Теоретичні положення.

Ґрунт є середовищем для існування більшості мікроорганізмів. У ньому живуть бактерії родів Pseudomonas, Bacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Bacillus, Clostridium, різні види грибів, водоростей, найпростіших.

Для визначення чисельності представників еколого - трофічних груп ґрунтової мікрофлори користуються методами:

1) прямого підрахунку клітин під мікроскопом (метод Виноградського). Метод Виноградського дає достовірні, але завищені дані, бо ним неможливо розрізнити живі і мертві клітини мікроорганізмів;

2) культивування мікроорганізмів на поживних середовищах. Для визначення кількості життєздатних клітин у ґрунті користуються методами висіву ґрунтової суспензії на тверді та рідкі поживні середовища. Ці методи дають занижені дані, бо виростають не всі мікроорганізми ґрунту, а лише ті, які здатні до росту на вибраних для досліду середовищах. Методами культивування визначається лише десята частина від кількості мікроорганізмів, що виявляється методом прямого мікроскопування. Запропоновано багато способів посіву і велику кількість поживних середовищ. Найчастіше використовують метод висіву мікроорганізмів з водної суспензії на тверді середовища в чашках Петрі або на рідкі середовища в пробірках;

3) вивчення мікробних пейзажів ґрунту (метод «скелець обростання» М.Г. Холодного, капілярний метод Б.В. Перфільєва і Д.Р. Габе). Ці методи дозволяють дослідити груповий склад мікроорганізмів ґрунту.

Порядок виконання роботи.

Робота складається з кількох етапів.

1. Взяття середньої ґрунтової проби і підготовка зразку.

Середню ґрунтову пробу одержують, змішуючи окремі зразки, кількість яких залежить від мікрорельєфу (рівний, хвилястий, схил) та площі. Рекомендують з площі 100 м² брати пробу з трьох точок, з більше ніж 100 м² - з п'яти точок, з 1 га - більше 15 точок. При дослідженні пашні проби беруть з глибини всього орного шару, знімаючи верхній 2 - сантиметровий шар, при дослідженні мікрофлори ґрунтового профілю - по генетичним горизонтам (знизу вверх).

Ґрунтовий зразок беруть стерильним буром, стерильною лопатою і стерильним ножем в заздалегідь підготовлену скляну широкогорлу банку, яка закривається корковою пробкою, обгорнутою стерильною ватою, в стерильні поліетиленові або пергаментні мішки. На пакети, банки наклеюють етикетки із зазначенням місця взяття проби, горизонту та інших даних.

Бур, лопату, ніж в полі перед взяттям зразку ретельно очищують, потім обпалюють спиртом.

Ґрунтові зразки аналізують в першу добу. При необхідності допускається зберігання їх в холодильному приміщенні (холодильнику) протягом двох днів. Для більшої однорідності середнього зразку, дотримуючись усіх правил асептики, його ретельно перемішують, виймаючи корені рослин, різні включення.

2. Приготування ґрунтової суспензії та посів.

На стерильному часовому склі стерильним шпателем (або амонієвою ложкою) розмішують 10 г ґрунту. Щоб при зважуванні в ґрунт не потрапили бактерії з повітря, часове скло накривають іншим часовим склом. (Шпателі, ложки, скельця стерилізують фламбуванням). Наважку ґрунту переносять в колбу на 250 мл з 90 мл стерильної водопровідної води, збовтують 10 хвилин на механічній гойдалці і дають відстоятися грубим часткам ґрунту.

Одночасно зі взяттям наважки для аналізу з середньої проби відбирають 10 - 20 г ґрунту для визначення вологості, оскільки одержані при аналізі дані перераховують на 1 г абсолютно сухого ґрунту.

Встановлено, що більше мікроорганізмів виявляється, якщо наважку заздалегідь помістити в стерильну фарфорову чашку або ступку, зволожити (0,4 - 0,8 мл. води або 0,1 % розчином пірофосфату Na₄P₂O₇ на 1 г ґрунту) і 5 хвилин розтирати стерильним резиновим пестиком або пальцем в стерильній резиновій рукавиці до пастоподібного стану.

Перед приготуванням суспензії для кожного зразку готують дві стерильні колби на 250 мл., одна містить 100 мл. стерильної водопровідної води, друга - пуста. Водою з першої колби розтерту ґрунтову масу змивають в пусту стерильну колбу. Колбу з суспензією струшують 5 хвилин, залишають на 30 с і готують розведення, які містять різні концентрації ґрунту. 1 мл. суспензії в першій колбі відповідає розведенню 10 ^{- 1}. Послідуючі розведення (10 ^{- 2}, 10 ^{- 3}, 10 ^{- 4}, 10 ^{- 5}, 10 ^{- 6} і т.д.) краще робити в колбах на 250 мл. з 90 мл. стерильної водопровідної води.

З кожного попереднього розведення окремою стерильною піпеткою беруть 10 мл. суспензії і переносять в наступну колбу з 90 мл. Н₂О. Кожний раз піпетку споліскують і залишають. Наступні колби струшують по 1 хвилині. З одержаних розведень проводять висіви на щільні та рідкі середовища. Набір середовищ залежить від задач бактеріологічного аналізу ґрунту.

Після певного часу інкубації при 20 - 30°С культури мікроорганізмів аналізують.

3. Провести спостереження за зміною мікробних пейзажів під впливом добрив.

У три банки вміщують наважки ґрунту по 200 г кожна і проводять дослід за схемою:

1 банка - контроль (ґрунт);

2 банка - органічні добрива (ґрунт + 2 г розмеленого сіна бобових трав);

3 банка - органічні та мінеральні добрива (ґрунт + 2 г розмеленого сіна бобових трав + 100 мг аміачної селітри).

У кожну банку закопують вертикально по 2 скельця на відстані 5 см між ними і витримують банки при температурі 25 - 28°С, періодично зволожуючи ґрунт. Через два тижні викопують одне скельце, через місяць - друге. Їх поверхню розглядають під мікроскопом, мікробні пейзажі замальовують в зошит.

Лабораторна робота № 14

Тема: Визначення біологічної активності ґрунту.

Мета: засвоїти методи визначення біологічної активності ґрунту

Матеріали й устаткування: скельця розміром 10х50 см, стерильні лопатка та ніж, пінцет, лляне полотно розміром 10х50 см, 0,5 % розчин нінгідрину в ацетоні, стерильна колба на 100 мл, резинова пробка зі скляною трубкою, вимірювальна бюретка каталазниці, стаканчик, 3 % розчин перекису водню, повітряно-сухий ґрунт

Теоретичні положення.

Для визначення активності ґрунтової мікрофлори користуються наступними методами:

1) дослідження нітрифікаційної здатності, що визначається по наростанню у ґрунті кількості нітратів після його витримування при певних умовах у термостаті. Показник нітрифікації свідчить про потенційну здатність ґрунту накопичувати мінеральний азот;

2) дослідження «дихання ґрунту», або виділення вуглекислого газу дозволяє мати уявлення про енергію процесів розкладу органічної речовини у ґрунті;

3) аплікаційним методом (закладення у ґрунт скелець, що обтягнуті лляною тканиною). Цей метод дозволяє виявити інтенсивність мікробіологічних процесів в різних горизонтах орного шару, встановити вплив різних добрив, пестицидів на ґрунтову мікрофлору;

4) дослідження ферментативної активності ґрунту, оскільки ґрунтові ферменти продукуються в основному мікроорганізмами. Тому між показниками ферментативної активності і певними мікробіологічними процесами спостерігається кореляційна залежність.

Порядок виконання роботи.

1. Визначення загальної біологічної активності ґрунту.

Лляним полотном обшити добре вимиті, стерильні скельця розміром 10х50 см. Потім стерильною лопатою та стерильним ножем роблять ґрунтовий розріз на глибину 35 см. До рівної стінки розрізу по профілю прикладають скельце з полотном, відступаючи від поверхні ґрунту 2 - 3 см. З протилежної сторони його засипають ґрунтом, щільно притискаючи до стінки. На поверхні ґрунту ставлять етикетку. Через 20 - 30 днів скельця відкопують, підсушують, відділяють від ґрунтових часток і обробляють 0,5 % розчином нінгідрину в ацетоні.

Для визначення ступеню розкладу полотна (в %) вирізають певну його площу на глибині горизонту (аналіз проводять по горизонтам), промивають рештки полотна водою, висушують і зважують. Потім вирізають шматок лляного полотна, який має таку саму площу, з контрольного варіанту і також зважують. Порівнюючи масу першого та другого шматків, визначають ступінь розкладу полотна.

2. Визначення каталазної активності ґрунту.

Каталаза - фермент, за участю якого здійснюється розклад перекису водню. Джерела його формування в дихальному процесі живих організмів різноманітні. Він може утворюватися при окисленні органічних сполук за участю флавінових ферментів. У деяких аеробних мікроорганізмів перекис водню утворюється в результаті переносу однієї пари іонів водню на молекулярний кисень при участі цитохромної системи.

Перенесення електрону по ланцюгу супроводжується синтезом АТФ, тому для мікроорганізмів розклад перекису водню - одне із джерел поповнення запасів високо енергетичних матеріалів для здійснення синтетичних процесів. Каталаза є не лише внутрішньоклітинним ферментом, вона активно виділяється мікроорганізмами в навколишнє середовище, володіє високою стійкістю і може накопичуватись та довгий час зберігатись у ґрунті. Тому каталазну активність ґрунту можна розглядати як показник функціональної активності мікрофлори в різних екологічних умовах.

Для визначення каталазної активності наважку (1 г) повітряно-сухого ґрунту поміщають в колбу на 100 мл., добавляють 20 мг вуглекислого кальцію і ретельно перемішують. Потім обережно на дно колби за допомогою пінцету ставлять маленький стаканчик з 5 мл 3% розчину перекису водню. Колбу щільно закривають резиновою пробкою зі скляною трубкою, яка зв'язана з вимірювальною бюреткою каталазниці.

Початок досліду відмічають за секундоміром в той момент, коли посудину з перекисом водню перекидають і вміст колби струшують. Збовтування суміші проводять протягом всього досліду, тримаючи колбу за горлечко. Кисень, що виділяється, витісняє з бюретки воду, рівень якої відмічають через 0,5; 1; 2 і 3 хвилини.

Активність каталази виражають в см³ кисню, що виділився за 1 хвилину на 1 г ґрунту. Дані вимірювань заносять в таблицю.

Результати роботи оформляють у вигляді звіту.

Лабораторна робота № 15

Тема: Дослідження бактерій кореневої зони рослин.

Мета: визначити якісний та кількісний склад бактерій кореневої зони рослин

Матеріали й устаткування: ґрунтовий моноліт з рослинами розміром 10х10 см, пінцети, ножиці, часове скло, колби на 250 мл, стерильна водопровідна вода, колби та вода для розведень, пісок, стерильні піпетки на 1 мл, піпетки Мора, стерильні шпателі, розрахункова камера Горяєва, мікроскопи, МПА в пробірці

Теоретичні положення.

Відомо, що чим ближче ґрунт розташовується до кореневої системи рослин, тим більшу кількість бактерій він має. Але особливо багато бактерій безпосередньо на поверхні коріння. Сукупність цих бактерій називають ризопланою.

В ґрунті, який прилягає до коренів (ризосфера) додатковим джерелом живлення бактерій є відмираючі клітини епідермісу, кореневі волоски, а також продукти екзосмосу рослин (кореневі виділення). В ризосфері розвиваються такі ж самі форми бактерій, що і в ґрунті, який віддалений від коренів. Як правило, на корінні розвиваються неспороносні палички роду Pseudomonas та мікобактерії.

Бактерії кореневої зони рослин є санітарами, очищуючи зону кореня від продуктів метаболізму рослин; мінералізують органічні рештки, переводячи ряд елементів живлення в доступну для рослин форму; продукують ростові речовини, вітаміни.

Деякі бактерії, які розвиваються в кореневій зоні і безпосередньо на корінні, мають денітрифікуючу здатність і при певних умовах можуть викликати великі втрати азоту з ґрунту, що має негативне значення.

Порядок виконання роботи.

1. Підрахувати кількість бактерій в ризосфері методом Красильникова.

Стерильною лопатою підкопують ґрунт під рослинами, стерильним пінцетом добувають та вилучають коріння. Ґрунт, який прилип до коренів, струшують у стерильну чашку Петрі, перемішують і беруть наважку ґрунту 1 г (одночасно беруть наважку для визначення вологості ґрунту). Потім 1 г ґрунту поміщають в 100 мл. стерильної водопровідної води і готують ряд розведень: 10 ^{- 2}, 10 ^{- 3}, 10 ^{- 4}.

При поверхневому посіві з одержаних розведень стерильною мікропіпеткою наносять 0,05 мл. на поверхню МПА і шпателем досуха втирають в агар. При глибинному посіві з розведень стерильною піпеткою беруть 1 мл суспензії і вносять в стерильну чашку Петрі. Потім додають 15 - 20 мл охолодженого до 40 - 45єС агаризованого поживного середовища.

Колонії, які виросли на агарі, підраховують візуально і під лупою. Для визначення кількості бактерій в 1 г ґрунту при глибинному посіві кількість колоній, що виросли, перемножують на відповідне розведення і ділять на масу абсолютно сухого ґрунту, який міститься в 1 г сирого ґрунту. При поверхневому посіві, для встановлення числа бактерій в 1 мл, кількість колоній на чашці Петрі перемножують на 20.

Для визначення якісного складу бактерій колонії розподіляють за культуральними ознаками. З кожної групи готують препарат і виявляють форму колоній. Для визначення видових ознак з колоній роблять пересів на скошений агар і після очистки культури вивчають її морфологічні та фізіологічні ознаки стандартними методами.

2. Облік ризосферної і кореневої мікрофлори методом послідовних відмивок коренів за Є.З. Теппер.

З викопаних монолітів ґрунту з рослинами стерильним пінцетом і ножицями відбирають 1 г молодих коренів (приблизно однакового діаметру) з прилиплими частками ґрунту (одночасно беруть наважку для визначення вологості ґрунту). Коріння поміщають в колби з 100 мл стерильної водопровідної води і збовтують протягом 2 хвилин. За допомогою стерильного крючка корені дістають із колби і переносять послідовно в другу, третю, четверту, п'яту, шосту, сьому колби, які також містять по 100 мл стерильної водопровідної води. В кожній колбі корені відмивають по 2 хвилини. В останню колбу перед стерилізацією додають 3 - 5 г піску.

Для якісного аналізу бактерій ризосфери з кожної колби окремо стерильною піпеткою беруть 0,05 мл відмивної води, наносять на поверхню МПА і окремим шпателем втирають досуха. Чашки поміщають в термостат при температурі 28 - 30єС на 3 - 5 діб.

По мірі відмивань коріння чисельність бактерій не зменшується, а в ряді випадків збільшується. При цьому в чашках з перших відмивань багато великих колоній, які представлені спороносними формами. Але надалі кількість бацилярних форм зменшується і збільшується число неспороносних форм роду Pseudomonas та мікобактерій, які часто забарвлені в жовтий і оранжевий колір.

Для кількісного аналізу бактерій ризосфери суспензію з першого відмивання додатково збовтують 5 хвилин. Потім з неї готують розведення і роблять поверхневі посіви на МПА. Вміст шести останніх колб зливають разом, готують послідовні розведення і роблять поверхневі посіви на МПА.

Для підрахунку бактерій - зародків в 1 г абсолютно сухого ґрунту ризосфери число колоній на чашці перемножують на 20 (для визначення числа бактерій в 1 мл.) і на ступінь розведення, а потім ділять на масу абсолютно сухого ґрунту ризосфери. Кількість ризосферного ґрунту, що потрапила з корінням в першу колбу, знаходять за різницею між першою наважкою і наважкою відмитих коренів. Для цього з кожної порції відмитої води корені дістають, поміщають на фільтрувальний папір для вилучення води і зважують.

Для визначення кількості мікроорганізмів на 1 г коріння число колоній, яке виросло на чашці Петрі, перемножують на 20, ступінь розведення і 600 (6 змивів по 100 мл. в кожному) і ділять на масу сирих коренів.

Список рекомендованої літератури