Основы молекулярной биологии и генной инженерии

Источники повреждения ДНК

• УФ излучение

• Радиация

• Химические вещества

• Ошибки репликации ДНК

Основные репарабельные повреждения в ДНК и принципы их устранения нуклеиновый кислота генный молекулярный

1. Апуринизация.

Масштабы апуринизации можно оценить по тому, что ДНК каждой клетки человеческого организма ежедневно теряет около 5000 пуринов. Результатом апуринизации является АР-сайт (англ, apurinic-apyrimidinic) -- дезоксирибоза, лишенная основания.Каждая соматическая клетка теряет за сутки около 10000 пуринов и пиримидинов.

Причины апуринизации: изменение рН, ионизирующее излучение, повышение температуры и т.д.

Разрывается N-гликозидная связь между пуриновым основанием и дезоксирибозой. Если бы апуриновые участки не исправлялись, то была бы катастрофа.

2. Дезаминирование.

При дезаминировании цитозин превращается в урацил, аденин -- в гипоксантин, а гуанин -- в ксантин. Наиболее вредно дезаминирование цитозина и аденина: обе реакции после репликации приводят к мутациям. Чаще всего дезаминируется цитозин; в ДНК каждой человеческой клетки за день происходит около 100 таких событий. При дезаминировании всех оснований возникают основания, не характерные для ДНК. Это обстоятельство позволяет репаративной системе клетки узнавать продукт дезаминирования и удалять его. Можно утверждать, что именно поэтому в ДНК в отличие от РНК вместо урацила присутствует тимин: урацил неотличим от продукта спонтанного дезаминирования цитозина.

3. Тиминовые димеры.

Под действием ультрафиолетого света происходит ковалентное сшивание рядом стоящих пиримидинов. При сшивании тиминов образуется циклобутановое производное, блокирующее репликацию. Фермент фотолиаза - узнает тиминовые димеры и на свету или в темноте образует с ними комплекс. При освещении видимым светом происходит активация фермента, циклобутановое кольцо разрывается, и вновь получаются два тимина. Этот процесс называется фотореактивацией.

Основные типы повреждения ДНК

• Повреждение одиночных нуклеотидов

• Повреждение пары нуклеотидов

• Разрыв цепи ДНК

• Образование поперечных сшивок между основаниями одной цепи или разных цепей ДНК

Многие канцерогены алкилируют, например метилируют, основания ДНК- Наиболее частые продукты этих реакций --это 0⁶-ме- тилгуанин, 7-метилгуанин и 3-метиладенин. Первое из этих изменений мутагенно, а два других делают еще более лабильной N-глико- зидную связь между основанием и сахаром, т. е. способствуют апуринизации.

Иногда может происходить размыкание пуринового кольца. Продукт формамидопиримидин представляет затруднение для репликации.

Главным нарушением, возникающим под действием ультрафиолета, является насыщение двойных связей оснований и образование пиримидиновых димеров из двух соседних пиримидинов цепи ДНК.

• Прямая реактивация повреждений ДНК

Ряд повреждений клетка удаляет из ДНК путем прямой реактивации. Так, по крайней мере у бактерий существует специальный фермент, метилтрансфераза, который переносит метильную или этильную группу с алкилированного основания на один из собственных цистеиновых остатков. Алкилированный в результате собственной активности белок инактивируется, но может служить регулятором активности своего гена и нескольких других (см. раздел 4 этой главы).

У многих организмов обнаружен фотореактивирующий фермент (PRE, англ, photoreactivating enzyme), или фотолиаза, репарирующий пиримидиновые димеры. Фотолиаза Е. coli -- это полипептид с молекулярной массой 35 кД, прочно связанный с маленькой молекулой РНК (10--15 нуклеотидов), необходимой для активности фермента. Фермент находит на ДНК образовавшийся под действием ультрафиолетового облучения (220--320 нм) пиримидиновый димер и прочно связывается с ним. При облучении такого комплекса видимым светом (300--600 нм) происходит фотохимическая реакция «расшивания» димера, обратная реакция его образования. После того как нормальная структура ДНК восстановлена, фермент теряет к ней сродство.

Другие виды репарации ультрафиолетовых повреждений ДНК называют темповой репарацией, чтобы отличить от прямой фотореактивации. Если невозможна прямая реактивация, работают механизмы эксци- зионной репарации, удаляющие из ДНК нарушенные участки. Так, практически на каждое аномальное основание, которое может возникнуть в ДНК, существует своя ДНК-N-гликозилаза -- фермент, с высокой специфичностью узнающий в ДНК определенное аномальное основание, например формамидопиримидин, и вырезающий его с разрывом N-гликозидной связи. У Е. coli есть около 20 различных ДНК-N-гликозилаз. Роль этих ферментов в репарации подтверждена исследованием мутантов: мутанты Е. coli по гену ung, кодирующему урацил-ДНК-гликозилазу, характеризуются повышенным уровнем спонтанного мутагенеза; повреждение гена tag, кодирующего 3-метиладенин-ДНК-гликозилазу, повышают чувствительность клеток к мутагену метилметансульфонату.

После действия ДHК-N-гликозилазы в ДНК остается АР-сайт. Репарация такого повреждения может идти одним из двух путей. У эукариот был обнаружен фермент ДНК-инсертаза, способный непосредственно пришивать к дезоксирибозе основание в соответствии с комплементарной цепью ДНК. Пока обнаружены лишь пуриновые инсертазы, видимо вследствие того, что апуринизация происходит значительно чаще, чем потеря пиримидинов. Второй путь репарации открывают ферменты, обнаруженные у всех организмов,-- АР-эндонуклеазы. АР-эндонуклеазы разрывают саха рофосфатный остов ДНК в АР-сайт. Существует два типа этих ферментов -- одни рвут фосфодиэфирную связь с З'-конца от АР-сайта, другие -- с 5'-конца. В некоторых случаях АР-эндонуклеаза и ДНК- N-гликозилаза совмещены на одном полипептиде. Например, эндонуклеаза III Е. coli -- это АР-эндонуклеаза и гликозилаза, специфичная к дигидро- и дигидрокситимину -- продуктам ультрафиолетового облучения. Разорванная после действия АР-эндонуклеазы цепь ДНК подвергается действию экзонуклеазы, удаляющей поврежденный участок. По крайней мере в некоторых случаях эту реакцию, видимо, осуществляет 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I, а полимеризующая активность заполняет образующуюся брешь. В том случае, если работают другие экзонуклеазы, брешь заполняет тоже ДНК-полимераза I. Остающийся разрыв сшивает ДНК-лигаза (рис. 45). Мутанты Е. coli с нарушенными ДНК-полимеразой I или ДНК-лигазой дефектны по эксцизионной репарации.

Несколько отличный путь используется для репарации повреждений ДНК, заметно нарушающих структуру молекулы, например пиримидиновых димеров, образующихся под действием ультрафиолета. Такие повреждения удаляет специальный фермент -- эндонуклеаза UvrABC (в темноте, когда не работает фотолиаза или когда повреждений в ДНК очень много). Эта нуклеаза разрывает фосфо- диэфирные связи с 5'- и с З'-конца от поврежденного участка, а затем с помощью белка UvrD, хеликазы II, поврежденный участок удаляется сопряженно с гидролизом АТР. Образующуюся брешь застраивает ДНК-полимераза I.

Видно, что эксцизионная репарация всегда использует один принцип: нарушенный участок ДНК удаляется, а затем восстанавливается на матрице ненарушенной комплементарной цепи ДНК. Другими словами, эксцизионная репарация основана на наличии в ДНК двух взаимокомплементарных цепей; более того, необходимость репарации -- одна из причин, обусловивших наличие в ДНК двойного избытка информации.

• Индуцируемая репарация

В условиях, увеличивающих количество повреждений ДНК, происходит индукция дополнительных репаративных ресурсов клетки. Классический пример индукции репарации -- так называемая реактивация Уэйгла. Это явление состоит в том, что облученный ультрафиолетом бактериофаг может размножаться только на тех бактериях, которые тоже облучены ультрафиолетом. Это значит, что для успешного развития фага необходима репарация его ДНК, которую могут осуществить лишь клетки с индуцированной системой репарации. Аналогичное явление наблюдается и для эукариотических клеток и их вирусов. У бактерий индуцируемая репарация используется лишь в тех случаях, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что это начинает угрожать клетке гибелью. Поэтому индицируемая система репарации называется SOS-системой или системой SOS-репарации. Степень индукции SOS-системы определяется количеством повреждений в ДНК: при небольшом количестве повреждений возрастает уровень некоторых репаративных белков, работавших и до индукции, например UvrA, В, С и D. При большем количестве повреждений блокируется деление клеток (в норме оно восстанавливается, если клетке удалось «починить» ДНК) и индуцируется синтез белка-продукта гена гесА, необходимого для рекомбинационной репарации и для дальнейшей индукции SOS-системы (см. ниже). При еще большем количестве повреждений ДНК индуцируются гены итиС и umuD, которые ответственны за особый путь репарации, сопряженный с возникновением мутаций. Механизм действия продуктов генов umuCD не ясен, но предполагается, что они позволяют

ДНК-полимеразе копировать нарушенный участок матрицы. Для этого продукты генов umuCD и reck должны изменить свойства ДНК-полимераз. Оказалось, что корректирующая активность г-субъединицы ДНК-полимеразы III специфически подавляется RecA-белком, связанным с поврежденным участком матрицы, например тиминовым димером. Можно думать, что продукты генов umuCD позволяют ДНК-полимеразе «в виде исключения» удлинять затравку, последний нуклеотид которой не спарен с матрицей. Подобное совместное действие продуктов генов umuCD и RecA-белка может быть полезным для выживания в условиях, когда поврежде

ний в ДНК очень много, в то же время очевидно, что активность генов umuCD приводит к появлению мутаций, поскольку при репликации напротив поврежденного участка матрицы, по-видимому, вставляется произвольный нуклеотид. В любом случае гены umuD и С обеспечивают весь мутагенный эффект ультрафиолетового облучения и многих химических мутагенов. Таким образом, мутагенез не является пассивным процессом, а требует активного вмешательства продуктов определенных клеточных генов. Эти генные продукты «обрабатывают» первичное нарушение в ДНК и лишь после этого возникает мутация.

Механизм индукции SOS-системы Е. coli основан на взаимодействии продуктов двух генов: recА и lexА. Белок LexA является репрессором и подавляет активность не менее 17 различных генов. Среди прочих LexA-белок подавляет собственный синтез и синтез белка RecA. Белок RecA способен связываться с поврежденными участками ДНК (например, с пиримидиновыми димерами в составе ДНК) или с продуктами деградации поврежденной ДНК (олигонуклеотидами), при этом RecA- белок приобретает способность связываться с белком LexA. Такое- связывание изменяет конформацию белка LexA и активирует его скрытую автопротеазную активность, что приводит к расщеплению- LexА-репрессора пополам. В результате репрессор инактивируется и происходит индукция всех подавляемых им генов, в том числе его собственного гена lexА. Когда исчезает индуцирующий сигнал (поврежденная ДНК), RecA-белок перестает связываться с LexA- репрессором и происходит быстрое возрастание концентрации последнего, поскольку ген lexА полностьюиндуцирован. В результате все гены SOS-системы подавляются. Индукция SOS-системы тонко настроена: для подавления разных генов SOS-системы нужны различные концентрации репрессора. Так как количество репрессора зависит от количества активированного RecA-белка, которое, в свою очередь, зависит от количества повреждений в ДНК, то степень индукции SOS-системы будет связана с количеством повреждений: при незначительных повреждениях ДНК индуцируется часть генов SOS-системы и лишь при очень сильном повреждении ДНК индуцируются все гены. Поскольку репарация -- процесс достаточно энергоемкий, индукция SOS-системы происходит только при условии благоприятного энергетического баланса клетки. Это обеспечивается тем, что RecA-белку для активации и связывания с LexA-репрессором необходим не только индуцирующий сигнал (поврежденная ДНК или продукты ее деградации), но и АТР.

Степень индукции SOS-системы в определенном смысле отражают «благополучие» клетки и ее шансы на выживание. Поэтому некоторые относительно автономные внутриклеточные генетические элементы, например умеренные бактериофаги, используют индукцию SOS-системы в качестве сигнала для размножения и уничтожения клетки-хозяина: безвредный до того участок хромосомы, «почувствовав» слабость хозяина, начинает размножаться и уничтожает его, чтобы спастись самому. Для фага лямбда показано, что чувствительность к состоянию индукции SOS-системы объясняется тем, что репрессор фага устроен аналогично белку LexA и «самораскусывается», связавшись с активированным RecA-белком.

SOS-система -- это не единственная индуцируемая система репарации у Е. coli. Совершенно другой набор генов индуцируется в ответ на алкилирующие соединения. Как было сказано, часть повреждений, вызываемых в ДНК этими соединениями, репарируется за счет прямой реактивации метилтрансферазой, которая сама при этом инактивируется. Оказалось, что алкилированная метилтрансфе- раза служит активатором транскрипции и повышает активность ряда генов, в том числе собственного гена ada и гена alkА, кодирующего ДНК-N-гликозилазу, специфичную к алкилированным основаниям. Обработка клетки небольшими количествами алкилирующих соединений вызывает 30-кратное увеличение уровня метилтрансферазы и предотвращает гибель клеток под действием существенно больших доз алкилирующих мутагенов.

• Репарация неспаренных нуклеотидов

Системы репликации и репарации ДНК хоть и очень редко, но все же ошибаются. В результате в ДНК может включиться «неправильный», т. е. не комплементарный матрице, нуклеотид. Другой источник неспаренных нуклеотидов -- гомологичная рекомбинация, в ходе которой образуются гетеродуплексы, состоящие из двух комплементарных цепей, исходно принадлежавших разным молекулам ДНК. Такие нарушенияструктуры ДНК репарируются, по крайней мере у бактерий и низших эукариот. Система репарации должна каким-то образом отличать друг от друга две цепи одной молекулы ДНК, чтобы решить, какой из двух неспаренных нуклеотидов «правильный», и заменить «неправильный» нуклеотид на нуклеотид, комплементарный «правильному».

В случае нарушений спаривания, возникающих в результате репликации или

репарации, новосинтезированная день ДНК некоторое время может отличаться от матричной цепи наличием одноцепочечных разрывов или брешей. Не исключено, что это различие использует система репарации, контролирующая правильность спаривания оснований. У Е. coli за такой контроль ответственны продукты генов recF и mutS. Для их действия необходим АТР, что наводит на мысль о направленном движении комплекса репаративных белков по одной из цепей ДНК начиная с одноцепочечного разрыва.

Другое отличие между ново- синтезированной и матричной цепями, по крайней мере у Е. coli, обусловлено метилированием ДНК. Метилаза, кодируемая геном dam, метилирует аденины в последовательности GATC. Большинство таких последовательностей метилированы в обеих цепях ДНК. После репликации возникает полуме-тилированная ДНК: последовательности GATC метилированы только в матричной, но не в новой цепиСо временем полуметилированные участки метилируются полностью, но пока отличие существует, оно служит указанием о направлении репарации неспаренных нуклеотидов для специализированной репарационной системы. В этой системе участвуют продукты генов mutH,mutL и mutS, SSB-белок и хеликаза II (UvrD-белок). Для работы системы необходим АТР и дезоксирибонуклеотиды. Скорее всего, dam -зависимая система репарации, обнаружив на одной молекуле ДНК неспаренные основания и полуметилированные участки, вносит в новосинтезированную ДНК разрыв и начиная от этого разрыва деградирует протяженный участок новой цепи, одновременно застраивая его заново. Мы еще раз убеждаемся в том, что поддержание высокой точности размножения и хранения информации обходится клетке дорого. Описанный механизм вносит вклад в эту точность. Мутации по генам mutH, L и S повышают частоту мутирования. К тому же эффекту приводят мутации по гену метилазы dam, или искусственно созданный в клетке избыток метилазы.

• Метилирование днк и «Горячие точки мутагенеза»

Метилирование не только способствует репарации ДНК, но может, напротив, облегчать мутагенез. В природе широко распространена метилирование цитозина. Каждый метилированный цитозин потенциально мутагенен, поскольку продуктом его спонтанного дезаминирования является тимин, нормальное для ДНК основание, а не урацил (продукт дезаминирования цитозина), который удаляется урацил-ДНК-гликозилазой. У Е. coli за счет активности гена dcm цитозины метилированы в последовательности CCAGG. Показано, что метилированный (внутренний)¹ цитозин в этой последовательности действительно является «горячей точкой мутагенеза».

+++

Дублирование информации в двух комплементарных цепях ДНК не позволяет безошибочно исправлять все типы повреждений. Описанные механизмы репарации не могут справиться с такими нарушениями структуры ДНК, как ковалентные межнитевые сшивки, которые могут возникать под действием ряда мутагенов, или двуцепочечные разрывы ДНК, вызываемые, например, г-облучением. Такие повреждения могут репарироваться только при наличии гомологичной неповрежденной молекулы ДНК, т. е. рекомбинационным путем. Рекомбинационная репарация будет рассмотрена в следующей главе.

Лекция 5-6. Транскрипция

транскрипция - это синтез всех видов РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

Транскрипция, как и репликация происходит по матричному синтез, т.е. имеется матрица ДНК и синтезируется новая дочерняя молекула которая антипараллельна и комплементарна матрице.

Синтез молекул РНК начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается в терминаторах. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции --- транскриптон.

В пределах каждого транскриптона копируется только одна из двух нитей ДНК, которая называется значащей или матричной. Во всех транскриптонах, считываемых в одном направлении, значащей является одна нить ДНК; в транскриптонах, считываемых в противоположном направлении, значащей является другая нить ДНК. Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК, а могут и перекрываться, в частности так, что в пределах участка перекрывания матричными оказываются обе нити. Разбиение ДНК на множество транскриптонов обеспечивает возможность независимого считывания разных генов, их индивидуального включения и выключения.

У эукариот в состав транскриптона, как правило, входит только один ген. Транскриптоны прокариот чаще называют оперонами многие из них содержат по нескольку генов, обычно функционально связанных, например, кодирующих ферменты синтеза той или иной аминокислоты. Существуют опероны, содержащие гены, не кодирующие белков (гены рибосомных РНК, тРНК и др.). Описаны смешанные опероны, включающие гены тРНК и белков.

Ген- это участок ДНК кодирующий один белок. Ген - это участок между промотором и терминатором. Это определенные сигналы ДНК с определенной последовательностью они означают начало и конец синтеза РНК. Транскрипция начинается на промоторе - это площадка для посадки фермента РНК-полимеразы на ДНК. Там имеется определенная последовательность, которая привлекает РНК-полимеразу, для ее опознания нужны еще дополнительны факторы. После того как РНК-полимераза села на промотор начинается синтез РНК. Он продолжается до участка с определенной последовательностью, которая называется терминатором. Он вызывает окончание синтеза и диссоциацию РНК-полимеразы от ДНК.

• PHК-полимеразы

У бактерий молекула РНК-полимеразы состоит из двух компонентов: минимальной РНК-полимеразы, или «кор»-фермента (от англ, core -- сердцевина), содержащего все каталитические центры, участвующие в синтезе РНК, и у-субъединицы, необходимой для правильного присоединения фермента к промотору и отделяющейся от РНК-полимеразы после начала синтеза РНК. Минимальная РНК- полимераза состоит из четырех субъединиц: двух идентичных б-субъединиц и неидентичных в- и в'-субъединиц. В в- и в'-субъедини цах имеется по одному атому Zn. У Е. coli б-субъединица состоит из 329 аминокислотных остатков (М_r==36,51 кД), в -- из 1342 (150,62 кДа), а в' -- из 1407 (155,16 кДа). Размеры этих субъединиц у других бактерий примерно такие же. Сильно вытянутые в- и в'- субъединицы имеют длину около 24,0 нм (что соответствует 70 п. н. в ДНК) и ширину примерно 40 нм. Эти субъединицы контактируют с ДНК в комплексе РНК-полимеразы с промотором и несут в себе каталитические центры.

в-Субъединица формирует центр связывания антибиотиков рифампицина и стрептолидигина, являющихся специфическими ингибиторами бактериальных РНК-полимераз. Функция б-субъединицы не известна.

Транскрипцию генов рибосомных РНК, тРНК и большинства генов, кодирующих белки, обеспечивают молекулы РНК-полимеразы, содержащие «главную» у-субъединицу (молекулярная масса у Е. coli 70 кД, у Вас. subtilis -- 43 кД).

На несколько тысяч молекул РНК-полимеразы, имеющихся в бактериальной клетке, приходится примерно тысяча молекул главной у-субъединицы. В меньших количествах имеются «минорные» у-субъединицы, используемые для транскрипции ограниченного числа генов. Набор минорных у-субъединиц у разных бактерий неодинаков. По размеру они меньше главной у-субъединицы. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов разных у-субъединиц свидетельствует о том, что все они произошли от одного предкового гена.

По аминокислотной последовательности субъединицы РНК-полимераз далеких видов бактерий существенно различаются, но по пространственной структуре, по-видимому, весьма сходны, так как в пробирке удается собирать активные гибридные молекулы, часть субъединиц которых взяты от одного вида бактерий, а часть-- от другого.

В ядрах эукариот обнаружены три специализированные формы РНК-полимеразы. РНК-полимераза I (или А по другой, номенклатуре) осуществляет в ядрышке синтез 18 S и 23 S рРНК. РНК-полимераза II (или В) -- синтез информационных РНК. РНК-полимераза III (или С) -- синтез тРНК и некоторых других низкомолекулярных РНК. РНК-полимеразы эукариот нечувствительны к ингибиторам бактериальных РНК-полимераз-- рифампицину и стрептолидигину. Специфическим ингибитором РНК-полимеразы II является токсин бледной поганки б-аманитин. Каждая форма РНК- полимеразы состоит из двух больших субъединиц с М_r~ 120ч220 кД и от 5 до 13 малых с М_r=10чМ00 кД. Несколько малых субъединиц являются общими для разных форм РНК-полимераз. Большие субъединицы, по-видимому, выполняют те же функции, что в- и в'-субъединицы бактериальных РНК-полимераз. О функциях малых субъединиц пока ничего не известно.

В самых больших субъединицах эукариотических РНК-полимераз обнаружено несколько участков, которые по аминокислотной последовательности у всех трех форм сходны между собой и с в'- субъединицей РНК-полимеразы Е. coli. В следующих за ними по размеру субъединицах эукариотических РНК-полимераз обнаружено сходство в аминокислотной последовательности с в-субъединицей РНК-полимеразы Е. coli. Эти данные свидетельствуют о том, что на заре эволюции эукариот у них имелась одна форма РНК- полимеразы, а разные формы возникли за счет умножения предковых генов (общих для про- и эукариот) и последующего расхождения их нуклеотидных последовательностей в результате множества мутаций.

Особые РНК-полимеразы обеспечивают транскрипцию клеточных органелл эукариот -- хлоропластов и митохондрий. В составе хлоропластной ДНК обнаружены гены, гомологичные генам, кодирующим б-, в- и в'-субъединицы РНК-полимеразы E. coli. Это, а также сходство нуклеотидной последовательности промоторов бактерий и хлоропластов свидетельствует о том, что РНК-полимераза хлоропластов должна быть сходна с РНК-полимеразой бактерий. РНК-полимеразы митохондрий состоят, по-видимому, всего из одной субъединицы, подобно РНК-полимеразам, кодируемым некоторыми бактериофагами, такими, как Т3 и Т7. РНК-полимераза митохондрий дрожжей сходна с РНК-полимеразами этих фагов по аминокислотной последовательности. Ген, кодирующий митохондриальную РНК-полимеразу, располагается в ядре.

Десять лет назад было выделено совершенно новое царство клеточных организмов -- архебактерии. Архебактерии -- это прокариотические микроорганизмы, многие из которых обитают в экстремальных условиях: при высоких концентрациях солей или при высоких температурах, приближащихся к 100 ^СС. Анализ нуклеотидных последовательностей их рибосомных РНК показал, что архебактерии примерно одинаково далеко отстоят по своей эволюционной истории и от эукариот, и от обычных бактерий. У архебактерии не обнаружено множества форм РНК-полимераз, но по своему субъединичному составу их РНК-полимеразы похожи на РНК-полимеразы эукариот: в их состав входит 8--10 субъединиц. Весьма четко прослеживается гомология больших субъединиц РНК-полимераз различных архебактерий с соответствующими субъединицами РНК- полимераз эукариот.

Цикл транскрипции

Цикл транскрипции можно разделить на четыре основные стадии, каждая из которых в свою очередь состоит из многих элементарных этапов: 1) связывание с ДНК; 2) инициация цепи РНК; 3) рост (элонгация) цепи РНК; 4) терминация цепи РНК.

Этот цикл у бактерий удается целиком осуществить в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНК-матрицы и очищенной РНК-полимеразы, без каких бы то ни было дополнительных факторов. Это не значит, что РНК-полимераза является единственным белком, участвующим в транскрипции. В ней могут участвовать и разнообразные регуляторные белки. Однако роль их вспомогательная: они мешают или помогают РНК-полимеразе на тех или иных стадиях цикла транскрипции, которые она осуществляет и в их отсутствие. Поэтому изучение цикла транскрипции изолированной бактериальной РНК-полимеразой позволяет понять не только ферментативные механизмы синтеза молекулы РНК, но, что еще важнее, дает ключ к пониманию механизмов регуляции транскрипции.

У эукариот транскрипция изучена хуже, чем у бактерий. Эго связано, в частности, с тем, что очищенные РНК-полимеразы эукариот не способны осуществить полный цикл транскрипции. Для этого всегда нужны дополнительные белковые факторы, лишь часть из которых получена в очищенном виде. Пока эукариотический цикл транскрипции удается осуществить лишь в частично очищенных клеточных экстрактах, содержащих недостаточно охарактеризованные компоненты. Тем не менее можно считать, что в основных чертах цикл транскрипции эукариот и бактерий сходен.

Цикл будет описан на примере хорошо изученного цикла для РНК-полимеразы Е. col.

Цикл транскрипции начинается с присоединения PHК-полимеразы к промотору--строго определенному участку ДНК, с которого начинается синтез РНК. Механизм поиска промоторов изучен недостаточно; предполагается, что молекулы РНК-полимеразы присоединяются к случайным местам двойной спирали ДНК, некоторое время перемещаются по ней, отсоединяются и снова присоединяются к ДНК до тех пор, пока не окажутся на промоторах.

Оказавшись на промоторе, РНК-полимераза образует с ним так называемый закрытый промоторный комплекс, в котором ДНК сохраняет двуспиральную структуру. В закрытом комплексе РНК- полимераза еще не способна к синтезу РНК- Этот комплекс нестабилен и легко диссоциирует при повышении ионной силы.

Закрытый комплекс может обратимо превращаться в открытый комплекс, в котором РНК-полимераза расплетает примерно один виток двойной спирали ДНК в районе стартовой точки -- нуклеотида, с которого начинается комплементарное копирование матрицы. В открытом комплексе связь РНК-полимеразы с промотором становится значительно более прочной, чем в закрытом.

При низких температурах равновесие сильно сдвинуто в сторону закрытого комплекса, при температурах, близких к физиологическим,-- в сторону открытого. Переход между этими крайними случаями происходит в узком температурном интервале, что, по- видимому, отражает кооперативный характер плавления ДНК промотора.

Следующая стадия, инициация, требует наличия субстратов РНК-полимеразы, нуклеозидтрифосфатов и заключается в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК. Первый нуклеотид входит в состав цепи, сохраняя свою трифосфатную группу, а последующие присоединяются к 3'-ОН-группе предыдущего с освобождением пирофосфата. На стадии инициации РНК-продукт связан с матрицей и РНК-полимеразой непрочно и с высокой вероятностью может освобождаться из комплекса. В этом случае РНК-полимераза, не покидая промотора, снова инициирует РНК. Такой синтез ди-, три- и более длинных олигонуклеотидов называют абортивной инициацией в противоположность продуктивной (т. е. завершающейся образованием полноценного РНК-продукта) инициации. Когда РНК-продукт достигает критической длины (от 3 до 9 нуклеотидов на разных промоторах), абортивная инициация полностью прекращается, транскрибирующий комплекс стабилизируется и уже не распадается до тех пор, пока синтез молекулы РНК не будет доведен до конца. Примерно в этот же момент, который считается концом инициации и началом элонгации, от РНК-полимеразы отделяется у-субъединица.

Эффективность инициации на разных промоторах, их «сила», существенно различается: если с некоторых промоторов инициируется всего одна-две мoлекулы РНК за период деления клетки, то с других (например, с промоторов генов рибосомных РНК) инициация происходит раз в одну-две секунды. Частота, с которой инициируется транскрипция при насыщающей концентрации субстратов, зависит главным образом от равновесной константы образования закрытых промоторных комплексов и константы скорости превращения закрытого комплекса в открытый. Для самых сильных промоторов обычно характерны высокие значения обеих констант (высокое сродство РНК-полимеразы к промотору и быстрый переход промоторного комплекса в активное открытое состояние). Для слабых промоторов характерны низкие значения этих величин. Слабость промоторов с низким сродством к РНК-полимеразе особенно заметна при низких концентрациях РНК-полимеразы и может быть скомпенсирована при ее высоких концентрациях. Промотор с низким сродством к РНК-полимеразе может быть достаточно сильным, если ему присуща высокая скорость перехода в открытое состояние. Сила большинства промоторов увеличивается с увеличением степени отрицательной сверхспирализации ДНК- Это объясняется тем, что отрицательная сверхспирализация облегчает расплетание ДНК и тем самым переход в открытый промоторный комплекс. Существуют, однако, промоторы, сила которых не зависит или даже уменьшается с увеличением степени сверхспирализации. Этому эффекту объяснения пока не найдено.

На стадии элонгации в ДНК расплетено примерно 18 н. п. Примерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК образует гибридную спираль с растущим концом цепи РНК (рис. 84). По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади -- восстановление двойной спирали ДНК- Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой. Эти перемещения должны сопровождаться относительным вращением PHК-полимеразы и ДНК. Трудно себе представить, как это может происходить в клетке, особенно при транскрипции хроматина. Поэтому не исключено, что для предотвращения такого вращения двигающуюся по ДНК РНК- лолимеразу сопровождают топоизомеразы.

В процессе удлинения РНК РНК-полимераза движется по ДНК с непостоянной скоростью. Особенно четко это видно при низких концентрациях субстратов. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, так называемые паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. Завершается синтез РНК в строго определенных участках матрицы -- терминаторах, где происходит отделение от ДНК и готовой РНК, и минимальной РНК-полимеразы, которая, объединившись со свободной a-субъединицей, может вступить в следующий цикл транскрипции.

Нуклеотидные последовательности промоторов прокариот

Основной элемент промотора -- место связывания РНК-полимеразы, которое она занимает перед началом синтеза РНК. В состав промоторов могут входить также участки связывания белков-регуляторов. Размер участка связывания РНК-полимеразы соответствует ее длине и составляет примерно 70 п. н. Располагается этот участок относительно стартовой точки несимметрично: по ходу транскрипции его граница отстоит от стартовой точки на 20 п. н., а против хода -- примерно на 50 п. н.

При сравнении нуклеотидной последовательности большого числа промоторов Е. coli, узнаваемых РНК-полимеразой, содержащей главную с-субъединицу, оказалось, что одинаковых среди них нет. Сходство между ними обнаружилось в основном в двух участках длиной по 6 п. н., центры которых располагаются в районах «--10» и «--35» п. н. Некоторое сходство наблюдается также в районе стартовой точки.

На основании сравнения последовательностей разных промоторов выведена «каноническая» последовательность промотора, в которой представлены наиболее часто встречающиеся в каждом положении нуклеотиды. Каноническая последовательность участка «--10» -- ТАТААТ (эта последовательность называется также блоком Прибнова), участки «--35» -- TTGACA (при рассмотрении промоторов обычно приводят последовательность только той нити ДНК, которая в транскрибируемой части совпадает с последовательностью РНК, т. е. является незначащей). Каноническая последовательность промотора несимметрична, что отражает его функциональную несимметричность. Действительно, промотор определяет не только место начала транскрипции, но и ее направление. Среди природных промоторов пока не обнаружено ни одного с канонической последовательностью, но искусственно сконструированный промотор с канонической последовательностью отличается очень высокой эффективностью (этот результат не был заранее очевиден: усредненная последовательность вполне могла бы обладать «средними» свойствами). О том, что каноническая последовательность является наиболее эффективной, свидетельствуют и результаты многочисленных данных по мутационным изменениям последовательности промоторов: изменения, приближающие последовательность промотора к канонической, как правило, увеличивают его силу, тогда как изменения, уменьшающие его сходство с канонической,-- уменьшают его силу. Изменения нуклеотидной последовательности вне участков «--10» и «--35» обычно слабо сказываются на силе промотора. Знание этих закономерностей, однако, еще не позволяет надежно предсказывать силу промоторов и находить промоторы, рассматривая последовательность ДНК, хотя РНК-полимераза делает это очень быстро.

У разных промоторов расстояния между участками «--10» и "--35" могут быть не одинаковыми, у большинства промоторов оно составляет 16--18 п. н.; у небольшого числа промоторов вариации составляют 15--20 п. н. Оптимальное расстояние 17 п. н.: мутации, изменяющие это расстояние как в сторону увеличения, так и уменьшения, ослабляют промотор.

Стартовая точка транскрипции отстоит у разных промоторов на 6--9 п. н. от последовательности Прибнова. Начальным нуклеотидом РНК чаще всего является диктуемый матрицей А или G. Предпочтение пуринов, однако, неабсолютно, и есть несколько промоторов, на которых транскрипты начинаются с С или U, несмотря на наличие на расстоянии одного-двух нуклеотидов потенциального пуринового начала. У некоторых промоторов стартовая точка не строго фиксирована: инициация происходит с двухтрех соседних нуклеотидов матрицы.

Описанная выше организация промоторов свойственна не только Е. coli. Так, например, промоторы, узнаваемые с помощью главной у-субъединицы Вас. subtilis, по своей нуклеотидной последовательности проявляют большое сходство с каноническим промотором Е. coli. Поэтому не удивительно, что они хорошо используются РНК-полимеразой Е. coli. Любопытно, что среди промоторов Вас. subtilis реже, чем в случае промоторов Е. coli, встречаются значительные отклонения от канонической последовательности. Создается впечатление, что РНК-полимераза Вас. subtilis более ограничена в отношении выбора последовательностей нуклеотидов промоторов, чем РНК-полимераза Е. coli. В соответствии с этим многие промоторы Е. coli плохо используются РНК-полимеразой Вас. subtilis.

Промоторы, используемые РНК-полимеразами, содержащими минорные у-субъедицы, заметно отличаются по нуклеотидной последовательности от промоторов, используемых РНК-полимеразой, содержащей главную у-субъединицу. Для каждого типа у- субъединицы характерна своя каноническая последовательность участков, аналогичных участкам «--35» и «--10».

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ

ПРОМОТОРОВ прокариот

Активность многих промоторов регулируется с помощью особых белков-регуляторов, которые присоединяются к определенным участкам ДНК и либо мешают, либо помогают РНК-полимеразе инициировать синтез РНК- В первом случае говорят о негативной„ во втором -- о позитивной регуляции активности промотора.

Белки, осуществляющие негативную регуляцию, называются репрессорами. .Места их связывания на ДНК называются операторами. Способность многих репрессоров связываться со своими операторами зависит от низкомолекулярных лигандов -- эффекторов. Эффекторы, снижающие сродство репрессора к оператору, называются индукторами. В отсутствие индуктора репрессор связывается с оператором и мешает РНК-полимеразе начинать синтез РНК с промотора (промотор репрессирован). В комплексе с индуктором репрессор теряет способность связываться с оператором, в результате чего промотор активируется (индуцируется). Другие репрессоры, наоборот, могут связываться с оператором только в комплексе с эффектором (который в этом случае называется корепрессором). В присутствии корепрессора промотор неактивен (репрессирован), в отсутствие корепрессора активируется (дерепрессируется).

Белки, осуществляющие позитивную регуляцию, называются активаторами. Ряд белков-регуляторов могут выступать как в роли репрессора, так и в роли активатора.

Для понимания механизмов взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами и с белками регуляторами важно знать пространственную структуру их комплексов с ДНК. К сожалению, в настоящее время почти ничего не известно о деталях пространственной структуры РНК-полимеразы и в частности. о структуре ее участков, взаимодействующих с ДНК. Приблизительное представление о структуре комплексов белков с ДНК дает анализ расположеия на ДНК химических групп, контактирующих с белками. .Метод основан а том, что присоединение белка к ДНК защищает ее в местах контактов от химических модификаций. В другом варианте следят за тем. какие химические модификации мешают белку присоединяться к ДНК. Используют различные химические реагенты, вызывающие в конечном итоге разрыв цепи ДНК в месте модификации. В зависимости от используемого реагента можно идентифицировать контакты с фосфатными группами ДНК. метильными группами гуанина и аденина. выступающими в большую и малую бороздки, локализовать расплавленные участки ДНК. Если нанести на пространственную модель ДНК Зарегистрированные таким образом контакты с белком, они очертят площадку, на которую садится белок, его «отпечаток» на ДНК. В случае РНК-полимеразы основные контакты группируются в районах «--З5» и «--10», что еще раз подчеркивает их функциональную значимость в связывании РНК-полимеразы с промотором. Рассмотрение отпечатка РНК-полимеразы на промоторе показывает, что она покрывает всю поверхность ДНК на месте своего присоединения, оставляя на другой стороне ДНК свободное место для присоединения других белков как в районе "--35", так и в районе стартовой точки.

Простейший механизм репрессии заключается в стерическом блокировании репрессором присоединения РНК-полимеразы к промотору. Такой механизм имеет место в тех промоторах, в которых участок связывания репрессора перекрывается с участком связывания РНК-полимеразы. Простейший механизм активации заключается в том, что белок-активатор присоединяется к промотору рядом с РНК- полимеразой и за счет непосредственного контакта с ней облегчает образование открытого промоторного комплекса. Дискуссионными являются механизмы действия тех белков-регуляторов, которые присоединяются к ДНК на значительном расстоянии от РНК-поЛи- меразы. Ниже рассмотрено несколько наиболее хорошо изученных примеров, иллюстрирующих различные принципы регуляции промоторов.

Репрессор фага л

Репрессор фага л представляет собой димер из двух идентичных субъединиц. Молекула димера связывается с участком ДНК длиной 17 п. н. Субъединицы состоят из двух компактных доменов примерно одинаковых размеров, соединенных короткой перемычкой (всего в мономере репрессора 236 а. о.). Перемычка легко расщепляется протеазами. N-концевой домен, полученный после расщепления протеазами (остатки 1--92), способен связываться с ДНК, однако менее прочно, чем интактный репрессор. Кроме того, изолированные N-концевые домены легко диссоциируют до мономеров. Поэтому считается, что в непосредственном контакте с ДНК находится только N-концевой домен, а С-концевой домен стабилизирует связывание с ДНК за счет стабилизации димера.

В N-концевом домене имеется пять участков б-спирали. Первые четыре спирали вместе с соединительными участками образуют компактную глобулу. Пятая спираль (нумерация идет от N-конца) выступает из глобулы и примыкает к пятой спирали другого мономера. За счет этого контакта N-концевые домены удерживаются в димере. Из глобулы выступают также первые 8 а. о.. образующих вытянутую «руку».

Рассмотрение пространственной структуры сразу дает представление об общем характере взаимодействия репрессора с оператором. В димере два одинаковых б-спиральных участка 3 образуют выступающие кромки, расстояние между центрами которых составляет 3,4 нм, т. е. равно расстоянию между двумя соседними большими бороздками двойной спирали ДНК. б-Спирали репрессора наклонены так, что могут свободно войти в две соседние, большие ба- роздки оператора, в которых боковые радикалы аминокислотных остатков могут непосредственно контактировать с химическими группами азотистых оснований, выступающими в эту бороздку. Спираль 2 располагается над бороздкой, и ее концевая часть может контактировать с фосфатным остовом молекулы. Гибкая «рука» репрессора (первые 8 аминокислот) обнимает молекулу ДНК. Основную роль в узнавании нуклеотидной последовательности оператора играет спираль, погруженная в большую бороздку ДНК, а остальные контакты неспецифически стабилизируют связь репрессора с оператором.

Наиболее убедительно об этом свидетельствуют изящные опыты по направленному изменению специфичности репрессора фага 434, родственного фагу л. Ген репрессора фага 434 был перестроен так, что аминокислотные остатки, расположенные на наружной поверхности б-спирали 3, входящей в большую бороздку оператора фага 434, были заменены на соответствующие аминокислотные остатки репрессора другого фага Р22. Аминокислотные остатки, расположенные на вну тренней стороне этой спирали и контактирующие с телом репрессора, были оставлены неизменными. Полученный гибридный репрессор потерял способность связываться с оператором фага 434 и приобрел способность связываться с оператором фага Р22.

Репрессор регулирует активность трех промоторов фага, из которых два, P_RM и P_r , располагаются рядом. Транскрипция с промоторов P_RM и P_r идет в противоположных направлениях. Между стартовыми точками этих промоторов располагаются три участка связывания репрессора: O_r1, O_r2, и O_r3 (рис. 88). Участок О_R3 перекрывается с участком связывания PHК-полимеразы с промотором P_rm, поэтому связывание репрессора с O_r3 мешает связыванию РНК-полимеразы с P_RM и тем самым подавляет транскрипцию.

Точно так же связывание репрессора с Or₁ подавляет транскрипцию P_r.

Последствия связывания с O_r2 более сложные. Этот участок частично перекрывается с участком связывания РНК-полимеразы с промотором P_r, поэтому связывание репрессора с O_r2, подавляет транскрипцию с P_r. Степень перекрывания O_r2 с участком связывания РНК-полимеразы с промотором P_RM очень мала: в нем имеется только одна фосфатная группа ДНК, с которой контактируют и PНК-полимераза, и репрессор. Поэтому можно думать, что связывание репрессора с O_r2 не мешает связыванию РНК-полимеразы с P_rm* Более того, показано, что репрессор, связываясь с O_r2, значительно стимулирует (до десяти раз) транскрипцию с P_rm * Предполагается, что активирующее действие репрессора обусловлено тем, что в районе «общего» фосфата между РНК-полимеразой и репрессором возникает белок-белковый контакт, помогающий РНК-полимеразе начать транскрипцию с промотора P_rm.

Наиболее убедительным доводом в пользу предположения о специфическом контакте репрессора и РНК-полимеразы служит анализ мутантных форм л-репрессора, которые сохранили способность связываться с оператором, но потеряли способность стимулировать транскрипцию с P_rm. Оказалось, что эти мутации затрагивают биспиральный ДНК-узнающий элемент репрессора. Измененные аминокислотные остатки не участвуют в контактах с ДНК и, располагаясь на поверхности репрессора, могут контактировать с находящимся поблизости участком РНК-полимеразы (рис. 88).

Три операторных участка O_R1, O_R2, O_R3 несколько отличаются по нуклеотидной последовательности. Отличается и сродство репрессора к этим участкам. Однако картина распределения молекул репрессора на трех операторных участках зависит не только от относительного сродства репрессора к каждому из этих участков, взятых по отдельности, но и от взаимодействия между димерами репрессора, присоединившимися к соседним участкам. Наибольшим сродством репрессор обладает к участку O_R1. Сродство репрессора-к соседнему O_R2 примерно в десять раз ниже, однако даже при неочень высокой концентрации репрессора участки О_R1 и O_R2 оказываются занятыми одновременно за счет того, что связывание репрессора с O_ri облегчает связывание другой молекулы репрессора с O_R1. Взаимодействие молекул репрессора является парным: контакт с одним соседом исключает взаимодействие с другим соседом, поэтому связывание двух молекул репрессора с O_R1 и O_R2 не помогает связыванию с участком O_R3, который оказывается занятым лишь при высоких концентрациях репрессора. Если повредить с помощью мутации O_R1 так, что он потеряет способность связывать репрессор, то взаимодействие репрессоров станет возможным в участках О_R2 и О_R3 и они будут заполняться одновременно. Взаимодействие молекул репрессора друг с другом осуществляется через С-концевые домены, так как молекулы, лишенные их, связываются с операторными участками независимо друг от друга.

Следует отметить, что кооперативность взаимодействия репрессоров с операторными участками может проявляться и в том случае, если сконструировать молекулы ДНК, в которых операторные участки удалены друг от друга. Предполагается, что и в этом случае две молекулы репрессора непосредственно контактируют между собой своими С-концевыми доменами, в результате чего ДНК образует петлю. Такие петли легко образуются, когда операторы разделены целым числом витков спирали. В этом случае молекулы репрессора располагаются по одной стороне ДНК, так что для образования петли ДНК нужно только изогнуть. Если расстояние между операторами составляет 2,5 или 3,5 витка спирали, образование петли затруднено, так как молекулы репрессора оказываются на разных сторонах ДНК- Поэтому для образования петли ДНК нужно не только изогнуть, но и закрутить или раскрутить на 180°. Энергия, затрачиваемая на это, весьма ощутима.

Кооперативность взаимодействия репрессора с операторами приводит к тому, что зависимость степени репрессии промотора P_R от концентрации репрессора имеет характерный «сигмоидный» вид (рнс. 90). При высоких концентрациях репрессора заняты оба участка, О_R1 и О_R2, что обеспечивает сильную (1000-кратную) репрессию. При незначительном уменьшении концентрации репрессора занятость участков O_R1 и O_R2 практически не уменьшается и степень репрессии не меняется. При дальнейшем уменьшении концентрации репрессора степень репрессии резко падает. Таким образом, промотор либо очень сильно репрессирован, либо почти полностью дере- прессирован: для перехода от 1000-кратной до 50 %-ной репрессии требуется уменьшить концентрацию репрессора всего в пять раз.

В отсутствие кооперативности зависимость степени репрессии от концентрации репрессора более плавная. Соответственно для тех промоторов, которые регулируются по принципу резкого переключения, используется кооперативный способ взаимодействия репрессора с оператором, состоящим минимум из двух участков связывания. В случае фага л такой способ переключения предохраняет клетку от случайного запуска развития фага, но легко позволяет включить такое развитие, когда это требуется. В тех случаях, когда необходим плавный переход через промежуточные степени активности, используется некооперативное связывание с одним оператор ным участком.