Предмет, методы и содержание микробиологии

Сывороточная болезнь возникает через 7-15 дней после первичного введения обычно больших доз чужеродной сыворотки. Болезнь проявляется в виде отека кожи и слизистых оболочек, повышения температуры тела, 6 эли в суставах, сыпи, кожного зуда.

Гиперчувствительность замедленного типа. ГЧЗТ связана не с антителами, а с иммунными лимфоцитами - Т-эфекторами (Те). Это Т-зависимая аллергия. К данному типу аллергии относитися инфекционная аллергия. Наблюдается она при туберкулезе, бруцеллезе, туляремии, ток-соплазмозе, грибковых заболеваниях. Аллергические пробы используют в диагностических целях. Аллергены, полученные из микробов, вводят внутрикожно или накожно. При наличии повышенной чувствительности к возбудителю через 24-48-72 часа развивается воспалительная реакция. Диагностические аллергические пробы применяются при туберкулезе (реакция Манту с туберкулином), при бруцеллезе, сибирской язве и др.

Контактная аллергия. Повышенная чувствительность аллергического характера к лекарственным препаратам связана с выработкой антител или иммунных лимфоцитов. Это явление существенно отличается от обычного усиления фармакологического действия лекарственного препарата.

Некоторые лекарственные средства имеют достаточно высокую молекулярную массу, чтобы действовать как полноценные антигены и вызвать иммунный ответ. Но в большинстве случаев аллергические реакции развиваются к лекарственным средствам, имеющим молекулярную массу менее 1 кД. Эти вещества действуют как гаптены и становятся полноценными антигенами после соединения с белком хозяина. Некоторые лекарства могут прямо соединяться с протеинами, но большинство, такие как аспирин, барбитураты, сульфаниламиды, вначале подвергаются частичному метаболизму.

При повышенной чувствительности к лекарствам может наблюдаться любой тип аллергической реакции. Ответственными за это являются антитела и иммунные лимфоциты. Клинические проявления: лихорадка, высыпания на коже и слизистых оболочках, отек, анафилактический шок, астма, васкулиты, аутоиммунные реакции.

Аллергии могут быть острыми и хроническими. Наиболее тяжелое проявление - это анафилактический шок, который встречается редко, но наступить может неожиданно.

Для выявления лекарственной непереносимости выясняется анамнез. Кожные пробы небезопасны, так как у пациента с повышенной чувствительностью даже ничтожная доза препарата может вызвать патологическую реакцию. Разработаны лабораторные тесты in vitro, в частности, химическая эритрограмма (ускорение гемолиза эритроцитов пациента под влиянием лекарственного средства), а также РПГА - реакция пассивной гемагглютинации, в которой антитела сыворотки крови пациента реагируют с лекарственным средством, адсорбированном на эритроцитах.

Наиболее полно изучены аллергические реакции к пенициллину. Реакции эти разнообразны. Продукты распада бензилпенициллина в организме могут вызвать как ГЧНТ, так и ГЧЗТ. Большинство нормальных взрослых людей имеют сывороточные антитела к бензилпенициллину. Наиболее часто встречаются IgG, но они не принимают участия в аллергических реакциях. Напротив, IgG действуют как блокирующие антитела, предотвращая аллергические реакции. Иммуноглобулины класса IgE участвуют в аллергической реакции немедленного типа - анафилактическом шоке и в крапивнице. Дерматиты являются ГЧЗТ с участием иммунных лимфоцитов и наблюдаются преимущественно среди лиц, занятых производством антибиотиков.

При аллергическом шоке, вызванном пенициллином, для немедленной помощи в качестве антидота применяется пенициллиназа (синоним - Neutropen).

Особенности противовирусного иммунитета

Характер иммунитета при вирусных инфекциях связан с особенностями вирусов как строгих внутриклеточных паразитов.

Неспецифическая противовирусная резистентность обусловлена такими механизмами, как:

1) отсутствие в организме чувствительных клеток к данному вирусу;

2) наличие неспецифических вирусных ингибиторов;

3) повышенная температура тела;

4) интерферон - один из основных противовирусных факторов защиты.

Фагоцитоз в отношении вирусов имеет меньшее значение, чем в отношении бактерий и часто бывает незавершенным.

Специфические противовирусные антитела могут нейтрализовать внеклеточные формы - вирионы, препятствуя их проникновению в клетки организма. Против внутриклеточных форм вирусов антитела неэффективны. Существенную роль играют секреторные SIgA, создающие местный иммунитет в воротах инфекции, например, при гриппе. Сывороточные антитела, циркулирующие в кровяном русле, играют защитную роль при вирусемии.

В противовирусном иммунитете действует особый механизм. Клетки, зараженные вирусом, имеют на своей поверхности антигенные детерминанты. Поэтому они становятся мишенями для цитотоксических лимфоцитов - Т-киллеров. При этом зараженные клетки погибают вместе с вирусом. Например, при вирусном гепатите В происходит гибель гепатоцитов, зараженных вирусом.

Иммунодефицитные состояния

Иммунодефицитами называют неполноценное функционирование иммунной системы. Иммунодефицитные состояния разделяют на первичные (врожденные) и вторичные (приобретенные).

Врожденные иммунодефициты связаны с генетическими дефектами развития иммунной системы. Дефекты В-снстемы ведут к пониженной выработке или полному отсутствию Ig-глобулинов. Чаще наблюдается избирательная недостаточность SIgA, что ведет к снижению местной защиты слизистых оболочек. Преимущественные дефекты Т-системы - это недоразвитие тимуса, которое обусловливает недостаточность клеточного иммунитета. Тяжелые последствия вызывают комбинированные дефекты Т- и В-системы. Наблюдаются также избирательные дефекты фагоцитов и дефекты системы комплемента.

Вторичные (приобретенные) иммунодефициты развиваются при многих бактериальных и вирусных инфекциях, при болезнях, сопровождающихся потерей белка (ожоги, болезни почек), при применении с лечебной целью рентгеновских лучей или иммуносупрессивных средств. Причинами развития вторичных иммунодефицитов могут быть диабет, ожирение, атеросклероз, истощение.

Приобретенные иммунодефициты инфекционной природы возникают вследствие размножения возбудителей непосредственно в клетках иммунной системы. Вирус иммунодефицита человека репродуцируется в Т-хелперах и макрофагах, и при этом страдают и клеточный, и гуморальный иммунитет, поскольку Т-хелперы являются регуляторами иммунного ответа.

Иммунодефицитные состояния способствуют возникновению инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, и развитию опухолей. Например, у больных СПИДом часто развивается саркома Капоши или пневмония, вызванная Pneumocysta carinii - микроскопическим грибом, который у людей с нормальным уровнем иммунитета не вызывает заболевания.

Оценка иммунного статуса организма

Иммунодефицитные состояния, так же, как и состояние избыточного реагирования иммунной системы (аллергические реакции и аутоиммунные процессы) поддаются лечению и коррекции. Однако такое лечение может проводиться только после оценки иммунного статуса организма. Исследование начинается с ориентировочного клинического этапа, на котором собирается иммунологический анамнез: инфекционные заболевания в прошлом, их течение, наличие очагов хронической инфекции. Проводится клинический анализ крови: количество полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, Выявляется носительство бактерий или вирусов.

В иммунологической лаборатории проводится исследование с использованием тестов 1-го и 2-го уровней.

Тесты 1-го уровня позволяют выявить грубые нарушения иммунной системы. Определяются следующие показатели:

- процентное содержание и абсолютное количество Т- и В-лим-фоцитов;

- концентрация сывороточных IgM, IgG, IgA: уровень сывороточных иммуноглобулинов отражает состояние В-системы иммунитета;

- для оценки факторов неспецифической защиты организма определяют фагоцитарную активность нейтрофилов крови и уровень комплемента крови.

Тесты 2-го уровня позволяют уточнить характер выявленного дефекта. К тестам 2-го уровня относится: определение соотношения Тх/Тс, оценка функциональной активности субпопуляций Т-лимфоцитов и др.

Иммунофармакологические средства

Нарушения иммунной системы можно устранять с помощью им-мунофармакологических средств, направленных на стимуляцию или угнетение иммунной системы или отдельных ее компонентов.

Иммуностимулирующим действием обладают следующие группы веществ:

1) гормоны иммунной системы: гормоны тимуса (тактивин, тималин), стимулирующие Т-систему лимфоцитов; гормоны костного мозга (миелопиды), стимулирующие В-систему лимфоцитов;

2) медиаторы иммунной системы - интерлейкины: лимфокины, монокины, интерферон, фактор некроза опухолей (ФНО);

3) лекарственные средства: левамизол (декарис), целый ряд протеолитических ферментов: террилитин, стрептолиаза; сосудорасширяющие средства: дибазол, курантил, эуфиллин; нуклеинат натрия, пирогенал, продигиозан.

Эффективным методом иммуностимуляции является экстракорпоральная иммунофармакотерапия. Один из методов заключается в том, что полученные от пациента клетки, способные продуцировать интерлейкины, обрабатывают иммуномодулирующим веществом, например, диуцифоном или фосфолипидами и затем вновь вводят пациенту.

Иммуносупрессивные средства применяются в тех случаях, когда возникает необходимость в подавлении иммунитета, например, при трансплантации, при аутоиммунных заболеваниях. Иммуносупрессивным действием обладают некоторые гормональные препараты и лекарственные средства: циклоспорин А, азатиоприн, батрпден, сали-цилаты, антилимфоцитарная сыворотка. Иммуносупрессивным действием обладают также стероидные гормоны, применение которых может проводиться только по строгим показаниям.

Становление и развитие иммунной системы в онтогенезе

Начальные этапы онтогенеза. Индивидуальное развитие организма начинается с момента оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом огца. Образуется зигота, из которой развивается зародыш, поровну наследующий геном родителей. Следовательно, он в генетическом отношении не является идентичным ни матери, ни отцу. По законам иммунологии материнская иммунная система должна препятствовать имплантации оплодотворенной яйцеклетки. Поэтому дальнейшее развитие зародыша возможно благодаря сложной системе защиты его от иммунного ответа матери.

Доступ сперматозоида к яйцеклетке и слияние их возможны потому, что: 1) система местного иммунитета женского полового тракта не препятствует продвижению сперматозоидов; 2) женские половые пути отчасти изолированы от общего кровотока; 3) семенная жидкость содержит вещества, подавляющие иммунные процессы.

В дальнейшем оплодотворенная яйцеклетка имплантируется в матке и не отторгается благодаря тому, что иммунная система беременной женщины проявляет относительную толерантность к антигенам эмбриона. Функцию изоляции плода от иммунной системы матери выполняет плацентарный барьер (трофобласт). Крово-ток матери и плода оказываются полностью изолированными друг от друга. Плацента и плод синтезируют белки и гормональные вещества, подавляющие реакцию отторжения. При нормально протекающей беременности в организме беременных вырабатываются факторы, угнетающие иммунный ответ против антигенов плода. В то же время способность женского организма формировать иммунный ответ против бактерий и вирусов во время беременности полностью сохраняется.

У плода тимус закладывается на 6-7-й неделе внутриутробного развития, формирование его заканчивается к концу 3-го месяца, в дальнейшем происходит увеличение коркового слоя. На 11-12-й неделе селезенка, костный мозг и печень заселяются лимфоцитами. Лимфатические узлы закладываются на 4-м месяце, но полностью формируются после рождения. Т-лимфоциты появляются у плода на 40-й день, отвечают на антигенное воздействие на 16-й неделе. Зрелые В-лимфоциты появляются на 12-15-й неделе, способность формировать гуморальный иммунный ответ - с 10-12-й недели развития плода, причем образуются IgM.

Трансплацентарная передача антител осуществляется с помощью плацентарных клеток, которые поглощают белковые молекулы и переносят их в неизмененном виде. Переносятся только IgG, причем интенсивность передачи регулируется концентрацией IgG у матери: при высоких концентрациях передача замедляется, при низких усиливается. Таким образом поддерживается постоянный уровень IgG в крови плода. Антитела класса IgM через плаценту не проходят, поэтому новорожденные оказываются недостаточно защищенными от гра-мотрицательных микробов (кишечных палочек, сальмонелл).

Околоплодные воды обладают защитными свойствами, они почти всегда стерильны, в них обнаруживаются лизоцим, р-лизин, имму-ноглобулины.

Комплемент через плацентарный барьер не проникает. В тканях плода отдельные фракции появляются на 6-й неделе, в крови - на 10-й неделе, к 19-й неделе кровь содержит весь комплекс белков" комплемента, но при этом у новорожденных отмечается слабая опсоническая активность крови, с чем связана их чувствительность к инфекции.

Фагоцитирующие клетки появляются в печени плода на 2-м месяце беременности. Фагоцитарная активность у них выражена слабо. При наличии инфекции количество их резко падает.

Период новорожденности. В этом периоде происходит интенсивное развитие механизмов иммунитета, которое определяет иммунный статус в последующем. Исходный уровень компонентов иммунной системы определяется в пуповинной крови.

Уже в первые часы после рождения организм ребенка сталкивается с разнообразной микрофлорой, заселяющей его кожу, дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт. В результате происходит стимуляция лимфоидного аппарата и интенсивное его развитие. Резко повышается количество лимфоцитов. Уже на первой неделе жизни -физиологический лимфоцитоз, сохраняющийся до 5-6 лет.

У новорожденных слабо выражена активность Т-киллеров, а также реакции ГЗТ, выявляемые аллергическими кожными пробами. Ослаблены процессы активации комплемента, продукции интерлейкинов и интерферона.

Количество В-лимфоцитов у новорожденных выше, чем у взрослых, но функция их слабее. Гуморальный иммунитет новорожденного зависит от материнских IgG, которые защищают от вирусов полиомиелита, кори, краснухи, от менингококков, стрептококков, бордетелл коклюша, коринебактерий дифтерии, клостридий столбняка.

Слабая фагоцитарная активность лейкоцитов связана в основном с недостатком опсонинов.

Концентрация лизоцима в пуповинной крови выше, чем у матери. В первые три дня количество его нарастает, к концу первой недели снижается до уровня лизоцима у взрослых.

Грудное молоко содержит не только необходимые питательные вещества в оптимальных для ребенка соотношениях, но и такие защитные факторы, как систему комплемента в стимулированной форме, лизоцим, антитела, гормоны, ферменты. Антитела относятся в основном к секреторным SIgA.

Грудное вскармливание защищает от инфекций в наиболее уязвимом возрасте. В условиях стационара грудное вскармливание предохраняет ребенка от внутрибольничных инфекций.

Реакции иммунитета

В основе реакций иммунитета лежит специфическое взаимодействие между антигеном и антителами. Реакции происходят в том случае, если антиген и антитела соответствуют, специфичны друг для друга. Следовательно, реакции иммунитета можно использовать в двух направлениях: 1) с помощью известных антигенов определить наличие антител в сыворотке крови больного и 2) с помощью известных антител, которые содержатся в иммунной сыворотке, определить вид и тип микроорганизма.

Поскольку в реакциях иммунитета участвует сыворотка, их называют серологическими (лат. serum - сыворотка).

Процесс взаимодействия антигена и антитела происходит в две фазы. Первая фаза - это специфическое соединение антигена и антител, вторая - неспецифическая, видимая фаза, происходит обычно в присутствии электролитов. Видимое проявление зависит от антигена: если это корпускулярный антиген, например, микробы, то образуются хлопья (агглютинация), если антиген растворимый (молекулярно-дисперс-ный), например, белки или полисахариды, то образуется осадок (преципитация)

Реакция нейтрализации токсина антитоксином

В этой реакции антигеном является экзотоксин, антителами - антитоксины. При их взаимодействии происходит нейтрализация токсина. Реакцию ставят в пробирках для определения силы антитоксической сыворотки. Внешнее проявление реакции - флоккуляция (помутнение). Для обнаружения токсина с диагностической целью при ботулизме, столбняке, газовой анаэробной инфекции ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксином в биологическом опыте на животных.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации - склеивание бактерий под влиянием специфических антител. Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клетки, во второй - образование хлопьев в присутствии электролита (хлорида натрия). Видимая реакция происходит в том случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому их них присоединяется антиген, и в результате образуется "решетка".

Методы постановки реакции агглютинации:

1) развернутая реакция агглютинации ставится в пробирках с последовательными разведениями сыворотки;

2) реакция агглютинации на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:5 - 1:10; наступает в течение нескольких минут.

Для определения антигенной структуры микробов, выделенных из организма пациента, используют агглютинирующую сыворотку, полученную из крови животного (кролика, барана), иммунизированного этими микробами. Титром диагностической агглютинирующей сыворотки называется наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию.

Если агглютинирующая сыворотка содержит антитела против Н-антигена, то подвижные бактерии склеиваются своими жгутиками, образуются рыхлые хлопья. Это крупнохлопчатая агглютинация, наступающая быстро - в течение двух часов.

Сыворотка, содержащая О-агглютинины, вызывает мелкозернистую агглютинацию в течение 18-24 часов.

Агглютинирующие сыворотки, полученные путем иммунизации животных микробами, могут содержать антитела против родственных микробов, то есть являются поливалентными. Для повышения специфичности сывороток из них удаляют групповые антитела методом адсорбции по Кастелляни, с помощью групповых антигенов. Полученные сыворотки называют адсорбированными. Оставляя антитела только к одному антигену, получают монорецепторные сыворотки. С такими сыворотками ставят реакцию агглютинации на стекле, которая в этом случае является окончательной, а не ориентировочной.

Для обнаружения антител в сыворотке крови пациента в качестве известного антигена используют убитые культуры микробов, так называемые диагностикумы. При постановке серологического диагноза учитывают диагностический титр сыворотки - для большинства заболеваний 1:100 или 1:200.

Реакции непрямой или пассивной гемагглютинации.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.

1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорбирован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отношении этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых планшетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кружевного зонтика», при отрицательной реакции - плотный осадок эритроцитов в виде "пуговки".

2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исследуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагностикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В отношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Реакция Кумбса (аптиглобулиновый тест)

Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh⁺ эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антитела не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антителами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов.

Реакция преципитации

Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реакции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции преципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осторожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем антигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципитата.

Реакцию применяют в судебной медицине для определения видовой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических исследованиях - для установления фальсификации пищевых продуктов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммунизации животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кролика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки - это наибольшее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.

Реакция преципитации в агаровом геле проводится несколькими методами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.

Реакция двойной иммунодиффузии (по Оухтерлони). Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердевания в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммунные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белых полос.

Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини). В растопленный агаровый гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических мо-норецепторных сыворотках.

Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направлению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образуются линии преципитации.

Реакции иммунного лизиса

Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфическими антителами, образует иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эритроциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, антитела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритроцитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лаковую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для обнаружения комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант реакции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.

Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют комплемент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, образуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител, и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут или 18-20 часов в холодильнике.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотке нет), комплемент останется свободным, и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонореи, сыпного тифа и других заболеваний.

РСК можно применять и для определения антигена, например, вируса. В этом случае в качестве антител применяется диагностическая иммунная сыворотка.

В качестве комплемента для РСК применяется сыворотка крови морской свинки. Гемолитическую сыворотку получают из крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана.

Реакции с участием меченых антигенов или антител

Реакции основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сыворотка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изоти-оцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.

Прямой метод РИФ. Из исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена (например, холерного вибриона), готовят препарат-мазок и обрабатывают его флюоресцирующей сывороткой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае - противохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдают светящиеся микробы.

Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь большой набор флюоресцирующих сывороток против каждого антигена.

Непрямой метод РИФ. Препарат-мазок обрабатывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противохолерной кроличьей сывороткой), а затем - флюоресцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблюдают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.

При использовании этого метода можно иметь одну флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммунитета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена (рис. 20). Первый этап - адсорбция специфических антител на твердой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей.

Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого луночки промывают.

Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. В качестве фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антнген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н₂О₂ в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, интенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.

2) Обнаружение антител (рис. 21). Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы - в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап - после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются "безреагентные" системы для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверхностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести исследуемый материал и наблюдать изменение окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг - это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем ферменты, разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем церено-

Лечебные и профилактические препараты Вакцины

Иммунобиологические медицинские лечебные и профилактические препараты служат для профилактики и лечения больных инфекционными заболеваниями путем создания искусственного иммунитета.

Вакцины - препараты, содержащие антигены и предназначенные для создания в организме искусственного активного иммунитета. Введение вакцины в организм называют вакцинацией. Вакцины применяют чаще для профилактики, реже - для лечения.

В зависимости от природы антигена, который они содержат, вакцины разделяют на живые, убитые, химические, анатоксины, ассоциированные.

Вакцины и анатоксины с уменьшенной дозировкой антигена (БЦЖ-м, АД-м и другие) применяют для вакцинации и ревакцинации при наличии противопоказаний к прививкам полной дозой антигена.

Вакцины против одной инфекции называют моновакцинами, против двух, трех, нескольких - соответственно дивакцинами, тривакцинами, поливакцинами.

Поливалентными называют вакцины, содержащие несколько серологических вариантов возбудителей одного вида, например, противогриппозные вакцины типов А и В.

Живые вакцины готовят из живых микроорганизмов, вирулентность которых ослаблена, а иммуногенные свойства сохранены. Научные основы получения вакцинных штаммов разработал Л. Пастер, установив возможность искусственного ослабления вирулентности патогенных микробов.

Для получения вакцинных штаммов применялись разные способы.

1) Выращивание на питательных средах, неблагоприятных для роста и размножения возбудителя. Так, французские микробиологи А. Кальметт и Г. Герен получили вакцинный штамм микобактерий туберкулеза (БЦЖ) путем культивирования возбудителей на питательной среде, содержащей желчь.

2) Пассажи возбудителя через организм животных Таким способом Л. Пастер получил вакцину против бешенства. Многократные пассажи привели к тому, что вирус адаптировался к организму кролика, возросла его вирулентность для кроликов и снизилась вирулентность для человека.

3) Отбор естественных культур микроорганизмов, маловирулентных для человека. Так были получены вакцины против чумы, бруцеллеза, туляремии, полиомиелита и др.

Живые вакцины имеют ряд преимуществ по сравнению с убитыми вакцинами. Размножение в организме человека вакцинного штамма микробов приводит к развитию вакцинальной инфекции - доброкачественно протекающего процесса, приводящего к формированию специфического иммунитета. Живые вакцины вводятся более простыми способами (перорально, интраназально, накожно, внутрикожно) и, как правило, однократно. Благодаря способности вакцинного штамма размножаться в организме и оказывать длительное антигенное воздействие создается напряженный, стойкий иммунитет.

Для сохранения стабильности живые вакцины выпускают в виде лиофилизированных препаратов. Хранить их следует в холодильнике, при температуре 4°-8°С в течение всего срока хранения, а также при транспортировке вакцин. В противном случае жизнеспособность вакцинного штамма может быть утеряна, и прививки не дадут нужного эффекта.

При проведении прививок живыми вакцинами соблюдаются определенные правила. За один-два дня до введения вакцины и в течение недели после вакцинации не следует применять антимикробные препараты, иммунные сыворотки, иммуноглобулины. Для введения вакцины нельзя употреблять горячие инстументы. Вскрытую ампулу употреблять немедленно или в течение 2-3 часов; защищать от солнечных лучей и нагревания. Кожу обрабатывать летучими веществами, например, спиртом, и вакцину вводить после его испарения; не применять с этой целью йод, карболовую кислоту и другие соединения, которые задерживаются на коже. Оставшуюся неиспользованной или забракованную вакцину не выливать, а предварительно убить. Местную реакцию на введение вакцины не лечить антибактериальными средствами.

Живые вакцины не рекомендуется применять при иммунодефицит-ных состояниях (например, при лучевой болезни), на фоне которых вакцинные штаммы могут вызвать инфекционные осложнения.

Живые вакцины применяются для профилактики следующих заболеваний: туберкулез, чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, корь, оспа, паротит, полиомиелит, желтая лихорадка.

Убитые (инактивированные) вакцины содержат бактерии, вирусы, инактивированные прогреванием, УФ-лучами, формалином, фенолом, спиртом. Для получения убитых вакцин используют штаммы, полноценные по иммуногенности. Инактивацию проводят так, чтобы надежно убить микробы, не повредив антигенных свойств.

Заболевания, для профилактики которых применяют убитые вакцины: лептоспироз, коклюш, грипп, бешенство, клещевой энцефалит.

Прививки убитыми вакцинами проводятся двукратно или троекратно; иммунитет менее продолжительный.

Вакцинотерапия. Вакцины из убитых микробов применяются для лечения больных хроническими вялотекущими инфекционными заболеваниями, такими, как бруцеллез, хроническая дизентерия, хроническая гонорея, хронический рецидивирующий герпес, хронические стафилококковые инфекции. Лечебный эффект при этом связан со стимуляцией фагоцитоза и иммунного ответа.

Лечение вакцинами проводится индивидуально, под врачебным наблюдением, так как вакцинотерапия нередко вызывает обострение инфекционного процесса.

В некоторых случаях для лечения применяют аутовакцины, которые приготавливают из бактерий, выделенных от самого пациента.

Химические вакцины содержат извлеченные из микробных клеток и из вирусов антигены, обладающие протективным (защитным) действием. Таким образом, в отличие от живых и убитых вакцин, являющихся корпускулярными, химические вакцины не содержат микробных клеток или цельных вирионов. Их можно назвать молекулярнодисперсными.

Преимуществом химических вакцин является то, что они не содержат балластных веществ, они менее реактогенны, то есть вызывают меньше побочных реакций.

Примеры химических вакцин: брюшнотифозная - содержит О-антиген; холерная (О-антиген); менингококковая - содержит полисахаридный антиген; сыпнотифозная - содержит поверхностный растворимый антиген из риккетсий Провацека. Вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины содержат наиболее иммуноленные антшены вирусов. Например, гриппозная вакцина (АГХ) содержит гемагглютинин и нейраминидазу.

Химические вакцины для повышения иммуногенности адсорбируют на адъюванте (гидроксиде алюминия). Адъювант укрупняет антп-генные частицы, замедляет резорбцию антигена, удлиняя ею действие. Кроме того, адъювант является неспецифическим стимулятором иммунного ответа.

Анатоксины - препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, лишенных ядовитых свойств, но сохранившие иммуногеные свойства. Метод получения анатоксинов предложил в 1923 г. французский ученый Г. Рамон. Для приготовления анатоксина к экзотоксину прибавляют 0,3-0,4% формалина и выдерживают при температуре 37-40°С в течение 3-4 недель до полного исчезновения токсических свойств.

Анатоксины выпускают в виде нагивных препаратов или в виде очищенных адсорбированных на адъювантах концентрированных препаратов.

Анатоксины применяют для создания искусственного активного антитоксического иммунитета. Применяются анатоксины, стафилококковый нативный и очищенный адсорбированный, холероген-анатоксин; адсорбированный дифтерийный (АД, АД-м), дйфтерийно-столбнячный (АДС, АДС-м), трианатоксин (ботулинический типов А, В, Е), тетра-анатоксин (ботулинический типов А, В, Е и столбнячный).

Ассоциированные вакцины содержат антигены, разные по своей природе. Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) содержит инактивированную коклюшную вакцину, дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидроксиде алюминия.

Вакцины новых поколений. Это вакцины будущего, некоторые из них уже применяются.

1) Искусственные вакцины, составленные из детерминантных групп антигенов, соединенных с белком-носителем.

2) Генноинженерные вакцины. Методами генетической инженерии гены, ответственные за синтез антигена, встраиваются в геном бактерий, дрожжей, вирусов. Создана вакцина, содержащая антигены вируса гепатита В, продуцируемые рекомбинантными клетками дрожжей; готовится генноинженерная вакцина против ВИЧ-инфекции из антигенов вируса, продуцируемых рекомбинантными штаммами Е. coli; вакцина из антигенов ВИЧ в составе вируса осповакцины.

3) Разрабатывается метод получения вакцин на основе антиидиотипических антител, то есть антител, специфичных к иммуноглобулину. Например, антитела против антитоксина могут иммунизировать животное или человека подобно токсину (или анатоксину).

Вакцины вводят накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, интраназально, перорально, ингаляционно. Для массовых прививок применяют безыгольную инъекцию с помощью автоматов пистолетного типа, а также пероральное введение вакцины и ингаляционный способ.

Система вакцинации для профилактики инфекционных болезней среди населения регламентируется календарем прививок, в котором определено проведение обязательных прививок для каждого возраста и прививок по показаниям.

При введении вакцин могут возникать местные и общие реакции. Общая реакция: повышение температуры до 38°-39°С, недомогание, головная боль. Эти симптомы обычно проходят через 1-3 дня после прививки. Местно через 1-2 дня на месте инъекции могут появиться покраснение и инфильтрация. Некоторые живые вакцины - оспенная, туляремийная, БЦЖ при внутрикожном введении вызывают характерные кожные реакции, что свидетельствует о положительном результате прививки.

Основные противопоказания к применению вакцин: острые инфекционные заболевания, активная форма туберкулеза, нарушение сердечной деятельности, функции печени, почек, эндокринные расстройства, аллергия, заболевания центральной нервной системы. Для каждой вакцины существует подробный перечень противопоказаний, приведенный в инструкции. В случае эпидемии или при угрожающих жизни показаниях (укус бешеным животным, случаи чумы) необходимо прививать и лиц с противопоказаниями, но под специальным медицинским наблюдением.

Иммунные сыворотки и аммуноглобулины

В течение многих инфекционных заболеваний в организме вырабатываются антитела, играющие защитную роль. Но накопление их в достаточном количестве наблюдается обычно через две-три недели от начала заболевания. Поэтому для специфического лечения и экстренной профилактики (при непосредственной угрозе заболевания) создают искусственный пассивный иммунитет путем введения иммунных сывороток или иммуноглобулинов.

По происхождению лечебные сыворотки делятся на гетерологичные (чужеродные) и гомологичные (полученные из крови человека).

Пассивный иммунитет создается быстро, так как введенные антитела немедленно оказывают защитное действие, но продолжается недолго. При введении чужеродных сывороток иммуноглобулины выводятся из организма через 1-2 недели, при введении гомологичных сывороток антитела сохраняются в организме в течение 4-5 недель.

По характеру содержащихся в них антител лечебные сыворотки можно разделить на антитоксические, антибактериальные, противовирусные.

Антитоксические сыворотки получают путем многократной иммунизации (гипериммунизации) лошадей, от которых можно получить достаточно большое количество крови. Иммунизацию проводят сначала анатоксином, затем токсином. Сыворотку крови подвергают очистке от балластных белков методом ферментирования и диализа ("Диаферм").

Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (ME) по способности нейтрализовать определенную дозу токсина. При практическом применении антитоксических сывороток их назначают не в весовых или объемных единицах, а в ME.

Сыворотки вводят внутримышечно, подкожно, иногда внутривенно. Поскольку антитоксические сыворотки являются гетерологичными, введение их производится по Безредка (см. "Аллергия").

Наиболее эффективно раннее применение лечебных сывороток, когда токсин еще не связался с чувствительными клетками.

Антитоксические сыворотки применяются при токсинемических инфекциях. На практике используются сыворотки: противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулиническая, противогангренозная.

Антибактериальные сыворотки получают гипериммунизацией лошадей соответствующими вакцинами. Применение антибактериальных сывороток ограничено ввиду их малой эффективности.

Более широко применяются противовирусные сыворотки.

Иммуноглобулины. Для очистки и концентрации иммунных сывороток используют метод, основанный на разделении белковых фракций сывороток и выделении активных иммуноглобулинов-этиловым спиртом при низкой температуре (метод водно-спиртового осаждения на холоде). Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения получают путем ферментативного гидролиза с химической модификацией, с использованием более мягких, по сравнению с этанолом, осадителей, ионообменной хроматографией.

Исходным материалом для получения гетерологичных иммуноглобулинов служит сыворотка или плазма крови гипериммунизированных животных. Таким образом получены иммуногло-булины: противосибиреязвенный, лептоспирозный, антирабический (против бешенства), против клещевого энцефалита. Преимуществом гетерологичных иммуноглобулинов является возможность получения препарата с более высоким титром антител, недостатком - риск аллергических реакций, в связи с чем эти препараты вводят по Безредка.

Материалом для приготовления гомологичных иммуноглобулинов служит плазма крови человека. Нормальный иммуноглобулин, называемый также противокоревым, получают из крови доноров или плацентарной крови. Поскольку исходным сырьем при промышленном изготовлении иммуноглобулина является плазма большого числа доноров (не менее 5000 человек), препараты содержат широкий набор антибактериальных, антитоксических и противовирусных антител. Нормальный иммуноглобулин используется для экстренной профилактики и лечения кори, коклюша, менингококковой инфекции, полиомиелита, скарлатины, гепатита, а также во всех случаях иммунодефицитных состояний, связанных с недостаточностью антител.

Нормальные иммуноглобулины обладают способностью связывать гистамин (гистаминопексия). Эта способность снижена у больных бронхиальной астмой. На практике применяются препараты -аллерглобулин и гистоглобулин для лечения больных бронхиальной астмой, экземой, нейродермитами.

Нормальный иммуноглобулин для внутримышечного введения представляет собой 10-16% белковый раствор, для внутривенного введения - 5% раствор.

Донорские иммуноглобулины направленного действия получают или путем отбора образцов донорской крови с высоким титром соответствующих антител, или путем предварительной иммунизации доноров. Применяются иммуноглобулины направленного действия для экстренной профилактики и лечения столбняка, клещевого энцефалита, гриппа, стафилококковой инфекции.

В качестве средств для создания пассивного иммунитета возможно применение препарата, полученного из сыворотки молока иммунизированных коров. Например, лактоглобулин, полученный из сыворотки молока коров, иммунизированных дизентерийными палочками, применяется путем, приема внутрь для лечения детей, больных дизентерией.

В будущем возможно применение для создания пассивного иммунитета моноклональных антител, полученных с помощью гибридом из клеток человека. Такие препараты будут максимально специфичны при минимальном риске осложнений.

ЧАСТЬ ВТОРАЯ ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

микроорганизм микроб инфекционный заболевание

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний проводится по следующим направлениям: 1) обнаружение возбудителя заболевания в патологическом материале; 2) обнаружение специфических антител в сыворотке крови больного (серологическая диагностика); 3) выявление у больного повышенной чувствительности к возбудителю с помощью аллергических проб.

Обнаружение и идентификацию возбудителя заболевания проводят, используя микроскопический, микробиологический и биологический методы.

Микроскопический метод используется для обнаружения возбудителя непосредственно в патологическом материале. Может применяться как самостоятельный метод в отношении некоторых микроорганизмов с характерной морфологией. С помощью микроскопического метода можно сделать заключение при обнаружении гонококков в гное, менингококков в спинномозговой жидкости, палочек туберкулеза, а также простейших: плазмодиев малярии, лейшманий, дизентерийной амебы. Микроскопия применяется как обязательный этап исследования при микробиологическом методе.

Микробиологический метод применяется для выделения чистой культуры микробов и их идентификации по ряду признаков: морфологии, способности окрашиваться красителями (тинкториальные свойства), характеру роста на питательных средах (культуральные свойства), ферментации углеводов, белков и других веществ (биохимические свойства) и по антигенной структуре. Для эпидемиологического анализа проводят внутривидовую идентификацию - определение серовара, фа-говара, биовара. С целью назначения рациональной антибиотикоте-рапии определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

Для экспресс-диагностики применяют РИФ со специфическими сыворотками. Метод позволяет выявить возбудителя в исследуемом материале в течение нескольких часов.

В последнее время для идентификации микробов применяют методы, основанные на исследовании состава ДНК. Для этого существует несколько методов.

1) Определение процентного соотношения гуанин + цитозин/ аденин + тимин (Г+Ц/А+Т) (см. главу 4).

2) Определение последовательности нуклеотидов в ДНК микроба. С этой целью путем нагревания вызывают разделение ДНК на две нити, добавляют ДНК-зонд - участок известной ДНК, меченный радиоактивной меткой, или ферментом, или биотином. ДНК-зонд присоединяется к одной из нитей исследуемой ДНК, если он комплементарен, то есть соответствует ей. Присоединение обнаруживается по наличию метки.

3) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет увеличить количество исследуемой ДНК с помощью фермента полимеразы и таким образом обнаружить даже небольшие количества ДНК.

Биологический метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры или в обнаружении токсина и определения его вида и типа.

Серологические методы направлены на выявление специфических антител в сыворотке крови пациента. Для этого используют реакции иммунитета. С целью выявления динамики нарастания титра антител исследуют парные сыворотки, полученные от пациента в начале болезни и через 1-3 недели.

...