Предмет, методы и содержание микробиологии

Воздух может служить фактором передачи патогенных микробов: стафилококков, стрептококков, палочек дифтерии, коклюша, туберкулеза, а также вирусов кори, гриппа. Передача воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем почти всегда происходит в закрытых помещениях и редко - на открытом воздухе.

Показатели санитарно-микробиологического состояния воздуха закрытых помещений:

- микробное число - количество микробов, обнаруженных в 1 м³ воздуха;

- наличие санитарно-показательных бактерий: Streptococcus haeraolyticus и Staphylococcus aureus.

Чистота воздуха зависит от своевременного проветривания помещения и влажной уборки. Применяется обработка воздуха бактерицидными УФ-лампами. Для уменьшения контаминации воздуха применяют марлевые и ватно-марлевые маски.

Микроорганизмы пищевых продуктов

Пищевые продукты и готовые блюда являются благоприятной средой для размножения микроорганизмов. Некоторые пищевые продукты содержат специфические виды микробов, необходимые для технологии их изготовления, например молочнокислые микробы в кисломолочных продуктах, квашеных овощах, некоторых напитках. Неспецифическая микрофлора - это микробы, случайно попавшие в пищевые продукты из внешней среды. Одни из них не оказывают действия на пищевые продукты, другие вызывают их порчу.

Пищевые продукты могут быть факторами передачи возбудителей кишечных инфекций: дизентерии, холеры, брюшного тифа, а также сибирской язвы, бруцеллеза, Ку-лихорадки и других.

Попадание в пищевые продукты и размножение в них сальмонелл, стафилококков, возбудителей ботулизма приводит к возникновению у человека пищевых токсикоинфекций и интоксикаций.

Для санитарно-микробиологической оценки пищевых прдуктов определяют микробное число и санитарно-показательные микроорганизмы (БГКП), а также наличие патогенных микробов. Санитарно-микробиологические показатели некоторых молочных продуктов, колбасных, консервированных изделий и других продуктов нормированы ГОСТами.

Микрофлора различных объектов

Разнообразные предметы в окружении человека можно разделить на три группы: бытовые, производственные и медицинские. В медицинских учреждениях, кроме бытовых предметов, имеются специфические медицинские объекты. Это медицинские инструменты, оборудование, перевязочный и шовный материал, лекарственные средства,

дезинфицирующие растворы, халаты, предметы ухода за больными. В этих объектах могут быть обнаружены как безвредные для человека, так и условно-патогенные и патогенные бактерии. Некоторые возбудители инфекционных заболеваний (легионеллы, синегнойная палочка, протей, иерсинии) способны размножаться в ванных комнатах, душевых, раковинах, кондиционерах. Другие микроорганизмы, не размножаясь в объектах внешней среды, могут сохраняться здесь в течение сроков, достаточных для того, чтобы могло произойти заражение. Возбудители кори, коклюша могут сохраняться в течение нескольких минут, возбудители туберкулеза - месяцами, а споры палочки сибирской язвы - годами.

Санитарно-микробиологические иследования проводятся в медицинских и детских учреждениях, предприятиях общественного питания и пищевой торговой сети. Определяют бактериологическую загрязненность рук работающего персонала и предметов окружающей обстановки путем исследования микрофлоры смывов. В смывах определяют: общее микробное число, наличие БГКП, протея, энтерококка, синегнойной палочки, стафилококка и других патогенных бактерий.

Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе, в возникновении и существовании биосферы

На Земле с момента ее возникновения совершается процесс превращения и перемещения веществ, происходит взаимодействие живых существ с неживой природой, а также зеленых растений с животным миром. Роль зеленых растений в том, что они путем фотосинтеза строят органические соединения из минеральных веществ. Кроме того, разлагая диоксид углерода, они выделяют в окружающую среду свободный кислород. Животные и бесхлорофильные растения, лишенные способности строить белок из неорганических соединений, нуждаются в готовых органических веществах и питаются растениями или другими животными. Они постепенно разлагают органические вещества, накопленные зелеными растениями, до более простых соединений с освобождением большого количества энергии. При этом они используют кислород, который выделяют зеленые растения.

Эта простая и стройная схема взаимоотношений зеленых растений, животных и неживой природы не может объяснить равновесия между живой и неживой природой. Остается неясной причина минерализации органических веществ с образованием таких окисленных неорганических соединений, как вода, углекислота, минеральные соли, вполне пригодные для питания растений. В организме животных и растений не все органические вещества окисляются до этих продуктов. С мочой и испражнениями животных, с остатками растений и трупами животных в почву попадает огромное количество органических веществ, непригодных для питания растений. Эти органические остатки завалили бы Землю и сделали бы невозможной дальнейшую жизнь на ней, если бы они не разрушались и не вступали вновь в круговорот веществ в природе. Этот важнейший процесс минерализации органических соединений осуществляют микробы. Они постепенно разлагают сложные органические соединения на простые, доступные для питания растений, и таким образом обеспечивают завершение круговорота углерода, азота, фосфора, серы и других элементов. Первым, кто указал на роль микробов как необходимых посредников между живой и неживой природой, был Пастер. Большую роль в изучении участия микробов в круговороте веществ сыграли работы Сергея Николаевича Виноградского и Мартинуса Виллема Бейеринка.

Круговорот азота (рис. 10). С остатками растений, с трупами животных в почву попадают сложные азотсодержащие соединения, главным образом, белки. Эти вещества подвергаются гниению (аммонификации) с участием гнилостных микроорганизмов. Аэробные гнилостные бактерии (В. subtilis, В. niesentericus, Proteus vulgaris) осуществляют гидролиз белков до аминокислот, затем до конечных продуктов: сероводорода, аммиака и др. При действии анаэробных гнилостных микробов преобладают восстановительные процессы, и распад белков идет не до конечных продуктов. Разложение мочевины осуществляют уробактерии, с образованием аммиака и углекислоты. Аммонийные соли подвергаются дальнейшему окислению нитрифицирующими бактериями. Этот процесс идет в два этапа: 1) одни бактерии окисляют аммонийные соли до нитритов; 2) другие бактерии окисляют нитриты до нитратов. Две фазы нитрификации - это пример метабиоза: один микроб живет, используя продукты жизнедеятельности другого микроба. Азотнокислые соли наилучшим образом усваиваются растениями, поэтому образование нитратов повышает плодородие почвы.

В почве происходит обратный процесс денитрификации - разложение нитритов и нитратов денитрифицирующими бактериями с выделением свободного азота, что приводит к снижению плодородия почвы.

В то же время имеются микроорганизмы, которые усваивают атмосферный азот и синтезируют азотсодержащие органические соединения. Это две группы микробов: свободноживущие почвенные азот-фиксирующие бактерии и клубеньковые бактерии, живущие в симбиозе с бобовыми растениями, образуя клубеньки на корнях. Азотфиксиру-ющие бактерии обогащают почву азотом, повышая ее плодородие.

Круговорот углерода. Зеленые растения и фотосинтезирующие бактерии усваивают диоксид углерода (СО₂) атмосферного воздуха, синтезируя углеводы (глюкозу, фруктозу), полимерные соединения: целлюлозу, крахмал, пектин. Образовавшиеся органические соединения используются человеком и животными для питания. После гибели растений и животных органические вещества попадают в почву.

Возвращение диоксида углерода в атмосферу происходит в процессе окисления аэробными микроорганизмами углеводов с образованием СО₂, в процессе брожения. Микробная природа брожений была впервые установлена Пастером. В зависимости от образующихся продуктов различают следующие виды брожения: спиртовое, уксуснокислое, молочнокислое, маслянокислое, а также разложение целлюлозы (клетчатки). Микроорганизмы, вызывающие брожение, имеют промышленное значение.

Спиртовое брожение - распад углеводов с образованием этилового спирта и диоксида углерода - вызывают дрожжевые грибы. Этот вид брожения известен давно и используется при изготовлении спиртных напитков.

Уксуснокислые бактерии окисляют этиловый спирт в аэробных условиях до уксусной кислоты. Они используются в промышленности, но при попадании в вино или пиво могут приводить к их порче.

Молочнокислое брожение вызывают лактобактерии. Конечным продуктом процесса является молочная кислота, которая губительно действует на гнилостные микробы кишечника. Молочнокислые бактерии применяют для изготовления кисломолочных продуктов: простокваши, йогурта, ацидофилина. Препарат лактобактерии, применяемый для устранения дисбактериоза, содержит культуру живых молочнокислых бактерий.

Маслянокислое брожение осуществляют анаэробные бактерии. Конечным продуктом брожения является масляная кислота, образование которой вызывает порчу консервированных продуктов.

Процессы разложения клетчатки, составляющей оболочку растительных клеток, и брожение пектина - межклеточного вещества растений - имеют большое значение в круговороте углерода в природе.

Круговорот серы, фосфора, железа

Круговорот серы совершается в результате жизнедеятельности бактерий, причем одни из них окисляют серу, другие - восстанавливают.

Фосфор освобождается из органических соединений в результате процессов гниения. Фосфорные бактерии, находящиеся в почве и в воде, в процессе своей жизнедеятельности переводят нерастворимые соединения фосфора в растворимые.

Круговорот железа осуществляют железобактерии, живущие в воде. Они используют растворимые соли железа как источник энергии, окисляя их до окисных соединений, нерастворимых в воде. Образующийся осадок откладывается в оболочке бактерий. Иногда большое количество железобактерий, накапливаясь в просветах водопроводных труб, вызывает их сужение и закупорку.

Микробиологические аспекты охраны окружающей среды

Задачей охраны окружающей среды является сохранение экологического равновесия в биосфере. Микробиологические аспекты состоят в следующем:

1) охрана микроорганизмов, участвующих в круговороте веществ в природе. Сброс в почву и воду промышленных и автомобильных отходов приводит к гибели почвенных микробов, осуществляющих процессы минерализации органических веществ, а это в свою очередь, ведет к накоплению неразложившихся органических веществ, к уменьшению количества нитратов в почве, снижению ее плодородия.

2) охрана микроорганизмов, осуществляющих биодеградацию, то есть разрушение вредных для человека веществ, которые обычно не встречаются в природе и попадают во внешнюю среду в результате деятельности человека. С другой стороны, подавление развития микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов и лекарств или разрушение различных материалов и приборов;

3) защита биосферы от загрязнения (контаминации) патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.

С прогрессом науки возникают новые аспекты. С развитием генетической инженерии возникла проблема защиты природы от искусственно полученных рекомбинантов, а с освоением космоса - защита от заноса на нашу планету внеземных и попадания в космос земных микроорганизмов.

ГЛАВА 9 ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Находясь во взаимосвязи с различными объектами окружающей среды, микробы постоянно подвергаются ее воздействию.

На микроорганизмы оказывают влияние факторы внешней среды:

1) физические (температура, высушивание, излучения, ультразвук, осмотическое давление);

2) химические (различные вещества):

3) биологические (другие виды микробов и вирусы).

Влияние физических факторов

Температура. Следует различать 1) температурные условия, при которых микроорганизмы растут и размножаются и 2) температурные границы, при которых микроорганизмы остаются живыми. Понятно, что во втором случае диапазон температур шире.

1) В зависимости от температурных условий, которые требуют микроорганизмы для своего роста и размножения, различают три группы: психрофилы, растущие при низкой температуре, мезофилы - при средней, и термофилы - при высокой температуре

Для психрофилов оптимальная температура для роста 10-15°С. минимальная 0-5°С, максимальная 25-30°С. Большинство из них свободноживущие и паразиты холоднокровных животных, по есть и патогенные для человека, например, иерсинии, псевдомонады. Они размножаются при температуре бытового холодильника и более вирулентны при низких температурах.

Мезофилы размножаются преимущественно в организме теплокровных животных и человека. Оптимальная температура для их роста 30-37°С, максимальная 43-45°С, минимальная 15-20°С. Большинство патогенных микроорганизмов относятся к мезофилам. В окружающей среде они обычно не размножаются, но могут сохраняться живыми.

Для термофилов оптимальная температура для роста 50-60°С, минимальная равна 45°С максимальная 90°С. Термофильные бактерии живут в юрячей воде гейзеров. Они не размножаются в организме человека.

2) Температурные зоны гибели микроорганизмов шире, чем температуры, при которых они могут расти.

Микроорганизмы более чувствительны к высоким температурам, при которых наступает их гибель вследствие свертывания белков и повреждения ферментов. Вегетативные формы бактерии погибают при 60-80°С в течение часа, при 100°С - через 1 минуту. Споры бактерий устойчивы к 100°С, например, споры палочек столбняка и ботулизма выдерживают кипячение в течение нескольких часов. Для того, чтобы убить споры, создают температуру сухого жара 160-170°С, пара под давлением 120-134°С. Высокие температуры применяют при стерилизации - обеспложивании различных материалов.

К низким температурам микроорганизмы более устойчивы. Многие из них переносят замораживание. Холерный вибрион, сальмонеллы, кишечная палочка могут сохраняться во льду. Особенно устойчивы к низким температурам споры бактерий и вирусы. В то же время есть виды микробов, не переносящих температуры ниже 20°С: менингококки, гонококки, возбудители коклюша, сифилиса.

Высушивание. Вода необходима для нормальной жизнедеятельности микробов, так как питательные вещества поступают в клетку в растворенном виде. При недостатке воды рост микробов прекращается, хотя некоторые их них остаются живыми в течение какого-то времени. Чувствительны к высушиванию менингококки, гонококки, возбудители сифилиса, коклюша, гриппа; устойчивы стафилококки, возбудитель туберкулеза. Наиболее устойчивы споры бактерий, так как вода в них находится в связанном состоянии. Для сохранения живых микроорганизмов применяют метод лиофилизации - высушивание под вакуумом из замороженного состояния. Лиофилизированные живые культуры микроорганизмов, вакцины, биопрепараты в течение ряда лет сохраняются, не изменяя своих свойств.

Действие излучений. Ионизирующая радиация - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий - губительно действуют на микроорганизмы, хотя смертельные дозы для них выше, чем для животных и растений. Ионизирующие излучения применяют для стерилизации одноразовых пластиковых шприцев и посуды, питательных сред, лекарственных препаратов.

Неионизирующие излучения - ультрафиолетовые лучи - повреждают микроорганизмы в большей степени, чем животных и растения. УФ-лучи повреждают геном микробных клеток, что приводит их к гибели. Для обеззараживания воздуха в лечебных учреждениях и в микробиологических лабораториях применяются бактерицидные лампы ультрафиолетового излучения.

Ультразвук при определенной частоте вызывает разрушение структуры микробных клеток вследствие образования кавитационных полостей и может применяться как метод обработки пищевых продуктов.

Осмотическое давление, его постоянство, имеет большое значение для жизни микробов. При повышении или понижении осмотического давления происходит разрыв клеточной мембраны и гибель клеток. Повышенные концентрации солей задерживают развитие микроорганизмов, особенно гнилостных, что используется для сохранения впрок пищевых продуктов: овощей, грибов, рыбы, мяса. На том же принципе основано применение концентрированных растворов сахара в варенье, сиропах. Концентрированные растворы лекарственных средств растительного происхождения являются более стойкими сравнительно с разведенными растворами.

Высокое атмосферное давление не оказывает значительного действия на микроорганизмы.

Влияние химических факторов

Химические вещества, оказывающие антимикробное действие, применяются для дезинфекции - от des (французской приставки, означающей отрицание) и inficere (лат. - заражать). С помощью дезинфекции производится уничтожение возбудителей инфекционных болезней на зараженных объектах внешней среды.

Дезинфицирующие вещества являются общетоксическими ядами, в отличие от химеотерапевтическнх средств и антибиотиков, оказыва-ющих избирательное действие на микроорганизмы. Механизм действия дезинфицирующих веществ в основном заключастся в нарушении физико-химической структуры микробной клетки.

Окислители (хлор и его соединения, вещества, содержащие йод, перекись водорода) обладают повышенной способностью окислять органические соединения в микробной клетке, что приводит к ее гибели.

Вещества, свертывающие белок (фенол, крезол, гексахлорофен, лизол, спирты, соли тяжелых металлов, например, сулема), проникая в микробную клетку, вступают в соединение с ее белками, денатурируют их и таким образом нарушают жизненные функции микроорганизма.

Детергенты (поверхностно-активные вещества (ПАВ)) - вещества, обладающие высокой поверхностной активностью, моющим, а многие из них и антимикробным действием - мыла, моющие средства. Высокой активностью обладают четвертичные аммониевые основания (ЧАО), вызывающие повреждение клеточной стенки бактерий, не проникая внутрь клетки.

Некоторые металлы в незначительных количествах обладают выраженным антимикробным действием (серебро, медь, золото и другие). Объясняется это тем, что они выделяют в воду ноны Такое явление называют олигодинамическим действием (греч. oligos - малый). Достаточно ничтожною количества ионов в жидкости, чтобы они концентрировались на поверхности микробов и, изменив ее заряд с "-" на "+", оказывали антимикробное действие.

Выбор способа дезинфекции зависит от биологичсских свойств микроба и от той среды, в которой он находится. Например, сулема мало пригодна для дезинфекции белковых субстратов, таких как гной. кровь, мокрота. Под влиянием сулемы происходит свертывание белков, и свернувшийся белок предохраняет микробов от действия дезин-фектанта. Этиловый спирт используют для обеззараживания рук, различных предметов, для консервации биологических объектом. Наиболее выражено бактерицидное действие 70%-ного спирта, поскольку чистый спирт вызывает свертывание поверхностных белков бактерий и не проникает внутрь клетки.

Значительным бактерицидным действием обладает гексахлорофен, причем грамположительные кокки более чувствительны к нему, чем грамотрицательнве палочки. Гексахлорофен применяется для обеззараживания кожи в виде мыла, содержащею 2-5% этого вещества; для санации полости носа в виде мази, содержащей 1%, для санации носоглотки путем орошения с целью борьбы со стафилококковым носитель-cibom - 0,1%-ный раствор.

Влияние биологических факторов

Микроорганизмы в природе являются составной частью биоценоза, развиваясь совместно с растениями, животными, другими видами бактерий, грибов, вирусов. Взаимоотношения различных микроорганизмов между собой могут быть взаимовыгодными, например, при совместном культивировании дрожжей к молочнокислых бактерий они развиваются лучше, чем каждый в отдельности. Возможна стимуляция размножения одного микроорганизма другим. Например, размножение палочки чумы усиливается в присутствии сарцин. Во многих случаях один вид микробов в результате своей жизнедеятельности создает благоприятные условия для развития другого вида. Например, развитие анаэробов в почве невозможно без аэробов, которые поглощают кислород почвы.

В процессе эволюции у микробов выработались также антагонистические отношения. Молочнокислые бактерии являются антагонистами гнилостных микробов, бактерий дизентерии. Некоторые микроорганизмы вырабатывают вещества, угнетающие и убивающие микробов других видов, так называемые бактериоцины.

Явления антагонизма используются в медицине с целью получения антибиотков и создания препаратов для бактериотерапии.

Асептика, антисептика, дезинфекция, стерилизация

Асептика - комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов в рану, или в пробирку с питательной средой, в ампулу с лекарственным средством и т.д.

Антисептика - способ обеззараживания ран, операционного поля, рук хирурга, а также воздействие на инфекцию в организме пациента с помощью химических веществ - антисептиков.

Дезинфекция - уничтожение патогенных микробов в окружающей среде и различных объектах с целью прервать путь передачи и распространения инфекционного заболевания. Для дезинфекции используют химические вещества, лучевые и другие воздействия.

Стерилизация - процесс, направленный на полное уничтожение всех микроорганизмов в каком-либо объекте. Для стерилизации используют физические, химические методы и их сочетание.

К физическим способам относятся: стерилизация высокой температурой, УФ-облучением, ионизирующим излучением, ультразвуком, фильтрованием через бактериальные фильтры.

Наиболее часто применяют следующие методы

Стерилизация высокой температурой

Прокаливание на огне. Это надежный метод стерилизации, но он имеет ограниченное применение из-за порчи предметов. Таким способом стерилизуются бактериологические петли.

Стерилизация сухим жаром. Проводится в печи Пастера (сухожаровый шкаф) при температуре 160-170°С в течение 1-го часа. Этим способом стерилизуют лабораторную стеклянную посуду, пипетки, завернутые в бумагу, пробирки, закрытые ватными пробками. При температуре выше 170°С начинается обугливание бумаги, ваты, марли.

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). Наиболее универсальный метод стерилизации. Проводится в автоклаве - водо-паровом стерилизаторе. Принцип действия автоклава основан на зависимости температуры кипения воды от давления.

Автоклав представляет собой двустенный металлический котел с герметически закрывающейся крышкой. На дно автоклава наливают воду, в рабочую камеру помещают стерилизуемые предметы, закрывают крышку, сначала не завинчивая ее герметически. Включают нагревание и доводят воду до кипения. Образующийся при этом пар вытесняет из рабочей камеры воздух, который выходит наружу через открытый выпускной кран. Когда весь воздух будет вытеснен, и из крана пойдет непрерывной струей пар, кран закрывают, крышку закрывают герметически. Доводят пар до нужного давления под контролем манометра. Температура пара зависит от давления: при нормальном атмосферном давлении стрелка манометра стоит на 0 атм. - температура пара 100°С, при 0,5 атм. - 112°С, при 1 атм. -121°С, при 1,5 атм. - 127°С, при 2 атм. - 134°С. По окончании стерилизации автоклав отключают, ждут, пока давление не снизится, выпускают постепенно пар и открывают крышку. Обычно при давлении 1 атм. в течение 20-40 минут стерилизуют простые питательные среды и растворы, не содержащие белков и углеводов, перевязочный материал, белье. Стерилизуемые материалы должны быть проницаемы для пара. При стерилизации материалов в больших объемах (хирургические материалы) время увеличивают до 2 часов. При давлении 2 атм. производят обеззараживание патологического материала и отработанных культур микробов.

Питательные среды, содержащие сахара, нельзя стерилизовать при 1 атм., так как они карамелизуются, поэтому их подвергают дробной стерилизации текучим паром, или автоклавированнию при 0,5 атм.

Для контроля режима стерилизации применяются биологический и физический методы. Биологичесжй метод основан на том, что одновременно со стерилизуемым материалом помещают споры Bacillus stearothermophilus, которые погибают при 121°С за 15 минут. После проведения стерилизации споры не должны дать рост на питательной среде. Физический метод основан на применении веществ, имеющих определенную точку плавления, например, серу (119°С), бензойную кислоту (120°С). Запаянные трубки, содержащие вещество в смеси с сухим красителем (фуксин) помещают в автоклав вместе со стерилизуемым материалом. Если температура в автоклаве достаточна, вещество расплавится и окрасится в цвет красителя.

Стерилизация текучим паром_проводится в аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Воду в аппарате нагревают до 100°С. Образующийся пар проходит через заложенный материал и стерилизует его. Однократная обработка при 100°С не убивает споры. Поэтому применяют дробный метод стерилизации - 3 дня подряд по 30 минут, в промежутках оставляя на сутки при комнатной температуре. Прогревание при 100°С вызывает тепловую активацию спор, вследствие чего они прорастают до следующего дня в вегетативные формы и погибают при втором и третьем прогревании. Вследствие этого стерилизация текучим паром могут подвергаться только питательные среды, т.к. для прорастания спор необходимо наличие питательных веществ.

Для материалов, разрушающихся при 100°С (например, сыворотки, питательные среды, содержащие белок) применяют другой вид дробной стерилизации - тиндализацию. Стерилизуемый материал прогревают на водяной бане при 56-60°С в течение 5-6 дней подряд - в первый день в течение 2 часов, в остальные дни по 1 часу.

Стерилизация облучением

УФ-лучи. Лампы ультрафиолетового излучения используют для обеззараживания воздуха лечебных учреждений, бактериологических боксов и лабораторий, а также для стерилизации жидкостей с помощью особых аппаратов.

Стерилизации ионизирующим излучением подвергаются в медицинской и микробиологической промышленности разнообразные объекты: лекарственные средства, перевязочные материалы, шелк, хирургические перчатки, одноразовые шприцы, пластмассовые трубки для внутривенного введения и многие другие материалы.

Применение ионизирующей радиации имеет ряд преимуществ перед тепловой стерилизацией. При стерилизации с помощью ионизирующего излучения температура стерилизуемого объекта поднимается незначительно, в связи с чем такие методы называют холодной стерилизацией. При стерилизации в больших масштабах может быть создан конвейер. Материалы стерилизуют в упакованном виде. Имеется два вида оборудования для облучения - гамма-установки с кобальтом-60 и ускорители электронов.

Химическая и физико-химическая стерилизация

Химическую стерилизацию применяют для обработки рук хирурга, операционного поля пациента, хирургических инструментов и перчаток, анестезирующих масок. Применяют некоторые дезинфицирующие средства, хлоргексидин и многие другие вещества.

Газовую стерилизацию проводят с помощью таких веществ, как окись этилена, метилбромид, окись пропилена, формальдегид, глютаральдегид, бета-пропиолактан, озон и другие. Такие вещества вводят в небольшое замкнутое пространство (автоклав, специальный контейнер), куда предварительно помещают стерилизуемые объекты. Газовая стерилизация - более сложный процесс, чем стерилизация с помощью высокой температуры и требует более строгого контроля.

Для упаковки объектов применяют материал, через который легко проходят газ и влага, но не проходят мелкая пыль и микроорганизмы. Лучше всего применять прозрачные полимерные пленки, через которые можно видеть предметы, не нарушая целостности упаковки. При проведении биологического контроля газовой стерилизации применяются материалы, содержащие лиофилизированные живые культуры золотистого стафилококка, кишечной палочки и споры сенной палочки.

После стерилизации для удаления газа камеры продувают стерильным воздухом, а затем выдерживают стерилизованный материал в течение нескольких суток. Проводится контроль остаточной концентрации газа в материале, так как газы токсичны,

Физико-химические методы - это сочетание физических и химических воздействий на микроорганизмы, например, действие дезинфицирующего вещества и нагревания.

Методы частичного обеспложивания

Кипячение - применяется для обработки шприцев, игл, инструментов. Стерилизацию проводят в течение 30 минут в специальных стерилизаторах для инструментов, в воду для устранения ее жесткости и повышения температуры кипения рекомендуется добавить 1-2% бикарбоната натрия. При кипячении споры бактерий не погибают, поэтому для стерилизации питательных сред этот способ не применяется. Подлежащие кипячению инструменты подвергаются обработке специальными мющими растворами для удаления крови и т.п.

Пастеризация._Метод был предложен Пастером для частичного обеспложивания жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры. Применяется для обработки вина, молока, других пищевых продуктов. При прогревании жидкости при 50-60°С в течение 30 минут, 70-80°С 5-10 минут и 90°С 2 минуты погибает большинство бесспоровых микробов. Споры остаются живыми. Поэтому во избежание их прорастания пастеризованный продукт необходимо хранить в холодильнике.

Холодная стерилизация

Фильтрование - освобождение жидкостей от микробов, применяется в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут нагреванию. Фильтры должны быть настолько мелкопористыми, чтобы задерживать микробы. Бактериальные фильтры изготавливаются из мелкопористых веществ в виде фарфоровых свечей, асбестовых пластинок Зейтца или мембранных фильтров. Фильтрование производят, создавая с помощью насоса разрежение в приемнике. Перед употреблением фильтрующее устройство должно быть простерилизовано. Вирусы проходят через бактериальные фильтры, поэтому метод фильтрования можно отнести к методам частичного обеспложивания. Этот метод используют не только для стерилизации питательных сред и растворов, но и для того, чтобы освободить от микробов токсины, антибиотики, бактериофаги, вирусы.

ГЛАВА 10 ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Организация генетического материала у бактерий. Генотип и фенотип

Материальной основой наследственности бактерий является ДНК. По сравнению с геном ом эукариотов геном бактерий устроен более просто - это молекула ДНК, замкнутая в кольцо, которое прикреплено к одной из мезосом. В отличие от парных хромосом эукариотов, у бактерий одна хромосома, то есть гаплоидный набор генов, поэтому у них нет явления доминантности.

Кроме хромосомы, у бактерий имеются внехромосомные генетические элементы - плазмиды. Это молекулы ДНК, которые или находятся вне хромосомы, в автономном состоянии, в виде колец, прикрепленных к мезосомам, или встроены в хромосому (интегрированное состояние). Плазмиды придают бактерии дополнительные наследственные признаки, но не являются обязательными для нее. Плазмида может быть элиминирована (удалена) из бактерии, что не влияет на ее жизнеспособность.

В настоящее время известно свыше 20 типов плазмид у бактерий. Назовем некоторые из них:

F-плазмида, фактор фертильности (лат. fertilis - плодовитый), или половой фактор, определяет способность бактерий к образованию половых ворсинок и к конъюгации.

R-плазмиды определяют резистентность бактерий к лекарственным средствам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим приводит к быстрому распространению лекарственноустойчивых бактерий.

Col-плазмиды кодируют синтез бактериоцинов - антибактериальных веществ, вызывающих гибель других бактерий того же илиродственных видов. Впервые они были обнаружены у Escherichia соН,отсюда и их название - колицины. Известны бактериоцины стафилококков (стафилоцины), палочек чумы (пестицины) и других бактерий. Наличие плазмиды бактериоциногенности придает бактериям селективные преимущества в биоценозах. Это может иметь для организма человека положительное значение, если колицины кишечной палочки губительно действуют на патогенные энтеробактерии, и отрицательное, если бактериоцины продуцируются патогенными микробами.

Ent-плазмиды определяют продукцию энтеротоксина. Н1у-плаз-мида - гемолитическую активность.

Дополнительными генетическими элементами являются также профаги - геномы умеренных фагов, которые, встраиваясь в хромосому бактерии, могут придавать ей определенные свойства. Например, tox-гены, кодирующие образование экзотоксинов коринебактерий дифтерии, клостридий ботулизма и др.

Генотип - это общая сумма генов микроба. В отношении микроорганизмов "генотип" означает то же, что "геном".

Фенотип - это весь комплекс свойств микроба, проявление генотипа в определенных, конкретных условиях существования.

Генотип - это возможные способности клетки, а фенотип - видимое их проявление.

Гены, ответственные за синтез какого-то соединения, обозначают строчными буквами латинского алфавита по названию соединения, например, при наличии гена, кодирующего синтез лейцина, - ieu⁺, при отсутствии - leu^-. Гены, ответственные за резистентность к лекарственным средствам, бактериофагам, ядам, обозначают буквой г (лат. resistentia), а чувствительные - буквой s (лат. sensitiv - чувствительный). Например, чувствительность к стрептомицину обозначают str⁵, резистентность str^r. Фенотип бактерий обозначается теми же знаками, но с прописной буквы: соотвественно Leu⁺, Leir, Str¹, Str⁸.

Изменчивость микроорганизмов

Наследственность - способность сохранения постоянства специфических свойств организма на протяжении ряда поколений, то есть способность воспроизводить себе подобных.

Изменчивость - различие в свойствах между особями одного вида. Различают изменчивость наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная или фенотипическая изменчивость (модификации) не затрагивает геном микроба, не передается по наследству. Модификации возникают в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, изменение исчезает. Например, кишечная палочка только в присутствии лактозы продуцирует ферменты, разлагающие этот углевод. Стафилококки образуют фермент, разрушающий пенициллин, только в присутствии этого антибиотика. Примером модификаций является также образование L-форм бактерий под действием пенициллина и возврат к исходной форме после прекращения его действия.

Наследственная или генотипическая изменчивость возникает в результате изменения самого генома. Изменение генома может наступить в результате мутаций или рекомбинаций.

Мутации (лат. mutatio - изменение) - изменение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК, в результате которого происходит появление или потеря признака. Таким признаком может быть способность синтезировать какую-либо аминокислоту или резистентность к антибиотику.

По происхождению мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Индуцированные мутации получают в эксперименте под влиянием мутагенов: радиации, некоторых химических веществ. Спонтанные мутации возникают под влиянием естественных факторов. Частота спонтанных мутаций невелика, в среднем 1 на 10 млн. Образевавшиеся микробы называют мутантами. Если возникшая мутация выгодна для микроба и создает для него преимущества в определенных условиях среды, то мутанты выживают и дают многочисленное потомство. Если же мутация не создает преимуществ, мутанты погибают.

Мутации микроорганизмов могут иметь важное практическое значение. Получены штаммы-мутанты грибов и актиномицетов, являющиеся продуцентами антибиотиков во много раз более активных, чем исходные культуры. Из мутантов с ослабленной вирулентностью могут быть получены вакцинные штаммы для получения живых вакцин.

Диссоциация бактерий (лат. dissociatio - расщепление) - одно из проявлений мутаций. В популяции микроорганизмов появляются особи, вырастающие при посеве на плотную питательную среду в виде гладких S-форм и шероховатых R-форм колоний (англ, smooth - гладкий, rough - шероховатый). S-формы колоний - круглые, влажные, с гладкой блестящей поверхностью, с ровными краями. R-формы колоний неправильной формы, сухие, с изрезанными краями и шероховатой поверхностью.

Процесс диссоциации, то есть расщепления особей в популяции, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные формы. У большинства видов бактерий вирулентными являются S-формы. Исключение составляют возбудители,чумы, сибирской язвы, туберкулеза.

Генетические рекомбинации

Генетические рекомбинации - (лат. recombinatio - перестановка) у бактерий - это передача генетического материала (ДНК) от клетки-донора к клетке-реципиенту, в результате появляются рекомбинанты с новыми свойствами.

Известны три типа генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация (рис.11, табл. 2).

Трансформация (лат. transforma-tio - превращение) - передача ДНК в виде свободного растворимого вещества, выделенного из клетки донора, в клетку реципиента. При этом рекомбинация происходит, если ДНК донора и реципиента родственны друг другу, и может произойти обмен гомологичных участков своей и проникшей извне ДНК. Впервые явление трансформации открыл Ф. Гриффите в 1928 г. Он ввел мышам живой невирулентный бескапсульный штамм пневмококка и одновременно убитый вирулентный кап-сульный штамм пневмококка Мыши погибли, из их крови была выделена живая культура вирулентного капсульного пневмококка Сам Гриффите считал, что трансформация произошла путем поглощения невирулентным пневмококком капсульного вещества вирулентного штамма Позже, в 1944 г О Эвери, К Мак Леод и М Мак-Карти доказали, что трансформирующее вещество - это ДНК, которая является носителем генетической информации Гак впервые была доказана роль ДНК как материального субстрата наследственности

Трансдукция (лат transductio - перенос) - передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту с помощью бактериофага Различают неспецифическую трансдукцию, специфическую и абортивную

При неспецифической трансдукции может быть перенесен любой фрагмент ДНК донора При этом ДНК донора попадает в головку бактериофага, не включаясь в его геном Принесенный бактериофагом фрагмент ДНК донора может включиться в хромосому реципиента Таким образом, бактериофаг в этом случае является только переносчиком ДНК, сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинанта

При специфической трансдукции гены хромосомы донора замещают собою некторые гены бактериофага В клетке реципиента фаговая ДНК вместе с фрагментом хромосомы донора включается в строго определенные участки хромосомы реципиента в виде профага Реципиент становится лизогенным и приобретает новые свойства.

Трансдукция называется абортивной, если фрагмент ДНК, принесенный бактериофагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента, а остается в цитоплазме и может кодировать синтез какого-то вещества, но не реплцируется при делении, передается только одной из двух дочерних клеток и затем утрачивается.

Конъюгация (лат. conjugatio - соединение) - это переход ДНК из клетки-донора ("мужской") в клетку-реципиент ("женскую") через половые пили при контакте клеток между собой. Донором является "мужская" клетка (F⁺-клетка), она содержит F-фактор - половой фактор, который кодирует образование половых пилей. Клетки, не содержащие F-фактора (F^--клетки), являются женскими. При конъюгации клетки-доноры соединяются с клетками-реципиентами с помощью F-пилей, через которые происходит переход ДНК. Если клетка-реципиент получает F-фактор, она становится "мужской" F⁺-клеткой.

Если F-фактор включен в хромосому, то бактерии способны передавать фрагменты хромосомы и называются Hfr-клетками (англ, high frequency of recombination - высокая частота рекомбинации). При конъюгации хромосома разрывается в месте нахождения F-фактора и реплицируется, причем одна нить ДНК передается в клетку реципиента, а копия остается в клетке донора. F-фактор включается в хромосому в определенном ее участке, поэтому перенос отдельных генов хромосомы совершается в строго определенное время. Таким образом, прерывая процесс конъюгации через разные промежутки времени путем встряхивания взвеси бактерий, можно выяснить, какие признаки передаются за это время. Это позволяет построить карту хромосомы, то есть последовательность расположения генов в хромосоме. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 минут. F-фактор при этом переносится последним.

Особенности генетики вирусов

Модификации. Ненаследуемые изменения у многих вирусов происходят в результате включения в состав их внешней оболочки липидов и углеводов клеток хозяина, в которых вирус репродуцируется.

Мутации. Спонтанные мутации возникают в результате ошибок при репликации генома вируса. Индуцированные мутации происходят под действием мутагенов. Одни из них (азотистая кислота) влияют на внеклеточный вирион, другие (акридин, аналоги азотистых оснований) - на процесс репликации вирусной нуклеиновой кислоты в клетке. Мутанты отличаются от исходных вирусов по строению и величине бляшек, которые они образуют в культуре клеток, по антигенам, по чувствительности к температуре.

Рекомбинации. При одновременном паразитировании двух вирусов в одной клетке хозяина возможен обмен генетическим материалом между ними. В результате генетической рекомбинации происходит обмен участками HK между разными вирусами, и образуются рекомбинанты, обладающие генами двух исходных вирусов. Вирус гриппа имеет геном, состоящий из восьми фрагментов РНК. При одновременной репродукции в одной клетке двух разных вирусов гриппа между ними может происходить обмен генами. Образовавшинеся рекомби-нанты будут представлять собой новый тип вируса гриппа.

При одновременном паразитировании двух видов вируса в одной клетке в момент формирования зрелых вирионов возможно фенотипическое смешивание, когда геном одного вируса одевается капсидом другого вируса (феномен транскапсидации). Так, например, известны случаи, когда геном вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) оказывается включенным в белковый капсид другого вируса. В результате такой вирус приобретает способность поражать такие виды клеток, которые были нечувствительны к исходному вирусу.

Практическое значение учения о генетике микробов

При микробиологической диагностике инфекционных заболеваний возникают затруднения в определении вида атипичных микробов, например, бактерий дизентерии, не агглютинирующихся сыворотками. Для их идентификации приходится применять другие методы.

В процессе лечения больных инфекционными болезнями создаются препятствия в виде устойчивости возбудителей к антибиотикам, и требуются специальные методы для преодоления лекарственной устойчивости. Селекция в условиях стационаров штаммов микроорганизмов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью и высокой вирулентностью для человека, привело к формированию так называемых «госпитальных» штаммов, вызывающих внутрибольничныс инфекции. Такие штаммы известны среди стафилококков, а также среди сальмонелл и других грамотрицательных палочек.

Методами направленной мутации и селекции получены живые вакцины, с успехом применяющиеся для профилактики инфекционных болезней.

Достижения молекулярной генетики используются для современных методов идентификации микробов: методы индикации нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полимеразная цепная реакция является высокочувствительной реакцией, т.к. позволяет увеличить число копий исследуемой цепи ДНК в сотни тысяч раз за несколько часов. ПЦР может быть использована особенно тогда, когда в исследуемом материале имеется очень малые концентрации возбудителя или трудно выделить чистую культуру, а также при его высокой антигенной изменчивости.

Генетическая инженерия

Генетическая инженерия основана на создании рекомбинантных организмов, содержащих встроенные в их хромосому гены, кодирующие продукцию необходимых для производства соединений.

Последовательные этапы рекомбинации:

1) получение ДНК. Участки ДНК, то есть гены, кодирующие синтез необходимого вещества, выделяют из хромосомы путем разрезания ферментами (рестриктазами). В некоторых случаях удается получить методом химического синтеза небольшие гены, аналогичные природным;

2) полученный ген (отрезок ДНК) с помощью ферментов (лигаз) соединяют ("сшивают") с другим отрезком ДНК, который будет служить вектором для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора можно использовать плазмиды, бактериофаги, вирусы;

3) вектор, несущий встроенный в него ген, встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает способность продуцировать не свойственное этой клетке вещество. В качестве таких реципиентов используют клетки Е. coli, P. aeruginosa, дрожжи, вирус осповакцины. Подбирая подходящего реципиента, учитывают выраженность синтеза необходимого вещества. Некоторые штаммы бактерий, получивших чужой ген, способны переключать половину своего потенциала на синтез соединения, кодируемого этим геном. Учитывается также возможность секреции вещества в окружающую среду, возможность культивирования в промышленных масштабах, экологическая безопасность.

Биологические препараты, полученные методом генетической инженерии: интерфероны, интерлейкины, инсулин, гормон роста, вакцина против гепатита В, антигены ВИЧ для диагностики и другие препараты.

Методы генетической инженерии перспективны:

- для получения антигенов с целью диагностики заболеваний, возбудители которых или не культивируются на питательных средах (сифилис, малярия) или опасны для культивирования;

- для получения препаратов, сырье для которых дорогостоящее или дефицитное: интерфероны, инсулин, гормон роста, интерлейкины и другие цитокины, регулирующие иммунитет, а также антитела.

ГЛАВА 11 АНТИБИОТИКИ

По современной классификации, термин «антибиотики» объединяет все лекарственные препараты, избирательно подавляющие микроорганизмы и не повреждающие органы и клетки человека. Их разделяют на следующие группы:

а) природные - продуцируемые живыми организмами;

б) полусинтетические - полученные в результате модификации структуры природных антибиотиков;

в) синтетические - полученные методом синтеза (прежнее их название - химиотерапевтические средства).

Исторически сложилось так, что вначале были получены синтетические препараты, получившие название химиотерапевтических, а лечение этими препаратами - химиотерапии. Основоположником химиотерапии является немецкий химик Пауль Эрлих (1854-1915), который установил возможность создания химических соединений, избирательно действующих на определенные виды микробов. Первыми химиотерапевтическими средствами, синтезированными Эрлихом, были сальварсан и неосальварсан, обладающие противосифилитическим действием. Эрлих сформулировал основные положения химиотерапии, понятие об этиотропном лечении (греч. aitia - причина), направленном против возбудителей заболевания, а также впервые обнаружил явление лекарственной устойчивости микробов.

В 1932 г. Г. Домагк синтезировал первый сульфаниламидный препарат - стрептоцид. В дальнейшем были получены препараты биологического происхождения, по своей антимикробной активности на несколько порядков превосходящие синтетические препараты. Их действие основано на антагонизме микробов. Чаще всего антагонизм наблюдается среди почвенных микробов. Еще в 1887 г. Л. Пастер обнаружил подавление роста бацилл сибирской язвы гнилостными бактериями при совместном их выращивании. Идея об антагонизме микробов нашла практическое применение в трудах И.И. Мечникова, предложившего использовать антагонистическое действие молочнокислых бактерий на гнилостные микробы кишечника и путем введения лакто-бактерий изменять кишечную флору. Идея И.И. Мечникова о возможности и целесообразности направленного изменения кишечной микрофлоры и об использовании с этой целью микробов-антагонистов лежит в основе бактериотераиии (лечения живыми микробами) п современного учения об антибиотиках.

В 1929 г. английский микробиолог А. Флеминг обнаружил на чашках Петри лизис колоний золотистого стафилококка вблизи плесени Penicillium notatum и показал, что фильтрат бульонной культуры этой плесени обладал антибактериальным действием в отношении грампо-ложительных бактерий. Однако препарат пенициллина получили лишь в 1941 г. Г.У. Флори и Э. Чейн. В Советском Союзе пенициллин был получен З.В. Ермольевой в 1942 г. из плесени Penicillium crustosum.

Вслед за получением пенициллина начались и продолжаются в настоящее время широкие поиски новых антибиотических веществ природного происхождения и получение высокоактивных синтетических препаратов. Синтезированные в последнее время фторхинолоны по своей активности приближаются к антибиотикам природного происхождения.

Для оценки пригодности антибиотика к применению служит химиотерапевтический индекс. Величина индекса определяется по формуле:

...