков ДНК препятствует их связывание SSB-белком, имеющим избирательное сродство к однонитевой ДНК. SSB-белки и хеликазы обнаружены у многих про- и эукариотических организмов. Роль SSB-белка в репликации, по-видимому, состоит в том, чтобы расправить ДНК, вытянуть ее и удалить возможные элементы вторичной структуры, которые могли бы образоваться в само- комплементарных участках ДНК. Cвязывание одноцепочечной ДНК с SSB-белком стимулирует ДНК- полимеразу и повышает точность ее работы.

Прерывистый синтез ДНК

Так как цепи ДНК в дуплексе антипараллельны, то очевидно, что направление расплетания двойной спирали при репликации совпадает с направлением синтеза ДНК лишь для одной матричной цепи, но противоположно направлению синтеза ДНК на комплементарной матрице. Это значит, что лишь на одной из матричных цепей синтез ДНК может происходить непрерывно. Как синтезируется ДНК на второй матрице? Показано, что ДНК синтезируется сравнительно короткими фрагментами, называемыми фрагментами Оказаки. Таким образом, синтез ДНК на двух матричных цепях исходной молекулы заметно различается. Новосинтезированная цепь,, которая синтезируется непрерывно, называется ведущей (англ, leading), другая цепь называется запаздывающей (англ, lagging). Каждый фрагмент Оказаки имеет на 5'-конце несколько рибонуклеотидов -- результат действия праймазы. Характерный размер фрагментов Оказаки различается для бактерий и эукариот: у бактерий они имеют длину около 1000 нуклеотидов, у эукариот они короче, порядка 100 нуклеотидов. Через некоторое время после синтеза РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-полимеразой,. а фрагменты сшиваются в одну ковалентно-непрерывную цепь ДНК предназначенным специально для этого ферментом, ДНК-лигазой.

ДНК-лигазы обнаружены у самых разных организмов. Они нуждаются в высокоэнергетических кофакторах: например, лигаза Е. coli нуждается в NAD⁺, а широко используемая для генно-инженерных методик лигаза фага Т4 -- в АТР. Прежде чем образовать фосфодиэфирную связь, соединяющую два фрагмента ДНК, лигаза активирует 5'-конец одного из фрагментов с помощью высокоэнергетического кофактора.

• Репликация ДНК Е. coli

Детальную картину репликации ДНК лучше всего рассмотреть на примере Е. coli.

Для выяснения механизма репликации бактериальной хромосомы незаменимую роль сыграл анализ разнообразных мутантов, нарушающих репликацию ДНК. Синтез ДНК -- функция жизненно важная, и мутации, инактивирующие ферменты синтеза ДНК, леталь- ны. Поэтому, как и в других подобных случаях, были использованы условно летальные мутации, в частности температурочувствительные (ts).

Основной хеликазой при репликации ДНК Е. coli служит комплекс из шести молекул белка-продукта гена dnaC и шести молекул белка-продукта гена dnaB (собственно хеликазой является DnaB- белок). С этой хеликазой связана праймаза, кодируемая у Е. coli геном dnaG. Такой комплекс из хеликазы и праймазы называют праймосомой. Гидролизуя АТР, праймосома едет по матрице для синтеза запаздывающей цепи ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу` и расплетает перед собой двойную спираль, а за собой оставляет РНК-затравки для синтеза фрагментов Оказаки.

Вспомогательной хеликазой при синтезе ДНК Е. coli служит белок -- продукт гена rер. Rep-хеликаза едет по матрице для синтеза ведущей цепи в направлении от 3'- к 5'-концу. Таким образом, хеликазы DnaB и Rep едут по разным цепям ДНК, но в силу антипараллельности цепей в двойной спирали в одну сторону, в сторону раскрывания репликативной вилки.

Теперь можно нарисовать репликативную вилку со всеми действующими там белками. Дуплекс родительской молекулы расплетают две хеликазы -- Rep и DnaB -- в составе праймосомы. Образующиеся одноцепочечные участки кооперативно покрывает SSB-белок. Холофермент ДНК-полимеразы III едет по одной из матричных цепей в направлении раскрывания вилки и синтезирует ведущую цепь ДНК- По другой матричной цепи в том же направлении едет праймосома. Время от времени входящая в состав праймосомы праймаза, белок DnaG, синтезирует РНК-затравки для запаздывающей цепи. Вторая молекула холофермента ДНК-полимеразы III удлиняет эти затравки до тех пор, пока не упрется в предыдущую затравку, т. е. синтезирует фрагменты Оказаки. Затем действует ДНК-полимераза I, которая продолжает удлинять фрагменты Оказаки, одновременно гидролизуя РНК-затравку предыдущего фрагмента, используя свою 5'-экзонуклеазную активность. После действия ДНК-полимеразы I между двумя соседними фрагментами остается только одноцепочечный разрыв, который зашивает ДНК- лигаза. Таким образом, в репликативной вилке одновременно работают около 20 разных полипептидов, осуществляя сложный, высокоупорядоченный и энергоемкий процесс. Не говоря уже о том, что каждый нуклеотид переходит в ДНК из богатого энергией предшественника, множество молекул АТР тратится на действие хеликаз, на синтез РНК-затравок, которые затем удаляются, на активацию ДНК-полимеразы III при переходе на каждый новый фрагмент Оказаки запаздывающей цепи и на работу топоизомераз по раскручиванию взаимозакрученных цепей ДНК. Такова цена высокой точности и скорости репликации. Холофермент ДНК-полимеразы III может димеризоваться. На этом основании выдвинуто предположение, что две молекулы холо- фермента, праймосома, и, возможно, дополнительная хеликаза образуют в клетке единый комплекс -- реплисому, которая движется по ДНК, одновременно синтезируя обе новые цепи.

Репликацию ДНК Е. coli удалось воссоздать in vitro в системе из очищенных белков.

Топологические проблемы репликации

Большинство молекул ДНК бактерий и некоторые ДНК эукариот являются кольцевыми. Из-за спиральной закрученности цепи этих молекул оказываются зацепленными -- их невозможно разделить, не порвав хотя бы одну из них.

Все эти проблемы разрешаются присутствием в клетке топоизомераз. Топоизомеразы на время вносят в зацепленные друг за друга цепи кольцевых молекул разрывы, которые необходимы для их разделения, т. е. выступают в роли «шарниров», позволяющих цепям ДНК раскрутиться. Способность бактериальной топоизомеразы II -- ДНК-гиразы -- отрицательно сверхспирализовать ДНК в ATP-зависимой реакции не только снимает вопрос о вращении всей непрореплицировавшейся части ДНК, но и облегчает действие хеликаз, поскольку отрицательная сверхспирализация, которую гираза создает перед вилкой, способствует расплетанию ДНК.

На заключительной стадии репликации кольцевых молекул часто остается одно или несколько зацеплений цепей исходной молекулы друг за друга. Это приводит к тому, что двуцепочечные кольца дочерних молекул также оказываются зацепленными, образуют катенан. ДНК-гираза может расцепить зацепленные кольца, используя свою способность вносить временный двуцепочечный разрыв. Такая активность гиразы действительно существенна для репликации ДНК. Важно отметить, что топоизомеразы необходимы для завершения репликации не только кольцевых молекул, но и очень длинных линейных эукариотических хромосом: две очень длинные дочерние молекулы не могут разойтись достаточно быстро, поскольку после репликации оказываются запутанными подобно катенанам, образующимся на заключительной стадии репликации кольцевых ДНК. Действительно, мутанты эукариот (дрожжей) с нарушенной топоизомеразой II дефектны по расхождению дочерних хромосом в митозе.

По крайней мере у бактерий топоизомеразы играют важную роль не только в ходе репликации и на завершающих стадиях этого процесса, но и при инициации раунда репликации.

Инициация раунда репликации

Начавшийся процесс репликации хромосомы бактерии продолжается до тех пор, пока не удвоится вся ДНК. В этом смысле бактериальная хромосома представляет собой единицу репликации -- репликон.

Репликация каждого бактериального репликона, в частности хромосомы Е. coli, как правило, начинается в одной избранной области ДНК, называемой ориджином репликации (от англ, origin --' начало, обозначается ori). Ориджин репликации каждого репликона имеет вполне определенную последовательность ДНК. В результате инициации раунда репликации на ориджине образуются одна или две репликативные вилки. Если возникает одна репликативная вилка, как, например, у плазмиды СolЕ1, то, объехав всю кольцевую молекулу, она заканчивает синтез на ориджине. Такая репликация называется однонаправленной. На многих ориджинах, в частности на хромосомном ориджине Е. coli, инициируется двунаправленная репликация, т. е. возникают две репликативные вилки, перемещающиеся в противоположных направлениях до тех пор, пока не встретятся. Реплицирующиеся кольцевые репликоны имеют характерную структуру, напоминающую греческую букву ? и называемую тэта-структурой.

Последовательность ориджина способствует необходимому для начала синтеза ДНК расплетанию двойной спирали ДНК и служит участком сборки, «посадки» на ДНК активного комплекса белков, осуществляющих репликацию. Чем же ориджины репликации отличаются от прочих последовательностей ДНК, что определяет их специфичность? Для разных репликонов ответ может быть различным, однако часто оказывается, что специфичность ориджина определяется специальным белком, участвующим в инициации синтеза ДНК и способным избирательно связываться с последовательностью нуклеотидов данного ориджина. Наличие на одном репликоне ориджина и гена, кодирующего специфичный к нему белок-инициатор, обеспечивает самоподдержание этого репликона в клетке.

Инициация репликации хромосомы Е. coli

Белок-инициатор, специфически узнающий хромосомный ориджин Е. coli oriC, кодируется геном dnaA. В последовательности oriC присутствует несколько участков связывания DnaA-белка. Молекулы белка-инициатора связываются с этими участками и расплетают ДНК в находящейся поблизости АТР-богатой области ориджина.

С комплексом DnaA-белка с расплетенным oriC связывается DnaC-белок, после чего с образовавшимся комплексом может связаться хеликаза DnaB, которая обеспечивает дальнейшее расплетание ориджина, необходимое для сборки реплисомы.

Для инициации репликации хромосомы Е. coli необходима также транскрипция области ориджина РНК-полимеразой. Поскольку первые РНК-затравки синтезирует, по-видимому, праймаза, роль РНК-полимеразы скорее всего заключается в «транскрипционной активации» ориджина.

Два фермента обеспечивают высокую избирательность инициации синтеза ДНК, ограничивая инициацию репликации только ориджином. Это топоизомераза I и РНКаза Н, избирательно гидролизующая РНК в составе гибридных дуплексов с ДНК. Действие этих ферментов направлено против гибридных ДНК--РНК-участков, которые могут случайно образоваться на ДНК при транскрипции и послужить затравками для начала синтеза ДНК.

Смысл ограничения инициации репликации областью ориджина становится понятным, так как репликация строго регулируется. Мишенью различных регуляторных воздействий является ориджин, поэтому для контроля репликации необходимо подавить инициацию в прочих местах.

Система обратной связи поддерживает определенную копийность репликона в клетке. Репликация может контролироваться дополнительными факторами, изменяющими число копий в зависимости от условий.

Особенности репликации ДНК эукариот

Инициация репликации у эукариот

Эукариотические геномы, как правило, значительно больше бактериальных, а скорость синтеза ДНК у эукариот, напротив, существенно ниже (несколько десятков нуклеотидов в секунду). Видимо, по этой причине инициация синтеза ДНК эукариот происходит во многих разных точках хромосомы, т. е. эукариотические хромосомы имеют полирепликонную организацию.

Инициация репликации строго регулируется. Полирепликонная организация требует, чтобы в каждом цикле клеточного деления каждый ориджин «сработал» только один раз, в противном случае на хромосоме образуются разветвленные структуры. Для дрожжевых ARS-последовательностей показано, что инициация действительно происходит один раз в каждой S-фазе клеточного цикла. У высших эукариот достаточно протяженные участки хромосом, содержащие несколько соседних репликонов, начинают синтез ДНК в S-фазе приблизительно одновременно, но каждый такой участок имеет характерное для него время инициации репликации: одни активируются в начале S-фазы, другие -- позже, а третьи -- в конце

Репликация концов ДНК хромосом эукариот

Удаление РНК-праймеров после завершения синтеза линейных ДНК в виде фрагментов Оказаки и заделывание образующихся между фрагментами брешей нуклеотидами ДНК приводит к тому, что дочерние цепи ДНК оказываются короче материнских на размер первого РНК-праймера (10-20 нукл.).

Образуются 3'-оверхенги, т.е. выступающие 3'-концы материнских цепей. Они узнаются теломеразой - ферментом, содержащим помимо белковой части еще и РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами.

Теломераза последовательно наращивает материнские цепи ДНК повторами, используя 3'-оверхенги в качестве затравок. Образующиеся длинные одноцепочечные концы в свою очередь служат матрицами для синтеза дочерних цепей традиционным репликативным механизмом. Хромосомы соматических клеток человека фланкированы многократно повторенными гексамерами TTAГГГ, общая длина районов с повторами может достигать 10 тыс. пар нуклеотидов. В комплексе со специфическими белками такие тандемные повторы образуют теломеры, защищающие концы ДНК от действия экзонуклеаз, предотвращающие неправильную рекомбинацию и позволяющие концам хромосом прикрепляться к ядерной оболочке.

При каждом раунде репликации происходит укорочение теломер в среднем на 50 пар нуклеотидов. Поскольку теломерные последовательности не являются кодирующими, они выступают в роли буферной зоны - как защита от "проблемы концевой репликации".

Укорочение ДНК в ходе каждого раунда репликации лишь сокращает нетранскрибируемый текст теломеры, но не приводит к утрате смысловых последовательностей - генов и регуляторов их экспрессии.

Регуляция репликации прокариот известна, т.к. известны гены белков регуляции репликации E.сoli и механизмы их включения (выключения). Для эукариот эти механизмы еще не ясны, но известно расписание репликации ДНК по разным хромосомам.

Репарация ДНК

Видимо, уже на ранних стадиях эволюции ДНК заменила РНК в качестве носителя генетической информации. Этому гипотетическому событию должны были способствовать большая химическая устойчивость ДНК, связанная с заменой рибозы на дезоксирибозу, и двуцепочечное строение, «скрывающее» целый ряд реакционноспособных группировок. Но несмотря на свои «преимущества», ДНК постоянно подвергается химическим изменениям, как спонтанным, так и индуцируемым мутагенами и даже клеточными метаболитами. Еще одна обычная причина повреждений ДНК--радиация и ультрафиолетовое облучение. Большинство происходящих с ДНК изменений недопустимы: они либо приводят к вредным мутациям, либо блокируют репликацию ДНК и вызывают гибель клеток. Поэтому все клетки имеют специальные системы исправления повреждений, репарации ДНК. Нарушение этих систем губительно. Репарация ультрафиолетовых повреждений ДНК нарушена у людей, страдающих тяжелым наследственным заболеванием -- пигментной ксеродермой. Такие больные не могут бывать на солнце и обычно умирают в раннем возрасте от какого-либо злокачественного заболевания.

...