Основы молекулярной биологии и генной инженерии

Ферментативная машина сплайсинга, локализованная в ядре, изучена недостаточно, однако ряд важных результатов получен при исследовании превращений предшественников индивидуальных мРНК (например, p-глобина) в ядерных экстрактах in vitro. Были выявлены следующие стадии сплайсинга. Прежде всего происходит разрыв нуклеотидной последовательности на границе экзона 1 и интрона с образованием 5'-конца, представленного фосфор и лированным гуанозином -- каноническим нуклеотидом левого (5'-конца) интрона. Следующая (или сопряженная с предыдущей) реакция заключается во взаимодействии 5'-конца удаляемой последовательности с 2'-гидроксилом аденозина интрона с образованием 2'--5'-фосфодиэфирной связи. Образуется разветвленная структура РНК, напоминающая лассо (кольцо с хвостом). Образование такой структуры можно также рассматривать как результат реакции трансэтерификации, в результате которой 2'-ОН-группа аденозина атакует фосфодиэфирную связь, замещая З'-ОН-группу экзона 1 Теперь экзон 1 представлен отдельной молекулой РНК, удерживаемой вместе с другой молекулой, содержащей лассб-интрон и экзон 2, в едином комплексе с белками, участвующими в реакции. По-видимому, образование лассо является условием для завязывания ковалентной связи З'-ОН-группы линейной молекулы экзона 1 с экзоном 2 в районе сайта сплайсинга; эта реакция также представляет собой трансэтерификацию, когда З'-ОН-группа экзона 1 атакует фосфодиэфирную связь и замещает З'-ОН-группу интрона; последовательность интрона выщепляется из РНК в форме лассо. В результате число фосфодиэфирных связей в составе субстрата и продукта не изменяется. Вероятно, процесс может идти без гидролиза высокоэргических кофакторов, как и аутосплайсинг предшественника рРНК.

По-видимому, в образовании лассо участвует последовательность сайта «ветвления» РНК, окружающая участвующий в реакции аденозин и способная образовывать комплементарную структуру с 5'-концом интрона. Внутренняя часть интрона, в ряде случаев достаточно протяженная, может быть безболезненно удалена без нарушения сплайсинга. Вопрос о том, какова судьба и возможная роль выщепляемых интронов, остается не ясным.

Необходимым компонентом системы сплайсинга гигантских ядерных предшественников мРНК являются так называемые малые ядерные РНК- Эти РНК обогащены уридином, поэтому они получили название U РНК: Ul, U2, U3, U4 и т. д. Они легко разделяются с помощью электрофореза. Разные малые ядерные РНК отличаются числом нуклеотидов, входящих в их состав (от 90 до 400). Обнаружена исключительная консервативность нуклеотидных последовательностей малых ядерных РНК птиц, млекопитающих и дрозофилы.

Малые ядерные РНК имеют на 5'-конце специфический кэп, представленный триметилгуанозином: 5'm⁸GpppAUACUUA... . Эта структура в составе UPHK необходима для осуществления сплайсинга. Удаление кэпа и прилегающих к нему нуклеотидов из L'PHK, равно как и добавление антител против триметилированного гуанозинового остатка, останавливает сплайсинг.

Вначале предполагали, что участие малых ядерных РНК в сплайсинге определяется тем, что их нуклеотидная последоватетьность комплементарна граничным экзон-интронным нуклеотидным последовательностям . Подобные комплементарные взаимодействия могли бы обеспечить «стягивание» экзонов и способствовать сплайсингу. Эта модель сплайсинга не получила экспериментального подтверждения, однако комплементарные взаимодействия отдельных UPHK с 5'-участками интрона (рис. 104, б), с З'-сайтом сплайсинга или с районом ветвления РНК при образовании лассо были доказаны. Несомненно, они играют существенную роль при протекании реакций сплайсинга.

Структурная рать малых ядерных РНК в сплайсинге остается невыясненной, но ясно одно, что они являются важным и необходимым компонентом реакций сплайсинга. Можно предполагать, что отсутствие того или иного типа UPHK будет приводить к нарушению процессинга и, следовательно, сопровождаться прекращением экспрессии гена. UPHK кодируются десятками генов, обычно рассеянных по геному. Образование зрелых UPHK, синтезируемых с участием РНК-полимеразы II, также сопряжено с процессингом предшественника. Показано, что синтез отдельных UPHK приурочен к определенным стадиям развития амфибий (Xenopusj. Дифференциальная экспрессия генов разных типов UPHK может определять регуляцию сплайсинга транскрилтов генов в процессе развития организма.

Процессинг предшественников мРНК в ядре несомненно идет при участии белков. Гигантские ядерные транскрипты связываются с ядерными белками. Возникают структуры типа «бусин на нити», соединенных участками РНК (сравни с нуклеосомами, гл. XII). После обработки РНКазой эти структуры распадаются с образованием отдельных рибонуклеопротеидных частиц. Каждая частица включает окало 500 нуклеотидов и по крайней мере 8--10 разных белков. Участие ряда белков в сплайсинге прямо доказано: моноклональные антитела, специфически реагирующие с отдельными белками, подавляют сплайсинг in vitro. Ядерные UPHK также связаны со специфическими белками, образуя малые ядерные рибонук- леотидные частицы. Способ функционирования этих частиц при сплайсинге не ясен, а белки, образующие эти частицы, охарактеризованы недостаточно.

Упаковка длинных ядерных транскриптов в составе рибонуклеопротеидных комплексов, по-видимому, необходима для осуществления правильного процессинга и узнавания сигналов сплайсинга. Элементом такой упаковки служит сп.гайсосома (англ, spliceosome), включающая UPHK, белки и субстраты сплайсинга: 5'-экзон, структуру лассо-интрон и З'-экзон. Молекулярная масса сплайсосомы около 3*10⁶. Образование сложного комплекса сплайсосомы in vitro требует ATP. Негидролизуемые аналоги не заменяют АТР; следовательно, при образовании комплекса в отличие от химических реакций сплайсинга затрачивается энергия. Структура сплайсосомы и ее компоненты еще плохо изучены.

Удаление нитронов, по-видимому, не идет строго и последовательно в направлении 5' >-3'. Вероятно, в результате выреза

ния интрона из предшественника меняется конформация гигантской РНК, направляются и облегчаются отдельные этапы сплайсинга. Перспективным в познании закономерностей сплайсинга является создание искусственных генов с заданными последовательностями интронов и исследование in vitro сплайсинга сложных транскриптов таких генов.

Процессинг 3'-конца транскрипта

На З'-конце большинства эукариотических мРНК (исключения составляют мРНК гистонов) находится последовательность из остатков адениловой кислоты, обычно включающая около 100 нуклеотидов. Считается, что присоединение адениловых остатков (полиаденилирование) приводит в первую очередь к увеличению времени жизни мРНК, ее стабилизации, а также обеспечивает транспорт мРНК в цитоплазму. Рассмотрим процессинг З'-конца транскриптов, который сопряжен со сплайсингом или даже предшествует отдельным стадиям сплайсинга.

Транскрипция гена с помощью РНК-полимеразы II, как это было показано, например, для гена {5-глобина млекопитающих и овальбумина птиц, может продолжаться еще на сотни нуклеотидов от сайта, соответствующего З'-концу зрелой мРНК- Сигнальные нуклеотидные поеледовательности на З'-конце гена и факторы, определяющие терминацию транскрипции с помощью РНК-полимеразы II, недостаточно иселедованы. З'-конец зрелой молекулы РНК определяется специфической эндонуклеазой, разрезающей длинный транскрипт. Эта реакция протекает быстро, отрезаемый эндонуклеазой дистальный конец мгновенно деградирует. Положение З'-конца зрелой мРНК, к которому прикрепляются адениловые остатки, определяется последовательностью ААТААА на З'-конце гена. Эта последовательность в составе зрелой мРНК (AAUAAA) обнаруживается отступя 11--30нуклеотидов (в среднем 15) от З'-конца. Эндонуклеаза, узнавая последовательность AAUAAA (сигнала полиаденилирова- ния), расщепляет транскрипт, а образующийся З'-конец подвергается полиаденилированию. Сигнал полиаденилирования необходим, но не достаточен для эндонуклеолитической реакции на З'-конце транскрипта. В процессинге З'-конца мРНК участвуют постедовательности, которые не входят в состав зрелой мРНК и локализованы за сайтом эндонуклеазной атаки, ближе к 3'-концу транскрипта.

В составе транскрипционной единицы в ряде случаев (например, 1ен овальбумина птиц) обнаруживается более одного сигнала поли- дденилирования. Сигналы полиаденилированкя могут находиться в разных участках гена. Выбор одного из возможных сигналов полиаденилирования, вслед за которым следует эндонуклеазное расщепление транскрипта, может также рассматриваться как способ регуляции экспрессии гена, обеспечивающий нужное направление 3'-процессинга с образованием мРНК данного типа. Выбор разных сайтов полиаденилирования, имеющий регуляторное значение, осуществляется, например, при транскрипции гена, кодирующего образование двух белков: кальцитонина -- гормона С-клеток щитовидной железы, регулирующего концентрацию кальция, и кальци- тонинподобного биологически активного пептида в нервной ткани <рис. 105, б). Информационная РНК, кодирующая кальцитонин, образуется путем сплайсинга первых четырех экзонов гена, причем последний экзон содержит сигнал полиаденилирования, узнаваемый в клетках щитовидной железы. В клетках мозга образуется другой тип мРНК, включающей последовательности не только первых трех экзонов, но и пятого, и шестого, причем последний несет второй сайт полиаденилирования, узнаваемый в клетках нервной ткани. Функции белка, кодируемого этим типом мРНК, не известны. Несомненно, выбор одного из возможных сайтов полиаденилирования играет роль в тканеспецифической экспрессии генов.

Значимость сайтов полиаденилирования при экспрессии генов выявляется при молекулярном анализе природы мутаций. Оказалось, что один из случаев нарушения синтеза (3-глобина человека обусловлен мутацией, которая привела к образованию лишнего сайта полиаденилирования и нарушила созревание нормальной мРНК.

Модификация 3'-конца транскрипта также может происходить с участием малых ядерных РНК определенного типа. Такой способ процессинга З'-конца осуществляется, например, при образовании мРНК гистоновых генов, лишенных полиаденилового хвоста на *З'-конце. В ходе процессинга предшественника мРНК гистона НЗ морского ежа принимает участие U7PHK. Разные гистоновые мРНК морского ежа содержат консервативную последовательность из 12 нуклеотидов на З'-конце, представляющую собой палиндром. Можно представить, что U7PHK за счет комплементарных взаимодействий раскрывает палиндромную шпильку с образованием однонитевой петли из 15 нуклеотидов, облегчающей действие эндонуклеазы. Показано, что последовательность CAAGAAAGA, взаимодействующая с U7PHK, но не входящая в состав зрелой мРНК, необходима для процессинга. Процессинг З'-конца, идущий с участием малых РНК, ингибируется антителами, специфически реагирующими с рибонуклеопро- теидными частицами, в состав которых входят эти PHК.

Размещено на Allbest.ru