Елективні умови передбачають ряд факторів, наприклад, потреба мікроорганізмів у живильному субстраті, відношення до кисню, кислотності середовища, температурі, здібність до спороутворення і т.д.

Підбираючи оптимальний склад живильного середовища та параметри культивування й інокулюючи середовище якими-небудь природними субстратами, що містять різноманітні мікроорганізми, можна одержати накопичувальну культуру організмів, що характеризуються визначеними фізіолого-біохімічними властивостями. З накопичувальних культур виділяють чисту культуру мікроорганізмів.

Чиста культура може бути одержана з окремої колонії або з одної клітини. Основним методом виділення чистих культур є метод Коха. Принцип його полягає в одержанні чистої культури з ізольованої колонії, що розвилася з однієї клітини.

Виділення чистої культури проводять з отриманої накопичувальної культури. Чиста культура може бути одержана механічним роз'єднанням мікроорганізмів методами, що використовують їхні біологічні особливості.

Метод заснований на тому, що за умов нанесення мікроорганізмів з посівного матеріалу на густе середовище окремі клітини будуть закріплюватися (іммобілізуватися) у визначеній крапці твердого середовища і, розмножуючись, давати потомство (клон), що представляє колонію чистої культури мікроорганізмів.

Спочатку вирощують культуру з механічним відокремлюванням клітин мікроорганізмів за посівом на густі живильні середовища в чашки Петрі. Таким чином одержують ізольовані колонії, припускаючи, що вони виросли з однієї клітини, і паралельно вивчають культуральні властивості.

Потім проводять виділення чистої культури з ізольованих колоній на скошений агар. Після цього ідентифікують мікроорганізми з різноманітних властивостей.

Перенесення клітин вирощеної культури мікроорганізмів з одного середовища у свіже стерильне живильне середовище називається пересіванням чи пасируванням. Пасирування - традиційний метод збереження чистої культури мікроорганізмів із дотриманням інтервалів, що залежать від їхнього виду, середовища культивування й умов збереження.

Посів (і пересів) мікроорганізмів проводять із дотриманням визначених правил стерильності - усі маніпуляції проводять біля полум'я пальника (у радіусі 15 - 20 см) по можливості швидко, щоб не забруднювати культуру сторонніми мікроорганізмами. Не рекомендується робити різкі рухи, ходити біля того, хто виконує посів мікроорганізмів, тому що рух повітря збільшує ймовірність випадкового забруднення культури.

Спосіб посіву в середовище залежить від її консистенції, якості матеріалу, що засівається, і мети дослідження.

Перед посівом необхідно написати на пробірці, колбі чи чашці Петрі назву мікроорганізму і дату посіву.

Виділення чистих культур за методом Коха.

Для одержання ізольованих колоній за методом Коха і виділення з них чистих культур аеробних бактерій роблять посів на поверхню твердого живильного середовища у чашки Петрі з накопичувальної культури:

розплавляють стерильне агаризоване сусло в колбі на водяній бані і розливають його в 3 - 4 стерильні чашки Петрі;

мікроорганізми висівають і розподіляють шпателем Дригальского чи петлею, використовуючи техніку виснаженого штриха чи мазка (рис. 7.1) послідовно в декількох чашках Петрі з застиглим твердим агаризованим середовищем;

спочатку на поверхню середовища першої чашки, використовуючи петлю, наносять краплю розведення накопичувальної культури й обережно розтирають її стерильним скляним шпателем по всій поверхні;

потім цим же шпателем із клітинами мікроорганізмів, що залишилися на ньому, засівають поверхню другої чашки. Далі цим же шпателем проводять вздовж поверхні третьої чашки Петрі;

після посіву чашки необхідно перевернути нагору дном і поставити в термостат із температурою, що сприятлива для даного мікроорганізму;

інкубують посіви звичайно протягом 2 - 5 днів (у залежності від швидкості росту конкретних мікроорганізмів);

після інкубації у перших чашках звичайно спостерігається суцільний ріст мікроорганізмів (суцільний «газон»), а в наступних утворюються ізольовані колонії. У випадку засіву за секторами у перших відбувається суцільний ріст, а уздовж наступних штрихів виростуть відособлені колонії мікроорганізмів, що представляють потомство однієї клітини;

ізольовані колонії відсівають петлею в пробірки на поверхню скошеного густого середовища чи в рідке середовище;

Висів із накопичувальної культури мікроорганізмів, що відносяться до факультативних аеробів чи факультативних анаеробів, для одержання ізольованих колоній роблять методом глибинного посіву в пробірки зі стовпчиком стерильного агару. Стерильною голкою беруть чисту культуру з колоній, одночасно виймають пробку, обпалюють край пробірки і, тримаючи її нагору дном, голкою над пальником роблять прокол до дна.

Виділення чистої культури анаеробних бактерій за методом Коха можливо тільки в умовах, що виключають доступ до них вільного кисню. Анаеробні мікроорганізми можна культивувати у звичайних пробірках і чашках Петрі, поміщаючи їх після посіву в анаеростати - вакуумні скляні ексикатори.



Рис. 7.1. Розсів мікроорганізмів на поверхню твердого середовища:

а - шпатель Дригальського;

б - розсів;

в - ріст мікроорганізмів після розсіву шпателем;

г - ріст мікроорганізмів після розсіву петлею.

Порядок виконання роботи

Ознайомитися з технікою поверхневого способу посіву на щільні середовища в чашки Петрі:

на тверде середовище наносять петлею краплю посівного матеріалу і потім рівномірно розподіляють його на поверхні, користаючись стерильним шпателем Дригальського. За умови узяття рідини петлею вона повинна затягти петлю тонкою плівкою. Піпеткою користаються в тому випадку, коли матеріал засівають у великій кількості чи визначеному об'ємі;

шпатель виймають із папера і беруть у праву руку;

відкривають кришку чашки Петрі лівою рукою і вносять у неї шпатель;

розмазують краплю посівного матеріалу шпателем обертальними рухами на поверхні агарової пластинки (надавлювати шпателем на тверде середовище не треба, тому що можна йому зашкодити);

з метою економії середовищ і посуду можна користатися однією чашкою, розділивши її на сектори і послідовно засівати їх штрихом (метод виснаженого штриха). Для цього спочатку засівають поверхню першого сектора, а потім послідовно засівають всі інші сектори клітинами, що залишилися на петлі. З кожним наступним штрихом відбувається зменшення кількості клітин, що засіваються;

переносять шпатель у судину з дезінфікуючим розчином.

2. Ознайомитися з технікою глибинного посіву на тверді середовища в чашки Петрі:

відкривають стерильну чашку і поміщають петлею чи піпеткою краплю посівного матеріалу на дно чашки;

розплавляють агаризоване живильне середовище у пробірці чи колбі й охолоджують його до 45 - 50С;

обпалюють край пробірки чи колби в полум'ї пальника і виливають середовище (15 - 20 мл) у чашку Петрі з внесеним посівним матеріалом, дотримуючись правил стерильної роботи;

розподіляють рівномірно посівний матеріал у живильному середовищі, для чого обережно круговими рухами переміщають чашку Петрі на поверхні столу;

залишають чашку Петрі на столі до повного затвердіння середовища;

роблять на чашці напис (число, назва мікроорганізму);

усі посіви для вирощування мікроорганізмів поміщають у термостат із температурою, що сприятлива для їхнього росту.

3. Ознайомитися з технікою пересівання культур мікроорганізмів, вирощених у рідкому середовищі:

клітини мікроорганізмів, що виросли в рідкому живильному середовищі відбирають частіше стерильною піпеткою;

зі стерильного папера виймають градуйовану стерильну піпетку за верхній кінець, беруть піпетку середнім і великим пальцями правої руки, не торкаючись поверхні тієї частини піпетки, що буде вводитися в судину з рідким середовищем;

беруть у ліву руку пробірку (чи колбу) із культурою мікроорганізму, що вирощена в рідкому середовищі, і тримають її у вертикальному положенні, щоб не замочити пробку;

відкривають пробку, дотримуючись правил асептики, і вводять піпетку в пробірку;

набирають у піпетку суспензію мікроорганізму, закривають пробкою пробірку (чи колбу), вносять визначену кількість суспензії у свіже стерильне живильне середовище, дотримуючись правил стерильності;

після використання піпетку поміщають у судину з дезінфікуючим розчином, не торкаючись нею навколишніх предметів (0,5 % - ний водний розчин хлораміну чи 3 - 5 % - ний водний розчин фенолу).

4. Ознайомитися з технікою посіву мікроорганізмів, що вирощені на твердому середовищі в пробірках, в іншу пробірку із середовищем:

запалюють пальник. Посіви проводять над полум'ям пальника, щоб гаряче повітря перешкоджало осадженню мікроорганізмів з навколишнього повітря;

беруть у праву руку бактеріологічну петлю, за допомогою якої здійснюють посів (петлю тримають як олівець). Стерилізують бактеріологічну петлю в полум'ї пальника, прожарюючи дріт до червоності, і одночасно обпалюють частину утримувача, що примикає до петлі і буде вводитися в пробірку з культурою мікроорганізму. Упродовж прожарювання петлю тримають у полум'ї майже вертикально, щоб весь дріт був розпечений;

беруть у ліву руку дві пробірки - одну зі стерильним середовищем (далі від себе), іншу - із культурою мікроорганізму;

не випускаючи бактеріологічної петлі, мізинцем і безіменним пальцем правої руки притискають зовнішні кінці ватяних пробок до долоні і виймають пробки з пробірок. Класти пробки на стіл не можна;

злегка обпалюють у полум'ї пальника край відкритих пробірок;

прожарену бактеріологічну петлю вводять у пробірку з культурою мікроорганізму. Щоб не зашкодити клітинам, петлю спочатку прохолоджують, доторкаючись до внутрішньої поверхні пробірки чи до живильного середовища, вільного від клітин мікроорганізмів, і тільки після цього відбирають невелику кількість мікробної маси;

виймають петлю і вводять її у пробірку зі стерильним живильним середовищем, уникаючи дотику зі стінками пробірки;

проводять петлею від дна догори зигзагоподібний чи прямий штрих, злегка торкаючись поверхні агару;

обпалюють ватяні пробки і край пробірок одночасно в полум'ї і закривають обидві пробірки;

закриту ватною пробкою пробірку з культурою ставлять у штатив, а витягнутий матеріал використовують для готування препарату чи для пересівання культури у свіже середовище;

обпалюють петлю в полум'ї;

усі описані маніпуляції варто проводити біля полум'я, за можливістю швидко, щоб не забруднити культуру сторонніми мікроорганізмами.

5. Зобразити необхідні малюнки для кращого засвоєння матеріалу та зробити висновки.

Лабораторна робота № 8

Тема: Методи кількісного обліку мікроорганізмів. Мікробіологічне дослідження мікрофлори повітря.

Мета: визначити чисельність мікроорганізмів за методом Коха; користаючись методом прямого рахунку мікробних клітин у рахункових камерах, визначити їхню чисельність; проаналізувати кількісний і якісний склад мікроорганізмів повітря

Матеріали й устаткування: предметні й покривні стекла, барвники, водяна баня зі штативом, бактеріологічна петля, пінцет, спиртівка, 0,1 % розчин агар - агару, окулярний мікрометр, об'єктивний мікрометр, мікроскоп, освітлювач, чисті і накопичувальні добові культури мікроорганізмів (дріжджі), рахункова камера Горяєва, стерильні пробірки, стерильні піпетки на 10 мл та 1 - 2 мл, колба зі стерильною водою, спирт 96⁰, зразки ґрунту, стерильні живильні середовища (МПА, СА), мікробіологічні пробірки зі стерильною водопровідною водою, шпателі Дригальського, піпетки, скляні палички

Теоретичні положення

Метод Коха - найбільш розповсюджений спосіб кількісного обліку мікроорганізмів на твердих середовищах. Сутність методу полягає в посіві визначеного об'єму досліджуваної суспензії мікроорганізму на тверде середовище в чашки Петрі і наступному підрахунку числа колоній, що виросли. При цьому приймають, що кожна колонія утворюється розмноженням однієї клітини.

Цей метод дозволяє вести облік тільки життєздатних мікроорганізмів. В аналізі беруть стерильно 1 мл суспензії і поміщають у 9 мл стерильної водопровідної води чи фізіологічного розчину, потім роблять ряд послідовних розведень (мал. 8.1).

Ступінь розведення перед посівом визначається передбачуваною кількістю мікроорганізмів в зразку. Ґрунт є середовищем заселення великого числа різноманітних мікроорганізмів. У 1 г ґрунту міститься від 1 до 10 млрд. клітин мікроорганізмів.



Рис. 8.1. Схема готування розведення і посіву суспензії мікроорганізмів

У лабораторній практиці мікробіології немає універсального живильного середовища, на якому розвивалися б усі ґрунтові мікроорганізми, тому результати загальної чисельності мікроорганізмів за методом висіву навіть на найбільш універсальні живильні середовища виходять заниженими.

Метод кількісного обліку мікроорганізмів за допомогою рахункових камер має обмежене застосування, пов'язане з тим, що в цьому випадку виконується облік усіх кліток мікроорганізмів без їхньої диференціації на живі й мертві клітини. Крім того, рахункові камери можуть бути використані лише для підрахунку щодо відносно великих об'єктів - клітин водоростей, дріжджів, спор, грибів, що можна дослідити методом мікроскопії з об'єктивами 8х - 40х.

У випадку рухливості клітин препарат незначно підігрівають (чи додають краплю 0,1 % розчину агар - агару). Фіксація і фарбування препаратів призводить до деяких змін розмірів мікробних кліток.

Рахункова камера Горяєва являє собою товсте предметне скло з нанесеними на ньому поперечними прорізами, що утворюють три поперечно розташовані плоскі площадки (рис. 8.2). Середня площадка подовжнім прорізом розділена навпіл, причому на кожній половині нанесена квадратна сітка. Дві бічні площадки розташовано на 0,1 мм вище за середню. Ці площадки служать для притирання покривного скла. Сітка розділена на визначене число згрупованих великих і маленьких квадратів.

Постійною величиною у всіх сітках є маленький квадрат, сторона якого дорівнює 1/20 мм, площа його 1/400 мм², а об'єм при висоті камери 1/10 мм - 1/4000 мм³ чи 1/4000000 мл. Так званий великий квадрат складається з 16 малих квадратиків.

Камера Горяєва має площу 9 мм², об'єм камери - 9 мм³ і розбита на 225 великих квадратів (15 рядів по 15 великих квадратів у кожнім ряду).

В

Рис. 8.2. Рахункова камера Горяєва:

А - вид зверху; Б - вид збоку; В - вид камери Горяєва з малим збільшенням мікроскопа.

Підрахунок кліток у камері починають через 3 - 5 хвилин після заповнення її, коли клітини осіли й розташувалися в одній площині. Підрахунок кліток ведуть звичайно в 10 великих або в 20 малих квадратах, переміщаючи її за діагоналлю. З вихідної суспензії варто приготувати 3 - 4 кратні розведення.

Порядок виконання роботи.

Виконати посів за методом Коха суспензії зі зразка ґрунту, що розведений в 1000, 10000 раз на тверде вівсяне живильне середовище, МПА і середовище Гаузе. Результати інокуляції й підрахунок мікроорганізмів зробити на наступному занятті:

наважку підготовленого ґрунту (1 г) поміщають у чисту ступку з невеликою кількістю стерильної води і розтирають гумовою маточкою чи пальцем у гумовій рукавичці приблизно 5 хвилин. Підготовлену суспензію переносять у колбу з 100 мл стерильної водопровідної води. Готують розведення ґрунтової суспензії, для чого 1 мл суспензії переносять послідовно в ряд пробірок з 9 мл стерильної водопровідної води;

на поверхню твердого й підсушеного середовища наносять краплю ґрунтової суспензії визначеного розведення й за допомогою стерильного скляного шпателя розподіляють по всьому агару. Якщо висів проводять, починаючи з великих розведень, то використовують нову стерильну піпетку і новий шпатель для кожного розведення;

засіяні чашки Петрі перевертають нагору дном і поміщають у термостат із визначеною температурою, яка сприятлива для розвитку мікроорганізмів, що враховуються;

підрахунок колоній, що виросли, проводять через визначений час після посіву (3 - 5 доби). На МПА звичайно на 2 - 3 добу інкубації враховують спорові й безспорові форми бактерій. На середовищі Гаузе на 5 - 7 добу враховують колонії актиноміцетів, на сусло - агарі на 5 - 7 добу - колонії грибів і дріжджів;

колонії, як правило, рахують, не відкриваючи чашки Петрі, у прохідному світлі. Для зручності дно чашки поділяють на сектори, підраховують кількість колоній у кожнім секторі, кожну відлічену колонію позначають крапкою (маркером) із нижньої сторони чашки Петрі й результати підсумовують. Для підрахунку колоній зручно користатися спеціальним приладом із лічильником;

точність методу залежить від числа підрахованих колоній: кращим розведенням вважають те, у висіві якого на твердому живильному середовищі виростає від 50 до 150 колоній;

підрахувавши кількість колоній на всіх паралельних чашках, обчислюють їхнє середнє число на одній чашці і потім роблять перерахування для визначення вмісту мікроорганізмів в 1 г ґрунту за формулою:

 (8.1)

де N - кількість клітин у 1 г ґрунту; a - середня кількість колоній на чашці; b - розведення, із якого зроблено посів; c - кількість крапель у 1 мл суспензії.

Приготувати препарат із добової культури дріжджів роду Saccharomyces і підрахувати кількість клітин у вихідній суспензії:

мікробіологічною петлею краплю суспензії дріжджів наносять у центр рахункової камери. Рахункову камеру покривають покривним склом, ретельно притираючи його з країв до утворення ньютонівських кілець (кольорових смуг);

підрахунок клітин дріжджів робити (із збільшенням мікроскопа: окуляр 10 - 15х, об'єктив 20 - 40х) у 20 малих квадратах, у 3 - 4 пробах досліджуваної суспензії. Загальне число підрахованих клітин мікроорганізмів повинне бути не менш 600, тому беруть 3 - 4 проби з досліджуваної суспензії для монтажу камери;

потім розраховують середнє число мікробних клітин в одному малому квадраті і роблять перерахування на вміст у 1 мл вихідної суспензії за формулою:

(8. 2)

де N - число клітин у 1 мл суспензії; а - середнє число клітин у малому квадраті сітки; h - глибина камери в мм, s - площа малого квадрата сітки в мм ²; n - розведення вихідної суспензії; 1000 - коефіцієнт перерахування мм³ у мл.

3. Провести дослідження мікрофлори повітря методом Коха. Цей метод заснований на седиментації, зв'язаний з осіданням бактеріальних клітин під впливом сили ваги на поверхню агару відкритої чашки Петрі. Він дає представлення в основному про якісний зміст мікроорганізмів. У залежності від поставленої задачі з дослідження мікрофлори повітря може проводитися як визначення загальної бактеріальної зараженості повітря, так і вивчення вмісту санітарно - показових мікроорганізмів, а також наявності патогенних і умовно - патогенних мікроорганізмів.

Для вивчення мікрофлори повітря зробити посів із повітря на МПА й СА живильні середовища у чашки Петрі.

Загальну кількість бактерій, що зустрічаються в повітрі, вираховують за ростом колоній мезофільних мікроорганізмів на МПА, проби відбирають на рівні подиху сидячої людини.

Чашки з МПА експонують 5 - 10 - 15 хвилин у залежності від передбачуваного бактеріального забруднення. Орієнтовно відповідно до перерахунку за Омелянським на поверхню 100 см² агару осідає за 5 хвилин така кількість бактерій, що міститься в 10 л повітря.

Результати всіх посівів розглянути на наступному занятті, та проаналізувати кількісний і якісний склад мікрофлори повітря з різних місць забору.

Лабораторна робота № 9

Тема: Дослідження культуральних властивостей мікроорганізмів. Перевірка чистоти культур.

Мета: визначити характер росту мікроорганізмів на твердому живильному середовищі; описати отримані колонії мікроорганізмів, що засіяні на попередньому занятті; провести мікроскопічне дослідження мазків різних колоній, забарвлених за Грамом

Матеріали й устаткування: колонії мікроорганізмів на твердих середовищах у чашках Петрі, мікробіологічні пробірки зі стерильним скошеним сусло - агаровим середовищем, МПА, вівсяним агаром, спиртівка (брикети сухого пального), мікробіологічна петля, мікроскоп МБР, предметні і покривні стекла, барвники для фарбування за Грамом - генціанвіолет, фуксин, розчин Люголя, 96 % - ний спирт, пробірки, поплавці, (трубочки діаметром 5 - 7 мм, довжиною 35 - 45 мм, запаяні з одного кінця), ваги, пептон, К₂НРО₄, агар, індикатор бромкризолпурпур чи бромтимолблау (1,6 % - ний спиртовий розчин), вуглеводи (глюкоза, лактоза, маніт, сахароза й ін.)

Теоретичні положення.

До культуральних, чи макроморфологічних, властивостей відносяться характерні риси росту мікроорганізмів на твердому й рідкому живильному середовищах. На поверхні твердих живильних середовищ мікроорганізми можуть рости у вигляді характерних колоній, чи штрихів суцільного газону. Колонією називають ізольоване скупчення клітин одного виду, що виросло в більшості випадків з однієї клітини. У залежності від того, де росте мікроорганізм (на поверхні густого живильного середовища, в товщі її чи на дні судини), розрізняють поверхневі, глибинні і донні колонії. Колонії, що виросли на поверхні середовища, відрізняються великою різноманітністю і є найбільш істотною особливістю росту багатьох мікроорганізмів на твердому субстраті. В описі колоній враховують наступні ознаки: форму, профіль, край, структуру, розмір, поверхню, колір колонії. Культуральні властивості є діагностичними для ідентифікації мікроорганізмів.

Чистота культури мікроорганізмів повинна бути ретельно перевірена. Це здійснюється, як правило, декількома способами - візуальним (дослідження колоній), мікроскопічним контролем і висівом на ряд живильних середовищ.

Звичайно колонії з клітин чистої культури, що висіяна на густе середовище, схожі одна на іншу, що є доказом чистоти культури (але є виключення, наприклад, у випадку дисоціації колоній на гладкі (S - ) і складчасті (R - форми).

Інший критерій чистоти культури - це морфологія клітин. Для чистої культури характерний високий ступінь морфологічної подібності клітин у забарвлених препаратах. Однак бувають виключення у залежності від віку культури, використовуваного середовища й інших умов росту.

Порядок виконання роботи.

Переглянути колонії на чашках Петрі. Колонії, що виросли на твердому живильному середовищі, проглянути спочатку неозброєним оком чи через лупу. Потім помістити чашки на столик мікроскопа нагору дном і вивчити колонії у прохідному світлі з об'єктивом 8х. Відзначити, описати й замалювати переважні форми (3 - 5 видів), вибираючи ізольовані колонії. Опис колоній проводять за схемою, що наведена нижче.

В описі колоній враховують наступні ознаки:

Форму колонії (рис. 9.1) - округла, амебоподібна, ризоїдна і т.д.

Рис. 9.1. Форма колоній:

1 - кругла; 2 - кругла з фестончастим краєм; 3 - кругла з валиком; 4 і 5 - ризоїдні; 6 - із ризоїдним краєм; 7 - амебоподібна; 8 - нитковидна; 9 - складчаста; 10 - неправильна; 11 - концентрична; 12 - складна.

Структура колонії (рис. 9.2) - однорідна, дрібно - чи грубозерниста і т.д.

Рис. 9.2. Структура колоній:1 - однорідна; 2 - дрібнозерниста; 3 - грубозерниста; 4 - струминна; 5 - волокниста.

Розмір (діаметр) колонії вимірюють у мм; якщо розміри колонії не перевищує 1 мм, то їх називають крапковими.

Оптичні властивості (блиск і прозорість) колонії - блискуча, матова, тьмяна, борошниста, прозора, напівпрозора, непрозора, флуоресціююча.

Колір колонії - безбарвна (грязно-білі колонії відносять до безбарвних) чи пігментована - біла, жовта, золотава, жовтогаряча, бузкова, червона, чорна і т.д. В описі колоній актиноміцетів відзначають пігментацію повітряного і субстратного міцелію. Особливо відзначають виділення пігменту в субстрат.

Поверхня колонії - гладка, шорсткувата, борозниста (горбиста), складчаста, зморшкувата, із концентричними колами чи радіально покреслена.

Профіль колонії (рис. 9.3) - плоский, опуклий, кратероподібний, конусоподібний.

Край колонії (рис. 9.4) - рівний, хвилястий, зубцюватий і т.д.

Рис. 9.3. Профіль колонії:

1 - вигнутий; 2 - кратероподібний; 3 - горбистий; 4 - колонія, що вростає у субстрат; 5 - плоский; 6 - опуклий; 7 - краплеподібний; 8 - конусоподібний.



Рис. 9.4. Край колонії: 1 - гладкий; 2 - хвилястий; 3 - зубцюватий; 4 - лопатевий; 5 - неправильний; 6 - війчастий; 7 - нитчастий; 8 - ворсинчастий; 9 - гіллястий.

Консистенцію колонії визначають, доторкаючись до її поверхні петлею. Колонія може легко зніматися з агару, бути густою, м'якою чи такою, що вросла в агар, слизуватою (прилипати до петлі), тягучою, плівчастою (знімається цілком), тендітною (легко ламається за умов дотику петлею).

Край і структуру колонії визначають із невеликим збільшенням мікроскопа. Для цього чашку поміщають на столик мікроскопа кришкою вниз. Консистенцію визначають під час відсівання колоній, доторкаючись до поверхні петлею.

Розміри й деякі інші особливості колоній змінюються з віком і залежать від складу середовища, тому в їхньому описі указують вік культури, склад середовища й температуру культивування.

Здатність до емульгування - рівномірна чи зерниста суспензія у воді, слабко чи зовсім не суспендується у воді.

Після опису колонії піддаються мікроскопічному дослідженню. З кожної групи колоній, що виросли на чашках Петрі для вивчення морфології і тинкторіальних властивостей мікроорганізмів повітря приготувати препарати «роздавлена крапля», виконати мазки й забарвити за Грамом. Препарати переглянути з об'єктивами 40х і 90х, відзначити форму й сполучення клітин, наявність чи відсутність спор, визначити, до яких морфологічних груп мікроорганізмів вони відносяться. Мікроскопічну картину замалювати.

Зробити підрахунок колоній, що виросли з посівів різних проб мікрофлори повітря і за результатами підрахунку визначити чисельність мікроорганізмів.

Оформити протокол роботи.

Лабораторна робота № 10

Тема: Антибіотики й антагонізм.

Мета: вивчити антибіотичні властивості мікроорганізмів, спектр антагоністичної дії

Матеріали й устаткування: культури мікроорганізмів (Streptomyces recifencis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus cereus, Sarcina flava, Saccharomyces cereviceae і ін.), чашки Петрі з МПА, стерильні диски антибіотиків, бактеріологічна петля, пінцет, стерильні ватні тампони, стерильна водопровідна вода

Теоретичні положення.

На мікроорганізми діють не тільки абіотичні фактори навколишнього середовища, але й інші мікроорганізми, що живуть в однім і тім же середовищі. Взаємини між ними можуть бути різними: метабіоз, паразитизм, симбіоз, антагонізм. У випадку антагоністичних відносин мікроорганізми виділяють у навколишнє середовище продукти обміну речовин, що можуть або гнітити ріст інших мікроорганізмів, або убивати їх.

Антибіотики - це специфічні продукти життєдіяльності мікроорганізмів, що мають високу фізіологічну активність стосовно визначених груп мікроорганізмів, затримуючи або цілком придушуючи їхній ріст.

Антибіотичні речовини - різноманітні за складом і механізмом дії; кожен антибіотик виявляє біологічний вплив лише стосовно визначених організмів чи груп організмів, не впливаючи на інші.

Утворення антибіотиків - це спадково закріплена особливість метаболізму організмів, специфічна особливість виду мікроорганізмів, що виникла в результаті еволюційного розвитку як одна з пристосувальних особливостей, що обумовлює прояв широко розповсюджених у світі мікроорганізмів антагоністичних відносин.

До синтезу антибіотиків, головним чином, здатні гриби з роду Penicillium, актиноміцети і деякі групи бактерій. Процес утворення антибіотиків тісно пов'язаний з розвитком організмів - продуцентів і здійснюється, як правило, у фазу уповільненого росту.

Для визначення спектра антимікробної дії антибіотика чи чутливості мікроорганізму до антибіотиків використовуються методи, пов'язані зі здатністю антибіотика дифундувати в товщу субстрату.

Порядок виконання роботи.

Визначити антибіотичну активність мікроорганізмів (наприклад, актиноміцетів) методом перпендикулярних штрихів чи методом агарових блоків.

У першому випадку продуцент і тест - організми вирощують на одному середовищі, у другому - на різних, тому що не завжди те саме середовище однаково сприятливе як для розвитку продуцента й утворення їм антибіотика, так і для росту тест - культур.

На живильний агар у чашці Петрі висівають штрихом передбачуваний продуцент антибіотичної речовини. Посів штрихом роблять вздовж діаметра чашки. Під час посіву чашки тримають агаровою пластиною вниз (щоб спори не розлетілися). Після того, як продуцент виросте (через 5 - 7 днів) і утворить антибіотичну речовину, що дифундує в товщу агару, перпендикулярно до його штриха підсівають штрихами тест - організми (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus чи ін.), починаючи від периферії чашки. Для посіву використовують густі суспензії у стерильній водопровідній воді. Чашки інкубують при 28 - 30С упродовж 2 - 8 діб у залежності від швидкості росту тест - організмів.

Вплив антибіотика на мікроорганізми, що тестуються, визначають за величиною відстані між краєм штриха продуцента антибіотика (наприклад, актиноміцету) і початком росту тест - організму. Нечутливі до антибіотичної речовини тест - організми ростуть поблизу штриха продуцента. Якщо антибіотик впливає на тест - організм, то ріст останнього буде спостерігатися удалині від штриха продуцента. Чим більше ця відстань, тим більше чутливий тест - організм до антибіотичної речовини, що утворюється даним продуцентом (рис. 10.1 - 1).

Рис. 10.1. Виявлення антибіотичних властивостей мікроорганізмів за методом перпендикулярних штрихів (1); визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків за методом паперових дисків (2).

Визначити чутливість мікроорганізмів до антибіотиків методом паперових дисків.

На чашки Петрі з підсушеним середовищем МПА засівають досліджувану культуру суцільним газоном. Посів роблять шпателем Дригальського чи стерильним ватним тампоном, змоченим суспензією досліджуваної культури. Стерильним пінцетом на агар щільно накладають індикаторні паперові диски (4 - 5 штук), просочені розчином визначеного антибіотика на рівній відстані один від одного на відстані близько 2,5 см від центру чашки (рис. 10.1 - 2).

Диски нумерують на зворотній стороні дна чашки. Засіяні чашки з нанесеними дисками термостатують (нагору дном) при 37С упродовж 16 - 18 годин.

Антибіотики, що дифундують у товщу агару, запобігають чи затримують ріст чутливих до них культур мікроорганізмів. Це виявляється в утворенні навколо відповідних дисків зон пригнічення росту, що чітко виділяється на фоні суцільного газону росту культури, яка тестується.

Результати чутливості мікроорганізмів до антибіотиків відобразити у вигляді таблиці. Величина зони пригнічення визначає ступінь чутливості мікроорганізмів до даного антибіотика.

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків

Діаметр зони затримки росту, мм	Ступінь чутливості до антибіотика
Більш 25	Високочутливі
15 - 25	Чутливі
10 - 14	Малочутливі
Менш 10 і повна відсутність	Стійкі

Результати роботи оформити у вигляді звіту.

Лабораторна робота № 11

Тема: Дослідження спиртового та молочнокислого бродіння.

Мета: ознайомитися з мікроорганізмами різних систематичних груп, які приймають участь у спиртовому та молочнокислому бродінні

Матеріали й устаткування: мікроскопи, чисті культури дріжджів, пробірка з бражкою, кисле молоко, розсіл огірків чи капусти, кефірні зерна, молочнокислі закваски, бактеріологічні петлі, предметні скельця, фарби, фільтрувальний папір, концентрована Н₂SO₄, 1 % - й розчин біхромату калію, суміш спирту з ефіром (1:1), імерсійна олія

Теоретичні положення.

Анаеробний розклад вуглеводів під дією мікроорганізмів на етиловий спирт та вуглекислий газ називається спиртовим бродінням. Головний кінцевий продукт бродіння - етиловий спирт:

С₆Н₁₂О₆ > СН₃СН₂ОН + 2СО₂ + 28,2 ккал

Проміжними продуктами бродіння є фосфорногліцеринова, оцтовий альдегід, піровиноградна кислоти, а побічними - гліцерин, янтарна кислота і сивушні масла (аміловий, ізоаміловий, бутиловий, ізобутиловий та інші спирти).

Збудниками спиртового бродіння є культурні (p. Saccharоmyces) і дикі (p. Torula) дріжджі, деякі плісняві гриби (р. Мисоr) і бактерії (р. Pseudomonas).

На Україні використовуються культурні дріжджі, які відібрані селекційними методами за позитивними для виробництва якостями. Клітини їх овальної форми, розміром 8 - 10 мкм. Розмножуються переважно брунькуванням, але можуть у несприятливих умовах утворювати спори. Широко поширені в природі дикі дріжджі - в ґрунтах і на поверхні рослин. Характерною ознакою для них є пігментація клітин (рожеві, зелені, чорні), яка захищає їх від сонячної інсоляції. Дріжджі роду Saccharоmyces міцелій не утворюють, а представники роду Torula мають зачатковий міцелій. Більшість дріжджів - сапрофіти, окремі види спричиняють псування харчових продуктів і захворювання людини (кандідози). Дріжджі, які викликають спиртове бродіння, поділяються на дві групи (раси).

Верхові дріжджі ростуть при підвищеній температурі (18 - 30°С). Бродіння супроводжується пишним і бурхливим виділенням вуглекислого газу та піни, помутнінням субстрату й утворенням пухкого осаду на дні. Ці дріжджі використовуються у хлібопеченні і виготовленні шампанських вин. Характерний представник Saccharomyces cerevisia.

Низові дріжджі можуть жити при низьких температурах (4 - 15°С). Низове бродіння відбувається спокійно, без бурхливого газоутворення, дріжджі не викликають помутніння субстрату, після закінчення бродіння легко випадають на дно, утворюючи щільний осад. Ці дріжджі використовують у пивоварінні і виноробстві. Представник - Saccharomyces vini.

Спиртове бродіння нормально відбувається в кислому середовищі при рН 4,0 - 4,5.

Клітини дріжджів мають повний набір дихальних ферментів і добре ростуть в аеробних умовах, утворюючи велику кількість біомаси. Їх використовують для одержання кормового білка (вирощують дріжджі з доступом кисню на мелясі, відходах целюлозної та нафтової промисловості, метанолі, етанолі). Дріжджі використовують також для одержання жирів (типу рослинної олії). Вони постачають нас вітамінами групи В. Методами генної інженерії дріжджам надають нові якості - вони починають продукувати біологічно активні речовини (інтерферон та інші), які використовуються як цінні медичні препарати.

Під час молочнокислого бродіння відбувається розклад вуглеводів в анаеробних умовах з утворенням молочної кислоти. Серед побічних продуктів утворюються оцтова кислота, вуглекислий газ, інколи етиловий спирт.

Молочнокислі бактерії, які здійснюють цей процес, за формою - палички і коки. Це грампозитивні мікроорганізми, спор не утворюють, переважно нерухомі, факультативні анаероби. Особливістю даної групи бактерій є слабкість їх біосинтетичних можливостей. Вони не здатні до синтезу, тому залежать від присутності у середовищі багатьох речовин: усіх амінокислот, вітамінів групи В, компонентів нуклеїнових кислот. Молочнокислі бактерії широко розповсюджені в природі, зустрічаються на поверхні рослин, у ґрунті, в кишковому тракті людини й тварин і, насамперед, у молоці та молочнокислих продуктах. За характером бродіння, яке вони викликають, виділяють такі групи:

Гомоферментативні, або типові бактерії - утворюють переважно одну молочну кислоту, яка становить 90 % усіх продуктів бродіння:

С₆Н₁₂О₆ > 2СН₃СНОНСООН + СО₂ + 94,3 кДж

Збудниками гомоферментативного бродіння є: Streptococcus lactis - молочнокислий стрептокок, клітини в якому розташовані у вигляді диплококів та коротеньких ланцюжків, викликає закисання молока; Lactobacterium bulgaricum - болгарська паличка використовується для виготовлення кислого молока; Lactobacterium cucumeris - огіркова паличка, утворює ланцюжки, бере участь у квашенні огірків; Lactobacterium plantarum - бере участь у квашенні овочів і силосуванні кормів; Lactobacterium casei - відіграє роль при дозріванні сирів; Lactobacterium acidophilus - використовується для виготовлення ацидофіліна.

Гетероферментативні, або нетипові бактерії - утворюють з вуглеводів, крім молочної, значну кількість оцтової кислоти, вуглекислий газ, етиловий спирт і гліцерин:

С₆Н₁₂О₆ > СН₃СНОНСООН + СН₃СООН + СН₂ОНСНОНСН₂ОН + СН₃СН₂ОН + СО₂

До збудників гетероферментативного молочнокислого бродіння належать Lactobacterium brassica - капустяна паличка, Betabacterium brevis. Вони зустрічаються на рослинах та у хлібних заквасках.

Біфідобактерії мають вигляд прямих або розгалужених паличок, У - форми, булавовидні та лопатовидні, нерухомі, безспорові, грампозитивні. Типовий представник - Bacterium bifidum. Біфідобактерії живуть у кишковому тракті людини, тварин та комах. Вони синтезують антибіотики, з чистих культур готують лікувальний молочнокислий біфідін.

Молочнокислі бактерії використовують для виготовлення кисломолочних продуктів, сирів, для квашення овочів і силосування; у промисловості - для одержання молочної кислоти.

Кисломолочні продукти бувають двох типів:

1) простого бродіння - кисле молоко, сметана, ацидофілія, ряжанка;

2) змішаного бродіння - кефір та кумис.

Кефір виготовляють за допомогою кефірних зерен, які є симбіотичним комплексом молочнокислих бактерій та дріжджів, а кумис - за допомогою заквасок, які також складаються з молочнокислих бактерій та дріжджів.

Порядок виконання роботи:

1. Вивчити збудників спиртового бродіння.

Приготувати мазок з культури дріжджів, висушити, зафіксувати його, пофарбувати фуксином 2 хвилини, промити водою, висушити, подивитись під мікроскопом на об'єктиві 90х з імерсією, замалювати в зошит.

2. Провести якісну реакцію на етиловий спирт.

До 3 - 4 мл бражки додають 2 - 3 краплі концентрованої сірчаної кислоти й крапають 1 % - й розчин біхромата калію до переходу оранжевого кольору в синьо - зелений за рахунок взаємодії біхромата калію і сірчаної кислоти з етиловим спиртом.

3. Вивчити збудників молочнокислого бродіння.

Молочнокисле бродіння викликають молочнокислі бактерії, котрі за морфологічними ознаками розподіляються на молочнокислі палички та молочнокислі стрептококи. Для виділення останніх застосовують метод збагачення.

Свіже молоко наливають в 1 - 2 стерильні пробірки по 5 - 6 мл і залишають при t = 30°С для розвитку бактерій. Чергові три пробірки з молоком заражають сметаною, сиром, кефіром і культивують 24 год при t = 30°С. Потім готують мазки із сироватки молока, що зсілося, з усіх пробірок. Препарати сушать, фіксують у полум'ї пальника. Жир знімають, накладаючи фільтрувальний папір на гарячий мазок. Мазок підфарбовують метиленовою синькою (фарбник добре забарвлює мікроби і погано - казеїн молока), мікроскопують і замальовують.

Для виділення чистої культури бактеріальною петлею молоко, що зсілося, з одібраних пробірок переносять у пробірку з 10 мл стерильного фізіологічного розчину, ретельно розмішують, потім висівають із пробірок по одній петлі в МПА з 2 % цукру, останній виливають у чашки Петрі. Через дві доби при t = 30°С на агарі виростають дрібні колонії: на поверхні - округлі, краплини близько 1 мм у діаметрі та глибинні - у вигляді черевичок. Форму колоній розглядають у бінокулярний мікроскоп і замальовують.

Із 4 - 5 ізольованих колоній роблять посів у пробірки із стерильним молоком. Посіви вирощують при t = 30°С. З пробірок, які містять молоко, готують і продивляються препарати. Чисті культури повинні містити однорідні диплококи, короткі ланцюжки або палички.

4. Провести якісні реакції на виявлення молочної кислоти.

Молочна кислота в кислому середовищі при температурі кипіння окислюється КМgО₄ в оцтовий альдегід, який з аміачним розчином срібла дає характерну реакцію «срібного дзеркала».

Молочнокислий затір звільняють від осаду за допомогою паперового фільтра або центрифуги. Супернатант у об'ємі 5 - 7 мл вміщують в 50 мл колбу, додають 1 мл 10 % розчину сірчаної кислоти і нагрівають до кипіння. Додають краплями 2 % - ний розчин КМgО₄ Молочна кислота перетворюється на оцтовий альдегід. Останній виявляють за допомогою фільтрувального паперу, змоченого аміачним розчином азотного срібла. Таким папером накривають колбу з супернатантом. Внаслідок дії оцтового альдегіду на аміачний розчин срібла папір чорніє.

Для приготування аміачного розчину AgNО₃ у пробірку вміщують 1 - 2 мл 10 % - ного розчину азотнокислого срібла і додають по краплі аміак. Спочатку з'являється бура муть (Ag₂О), котра потім розчиняється в NН₃ Цим розчином і змочують папір.

Результати роботи оформити у вигляді звіту.

Лабораторна робота № 12

Тема: Біологічна фіксація азоту. Дослідження вільноживучих та симбіотичних азот фіксаторів.

Мета: ознайомитися з вільноживучими та симбіотичними азотфіксаторами

Матеріали й устаткування: мікроскопи, бактеріологічні петлі, набір фарб, предметні скельця, стерильна вода, імерсійна олія, спиртівки, чашки Петрі із стерильним безазотистим середовищем Ешбі (1 на двох студентів), шпателі для розкладання ґрунту, ґрунт у чашках Петрі, пінцети, скальпелі, 96 % - ний етиловий спирт, свіжий корінь бобової рослини з бульбочками, ботанічна бритва, препарувальні голки

Теоретичні положення.

Кожного року з урожаєм сільськогосподарських культур з ґрунту виноситься 100 - 120 млн. тонн азоту. З мінеральними азотними добривами повертається в ґрунт лише 15 - 25 % від зазначеної кількості. При такому співвідношенні запас азоту в ґрунтах міг би вичерпатися за 50 - 75 років, однак цього не відбувається внаслідок біологічної фіксації азоту атмосфери.

Процес біологічної фіксації молекулярного азоту й утворенням з нього органічних азотистих сполук мікробних клітин називається азотфіксацією. Останню здійснюють азотфіксуючі мікроорганізми. Азотфіксатори бувають вільноживучі (живуть у ґрунті самостійно) і симбіотичні (живуть у симбіозі з вищими рослинами).

Головними представниками вільноживучих азотфіксаторів є аеробні бактерії родів Azotobacter, Beijerinckia, анаеробні бактерії роду Clostridium, а також багато видів ціанобактерій (синьо - зелені водорості). Типовий представник анаеробних азотфіксаторів - Clostridium pasteurianum - належить до маслянокислих бактерій.

В молодій культурі Clostridium pasteurianum клітини мають форму паличок з перитрихіальним розташуванням джгутиків, потім клітина утворює спору, яка може розташовуватися ближче до краю, а частіше всередині клітини. Спори овальні, покриті оболонкою. Клітини мають клостридіальну форму, накопичують гранульозу, яка зафарблюється при дії розчину Люголя в синьо - фіолетовий колір. В період утворення спор гранульоза зникає. Зустрічаються в ґрунтах, забруднених водоймах тощо.

Усі представники роду Azotobacter - аеробні, грамнегативні, великі клітини, можуть окислювати органічні сполуки, живуть лише при нейтральній реакції середовища (рН не нижче 6,0). Найпоширеніший вид - Azotobacter chroococcum. У молодому віці - це паличкоподібні, рухомі клітини, з віком заокруглюються й розташовуються попарно («вісімки»). Клітини назовні оточені товстою слизовою капсулою. Бактерії цього виду утворюють темний пігмент меланін, який надає колоніям характерне буре забарвлення. За рік азотобактер фіксує 20 - 30 кг/га азоту. Бактерії роду Beijerinсkia sp. відрізняються від роду Azotobacter sp. більшою стійкістю до кислотності ґрунтів і можуть розмножуватися при рН 3,0

Бульбочкові бактерії живуть на коренях бобових рослин (рід Раріlіопасеае). Проникаючи всередину кореневих волосків, вони утворюють нарости - бульбочки різної форми, розмірів і забарвлення.

Рід Rhizobium - це група аеробних, грамнегативних, неспороутворюючих бактерій. Мають складний цикл розвитку. Рухомі паличкоподібні клітини з віком гублять джгутики, нерівномірно фарбуються, а потім перетворюються у потовщені, роздуті грушоподібні або розгалужені утворення - бактероїди, які мають розпадатися на клітини кулястої форми.

Бульбочкові бактерії відрізняються специфічністю - кожний вид бактерій утворює бульбочки лише на коренях певних культур: люпину, сої, гороху, вики, квасолі, конюшини та інших; вірулентністю, тобто здатністю швидко проникати у кореневі волоски рослин, та активністю - здатністю фіксувати азот атмосфери. Неактивні штами бульбочкових бактерій утворюють на коренях дрібні зеленуваті бульбочки, в яких фіксація азоту не відбувається. Активні штами утворюють великі рожеві бульбочки, в яких азотфіксація відбувається дуже інтенсивно. Нітрагін готують з високо вірулентних та високоактивних штамів. Бульбочкові бактерії у симбіозі з бобовими рослинами можуть зв'язати за рік азоту: під люцерною - 500, під конюшиною - 300, під люпином - 150, під зернобобовими - 60 - 90 кг/га.

Порядок виконання роботи.

1. Вивчити вільноживучі азотфіксатори.

Для виділення з ґрунту азотобактера використовують агарове безазотисте середовище Ешбі. Його розплавляють і розливають у стерильні чашки Петрі. Коли середовище застигне, на його поверхні розкладають 50 грудочок ґрунту. Чашки ставлять у термостат при 28°С. Через 5 - 7 днів спостерігають утворення навколо грудочок ґрунту бурі плями слизистих колоній Azotobacter chroococcum. Підраховують процент оброслих грудочок. З колоній готують мазки, фарбують фуксином 2 хвилини і мікроскопують з імерсією. Замальовують клітини азотобактера в зошит.

2. Вивчити симбіотичні азотфіксатори.

Відібрати свіжий корінь бобової рослини з добре розвиненими бульбочками, промити у воді і відрізати від нього найбільші бульбочки. Для знищення поверхневої мікрофлори, їх стерилізують 5 хвилин у 96 % - му етиловому спирті, а потім відмивають 5 - кратно стерильною водою (переносять бульбочки послідовно в 5 пробірок із стерильною водою). Стерилізовану бульбочку кладуть у стерильну чашку Петрі, роздавлюють на шматочки профламбованим пінцетом або скальпелем, додають кілька крапель стерильної води. Готують фіксований препарат, фарбують фуксином 2 хвилини, мікроскопують з імерсією. Замальовують клітини бульбочкових бактерій в зошит.

Вивчаючи бульбочкові бактерії звернути увагу на те, що вони розповсюджуються у вигляді інфікованих плиток - колоній клітин бактерій, які розмножилися. В зрілій бульбочковій тканині бактеріальні клітини перетворюються в бактероїди, які мають грушоподібну гіллясту форму. Треба пам'ятати, що форма та розмір бульбочок різних бобових рослин неоднакові, а руйнування бульбочок супроводжується деградацією елементів рослинної клітини і лізисом частини бактероїдів. Останні бактероїди утворюють маленькі кулясті клітини - своєрідні артроспори, які виконують функцію розмноження.

Вивчення бульбочок бобових рослин вивчають на зрізах, які роблять гострою ботанічною бритвою або готують на мікротомі. Тонкий зріз, поздовжній або поперечний поміщають на предметне скельце і розглядають в роздавленій краплі при різних збільшеннях.

В сухій системі проглядають структуру бульбочок, знаходять бактерійну тканину, а потім при достатній тонкості зрізу препарат досліджують з імерсійною системою, при цьому добре проглядається бактероїдна зона бульбочок.

Для знайомства з формами різних видів бульбочкових бактерій готують фіксовані і зафарбовані препарати з бактероїдної тканини бульбочок різних бобових культур. Якщо бульбочки достатньо великі, їх розрізають бритвою на 2 частини і поверхню зрізу багатократно проколюють стерильною голкою, викликаючи механічне пошкодження клітини. Потім віджимають краплю рідини на предметне скельце і готують фіксований забарвлений препарат.

Для вивчення м'яких бульбочок (2 - 3 бульбочки) їх поміщають на предметне скло, добавляють краплю води, притискають зверху іншим предметним склом. Видавлений вміст розмазують по скельцю, мазок зафарблюють. Застосовують наступні фарбники: карболовий еритрозин, фуксин або генціанфіолетовий. Інтенсивне фарбування отримують при застосуванні суміші різних частин фуксину і метиленового синього, які розчинені в 1 % - ній оцтовій кислоті. В суміші барвників препарат витримують 3 хвилини. Тканина бульбочок зафарбовується в синій колір, а бактерії у червоний.

Форми і розміри бульбочкових бактерій, в тому числі і бактероїдів, із різних бобових замалювати, написати їх назву.

Лабораторна робота № 13

Тема: Загальний мікробіологічний аналіз ґрунту.

Мета: визначити кількість мікроорганізмів у пробах досліджуваного ґрунту, провести спостереження за зміною мікробних пейзажів

Матеріали й устаткування: наважка ґрунту 10 г, 2 колби з 100 мл стерильної води, чашки Петрі з стерильними МПА (на двох студентів), 2 стерильні піпетки на 1 мл, скляні та залізні шпателі, пінцети, спиртівки, поживні середовища КАА, Чапека, Ешбі, Виноградського, ґрунтова витяжка по Фішеру, середовище Гетчинсона, добрива, мікроскопи, імерсійна олія, фільтрувальний папір, предметні скельця, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, дистильована вода, барвники за Грамом

...