Основы молекулярной биологии и генной инженерии

Белок-активатор катаболитных оперонов

Белок-активатор катаболитных оперонов (БАК) в комплексе с циклическим сАМР активирует транскрипцию большого числа оперонов, отвечающих за расщепление различных соединений, преимущественно сахаров, используемых бактериальной клеткой в качестве источников энергии и углерода. Концентрация с АМР в клетках повышается при росте на плохо усваиваемых источниках, например ацетате или глицерине, и снижается при росте на легко усваиваемых, например глюкозе. Поэтому система регуляции с помощью БАК-сАМР позволяет клетке включать опероны катаболизма лишь по мере истощения более легко усваиваемых пищевых веществ.

БАК состоит из двух идентичных субъединиц. Каждая субъединица образует два домена, но в отличие от репрессора фага л за связывание с ДНК отвечает С-концевой домен. N-концевой домен БАК связывается с сАМР и обеспечивает межсубъединичные контакты в димере. Как и у репрессора фага л и многих других регуляторов транскрипции, связывание БАК с ДНК осуществляется за счет пары биспиральных элементов, погруженных в большие бороздки В-формы ДНК. Особенностью взаимодействия БАК с ДНК является то, что он изгибает ДНК в месте своего присоединения к ней.

Участки связывания БАК в разных промоторах не идентичны по нуклеотидной последовательности, но проявляют значительное сходство друг с другом. Эти участки в разных промоторах располагаются по-разному относительно стартовых точек транскриптов, которые стимулируются БАК. В промоторе галактозного оперона участок связывания БАК непосредственно прилегает к участку связывания РНК-полимеразы. Рядом располагается второй участок связывания БАК; с ним БАК связывается только в том случае, если на промоторе уже находится РНК-полимераза и БАК на первом участке. В промоторе лактозного оперона имеется только один участок связывания БАК, ориентированный относительно участка связывания РНК-полимеразы точно так же, как второй участок связывания БАК в галактозном промоторе. В промоторе гена malT, кодирующего белок-активатор мальтозных оперонов, и в промоторах мальтозных и арабинозного оперонов участок связывания отстоит от стартовой точки транскрипции еще дальше. В промоторах мальтозных и арабинозного оперонов, между участками связывания БАК и участками связывания РНК-полимеразы, располагаются участки связывания белков-активаторов этих оперонов, кодируемых генами malT и аrаС соответственно.

.Механизм действия БАК не вполне понятен. По аналогии с репрессором фаза а можно предположить, что существенную роль играют контакты белков-регуляторов между собой и с РНК-полиме- разой. Скорее всего с РНК-полимеразой непосредственно взаимодействует лишь ближайший к ней белок. В пользу этого говорит, например, то, что повышение концентрации белков MalT и АrаС снижает зависимость транскрипции соответствующих оперонов от БАК.

U3

БАК может выступать также и в роли репрессора транскрипции. Например, в галактозном опероне кроме стимулируемого БАК промотора Р₁ имеется репрессируемый БАК промотор Р₂. Эти два промотора перекрываются друг с другом, так что присоединение одной молекулы РНК-полимеразы к промотору Р₂ препятствует присоединению другой молекулы РНК-полимеразы к Р₂. Присоединение БАК к ДНК мешает связыванию РНК-полимеразы с Р₂ и не мешает связыванию с Р₁. Поэтому БАК оказывает не только- прямое, но и опосредованное активирующее действие на промотор Р₁. Блокирование промотора Р₂ приводит к усилению транскрипции с P₁ так как обеспечивает беспрепятственное связывание РНК- полимеразы с Р₁.

Репрессоры катаболитных oneронов

Помимо общей регуляции с помощью БАК-сАМР существует индивидуальная регуляция катаболитных оперонов. Классическим примером является негативная регуляция лактозного оперона. В отличие от ранее рассмотренных димерных белков-регуляторов репрессор лактозного оперона представляет собой тетрамер и содержит два идентичных центра связывания ДНК- Пространственная структура этих центров формируется N-кониевыми участками поли- пептидных цепей, которые, судя по их аминокислотной последовательности, способны образовывать биспиральные элементы, аналогичные биспиральным ДНК-узнающим элементам репрессора фага л и БАК. С-концевые домены субъединиц лактозного репрессора формирует два центра связывания индуктора лактозного оперона.

Оператор лактозного оперона располагается сразу за стартовой точкой транскрипции. Долгое время считалось, что присоединение лактозного репрессора к промотору стерически мешает присоединению РНК-полимеразы. Однако недавно получены данные, свидетельствующие о том, что репрессор и РНК-полимеразы могут расположиться на промоторе рядом друг с другом. Поэтому приходится думать о более изощренных механизмах репрессии, включающих специфические контакты репрессора с РНК-полимеразой. В лактозном опероне имеется два псевдооператора, сходных по нуклеотидной последовательности с оператором, но обладающих меньшим сродством к репрессору. Один из этих псевдооператоров располагается внутри гена, кодирующего лактозный репрессор, на расстоянии 92 п. н. от главного оператора, другой -- на расстоянии 401 п. н. внутри гена в-галактозидазы. Наличие псевдооператоров несколько увеличивает сродство репрессора к оператору. Стабилизация комплекса репрессора с оператором может происходить за счет того, что одна молекула репрессора, имеющая два центра связывания ДНК, может одновременно присоединить к себе и оператор, и псевдооператор. Разделяющая их ДНК при этом образует петлю.

Два оператора имеется в галактозном опероне. Один из них располагается в районе --60 п. н. промотора, другой -- в районе +55 (рис. 92). Показано, что связывание репрессора с операторами не мешает связыванию БАК и РНК-полимеразы с промотором. Поскольку для эффективной репрессии нужны оба оператора, предполагается, что молекулы репрессора, расположенные на операторах, взаимодействуют друг с другом, образуя петлю ДНК. Такая конформация каким-то образом мешает инициации транскрипции.

Образование петель постулировано и при репрессии арабинозного оперона araBAD. Репрессором этого оперона является белок, кодируемый геном аrаС. В отсутствие арабинозы АrаС-белок, являющийся димером, репрессирует araBAD-оперон, а в присутствии арабинозы превращается в активатор, который активирует этот оперон. Кроме того, АгаС-белок как в присутствии, так и в отсутствие арабинозы умеренно репрессирует транскрипцию своего собственного гена, в результате чего концентрация АгаС-белка поддерживается на постоянном уровне.

Ген аrаС располагается перед началом araBAD-оперона, но транскрибируется в противоположном направлении (рис. 93).

Стартовые точки транскрипции промоторов Р_с и P_Bad находятся на расстоянии 147 п. н. Репрессируя Р_с, белок АrаС связывается оператором аrаО₁, перекрывающимся с участком связывания РНК- полимеразы. Находясь в состоянии активатора, АrаС-белок связывается с участком аrаI, непосредственно примыкающим к участку связывания РНК-полимеразы с промотором. Можно думать, что активация происходит за счет контакта с РНК-полимеразой.

Репрессия araBAD-оперона осуществляется в результате связывания АrаС-белка с участком аrаО₂, расположенным на расстоянии почти 300 п. н. от стартовой точки транскрипции (рис. 93). Предполагается, что белок АrаС, располагаясь на аrаO₂, взаимодействует с промоторной зоной за счет изгибания ДНК и образования петли, подобной той, которая образуется при кооперативном взаимодействии двух молекул репрессора фага л, присоединяющихся к двум операторным участкам, разделенных целым числом витков- двойной спирали ДНК. Эта гипотеза основана на результатах экспериментов, в которых изменяли расстояние между аrа0₂ и Р_BAD за счет небольших делеций и вставок. Когда изменение было кратно одному витку спирали ДНК, степень репрессии не изменялась. Если изменение составляло полвитка, полтора и т. д., то репрессия ослаблялась. Таким образом, для репрессорного действия АrаС- белка существенно не расстояние от промотора, а осевой угол между аrаO₂ и промотором. С каким белком, находящимся на промоторе, контактирует АrаС-белок, находясь на аrаO₂, пока не установлено. Это может быть другая молекула АrаС-белка, расположенная на аrаI, или непосредственно РНК-полимераза.

у-Субъединицы РНК-полимеразы

у-Субъединицы РНК-полимеразы можно рассматривать как белки- регуляторы, включающие определенные группы генов. От других белков-активаторов у-субъединицы отличаются лишь в деталях механизма действия: если «обычные» белки-активаторы сначала присоединяются к промотору, а затем взаимодействуют с РНК-полимеразой, то а-субъединица сначала присоединяется к РНК-полимеразе, а затем присоединяется к промотору как часть ДНК-связывающего центра фермента.

Впервые включение генов за счет появления в клетке новыху-субъединиц было продемонстрировано при таком запрограммированном во времени необратимом процессе, как развитие бактериофагов. Другим запрограммированным во времени необратимым процессом, при котором происходит последовательное включение и выключение больших групп генов с участием различных у-субъединиц, является споруляция таких бактерий, как Вас. subtilis.

у-Субъединицы участвуют также в регуляции ряда промоторов, активность которых обратимо реагирует на изменения внешних

условий, например на тепловой шок. Реакция теплового шока характерна для всех изученных организмов, как эу-, так и прокариот. При резком повышении температуры происходит значительное (но кратковременное) ускорение синтеза определенных белков за счет усиления транскрипции их генов. Промоторы соответствующих генов у Е. coli отличаются по нуклеотидной последовательности от промоторов, используемых РНК-полимеразой, содержащей главную у⁷⁰-субъединицу. Транскрипцию с промоторов, активируемых при тепловом шоке, осуществляет РНК-полимераза, содержащая особую у³²-субъединицу с М_r=32 кД. Молекулы у³² отличаются коротким временем жизни в клетке, т. е. расщепляются протеазами через несколько минут после своего образования. Количество у³² в клетке при тепловом шоке возрастает за счет неизвестного еще механизма, что является причиной ускорения транскрипции генов белков теплового шока.

Особая у-субъединица участвует в транскрипции ряда генов, ответственных за метаболизм азота. К ним относятся ген, кодирующий глутаминсинтетазу, и гены, контролирующие фиксацию атмосферного азота. Промоторы этих генов не содержат обычных для других промоторов последовательностей «--10» и «--35». Вместо них имеются участки гомологии, центры которых расположены в положениях «--11» и «--21». Поэтому неудивительно, что эти промоторы не используются РНК-полимеразой, содержащей главную сигма- субъединицу, у⁷⁰. Транскрипцию этих промоторов обеспечивает одна из минорных у-субъединиц, у⁶⁰, кодируемая геном rpoN. Однако для функционирования промотора гена глутаминсинтетазы белка у⁶⁰ недостаточно. Необходим еще ДНК-связывающийся белок, называемый NR¹ . Перед промотором имеется пять участков его связывания; наибольшее сродство NR₁ проявляет к двум отдаленным участкам. Эти последовательности необходимы для активации промотора при низких концентрациях NR₁ и не обязательны при высоких. Если эти последовательности отодвинуть на тысячу пар нуклеотидов от промотора, они продолжают обеспечивать активность промотора. Предполагается, что белок NR₁ взаимодействует с РНК-полимеразой, расположенной на промоторе. Посадка NR₁ на ДНК облегчает это взаимодействие, сопровождаемое, по-видимому, образованием петли ДНК.

Промотор гена глутаминсинтетазы замечателен не только тем, что он регулируется с участием минорной сигма-субъединицы и нуклеотидных последовательностей, удаленных на большие расстояния от старта транскрипции, но и тем, что действие регуляторного белка модулируется не путем связывания лигандов-эффекторов, которыми могли бы быть глутамин или глутаминовая кислота, а путем химической модификации -- фосфорилирования и дефосфорилирования NR₁,-- осуществляемой несколькими ферментами, реагирующими на обеспеченность клетки источниками азота.

Гуанозинтетрафосфат

Во всех до сих пор рассмотренных примерах регуляции транскрипции на взаимодействие PHК-полимеразы с промотором влияли белки. Регуляция синтеза рибосомных РНК дает пример того, что с РНК-полимеразой могут непосредственно реагировать и низкомолекулярные эффекторы.

В хромосоме Е. coli имеется 7 копий генов рибосомных PHК. Эти гены организованы в 7 оперонов и располагаются в каждом из них по направлению транскрипции в последовательности 16S-- 23S -- 5S. Перед каждым опероном располагается по два промотора, Р1 и Р2, отстоящих друг от друга на расстоянии более 100 п. н. Р1 является сильным промотором, Р2 -- относительно слабым.

Синтез рибосомных РНК строго скоординирован с синтезом рибосомных белков так, что в клетках в заметных количествах не обнаруживается ни свободных рибосомных РНК, ни свободных рибосомных белков. Скорость образования рибосом регулируется: в

быстро растущих на богатых питательных средах культурах эта скорость высокая, в медленно растущих на бедных средах -- низкая. Механизмы координированной регуляции синтеза компонентов рибосом отличаются большой сложностью и изучены еще недостаточно. Здесь будет рассмотрен только один элемент этой регуляции, основанной на взаимодействии с РНК-полимеразой низкомолекулярного эффектора гуанозинтетрафосфата. Этот нуклеотид синтезируется на рибосомах в условиях аминокислотного голодания клеток- Накопление гуанозинтетрафосфата в голодающих по аминокислотам клеткам приводит к значительному замедлению синтеза рибосомных РНК и мРНК рибосомных белков и может стимулировать транскрипцию оперонов биосинтеза аминокислот.

Добавление гуанозинтетрафосфата к очищенной РНК-полимеразе подавляет транскрипцию оперона рибосомной РНК с промотора Р1, но не влияет на транскрипцию с Р2. Поэтому подавление транскрипции рибосомной РНК гуанозинтетрафосфатом никогда не бывает полным.

В пользу того, что и в живых клетках гуанозинтетрафосфат действует непосредственно на РНК-полимеразу, свидетельствует получение мутаций, изменяющих ее в-субъединицу и приводящих к нечувствительности синтеза РНК к гуанозинтетрафосфату.

Регуляция транскрипции в терминаторах прокариот

Очевидная роль терминаторов транскрипции состоит в прекращении синтеза РНК в концах оперонов, что обеспечивает независимую регуляцию экспрессии различных участков ДНК- Но терминаторы встречаются и внутри оперонов. Эффективность этих «внутренних» терминаторов может регулироваться, что позволяет клетке изменять скорость синтеза РНК на участках ДНК, расположенных за терминаторами, не меняя скорости синтеза РНК на участках, расположенных перед терминаторами. Прежде чем переходить к обсуждению функционального смысла и механизмов такой регуляции, в которой участвуют специальные белковые факторы и рибосомы, рассмотрим процесс терминации в отсутствие факторов.

В их отсутствие РНК-полимераза способна терминировать синтез РНК лишь на некоторых терминаторах, нуклеотидная последовательность в районе которых отличается двумя характерными особенностями. В них по ходу транскрипции сначала идет GC-богатый участок, обладающий центральной симметрией, а затем участок из

• 8 расположенных подряд А в значащей нити. Транскрипция заканчивается на конце олигоА последовательности или сразу за ней. Предполагается, что после прохождения РНК-полимеразой GС-богатого участка с центральной симметрией в РНК-продукте возникает шпилька, приводящая к остановке РНК-полимеразы и разрушению части РНК. ДНК гибрида транскрибирующего комплекса. Оставшаяся часть РНК. ДНК гибрида, содержащая концевую олигоU последовательность РНК, легко плавится ввиду относительной нестабильности rU•dA-nap, что приводит к освобождению РНК-продукта. Первым из комплекса освобождается РНК- продукт, а затем РНК-полимераза. В какой момент происходит охлопывание нитей ДНК, пока не известно.

Эффективность терминации зависит от прочности терминаторной шпильки в РНК. Это видно из того, что мутации, приводящие к нарушению комплементарного спаривания какого-либо основания в шпильке, ослабляют терминацию, а мутации, восстанавливающие комплементарность, усиливают терминацию. Усиление прочности РНК-ДНК гибрида в районе олигоU ослабляет терминацию. Такое усиление происходит при уменьшении длины олигоA в матрице (минимальный размер этой последовательности, при котором терминация еще возможна, четыре нуклеотида).

Таким образом, эффективность терминации зависит, по-видимому, от баланса стабильности различных РНК:РНК и РНК : ДНК двойных спиралей. В энергетику этого баланса вносит вклад и РНК-полимераза, так как определенные мутации, затрагивающие РНК-полимеразу, влияют на эффективность терминации. Эти же мутации влияют и на продолжительность пауз транскрипции, что подтверждает представление о том, что подготовительной стадией терминации является пауза.

Терминация в отсутствие факторов, по-видимому, не полностью моделирует этот процесс в том виде, как он протекает в живой клетке. Действительно, на ряде терминаторов очищенная РНК- полимераза завершает синтез молекул РНК, отступя на несколько нуклеотидов от того места, где она завершает его в живой клетке, и с меньшей эффективностью. Недавно обнаружен белковый фактор, названный тау(т), который улучшает эффективность и точность терминации на таких терминаторах. Механизм его действия еще не изучен. Многие терминаторы узнаются РНК-полимеразой только с помощью фактора терминации, названного с. Этот белок с молекулярной массой 46 кД обладает РНК-зависимой нуклеозидтрифосфатаз- ной активностью, обязательной для терминирующего действия. НТФазная активность фактора р проявляется только в комплексе с однонитевой РНК- Наибольшей НТФазной активностью р-фактор обладает в присутствии полицитидиловой кислоты. Фактор р агрегирует с образованием гексамера, способного связываться с РНК- В комплексе с РНК гексамер защищает в ней от действия PHК азы 80--90 нуклеотидов, так что каждый мономер связывает по 12--14 нуклеотидов PHК. Фактор с присоединяется к РНК-продукту до того, как РНК- полимераза достигает терминатора. Присоединение происходит к определенным участкам РНК, в нуклеотидной последовательности которых пока не обнаружено каких-либо характерных особенностей. Ясно лишь, что эти участки не склонны к образованию протяженных двуспиральных структур.

В местах с-зависимой терминации РНК-полимераза делает паузы в отсутствие с-фактора, поэтому считается, что роль с-фактора заключается в вытеснении РНК из транскрипционного комплекса в местах пауз. Рассматриваются две модели. Согласно одной из них, фактор движется по синтезируемой РНК, а в местах пауз, догоняет РНК-полимеразу и вытесняет РНК-продукт. Другая модель основана на том, что пирофосфат подавляет НТФазную активность с-фактора. Согласно этой модели, с-фактор движется за РНК-полимеразой без отставания, но при нормальной скорости элонгации ингибируется пирофосфатом, высвобождающимся при синтезе РНК- Активация с-фактора происходит лишь в местах пауз, где синтез цепи РНК временно останавливается, что приводит к прекращению освобождения пирофосфата.

Конкретный механизм вытеснения РНК из транскрипционного комплекса под действием с-фактора еще не выяснен. Это вытеснение сопряжено с гидролизом НТФ, при котором, по-видимому, происходит конформационное изменение с-фактора. В результате этого изменения РНК вытесняется из комплекса либо непосредственно с-фактором, либо за счет воздействия на РНК-полимеразу.

Однако с-фактор вызывает терминацию не во всех местах пауз- _ч Например, в случае транскриптов, инициированных на уже известном нам промоторе P_R фага л, с-зависимая терминация происходит лишь в местах пауз, расположенных от промотора на расстояниях, больших 290 н. п., хотя длительные паузы возникают и в более близких к промотору местах. Анализ нуклеотидной последовательности показывает, что начальная часть РНК способна образовывать большое число двунитчатых структур. По-видимому, в данном случае сильно развитая вторичная структура транскрипта мешает связыванию с ним с-фактора, без которого терминации в местах пауз не происходит.

Связыванию с-фактора с РНК мешают также рибосомы, транслирующие РНК, поэтому на с-зависимых терминаторах, встречающихся внутри структурных генов, с-фактор не обеспечивает терминации, если мРНК эффективно транслируется. Наличие таких терминаторов внутри генов, по-видимому, не случайно. Когда синтез белка по каким-либо причинам подавлен, они сигнализируют РНК-полимеразе о том, что мРНК не транслируется и синтез ее бессмыслен.

Аттенюаторы

Регулируемые терминаторы бактерий называют аттенюаторами (ослабителями). Впервые обнаружен и лучше других изучен аттенюатор триптофанового оперона Е. coli. Этот оперон состоит из пяти генов, кодирующих ферменты биосинтеза триптофана. Регуляцию осуществляют две системы, чувствующие потребность клетки в триптофане. Первая система влияет на эффективность инициации на промоторе оперона. Репрессор триптофанового оперона в комплексе с триптофаном присоединяется к оператору, расположенному перед стартовой точкой транскрипции в районе «--10», и стерически препятствует РНК-полимеразе присоединяться к промотору. Таким образом, при избытке триптофана оперон репрессирован. В отсутствие триптофана репрессор теряет способность связываться с оператором, в результате чего оперон индуцируется. Эту систему дополняет регуляция в аттенюаторе, расположенном на расстоянии 180 п. н. от стартовой точки транскрипции внутри «лидерной» последовательности, предшествующей инициирующему кодону первого структурного гена. В условиях избытка триптофана лишь одна из десяти молекул РНК-полимеразы, начавших синтез РНК на триптофановом промоторе, преодолевает этот терминатор и переходит в область структурных генов. При уменьшении количества триптофана доля молекул РНК-полимеразы, преодолевающих аттенюатор, возрастает.

Перед аттенюатором располагается несколько областей с центральной симметрией. Образующаяся на них лидерная РНК содержит четыре участка, способных образовывать шпильки в различных сочетаниях (рис. 95). Могут образоваться шпильки 1 : 2 и 3 : 4; шпилька 2 : 3 при этом образоваться не может. Если образуется шпилька 2 : 3, то не могут образовываться шпильки 1 : 2 и 3 : 4. Шпилька 3 : 4 представляет собой терминаторную шпильку, характерную для обычных с-независимых терминаторов, так как после нее в РНК следует несколько U подряд. Поэтому при образовании этой шпильки в аттенюаторе происходит терминация. Эффективность ее составляет около 80--90 %. Если же шпильки 3 : 4 не образуется (за счет образования шпильки 2 : 3), то терминации не происходит.

Образование альтернативных шпилек в лидерной области, от которых зависит терминация в аттенюаторе, определяется тем, как транслируется лидерная РНК (рис. 96). Эта РНК кодирует так называемый лидерный пептид, содержащий два триптофановых остатка подряд. Если этот пептид не транслируется, то вторичная структура РНК формируется по мере ее роста и выхождения из транскрипционного комплекса: сначала формируется шпилька 1 : 2, что делает невозможным образование шпильки 2 : 3, а затем шпилька 3:4, что приводит к терминации синтеза РНК- Если в клетке имеется недостаток триптофана, то рибосома, транслирующая лидер-

ный пептид, задерживается на его триптофановых кодонах. Эти кодоны расположены так, что, находясь на них, рибосома прикрывает последовательность 1 и мешает образованию шпильки 1 : 2. В результате становится возможным образование «антитерминатор- ной» шпильки 2 : 3. Терминации не происходит, и РНК-полимераза переходит в область структурных генов.

Сходная система регуляции в аттенюаторе используется в опе- ронах, отвечающих за синтез других аминокислот у Е. coli. В лидерных РНК этих оперонов закодированы специфические пептиды, включающие по нескольку остатков той аминокислоты, биосинтез которой определяется опероном. Если в лидерном пептиде триптофа- нового оперона содержится два тандемно расположенных остатка триптофана, то в лидерном пептиде фенилаланинового оперона -- последовательно семь остатков фенилаланина, в которые вклинивается один остаток аланина и один остаток треонина, в лидерном пептиде гистидинового оперона -- подряд семь остатков гистидина, в лидерном пептиде лейцинового оперона -- четыре остатка лейцина подряд и т. д. При отсутствии соответствующей аминокислоты рибосома задерживается на ее кодонах и обеспечивает образование «антитерминаторной» шпильки.

Аттенюаторы могут регулироваться и в зависимости от уровня нуклеозидтрифосфатов. Например, в руr-опероне в лидерной РНК 'возможно образование двух шпилек, одна из которых является терминаторной. Первая от промотора шпилька вызывает при низкой концентрации UTP паузу транскрипции; в результате рибосома, синтезирующая лидерный пептид, догоняет РНК-полимеразу и мешает образованию терминаторной шпильки. При высокой концентрации UTP пауза не возникает и первой успевает образоваться антитерминаторная шпилька.

Аттенюатор может быть настроен на количество рибосом в клетке. Например, в случае оперона в-лактамазы Е. coli р-независимый терминатор, расположенный в конце лидерной РНК, перекрывается с участком связывания рибосом. В результате при высокой концентрации рибосом вероятность нарушения структуры терминаторной шпильки больше, чем при низкой. Поскольку концентрация рибосом в быстро делящихся клетках выше, чем в медленно делящихся, синтез в-лактамазы оказывается скоординированным со скоростью деления клеток.

Аттенюатор может регулироваться и без участия рибосом (или, говоря осторожнее, без трансляции лидерной РНК). Так, лидерная РНК триптофанового оперона Вас. subtilis не кодирует лидерного пептида. Тем не менее эффективность терминации в аттенюаторе зависит от концентрации триптофана. Предполагается, что баланс в образовании терминаторной и антитерминатор ной шпильки в лидерной РНК определяется специальным белком, присоединяющимся к лидерной РНК и блокирующим образование антитерминатор ной шпильки.

Своеобразная форма аттенюаторной регуляции обнаружена в сrр-опероне, кодирующем БАК. Этот оперой авторегулируется, т. е. его транскрипция подавляется БАК в комплексе с сАМР. В районе промотора этого оперона имеется участок связывания БАК. Оказалось, что, связываясь с этим участком, БАК активирует транскрипцию с другого, направленного в противоположную сторону промотора, с которого образуется РНК, комплементарная первым 11 нуклеотидам сгр-РНК- В результате «антилидерная» РНК образует двунитевую структуру с сrр-РНК, сходную с терминаторной шпилькой, что приводит к терминации едва начатой с рРНК.

Антитерминация у фага л и в генах рибосомных РНК

Включение определенных генов фага л происходит за счет выключения p-зависимых и p-независимых терминаторов, расположенных перед ними, под действием белка, кодируемого геном N. Кроме фагового N-белка в антитерминации участвуют по крайней мере три белка, кодируемых клеткой-хозяином, из которых более подробно изучен белок, кодируемый геном nusA, который способен взаимодействовать с минимальной РНК-полимеразой, занимая на ней место у-субъединицы. Хотя белок NusA является компонентом системы антитерминации, сам по себе он способен удлинять паузы в некоторых участках ДНК и даже вызывать терминацию.

Белки, участвующие в антитерминации, присоединяются к транскрибирующему комплексу до того, как он достигает терминаторов.

Присоединение белков-антитерминаторов происходит в то время, когда PHК-полимераза проходит специальный сигнал антитерминации, так называемый участок nut. Этот участок располагается между промотором и терминатором в нетранслируемой части транскриптона. Предполагается, что в тот момент, когда PHК-полимераза достигает участка nut, к ней присоединяется белок Nus А. После этого с комплексом связывается с-фактор. При дальнейшем продвижении РНК-полимеразы в пределах nut-участка в комплекс включаются белок N и другие белки, необходимые для антитерминации. В такой «регулосоме» PHК-полимераза приобретает особую конформацию, которая позволяет ей проходить через любые сигналы терминации, расположенные на значнтезьном расстоянии от участка nut.

Участки, сходные по последовательности с nut-участками фага л, обнаружены и в некоторых оперонах хромосомы Е. coli, в частности в оперонах рибосомных РНК. Внутри этих оперонов имеются с-зависимые терминаторы, на которых, однако, в норме терминации не происходит. С низкой эффективностью идет в этих оперонах терминация и на искусственно введенных с-зависимых терминаторах. Терминаторы внутри генов рибосомной РНК, по-видимому, не нужны для его функционирования. Они просто там есть, потому что некоторые последовательности, необходимые для функционирования рРНК, проявляют терминирующие свойства. Когда такие последовательности встречаются в составе мРНК, с терминацией борется рибосома, осуществляющая трансляцию. Поэтому в отсутствие трансляции внутри многих генов происходит терминация транскрипции. В случае рибосомных РНК, которые никогда не транслируются, для борьбы с терминацией в ненужных местах предусмотрена система антитерминации, формирующаяся в начале оперона. Какие белки принимают участие в этой системе, еще не ясно.

Процессинг первичных транскриптов

Молекулы предшественников зрелых клеточных РНК подвергаются расщеплению и химической модификации. Совокупность биохимических реакций, в результате которых уменьшается молекулярная масса РНК-предшественника и осуществляются разные способы химической модификации с образованием зрелых молекул РНК, называют процессингом. Процессинг наблюдается и в прокариотических клетках, но особенно сложны превращения предшественников клеточных РНК в ядрах эукариот. Хромосомы эукариотической клетки, в которых осуществляется транскрипция, локализованы в ядре и отделены двойной ядерной мембраной от цитоплазмы, где протекает трансляция. В ядре синтезируются предшественники всех типов цитоплазматических РНК- Зрелые молекулы РНК транспортируются в цитоплазму. Механизм транспорта РНК из ядра в цитоплазму исследован недостаточно. Полагают, что процессинг РНК с образованием зрелых молекул продолжается и в ходе их транспорта в составе рибонуклеопротеидных частиц через поры ядерных мембран. В клетках эукариот только незначительная часть, около 10°ь, транскрибируемых в ядре последовательностей ДНК выявляется в составе цитоплазматических мРНК. Основная часть новообразованной РНК распадается в ядре и не обнаруживается в цитоплазме.

Исследование закономерностей процессинга необходимо для выяснения механизмов регуляции экспрессии генов. Рассмотрение этапов процессинга и его вариантов у разных организмов затрагивает также ряд других принципиальных проблем. Оказалось, что молекула РНК и в отсутствие белка может выступать как аутокатализатор, осуществляя благодаря конформационной гибкости молекулы сложную и точную собственную перестройку с образованием новых ковалентных связей. Таким образом, полирибонуклеотиды могут функционировать подобно ферментам. Открытие возможности аутокаталитнческих превращений полирибонуклеотидов показало, что исследование процессинга РНК имеет прямое отношение к вопросу о пребиотических стадиях эволюции макромолекул.

• Процессинг у прокариот

В бактериальных клетках большей частью образуются и транслируются полнцистронные мРНК, однако некоторые типы мРНК моноцистронные.

Процессинг предшественников мРНК не характерен для бактеральных клеток, хотя случаи процессинга обнаружены, например, при транскрипции оперона, кодирующего рибосо- мальные белки (LI, L7. 12) и субъединицы РНК-полнмеразы (в и в'). Гены расположены в следующем порядке: Ll>L7/12>в>в' Транскрипция идет в направлении от L1 к в' Созревание полицист- ронной РНК осуществляется за счет эндонуклеазного расщепления РНК, в результате которого разъединяются мРНК для рибосомаль- ных белков и субъединиц РНК-полимеразы. Однако этот процесс, по-видимому, не является обязательным для обеспечения трансляции проксимальных LI, L7/12 или дистальных (в, в') генов.

Еще недавно считали, что полиаденилирование З'-конца мРНК происходит только в клетках эукариот. Теперь показано, что существенная часть мРНК бактерий также подвергается посттранскрипционному полиаденилированию.

Процессинг необходим в бактериальных клетках при образовании зрелых молекул рРНК и тРНК. Транскрипт-предшественник образуется на оперонах, включающих гены 16S, 23S, 5S и тРНК. В хромосоме Е. coli находятся 7 таких оперонов, различающихся друг от друга типами и числом генов для тРНК. Транскрипт, включающий около 5600 нуклеотидов, по-видимому, по мере своего образования подвергается действию эндонуклеаз и экзонуклеаз. Специфичность их действия в значительной степени обусловлена особенностями вторичной структуры образующегося транскрипта. РНКаза III (эндонуклеаза) атакует двунитевые участки (черешки) петель, включающие последовательности будущих зрелых 16S (1542 нуклеотида) и 23S (1904 нуклеотида) рРНК. В результате осуществляется одновременное созревание 5"- и З'-концов рРНК. Вслед за РНКазой III, вероятно после взаимодействия транскрипта с рибосомными белками, в процессинге примут участие и другие эндонуклеазы (М-эндонуклеаза, от англ, maturation -- созревание). Действие всех эндонуклеаз сопровождается образованием 5'-Р- и З'-ОН-концов. В структурах, расщепляемых РНКазой III, не обнаружено сходства на уровне нуклеотидной последовательности, за исключением общего требования -- двунитевой структуры, которая окружает или включает сайт расщепления. Подобным образом действует и РНКаза, участвующая в процессинге 5S РНК.

Функциональный смысл такого способа организации оперонов рРНК и процессинга транскрипта не совсем ясен. Можно предполагать, что многоступенчатость процессинга позволяет на каждой его стадии регулировать скорость образования зрелых РНК. Кроме того, локализация в одном первичном транскрипте будущих 16S и 23S рРНК, входящих в состав малой и большой субъединиц рибосом, автоматически обеспечивает их образование в равных молярных соотношениях.

ПРОЦЕССИНГ рРНК у ЭУКАРИОТ

Гены рРНК у эукариот представлены тандемно повторяющимися копиями (100--400), служащими матрицами для образования транс- криптов, подвергающихся процессингу. Транскрибируемые последовательности разделены спейсерами, также играющими большую роль в транскрипции рРНК и ее регуляции. В результате процессинга, в ходе которого метилируется ряд рибозных остатков, из молекулы предшественника выхцепляются три типа рРНК: 18S, входящая в состав малой субъединицы рибосом, а также 28S и 5.8S, локализующиеся в большой субъединице.

У некоторых организмов в составе предшественника 28S РНК находится вставка -- интрон, который удаляется при процессинге. Сшивание фрагментов молекулы РНК при удалении интрона получило название сплайсинга. Сплайсинг фрагментов РНК большой рибосомальной субъединицы обнаружен и изучен у ресничной инфузории Tetrahymena при функционировании генов «вегетативного ядра» -- макронуклеуса, а также при процессинге митохондриальной рибосомальной РНК у дрожжей. Исследование сплайсинга предшественника рРНК инфузорий in vitro выявило удивительный результат. Оказалось, что удаление интрона и сплайсинг можно наблюдать не только в изолированных ядрах, но и при инкубации очищенного предшественника рРНК в отсутствие белка. В последнем случае процесс идет медленнее, но достаточно эффективно, если присутствуют ионы магния и гуанозин (или GMP, GDP, GTP). Таким образом, наблюдается аутокаталитический процесс само- сплайсинга (англ, selfsplicing), в результате которого в молекуле РНК разрываются одни межнуклеотидные ковалентные связи и устанавливаются новые. Реакция идет по механизму трансэтерификации: З'-ОН-группа гуанозина атакует фосфодиэфирную связь между 3'- концом первого экзона и первым нуклеотидом нитрона, причем гуанозин присоединяется к 5'-концу нитрона . На следующем этапе З'-ОН-группа на конце первого экзона атакует другой конец интрона. Реакция трансэтерификации сопровождается вы- щеплением интрона, молекула РНК подверглась самосппайсингу. Обе стадии сплайсинга осуществляются путем трансэтерификации, причем в итоге число эфирных связей не меняется. Поэтому сплайсинг может осуществляться без внешнего источника энергии, в отсутствие АТР или GTP.

Вырезание интрона происходит очень точно; это обеспечивается наличием сложной вторичной и третичной структуры РНК. Нуклеотидная последовательность интрона с учетом комплементарных взаимодействий отдельных участков может быть представлена в виде достаточно сложной структуры. Сходную структуру имеет интрон предшественника рРНК митохондрий. Замены отдельных нуклеотидов в составе интрона обнаруживают необходимость отдельных элементов его структуры для самосплайсинга. Например, нарушение комплементарности в районе А препятствует сплайсингу. Оказывается, что для правильного сплайсинга необходимы также комплементарные взаимодействия нуклеотидов (вне плоскости рисунка ) в элементах Б и В. Замена нуклеотида в районе Б, нарушившая комплементарность и сплайсинг, может быть компенсирована другой нуклеотидной заменой в районе В, если она восстановит комплементарные взаимодействия. Каталитические свойства определяются особой структурой РНК, создаваемой в результате комплементарных взаимодействий.

Нуклеотидные последовательности этих элементов структуры сохраняются в эволюции. Интроны с подобной структурой и со способностью к «самовырезанию» из предшественника обнаружены в генах трех разных клеточных органелл: в ядрах инфузорий, митохондриях дрожжей и хлоропластах растений. Обнаружение самосплайсинга предшественника рРНК показывает, что молек\ла РНК может выступать как катализатор или, вернее, как квазикатализатор, поскольку в процессе реакции меняется структура РНК- Подобный случай сплайсинга (самосплайсинга) обнаружен и в прокариотических системах при исследовании экспрессии гена тимн- дилатсинтазы фага Т4, заражающего клетки Е. coli. Ген, кодирующий тимидилатсинтазу, содержит интрон, выщепляемый при процессинге мРНК.

Способность РНК осуществлять биокатализ ярко проявляется также при исследовании процессинга предшественников тРНК.

ПРОЦЕССИНГ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ тРНК У ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

Выщепление предшественника молекулы тРНК из состава первичного транскрипта у бактерий осуществляется с помощью РНКазы III. Предшественник тРНК содержит около 100 нуклеотидов, а зрелые тРНК -- 70--90 нуклеотидов. Процессинг 5'- конца предшественников (англ, precursors) тРНК осуществляется с помощью РНКазы Р. По-видимому, РНКаза Р осуществляет процессинг 5'-конца всех тРНК бактериальной клетки.

Процессинг 3'-конца осуществляется с помощью РНКазы D (D -- digestion), представляющей собой экзо-З'-нуклеазу. Это непроцессивный фермент, при работе которого комплекс с субстратом диссоциирует после каждого акта отщепления нуклеотида. Скорость отщепления резко падает, когда нуклеаза достигает три нуклеотидной последовательности ССА_он, необходимой для взаимодействия с аминоацил-тРНК-синтетазой при образовании аминоацил-тРНК. При созревании некоторых видов тРНК З'-конец ССА₀н образуется заново в результате последовательных нуклеотид илтрансферазных реакций.

Узнавание тРНК-предшественника РНКазой Р осуществляется при ее взаимодействии со зрелой «клеверной» (или L-образной) структурой молекулы тРНК, причем отщепление с б'-конца нескольких нуклеотидов, варьирующих в разных тРНК, осуществляется с удивительной точностью. Фермент состоит из двух компонентов: РНК и основного белка с М_г=17 000. Подобный фермент функционирует и при процессинге тРНК у эукариот. РНК-компонент нук- леазы Р Е. coli (Ml РНК, от англ, maturation -- созревание) содержит 400 нуклеотидов, в клетках дрожжей -- 250 нуклеотидов и в клетках человека -- около 100 нуклеотидов. Оказалось, что в присутствии высоких концентраций магния молекула РНК без белка способна катализировать созревание предшественника тРНК. Ферментативной активностью обладает РНК, а белок сам по себе неактивен, но усиливает каталитическую активность РНК. В его присутствии также расширяется ассортимент расщепляемых in vitro предшественников тРНК- В РНК-компоненте РНКазы Р имеются последовательности, комплементарные инвариантным районам молекул тРНК. В процессе реакции несомненно происходят взаимные конформационные структурные перестройки Ml РНК и тРНК, которые значительно легче протекают в присутствии белка, однако детали этого процесса не выяснены. Мутантные тРНК с нарушенной вторичной или третичной структурой не подвергаются процессингу. Удается осуществить реконструкцию активной РНКазы Р, если объединять белковый и PH К-компоненты, взятые из разных источников, например из клеток бактерий и человека. РНК-ком- поненты РНКазы Р разного происхождения не обладают гомологией по нуклеотидной последовательности, хотя отдельные короткие участки молекулы могут сохранять большое сходство. Следовательно, за узнавание РНК другой РНК могут отвечать как общая кон- формационная структура РНК, так и конкретные нуклеотидные последовательности. Вероятно, в процессе эволюции отбор был направлен на поддержание тех функциональных свойств субъединиц РНКазы Р, которые обеспечивают сохранность структур высшего порядка.

РНКаза Р представляет собой удивительную модель, пригодную для выяснения закономерностей белково-нуклеинового узнавания и позволяющую исследовать, каким образом белок, необходимый для работы фермента в клетке, может облегчать катализ, осуществляемый РНК..

РНК в составе РНКазы Р выступает как настоящий катализатор, свойства которого определяются нативной структурой РНК- Отмечают общность характеристик каталитических процессов, осуществляемых белками и РНК. В обоих случаях катализ основан на способности образовывать специфические комплексы с субстратом, характеризуется высокой субстратной специфичностью, а кинетика процесса описывается уравнением Михаэлиса -- Ментен. Молекулы РНК, способные осуществлять биокатализ, называют рибозимами. Рибозимы отличаются от белков-катализаторов значительно меньшим разнообразием боковых радикалов. Вероятно, как это предвидел Крик, молекулы РНК на заре жизни представляли собой простейшие катализаторы (автокатализаторы), которые способствовали возникновению разнообразия нуклеотидных последовательностей. Скорее всего, именно они были способны к пребиотической эволюции, а затем сыграли большую роль в эволюции живых систем. Однако рибозимы -- это не «молекулярные ископаемые» в ряду биологических катализаторов, они сохранились и активно функционируют в клетках про- и эукариот до наших дней.

Особенности процессинга тРНК у эукариот обусловлены тем, что ядерные предшественники многих тРНК содержат интрон. Сразу за антикодоном (от 5'-конца тРНК) следует нуклеотид, вслед за которым начинается последовательность одного интрона, обычно включающая 14--16 нуклеотидов (рис. 100, а). Созревание тРНК требует удаления интрона и сплайсинга. Сплайсинг предшественника тРНК в отличие от сплайсинга ядерных предшественников рРНК у инфузорий целиком зависит от присутствия белков-ферментов. Механизм реакций сплайсинга предшественником тРНК с участием ферментов, очищенных из дрожжей, изображен на рис. 100, б. Эндонуклеаза расщепляет РНК в двух сайтах сплайсинга, образуя на концах сшиваемых экзонов 2'--3'-циклофосфат и 5'-ОН-группу. Эндонуклеазная активность связана с ядерной мембраной. Это обстоятельство указывает на сопряженность процессинга с транспортом тРНК из ядра в цитоплазму. Следующие химические реакции (киназная реакция, в результате которой фосфорилируется 5'-конец, его аденилирование и, наконец, активность 3'-фосфодиэсте- разы, в результате которой 2'--3'-циклофосфат превращается в 2'- фосфат), а также сама лигазная реакция, по-видимому, обеспечиваются одним полипептидом. Последоватетьность и механизм реакций сплайсинга при созревании тРНК млекопитающих может в деталях отличаться от представленной схемы. В следующем разделе будет рассмотрен механизм сплайсинга предшественников информационной РНК (мРНК), который осуществляется другими путями.

ПРОЦЕССИНГ РНК, СИНТЕЗИРУЕМЫЙ С ПОМОЩЬЮ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ II, У ЭУКАРИОТ

Модификация 5' -конца РНК и сплайсинг

РНК полимераза II транскрибирует все гены эукариот, кодирующие белки, а также малые ядерные РНК и, по-видимому, РНК-компо- нент РНКазы Р. Рассмотрим лишь наиболее изученный механизм процессинга транскриптов, приводящий к образованию зрелых молекул мРНК, обычно содержащих 1500--2000 нуклеотидов.

Протяженность первичных ядерных транскриптов, образуемых РНК-полнмеразой II, сильно варьирует, но может достигать десятков тысяч нуклеотидных пар, т. е. соответствует размерам ряда эукариотических генов . При исследовании клеточного ядра специальными методами электронной микроскопии удается обнаружить транскрипционные комплексы. Продвижение РНК-полимеразы по ДНК сопровождается образованием транскриптов, которые, взаимодействуя с белками, упаковываются в рибонук- леопротеидные комплексы.

Протяженные транскрипты эукариотических генов содержат последовательности нитронов, которые при образовании мРНК вырезаются, тогда как нуклеотидные последовательности экзонов сшиваются, т. е. происходит процесс сплайсинга.

Разорванные (мозаичные) гены, составленные из экзонов и нитронов, характерны для самых разных представителей эукариот -- растений, дрожжей, различных беспозвоночных (черви, насекомые), птиц и млекопитающих, включая человека. Наличие и расположение интронов удается наглядно показать при исследовании гибри. дов клонированных фрагментов геномной ДНК и зрелых мРНК, Участки геномной ДНК, включающие интроны, образуют петли, поскольку они не гибридизуются с мРНК- На рис. 103 демонстрируется структура таких гибридов мРНК и ДНК в случае гена а-кол- лагена цыпленка.

Число интронов может сильно варьировать: от одного в гене актина дрожжей до нескольких десятков (17 в гене 6-кристаллина птиц, 31 в гене вителлогенина птиц и 50 в гене проколлагена млекопитающих). Интроны могут составлять большую часть мозаичного гена. Суммарная нуклеотидная длина интронов может превышать во много раз длину экзонов. Например, в гене проколлагена птиц экзоны составляют лишь восьмую часть общей длины гена, а в гене тиреоглобулина млекопитающих -- лишь двадцатую. Экзонами называют не “Только те районы гена, которые содержат последовательности, кодирующие участки полипептидной цепи, но и районы, транскрипты которых входят в состав зрелых мРНК, но не транслируются. Эти районы соответствуют «лидерной» области перед инициирующим кодоном или в нетранслируемой части на 3'-конце мРНК вслед за терминирующим триплетом. Иногда, как это показано на рис. 102, а, лидерная зона соответствует отдельным экзонам (ген овальбумина птиц или инсулина млекопитающих), З'-нетранслируемый конец также может быть представлен отдельным экзоном (мРНК фибриногена крысы).

Инициация транскрипции сопровождается модификацией 5'- кониа РНК с образованием специфической нуклеотидной структуры, в которой Х7-метилированный остаток гуанозин-5'-трифосфата соединен 5'--5'-фосфодиэфирной связью с концевым нуклеотидом РНК. Это так называемый кэп (англ, cap), который присоединяется сразу после инициации транскрипции к адениловому или гуанило- вому остаткам. Поэтому сайт инициации транскрипции часто называют кэп-сайтом.

.Модифицированный 5'-конец обеспечивает эффективную трансляцию мРНК и удлиняет время ее жизни в клетке. Образование кэпа также способствует дальнейшему ходу процессинга. Узнавание кэпа, по-видимому, является важной стадией в процессе работы сложной ферментативной системы, осуществляющей сплайсинг.

Добавление структурных аналогов кэпа-динуклеотида -- m^:G(5)- р-р-р-5-N или гтгСТР -- сильно подавляет сплайсинг.

Транскрипция экзонов и интронов сложного эукариотического гена осуществляется в порядке их расположения друг за другом (ко.иинеарная транскрипция>, после чего вырезаются районы интронов, а экзоны сшиваются в результате сплайсинга. Порядок вырезания районов нитронов необязательно соответствует последовательности их расположения в гене. Образуется мРНК. в которой вслед за лидерной зоной следует так называемая «открытая рамка трансляции» (англ, open reading frame) -- последовательность триплетов, кодирующих полипептид, начинающаяся с инициирующего AUG. Сплайсинг должен быть очень точным, в противном случае ошибка на один нуклеотид может вызвать нарушение «рамки» трансляции, что приводит, например, к образованию терминирующих триплетов н остановке синтеза полипептида. Последовательность ДНК в нитроне начинается, как правило, с нуклеотидов GT с 5'-конца и заканчивается нуклеотидами AG. Соответственно в РНК последовательность интрона содержит по концам динуклеотиды GL и AG . Однако границы экзонов и интронов часто не удается определить с точностью до нуклеотида, поскольку в районе сайтов сплайсинга нуклеотиды могут быть повторены.

Нарушения сплайсинга могут быть губительны для организма. У человека известна аутосомная рецессивная мутация в гене фени- лаланингидроксилазы. В гомозиготном состоянии мутация приводит к заболеванию -- фен и л кетон у ри и, проявляющейся в резкой задержке развития и смерти в раннем детском возрасте при отсутствии специальной диеты. Это наиболее частый случай врожденных ошибок аминокислотного метаболизма (1 : 8000 в США). Отсутствие фермента, катализирующего гндроксилирование фенилаланина с образованием тирозина, приводит к накоплению фенилаланина и нарушению образования многих метаболитов, образующихся из ароматических аминокислот. Протяженный ген фенилаланингидрок- силазы человека, включающий окало 90 т. п. н., содержит 12 интронов, составляющих основную часть гена. Единственная замена в З'-районе 12-го интрона, превращающая канонический динуклеотид GT в АТ, приводит к нарушению сплайсинга и процессинга. Образующаяся аберрантная РНК, не содержащая концевого экзо- на, служит матрицей для трансляции преждевременно обрывающегося полипептида, который быстро распадается в клетке. Нарушения сплайсинга описаны также для генов человека, кодирующих глобины. Эти мутации у гомозигот приводят к болезням у человека, обусловленным недостаточностью того или иного типа глобина (гемоглобинопатии, или талассемии).