Главная Коллекция "Revolution" Биология и естествознание Мікробіологія з основами вірусології

Мікробіологія з основами вірусології

Методи мікроскопічного дослідження морфології мікроорганізмів. Виготовлення живильних середовищ, методи стерилізації, культивування чистих культур. Визначення та вивчення культуральних, фізіолого-біохімічних, антибіотичних властивостей мікроорганізмів.

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	методичка
Язык	украинский
Дата добавления	22.07.2017
Размер файла	534,2 K

посмотреть текст работы

скачать работу можно здесь

полная информация о работе

весь список подобных работ

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Страница:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство аграрної політики та продовольства України

Дніпропетровський державний аграрний університет

Кафедра загального землеробства та ґрунтознавства

Методичні вказівки

до виконання лабораторних робіт з дисципліни

«Мікробіологія з основами вірусології»

Для студентів агрономічного факультету

Напрям підготовки: 6.090101 «Агрономія»

Дніпропетровськ - 2013

Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з дисципліни «Мікробіологія з основами вірусології» для студентів агрономічного факультету, які навчаються за напрямом підготовки: 6.090101 - «Агрономія». - Дніпропетровськ : ДДАУ, 2013 - 72 с.

Укладачі: к.б.н., доцент Т. П. Кілочок, к.б.н., доцент Н. В. Гончар

Розглянуто на засіданні кафедри загального землеробства та ґрунтознавства ДДАУ

Протокол № 5 від 25 грудня 2012 року

Схвалено науково - методичною радою агрономічного факультету ДДАУ. Протокол № 6 від 15 січня 2013 року

Рецензент: к.б.н., доцент кафедри мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету імені Олеся Гончара Н. П. Чорногор

Зміст

Вступ
Лабораторний практикум
Лабораторна робота №1
Лабораторна робота №2
Лабораторна робота № 3
Лабораторна робота № 4
Лабораторна робота № 5
Лабораторна робота № 6
Лабораторна робота № 7
Лабораторна робота № 8
Лабораторна робота № 9
Лабораторна робота № 11
Лабораторна робота № 12
Лабораторна робота № 13
Лабораторна робота № 14
Лабораторна робота № 15
Список рекомендованої літератури
Додаток 1 (до ЛР №5)
Додаток 2 (до ЛР № 6)

Вступ

Дисципліна «Мікробіологія з основами вірусології» є теоретичною основою агрономічних дисциплін, в тому числі землеробства, і в останні роки досягла значних успіхів у вирішенні проблем загальної біології, біотехнології, імунології, геронтології, генетики, охорони навколишнього середовища та ін.

Мікробіологія вивчає морфологію, систематику, фізіологію, біохімію, генетику, екологію найдрібніших і найбільш поширених у природі, невидимих для неозброєного ока живих організмів, які відносяться до різних таксонів: бактерій, актиноміцетів, рикетсій, мікроскопічних грибів, водоростей та найпростіших. Об'єктами мікробіологічних досліджень є також віруси і бактеріофаги - збудники захворювань людини, тварини, рослини. Завдяки діяльності мікроорганізмів відбувається кругообіг речовин у природі, обумовлюється родючість ґрунтів, забезпечується життєдіяльність людей, тварин і рослин.

Метою курсу «Мікробіологія з основами вірусології» є оволодіння теоретичними основами загальної і сільськогосподарської мікробіології, вивчення морфолого-фізіологічних і метаболічних ознак прокаріотичних і еукаріотичних мікроорганізмів різних таксономічних груп, а також найважливіших мікробіологічних процесів, які відбуваються в природі, і зокрема в ґрунті, та при переробці сільськогосподарської сировини з тим, щоб навчитися цілеспрямовано керувати діяльністю мікроорганізмів на користь людини; практично впливати на окремі біологічні групи бактерій для підвищення родючості ґрунтів та продуктивності сільськогосподарських культур.

В результаті вивчення дисципліни «Мікробіологія з основами вірусології» студент повинен знати:

- морфологію, систематику, фізіологію і біохімію прокаріотичних і еукаріотичних мікроорганізмів різних систематичних груп, а також вірусів;

- суть найважливіших мікробіологічних процесів, що відбуваються в природі, а саме:

1) перетворення мікроорганізмами вуглецю, азоту, сполук сірки, фосфору, заліза та інших елементів;

2) значення мікроорганізмів у ґрунтоутворювальному процесі, утворенні перегною і мікробіологічні основи підвищення родючості ґрунтів;

3) складу мікробних ценозів ґрунтів різних типів;

4) впливу факторів середовища, обробки та меліорації ґрунтів, гербіцидів на розвиток ґрунтових ценозів.

Повинен уміти:

- за морфологічними ознаками на основі сукупності простих та складних методів забарвлення та мікроскопії орієнтуватися в особливостях будови прокаріотичних і еукаріотичних клітин мікроорганізмів різних таксономічних груп;

- управляти мікробіологічними процесами, які проходять у ґрунті і впливають на кількісний та якісний склад мікроорганізмів різних систематичних груп, а також на родючість ґрунту;

- позитивно впливати на життєдіяльність корисних мікроорганізмів у посівах сільськогосподарських культур та при виробництві різних біологічно активних речовин, яке базується на промисловому використанні мікроорганізмів;

- управляти мікробіологічними процесами при консервуванні плодів і овочів, у виноробстві, одержанні біологічно активних речовин і енергії;

- застосовувати знання з курсу «Мікробіологія з основами вірусології» при розробці заходів захисту сільськогосподарських культур від грибкових, бактеріальних і вірусних хвороб.

Методичні вказівки складено відповідно до робочої програми дисципліни «Мікробіологія з основами вірусології» для студентів, які навчаються за напрямом підготовки 6.090101 - «Агрономія».

У методичних указівках викладено сучасні методи мікроскопічного дослідження морфології мікроорганізмів, виготовлення живильних середовищ, методи стерилізації, культивування чистих культур, кількісного визначення та дослідження культуральних, фізіолого-біохімічних та антибіотичних властивостей мікроорганізмів.

Лабораторні роботи допоможуть оволодіти основними навичками мікробіологічного дослідження, що необхідні для вивчення основних властивостей мікроорганізмів.

Основна мета методичних указівок:

- закріплення теоретичних знань студентів, отриманих на лекціях з дисципліни «Мікробіологія з основами вірусології»;

- вивчення основних принципів виявлення властивостей мікроорганізмів і методів визначення їхньої кількості з метою використання цих знань під час вирішення питань аналізу й контролю мікробіологічних процесів;

- одержання практичних навичок дослідницької роботи в області мікробіології.

Лабораторні роботи з дисципліни «Мікробіологія з основами вірусології» надають студентам можливість опанувати основними мікробіологічними методами дослідження, які необхідні майбутньому агроному. Кожна запропонована робота носить науково - дослідний характер.

Матеріал із кожного заняття надається у наступній послідовності: спочатку коротко формулюється мета роботи, потім визначається конкретне завдання, надається перелік необхідного обладнання та матеріалів, а також методичні вказівки та порядок виконання завдання. Перед описом лабораторних робіт із кожної теми дається стислий теоретичний вступ, необхідне для розуміння студентами сутності досліджуваних питань із приведенням необхідних рисунків, таблиць, графічних структур, що наочно відображує необхідний матеріал.

Кожний студент зобов'язаний, керуючись цими «Методичними вказівками», вивчити до заняття теоретичні питання, знати принцип виконання роботи, переписати завчасно хід роботи у свій робочий зошит.

Лабораторні роботи виконуються кожним студентом самостійно. Результати дослідження обов'язково протоколюються, вони оформляються у зошиті у вигляді звіту. У протоколі записується тема заняття, поставлена мета і короткий опис ходу роботи з приведенням необхідних малюнків, таблиць. При собі необхідно мати кольорові олівці і використовувати їх для зарисовки морфологічних ознак мікроорганізмів безпосередньо з препаратів, а не з книг або таблиць. Під час мікроскопічного дослідження препаратів мікроорганізмів результати заносяться до протоколу у вигляді малюнку з повною назвою об'єкта на латині. Робиться загальний висновок за результатами дослідження.

Дуже важливо, щоб студенти навчились економно витрачати реактиви й фарби, бережливо відносилися до лабораторного обладнання й апаратури, особливо до мікроскопа, дотримуватись правил особистої гігієни та профілактики.

Студент повинен уміти відповісти на питання для самоконтролю і захистити роботу в день проведення занять.

Наприкінці «Методичних указівок» приведено літературні джерела, які студент може використати для підготовки до лабораторних занять.

Перш, ніж приступити до виконання лабораторних робіт, необхідно ознайомитися з правилами техніки безпеки при роботі в мікробіологічній лабораторії.

Правила роботи й техніки безпеки у мікробіологічній лабораторії

Загальні правила роботи в мікробіологічній лабораторії.

Лабораторія повинна утримуватися в ідеальній чистоті.

У лабораторію забороняється входити у верхньому одязі і класти на робочі столи сторонні предмети (сумки, портфелі й інші особисті речі).

У мікробіологічній лабораторії дозволяється працювати тільки в халатах, що захищають одяг від забруднення мікроорганізмами, а також перешкоджають поширенню їх за межі лабораторії.

За кожним студентом закріплюється постійне робоче місце і мікроскоп. Робоче місце під час занять утримується в повному порядку, на ньому не повинно бути нічого зайвого.

Необхідно чітко виконувати інструкції до лабораторних занять. Роботу з біологічним матеріалом проводити тільки інструментами.

Робоче місце, де безпосередньо проводиться робота з культурами мікроорганізмів, вимагає особливо ретельної обробки. Стіл перед початком роботи варто дезінфікувати.

Під час виконання практичних занять зберігати тишу, запобігати зайвого ходіння, відкривання та закривання дверей, що посилює рух повітря.

Дуже важливо навчитись економно витрачати реактиви та фарби, бережливо відноситися до лабораторного обладнання й апаратури, особливо до мікроскопа, дотримуватись правил особистої гігієни та профілактики.

Закінчивши роботу із заразним матеріалом, необхідно провести профілактичну дезінфекцію рук і робочого місця. Для дезінфекції відпрацьованого матеріалу після занять використовують 2 % - ний розчин хлораміну чи 3 % - ний розчин карболової кислоти. Для знезаражування рук після роботи, як правило, використовують ізопропіловий або етиловий спирт, розчин хлораміну в концентрації 0,5 %, потім руки миються з милом.

На всіх пробірках і чашках обов'язково пишеться назва мікроорганізмів, дата його посіву, прізвище студента, № групи.

Не можна виносити за межі кафедри будь - які матеріали (пробірки, фарби та ін.).

Про випадки улучення досліджуваного матеріалу культури мікроорганізмів на руки, стіл, халат чи взуття необхідно негайно повідомити викладача і під його керівництвом провести дезінфекцію.

У лабораторії категорично забороняється приймати їжу, пити воду. Не допускаються зайві ходіння, різкі рухи, сторонні розмови (особливо під час посіву мікроорганізмів).

Металеві предмети (бактеріологічні петлі, голки й пінцети) після кожного зіткнення з культурами пропалюють у полум'ї спиртівки. Використані шпателі, предметні та покривні стекла, піпетки поміщають у банки з дезінфікуючим розчином. Класти на стіл названі предмети категорично забороняється.

Забруднені патологічним матеріалом чи культурою мікробів градуйовані та пастерівські піпетки, скляні шпателі й металеві інструменти негайно після використання опускають у ємності з дезінфікуючим розчином.

На кожне заняття в групі призначаються чергові. Під час роботи вони стежать за виконанням кожним студентом правил роботи й поводження в лабораторії. Після закінчення заняття чергові здають відпрацьований матеріал на стерилізацію, виключають прилади, світло і провітрюють приміщення.

Дезінфекція.

Мікробіолог у більшості випадків має справу з чистими культурами мікроорганізмів, що являють собою потомство однієї клітини. Через те, що в повітрі і на поверхні предметів лабораторії (на столах, інструментах, одязі), а також на руках, волоссі і т.д. завжди мається велика кількість різноманітних мікроорганізмів, варто постійно піклуватися про збереження чистоти досліджуваних культур. Для цього живильні середовища, посуд, інструменти й прилади стерилізують, лабораторію та робочі місця утримують у чистоті й періодично піддають спеціальній обробці, що спрямована на знищення мікроорганізмів.

У лабораторному практикумі з мікробіології не передбачені роботи з живими патогенними мікроорганізмами. Проте варто мати на увазі, що з посівом сапрофітних мікроорганізмів з навколишнього середовища може бути внесена й патогенна форма. Сама робота із сапрофітними формами в ряді випадків вимагає абсолютної стерильності для одержання надійних результатів досліду.

У зв'язку з цим правила роботи в мікробіологічному практикумі є загальними з будь - якою бактеріологічною лабораторією.

Забезпечити повну стерилізацію лабораторії важко, і це не завжди необхідно. У мікробіологічній практиці з метою знищення мікроорганізмів в повітрі і на різних поверхнях лабораторних приміщень широко застосовують різні способи дезінфекції. Слово «дезінфекція» означає знезаражування, тобто знищення збудників інфекційних захворювань на об'єктах зовнішнього середовища. Під час дезінфекційної обробки можуть знищуватися не тільки патогенні, але і сапрофітні форми.

Дезінфекція повітря лабораторій найбільше просто здійснюється провітрюванням. Тривала вентиляція приміщення через кватирку (не менш 30 - 60 хвилин) призводить до різкого зниження кількості мікроорганізмів в повітрі, особливо за умов значної різниці температур між зовнішнім повітрям і повітрям приміщення.

Найефективніший і найчастіше застосовуваний спосіб дезінфекції повітря - опромінення УФ - променями протягом 30 хвилин до декількох годин у залежності від ступеня забруднення повітря. Як джерело УФ - випромінювання використовуються бактерицидні лампи. Необхідно мати на увазі, що УФ - промені можуть викликати важкі поразки очей. У невеликих приміщеннях при включеній бактерицидній лампі знаходитися не можна.

Робоче місце, де безпосередньо проводиться робота з культурами мікроорганізмів, вимагає особливо ретельної обробки. Стіл варто дезінфікувати не тільки до початку роботи, але і після її закінчення. Для протирання поверхні столу можна користуватися розчинами хлораміну, карболової кислоти, а також ізопропіловим і етиловим спиртом. Спирти можуть використовуватися і для дезінфекції рук. Поверхню робочого столу можна дезінфікувати й УФ - променями.

Особливо відповідальні роботи з мікроорганізмами (пересівання чистих культур) бажано здійснювати в спеціальному приміщенні, яке називається «бокс». Бокс являє собою ізольовану кімнату, розділену перегородкою на дві частини. Вхід в основне, робоче приміщення боксу здійснюється через тамбур із рухливими дверима, що виключає різке переміщення повітря і, отже, занесення ззовні сторонньої мікрофлори.

Причини пожежі у мікробіологічній лабораторії і способи її гасіння.

Можливість виникнення пожежі в мікробіологічній лабораторії особливо велика, тому що постійно треба працювати з газовими чи спиртовими пальниками, електронагрівальними приладами, фіксаторами, розчинниками, приготовленими на спирті, фенолі, ацетоні та ін. У роботі з газовим пальником можливе «проскакування» полум'я, що може призвести до загоряння гумової трубки чи прилеглих предметів і речовин. Загоряння може відбутися під час стерилізації сухим жаром посуду, що загорнена в папір, за умов неправильного режиму роботи сушильної шафи. Причиною пожеж може стати несправність електричних приладів.

У випадку виникнення пожежі необхідно пам'ятати, що спосіб його гасіння залежить від причини, що обумовила загоряння, і від характеру палаючого об'єкта. Палаючі дерев'яні предмети можна гасити водою, піском і за допомогою вогнегасника. Нерозчинні у воді органічні речовини (наприклад, бензин) не можна гасити водою, тому що в цих умовах пожежа може навіть підсилитися. Ці речовини варто гасити піском або швидко накрити азбестом. Розчинні у воді органічні речовини (спирт, ацетон) можна гасити водою. Для гасіння усіх вище названих речовин придатний чотирихлористий вуглець. У зіткненні з вогнем він утворює важкі пари, що витісняють кисень, у результаті чого горіння припиняється. Найефективнішим протипожежним засобом у лабораторії є вогнегасник. На кожному з них міститься інструкція, із якою повинні бути ознайомлені всі працюючі в лабораторії.

Таким чином, на випадок пожежі в лабораторії у відповідних місцях завжди повинні бути: пожежний рукав; шухляда з піском; азбестова ковдра; вогнегасник; чотирихлористий вуглець. За умов виникнення пожежі в лабораторії всі наявні під рукою засобу гасіння необхідно негайно використовувати й одночасно викликати місцеву пожежну команду.

Правила безпечної роботи із застосуванням пального.

Перед запалюванням спиртівки треба переконатися, що корпус її вирівняний, ґніт випущений на необхідну висоту і розгорнутий.

Запалену спиртівку не можна переносити з місця на місце; не можна запалювати одну спиртівку від іншої.

Гасити спиртівку необхідно, накриваючи полум'я ковпачком. Задувати полум'я забороняється.

У спиртівках використовується тільки етиловий спирт; користатися бензином чи іншими пальними рідинами забороняється.

Брикети (таблетки) сухого пального можна також використовувати для нагрівання. Запалювати їх потрібно на керамічних пластинках, гасити - ковпачками для спиртівок чи керамічними тиглями. Брикети, що не догоріли, після погашення необхідно забрати у витяжну шафу.

З появою пожежі насамперед необхідно виключити всі нагрівальні прилади, потім гасити полум'я. Його не можна задувати. Якщо горять органічні речовини, не слід заливати полум'я водою. Необхідно скористатися піском, азбестовою ковдрою, вогнегасником (краще вуглекислотним).

За умов незначних опіків обпалене місце потрібно обробити етиловим спиртом чи міцним розчином марганцевокислого калію, якщо опіки важкі, необхідно звернутися до лікаря.

Невідкладна медична допомога в лабораторії.

У лабораторії бувають випадки, що вимагають невідкладної медичної допомоги - порізи рук, опіки гарячими предметами, кислотами та лугами й т.п. При пораненнях склом потрібно насамперед видалити його осколки з рани (якщо вони в ній залишилися) і, переконавшись, що там вони відсутні, змазати рану йодом і перев'язати уражене місце. При термічних опіках першого й другого ступеня обпалене місце необхідно внести під струмінь холодної води, а потім присипати гідрокарбонатом натрію чи обробити примочками зі свіжоприготовлених розчинів питної соди (2 % - й) чи перманганату калію (5 % - й). Кращим засобом для примочок є абсолютний чи 96 % - ний етиловий спирт. Він виявляє одночасно знезаражуючу й знеболюючу дію. При опіках кислотами та лугами уражене місце варто швидко промити великою кількістю води. Потім на обпалене місце накласти примочку: при опіках кислотою - з 2 % - го содового розчину, при опіках лугом - із слабкого розчину оцтової чи борної кислоти.

За умов отруєння газом постраждалого необхідно вивести на свіже повітря і негайно викликати лікаря чи доставити його в медпункт.

Лабораторний практикум

Лабораторна робота № 1

Тема: Будова світлопольного мікроскопу. Види мікроскопії

Мета: ознайомитися з особливостями роботи в мікробіологічній лабораторії та технікою безпеки. Вивчити будову світлопольного мікроскопу, його механічну та оптичну системи, типи сучасних мікроскопів та правила користування ними в мікробіологічній практиці

Матеріали й устаткування: мікроскопи МБР, МБД, набори об'єктивів та окулярів, конденсорів, предметні та покривні скельця, імерсійна олія

Теоретичні положення

Для вивчення морфології мікроорганізмів у прохідному світлі використовують оптичні мікроскопи МБР (рис. 1.1), МБД.

Механічна частина складається зі штатива з предметним столиком, тубуса, револьвера, механізму наведення різкості, що складається з макрометричного й мікрометричного гвинтів.

Оптична частина мікроскопа включає об'єктив і окуляр. Об'єктив є найважливішою частиною мікроскопа. Він складається із системи лінз, укладених у металеву оправу. Одне з позначень на оправі відповідає значенню збільшення об'єктива. В мікроскопі МБР використовуються об'єктиви, що дають збільшення в 8, 40 і 90 разів. Це багатолінзові короткофокусні системи, від якості яких залежить, в основному, зображення об'єкту. Збільшення об'єктива залежить від фокусної відстані головної - фронтальної лінзи. Чим більше кривизна фронтальної лінзи, тим коротше фокусна відстань, тобто тим нижче треба опускати об'єктив над площиною препарату. Інші лінзи називаються корекційними, вони необхідні для усунення сферичної й хроматичної аберації.

Об'єктив дає дійсне, збільшене, зворотне зображення предмету.

Окуляр містить дві лінзи - очну (верхню) і польову або збірну (нижню). Польові лінзи збирають промені, які йдуть від об'єктиву. Очна лінза збільшує зображення, яке дає об'єктив. Окуляри можуть давати збільшення в 5, 7, 10, 12, 15 і 20 разів, що зазначено на їхній оправі.

Окуляр дає збільшене, уявне, пряме зображення по відношенню до зображення, яке дає об'єктив. Окуляри можуть бути різних типів, їх вибір залежить від об'єктивів.

Освітлювальна система включає дзеркало з двома поверхнями (увігнутою та плоскою) і конденсора (у мікроскопі МБД є убудоване джерело світла). Увігнуте дзеркало збирає й концентрує в площині препарату пучок рівнобіжних променів світла, що йдуть від джерела світла, тому їм користаються в тих випадках, коли працюють без конденсора, тобто з малим збільшенням. Конденсор, укріплений безпосередньо над дзеркалом, складається з двох лінз і призначений для збирання паралельних променів світла, відбитих дзеркалом, у крапці - фокусі, що знаходиться в площині препарату. Убудована в конденсор ірисова діафрагма служить для затримання зайвих променів світла і дозволяє при необхідності зменшувати апертуру конденсора.

Загальне збільшення, що дає мікроскоп, визначається добутком збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Виразність одержуваного зображення характеризується дозвільною здатністю, що визначається мінімальною відстанню між двома крапками, коли вони ще не зливаються в одну.

Рис. 1.1. Мікроскоп МБР - 1:

1 - основа мікроскопа; 2 - предметний столик; 3 - гвинти для переміщення предметного столику; 4 - клеми для фіксації препарату; 5 - конденсор; 6 - кронштейн конденсора; 7 - гвинт, що закріплює конденсор у гільзі; 8 - гвинт переміщення конденсора; 9 - ручка ірисової діафрагми конденсора; 10 - дзеркало; 11 - тубусоутримувач; 12 - макрометричний гвинт (кремальєра); 13 - мікрометричний гвинт; 14 - револьвер; 15 - об'єктиви; 16 - тубус; 17 - гвинт для кріплення тубуса; 18 - окуляр.

Величина дозвільної здатності мікроскопа залежить від довжини хвилі використовуваного світла () і суми числових апертур об'єктива (A1) і конденсора (A2):

(1.1)

Числова апертура (A) визначається добутком синуса половини кута охоплення лінзи (U)та показника заломлення середовища (n), що граничить із лінзою:

A = sin U·n.

Тобто числова апертура характеризується кількістю променів, що попадають у лінзу (рис. 1.2).

Дозвільна здатність мікроскопа - величина, зворотна дозвільної відстані. Чим більше дозвільна здатність, тим меншої величини об'єкт можна побачити. Світловий мікроскоп за умов використання видимого світла має дозвільну здатність близько 0,2 мкм.

Рис 1.2. Схема ходу променів із різною величиною отвірного кута:

А - об'єкт;

О - об'єктив;

- отвірний кут;

U - половина отвірного кута.

Підвищити дозвільну здатність можна двома шляхами: висвітлюючи об'єкт більш короткими променями світла, наприклад, УФ, або, збільшуючи показник середовища, що граничить із лінзою, для того, щоб наблизити його до показника заломлення скла (n скла = 1,5). У вивченні мікроорганізмів майже постійно користаються імерсійним, або олієзануреним об'єктивом (90х), що дає збільшення у 900 - 1350 разів (рис. 1.3).

Рис 1.3. Вплив імерсійної олії на хід променів у мікроскопі:

1 - об'єктив;

2 - предметне скло;

3 - об'єкт;

4 - імерсійна олія;

5 - промені світла;

6 - фронтальна лінза об'єктива.

Тому всі промені, не переломлюючись і не змінюючи свого напрямку, потрапляють в об'єктив і забезпечують гарну видимість дрібних об'єктів.

Мікроскопія в темному полі. Основи цього методу розроблено австрійським вченим Р. Зігмонді, він дає можливість підвищувати дозвільну здатність мікроскопу в 10 разів і використовується для дослідження об'єктів малої величини. Для цього в біологічному мікроскопі звичайний конденсор заміняють спеціальним конденсором темного поля, що має затемнену середню частину і пропускає тільки бічні промені.

Таким чином, мікроскопія в темному полі базується на висвітленні об'єкта косими променями світла (явище Тиндаля). Ці промені, не потрапляючи в об'єктив, залишаються невидимими для ока, тому поле зору виглядає зовсім чорним (рис. 1.4).

Рис. 1.4. Схема ходу променів у конденсорі темного поля:

1 - лінза конденсора;

2 - чорна пластинка;

3 - об'єктив.

Якщо препарат містить якісь частки, наприклад, мікроорганізми, то косі промені, проходячи через такий препарат, у значній мірі відбиваються від поверхні цих часток і, ухиляючись від свого первісного напрямку, попадають в об'єктив. Тоді спостерігач бачить на чорному фоні інтенсивно світні об'єкти з різким бічним контрастом. При цьому апертура конденсора повинна бути трохи більше апертури об'єктива (об'єктив необхідно діафрагмувати, а конденсор імергувати). Метод темного поля використовується для спостереження живих клітин мікроорганізмів.

Фазово - контрастна мікроскопія. Метод запропоновано голландським фізиком Ф. Церніке для спостереження за живими об'єктами.

Більшість препаратів живих мікроорганізмів слабо контрастні, тобто клітини мало відрізняються за забарвленням і прозорістю від навколишнього середовища. Проте світлова хвиля набуває певних змін: проходячи через ділянки препарату, що мають більший, ніж у навколишнього середовища показник заломлення, вона виходить із деяким відставанням за фазою. Спеціальний фазово - контрастний пристрій дозволяє оптичним шляхом перетворювати розходження за фазою в зміни амплітуди, у результаті чого живі прозорі об'єкти стають контрастними, їх можна побачити оком.

Оптична система, яка використовується для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластинки в одній з лінз об'єктива, що має форму кільця, і кільцевої діафрагми в спеціальному конденсорному пристрої. Для одержання фазового ефекту необхідне точне сполучення фазового кільця з проекцією кільцевої діафрагми (рис. 1.5).

Метод фазового контрасту застосовується для дослідження живих клітин мікроорганізмів різних систематичних груп, контрастність яких досягається оптичним шляхом без втручання в фізіологічні процеси об'єктів, що вивчаються.

Рис. 1.5. Схема ходу променів із використанням фазово - контрастного пристрою:

- кільцева діафрагма;

- конденсор;

- об'єкт;

- об'єктив;

- фазова пластинка.

Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія. Вперше феномен люмінесценції для мікроскопічних досліджень було використано австрійським ученим А. Келером.

Деякі біологічні об'єкти здатні при освітленні короткохвильовими променями (синьо - фіолетовими, ультрафіолетовими) поглинати їх і випромінювати промені з більш довшою хвилею, при цьому виникає світіння жовто - зеленим або оранжевим кольором. Таке явище називається власною, або первинною, люмінесценцією.

Об'єкти, яким не притаманна первинна люмінесценція, можна обробити спеціальними флуорохромами (акридином жовтим, акридином оранжевим, аураміном, примуліном, конго червоним, тетрацикліном, хініном) і також спостерігати люмінесценцію, але це вже буде наведена, або вторинна люмінесценція. Препарати, забарвлені флуорохромами, вивчають на середовищах, що не здатні до люмінесценції (воді, гліцерині, фізіологічному розчині).

Оптична схема люмінесцентного мікроскопу відрізняється від схеми звичайного вибором джерела світла, а саме, заміною низько вольтової лампи на ртутну і наявністю на шляху променів двох світлофільтрів (синій - перед конденсором пропускає синьо - фіолетові промені видимого спектру, жовтий світлофільтр в окулярі мікроскопу гасить синьо - фіолетові промені, які заважають виявленню люмінесценції). Люмінесцентна мікроскопія - поєднання кольорового зображення з контрастністю об'єктів, дає можливість спостерігати за морфологією живих та мертвих клітин мікроорганізмів, досліджувати клітинні мікроструктури та функціонально - морфологічні зміни в клітині.

Електронна мікроскопія. Перший прототип сучасного електронного мікроскопа було побудовано радянським вченим Е. Руске. В електронному мікроскопі замість світлових променів використовують пучок електронів, які мають хвильові властивості. Нині широко використовують два типи електронних мікроскопів: трансмісійний і растровий.

В трансмісійному електронному мікроскопі пучок електронів рухається прямолінійно в безповітряному просторі від джерела електронів (розжарена нитка вольфрамової гармати) крізь досліджуваний об'єкт у напрямі до флуоресцентного екрану і викликає його світіння.

При дослідженні морфологічних особливостей клітин мікроорганізмів, їх товщина не повинна перевищувати 0,8 - 0,9 мкм. Контрастність зображення досягається за рахунок напилювання на досліджуваний об'єкт важких металів (хрому, золота, паладію) або обробки фосфорно - вольфрамовою кислотою і уранілацетатом.

Растровий електронний мікроскоп дозволяє отримувати об'ємне, тривимірне зображення об'єкта. Для цього тонкий рухомий електронний промінь дуже швидко і послідовно оббігає поверхню клітини і передає отриману інформацію на електронно - променеву трубку, що вкрита люмінофором.

Препарати для цього типу електронних мікроскопів піддають спеціальній обробці, основна мета якої - зневоднення об'єкту без порушення поверхні структур. Потім препарат вкривають тонким шаром сплаву золота або платини, що робить поверхню зразка електропровідною і дозволяє уникнути накопичення електричного заряду, який може знизити дозвільну здатність мікроскопа.

Порядок виконання роботи.

1. Ознайомитися з правилами поведінки й техніки безпеки в мікробіологічній лабораторії.

2. Ознайомитися з будовою світлопольного мікроскопу (монокуляри, бінокуляри), які використовуються при виконанні лабораторних робіт з дисципліни.

3. Вивчити основні види мікроскопії, які застосовуються для дослідження живих клітин мікроорганізмів, а також встановити їх переваги та недоліки.

4. Визначити можливі варіанти загального збільшення світлопольного мікроскопу та його дозвільної здатності.

5. Замалювати малюнки згідно методичним вказівкам, зробити необхідні обчислення та висновки.

Лабораторна робота №2

Тема: Мікроскопічні дослідження мікроорганізмів різних систематичних груп. Прості методи забарвлення

Мета: освоїти методики приготування препаратів живих і фіксованих забарвлених мікроорганізмів та техніку мікроскопії

Матеріали й устаткування: постійні препарати культур мікроорганізмів різних систематичних груп (Streptococcus lactis, Micrococcus lisodeikticus, Lactobacillus acidophylum, Streptomyces recifensis, Staphylococcus aureus, Lactobacterium plantarum, Bacillus subtilis та ін.), природні субстрати, мікроскопи, предметні і покривні скельця, крапельниці з водою, бактеріологічні петлі, препарувальні голки, імерсійна олія, метиленовий синій, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, бензин, серветки, фільтрувальний папір, промивалка з дистильованої водою, розчин, що дезінфікує

Теоретичні положення.

Мікроскопічні дослідження мікроорганізмів проводять в живому або фіксованому стані. Мікроскопія мікробних клітин в живому стані застосовується головним чином для вивчення їх розмірів, форми, структури, рухомості, характеру розмноження, відношення клітин до різних хімічних подразників. З цією метою найчастіше готують препарати роздавлена та висяча краплі.

Метод «роздавленої краплі». На чисте знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять краплю суспензії мікроорганізмів. Якщо в культурі розвилося дуже багато бактерій, її розводять водою.

Покривне скло ставлять на ребро з краю краплі і поступово опускають на неї. Між скельцями не повинно залишатися пухирців повітря, які заважатимуть мікроскопії. Крапля повинна бути невеликою, щоб після «роздавлювання» рідина не виступала за край покривного скла. Препарат розглядають із сухою системою.

Метод «висячої краплі». Препарат «висяча крапля» використовують для виявлення рухливості мікроорганізмів. Крім того, можна довгостроково спостерігати за життєдіяльністю мікроорганізмів: розмноженням, утворенням і проростанням спор.

Для готування препарату невелику краплю суспензії мікроорганізмів наносять на покривне скло, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) у центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Край лунки попередньо змазують вазеліном. Крапля виявляється герметично замкненою у вологій камері, що дозволяє багатоденне спостерігання за об'єктом.

Препарати розглядають під мікроскопом, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. З невеликим збільшенням знаходять край краплі, що буде чітко видний у затемненому полі зору. Край краплі пересувають у центр полю зору мікроскопа і переводять на велике збільшення, розширивши при цьому діафрагму. Більш чіткі результати можна одержати у темнопольній або фазово - контрастній мікроскопії.

Препарат «відбиток». Ці препарати є зручними для вивчення природного розташування клітин у колонії мікроорганізмів й особливо для дослідження форми спор і спороносців актиноміцетів і грибів.

З агаризованої пластинки, на якій мікроорганізми виросли суцільним газоном, вирізають скальпелем невеликий блок і переносять на предметне скло так, щоб поверхня з мікроорганізмами була обернена нагору. Потім до газону прикладають чисте покривне скло і негайно знімають, намагаючись не зрушити убік. Отриманий препарат поміщають відбитком униз у краплю води (можна в краплю метиленового синього) на предметне скло і розглядають під мікроскопом із сухою системою. Такий відбиток можна одержати і на предметному склі, якщо торкнутися ним поверхні колонії. Відбитки можна фіксувати й забарвлювати будь - яким способом.

Дослідження фіксованих забарвлених препаратів - найбільш розповсюджений мікробіологічний метод для виявлення морфологічних особливостей, кількісного обліку мікроорганізмів, а також для перевірки чистоти культури. Фіксовані забарвлені препарати можуть зберігатися тривалий час і розглядаються з імерсійною системою. Їхнє готування включає наступні етапи: виконання мазка, висушування, фіксацію й забарвлення.

У простому забарвленні мікроорганізмів застосовують якийсь один з основних анілінових барвників: метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий. Профарбовується вся клітина.

Готування мазка. За допомогою стерильної бактеріологічної петлі чи піпетки нанести на знежирене предметне скло краплю суспензії мікроорганізму. Матеріал із густого живильного середовища узяти бактеріологічною петлею і внести його в краплю стерильної водопровідної води. Матеріал рівномірно тонким шаром розподілити на площі 1 - 2 см².

Висушування мазка. Висушити приготовлений мазок при кімнатній температурі у повітрі. Тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнене, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря, тримаючи предметне скло високо над полум'ям пальника мазком нагору. Цю операцію проводять дуже обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.

Фіксація дає можливість швидко перервати протікання життєвих процесів у живому об'єкті, зберігаючи його тонку структуру. Фіксація переслідує кілька цілей: забезпечити прикріплення клітин до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення, оскільки мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі; зробити безпечним подальші маніпуляції з мазком, що важливо в роботі з патогенними мікроорганізмами.

Найпростіший і розповсюджений спосіб фіксації - термічна обробка. Після висушування мазок зафіксувати в полум'ї пальника. Тримаючи скло мазком нагору, тричі провести його через гарячу частину полум'я пальника. Щоб уникнути перегріву, час прямого впливу полум'я не повинний перевищувати 3 - 4 с. Крім жару фіксацію можна робити хімічними речовинами, для цього використовують 96 % - ний етиловий спирт (час фіксації 5 - 10 хвилин), суміш Нікіфорова (спирт : ефір - 1 : 1; час фіксації 10 - 15 хвилин); ацетон (5 хвилин) та ін.

Забарвлення. Фіксований препарат помістити мазком нагору на місток із двох паралельних скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками, що знаходяться на стінках кювети чи кристалізатора. Нанести на нього 2 - 3 краплі барвника (кінець піпетки не повинний торкатися мазка!) на 2 - 3 хвилини. Під час фарбування розчин барвника на мазку не повинний підсихати, при необхідності доливати нові порції. Для одержання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальним папером. По закінченні фарбування препарат промивають водою доти, поки стікаюча вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують у повітрі і промокають фільтрувальним папером.

Існують прості і диференційовані методи забарвлення. При простому забарвленні використовують один який-небудь барвник, наприклад метиленовий синій, фуксин, генціанфіолетовий в лужних або карболових розчинах. При цьому фарбується вся клітина. При диференційованому забарвленні різними барвниками забарвлюються тільки окремі структури клітини. Наприклад - метод забарвлення за Грамом, забарвлення спор, джгутиків, нуклеоїду та ін.

Барвники за хімічною природою розподіляються на кислі та лужні. Їх також поділяють на позитивні й негативні. З барвників, які застосовуються в мікробіологічній практиці, більшість відноситься до позитивних. Вони забарвлюють всю клітину при кімнатній температурі протягом 30 - 60 с. Негативні барвники забарвлюють проміжки, які оточують клітини мікроорганізмів. В результаті клітини виглядають силуетами на фоні барвника.

Правила роботи з імерсійним об'єктивом. Після установлення освітлення приготовлений сухий пофарбований препарат спочатку розглядають із невеликим збільшенням під об'єктивом сухої системи (8х, 40х). Знайшовши найбільш удале місце на ньому, препарат закріплюють затисками на столику мікроскопа. Тубус мікроскопа піднімають і, повертаючи револьвер, установлюють імерсійний об'єктив. Потім у центр препарату на мазок, не знімаючи зі столика мікроскопа, наносять краплю імерсійної (кедрової) олії і, дивлячись збоку, обережно опускають тубус мікроскопа до занурення об'єктива в олію. Стежать за тим, щоб фронтальна лінза не торкнулася предметного скла і не одержала ушкодження. Після цього, дивлячись в окуляр, макрометричним гвинтом повільно піднімають об'єктив до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Фокус уточнюють за допомогою мікрометричного гвинта.

Після роботи кедрову олію негайно видаляють з об'єктива серветкою, що змочена очищеним бензином. Ксилол і спирт використовувати не рекомендується, тому що вони можуть викликати розклеювання лінз об'єктивів.

У правильно забарвленому і добре промитому препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими залишаються клітини мікроорганізмів.

Порядок виконання роботи.

1. Приготувати й провести мікроскопічне дослідження прижиттєвих препаратів мікроорганізмів за методами «висяча» та «роздавлена» краплі.

2. Зробити препарат «відбиток».

3. Приготувати для мікроскопічного дослідження препарати фіксованих забарвлених клітин мікроорганізмів простим способом та виконати мікроскопію з імерсією.

4. Вивчити препарати. Результати занести до зошита у вигляді малюнка. Зробити висновки.

5. Препарати, перш ніж вимити, поміщають у судину з дезінфікуючим розчином.

Лабораторна робота № 3

Тема: Морфологія бактерій і актиноміцетів

Мета: вивчити морфологічну різноманітність прокаріотичних організмів (бактерій і актиноміцетів)

Матеріали й устаткування: природні субстрати (кисляк, кефір, настій сіна, біогумусу, розсіл квашеної капусти, гниле м'ясо й ін.) і постійні препарати з культур мікроорганізмів різних морфологічних груп (Streptococcus lactis, Micrococcus lisodeikticus, Lactobacillus acidophylum, Streptomyces recifensis, Lactobacterium plantarum й ін.), культури актиноміцетів, що виросли на чашках Петрі, мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1 - 2 мл, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, у тому числі з лункою, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами: метиленовий синій (1:40), водний розчин фуксину основного, генціанвіолет, стерильний розчин чорної туші (1:9); імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованої водою

Теоретичні положення.

Бактерії складають найбільш велику і дуже різноманітну групу (понад 1600 видів) мікроорганізмів. Бактерії - це в основному одноклітинні організми, що розмножуються простим поперечним поділом. Морфологічно бактерії розрізняють за формою, взаємним розташуванням клітин, наявністю чи відсутністю джгутиків і капсул, здатністю клітин до спороутворення і т.п.

За формою бактерії поділяються на кілька груп: сферичні, циліндричні, спіральні, незвичайної форми і нитчасті.

Кулясті (сферичні) бактерії - коки (Coccus). Напрямок площини поділу клітин і характер взаємного розташування клітин використовують як систематичну ознаку для виділення родів сферичних бактерій. Діаметр коків 0,5 - 1,2 мкм. Кулясті бактерії, як правило, не мають джгутиків, нерухомі і спор не утворюють.

Моно - чи мікрококи (рід Micrococcus). Їхні клітини поділяються в будь - якій площині і відразу після поділу відокремлюються, розташовуючись поодиноко.

Диплококи (рід Diplococcus) і стрептококи (рід Streptococcus) утворюються у поділі клітин в одній площині; у диплококів клітини розташовуються попарно.

Стрептококи (рід Streptococcus) поділяються також в одній площині, але клітини не відокремлюються одна від одної , а утворюють ланцюжка.

Тетракоки (рід Tetracoccus) виникають за умов поділу клітин у двох взаємно перпендикулярних площинах, клітини утворюють групи по 4 особини.

Сарцини (рід Sarcina) формуються у розподілі клітин у трьох взаємно перпендикулярних площинах, при цьому утворюються пакети з 8 - 12 клітин і більше.

Стафілококи (рід Staphylococcus) представляють скупчення клітин, що нагадують виноградні грона. Поділ клітин відбувається в будь - якій площині.

Крім правильної кулястої форми, клітини можуть мати овальну чи ланцетоподібну форму (пневмококи), чи бобоподібну форму кавового зерна (гонококи, менінгококи).

Паличкоподібні (циліндричні) бактерії - найбільш чисельна та різноманітна група бактерій. Паличкоподібні бактерії розрізняють по величині клітин, їхньому розташуванню, обрису кінців клітини, по наявності чи відсутності джгутиків. Довжина клітин паличкоподібних бактерій коливається від десятих часток мкм до 10 - 15 мкм і більш, діаметр клітин від 0,5 до 1,0 мкм.

Більшість паличкоподібних мікроорганізмів - форми безспорові, вони називаються бактеріями (Bacterium, позначають Bact., чи B). Паличкоподібні бактерії, які здатні за несприятливих умов формувати спори, прийнято називати бацилами (Bacillus, позначають Bac.). Бактерії й бацили розташовуються поодиноко, чи попарно з'єднуються в ланцюжки, в останньому випадку їх називають відповідно стрептобактерії та стрептобацили. Спори різних бактерій відрізняються за формою, розмірам і положенню в клітині. За умов бацилярного положення спори локалізуються в клітині у центрі, ексцентрально чи термінально і при цьому клітина не змінює свою форму. Під час клостридіального формування спори клітина змінює форму, здобуваючи вид човника чи веретена. Ендоспора розташовується в стовщеній частині клітини центрально чи ексцентрально. Плектридіальне положення - це термінальна локалізація спори. У місці її розташування клітина розширюється й здобуває вид барабанної палички чи ракетки.

Звиті (спіральні) бактерії у залежності від форми й кількості витків поділяють на три типи клітин.

Вібріони (рід Vibrio) представлені короткими вигнутими паличками у формі коми. Клітини вібріонів вигнуті на 1/3 - 1/4 обороти. Довжина клітин складає 1 - 3 мкм.

Спірили (рід Spirillum) - клітини, що вигнуті на 2 - 3 обороту, мають форму латинської букви S. Розміри клітин у порівнянні з вібріонами значно крупніше - 15 - 20 мкм.

Спірохети (рід Spirochaeta) представлені дуже тонкими довгими клітинами штопороподібної форми з великим числом дрібних витків. Довжина клітин перевищує ширину в 5 - 200 разів. Число витків спіралі є одним із систематичних ознак для визначення виду.

Міксобактерії (слизисті бактерії). Група бактерій, які стоять на більш високому ступені розвитку, ніж описані вище. У деяких представників міксобактерій (Sorangsum, Poliangium) в світлопольному мікроскопі чітко видно диференційоване ядро. Вегетативні клітини мають паличкоподібну форму з загостреними або округлими кінцями. По мірі старіння вони скорочуються і переходять в мікроспори, які з'єднуються слизом й утворюють первинні або вторинні цисти, з яких в подальшому формуються плодові тіла.

Для спостереження за формою міксобактерій беруть колонії, які розвиваються навколо грудочок ґрунту на гелевих пластинах з клітковиною.

Нитчасті форми бактерій являють собою ланцюжки циліндричних клітин, часто оточені загальним чохлом. Розповсюджені в ґрунті, водоймах, особливо з високим вмістом заліза. Типовим представником нитчастих бактерій є Leptothrix, який відноситься до залізобактерій. Він окислює закисні форми заліза в окисні.

...