Вплив парціального тиску кисню та донора сірководню на проліферацію соматичних клітин людини лінії 4BL

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Вплив парціального тиску кисню та донора сірководню на проліферацію соматичних клітин людини лінії 4BL

Плотнікова Лідія Миколаївна

03.00.13 - фізіологія людини та тварин

Науковий керівник

Березовський Вадим Якимович

доктор медичних наук, професор

Київ - 2015

Зміст

Перелік умовних скорочень

Вступ

Розділ 1. Огляд літератури

1.1 Характеристика стовбурових клітин

1.2 Молекулярні механізми, що індукуються у клітинах при зниженому парціальному тиску кисню

1.3 Вплив зниженого парціального тиску кисню на проліферацію і диференціацію мезенхімальних стовбурових клітин

1.4 Механізми реалізації впливу сірководню на клітини

1.4.1 Роль сірководню в регуляції апоптозу клітин

1.4.2 Роль сірководню у цитопротекції

Розділ 2. Матеріали і методи дослідження

2.1 Умови культивування соматичних клітин людини лінії 4BL

2.2 Оцінка проліферації клітин у культурі

2.3 Визначення концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини

2.4 Визначення активності лужної фосфатази в культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини

2.5 Визначення концентрації вільних амінокислот у культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини

2.6 Методи статистичної обробки результатів

Розділ 3. Результати досліджень

3.1 Морфологічні характеристики культивованих клітин людини лінії 4BL в умовах зниженого парціального тиску кисню та додавання донора сірководню

3.2 Вплив 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на клітини лінії 4BL людини

3.2.1 Проліферація клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню

3.2.2 Зміни активності лужної фосфатази і концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню

3.2.3 Концентрація вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню

3.3 Вплив переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню на клітини лінії 4BL людини

3.3.1 Проліферація клітин лінії 4BL людини, що зазнавали впливу переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню

3.3.2 Зміни активності лужної фосфатази і концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали впливу переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню

3.3.3 Концентрація вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали впливу переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню

3.4 Вплив донора сірководню на клітини лінії 4BL людини

3.4.1 Проліферація клітин лінії 4BL людини культивованих в умовах додавання донора сірководню

3.4.2 Зміни активності лужної фосфатази і концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню

3.4.3 Концентрація вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню

3.5 Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на культуру клітин лінії 4BL людини

3.5.1 Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на проліферацію клітин лінії 4BL людини

3.5.2 Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на активність лужної фосфатази і концентрацію загального білку у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини

3.5.3 Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини

Розділ 4. Обговорення результатів дослідження

Висновки

Список використаних джерел

Перелік умовних скорочень

АК - амінокислота

АТФ - аденозинтрифосфорна кислота

АФК - активні форми кисню

ГМК - гладенькі м'язові клітини

ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота

ДСК - дорослі стовбурові клітини

ЕСК - ембріональні стовбурові клітини

ЛФ - лужна фосфатаза

ММСК - мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини

МСК - мезенхімальні стромальні клітини

CA - стандартна атмосфера

СК - стовбурові клітини

ТНТ - тунельні нанотрубочки

CO - монооксид вуглецю

EPO - еритропоетин

EGF - епідермальний фактор росту

FGF - фактор росту фібробластів

H2S - сірководень

HIF-1 - фактор індукований гіпоксією

HGF - фактор росту гепатоцитів

NaHS - гідросульфід натрію

NF-kB - nuclear factor kB

NO - оксид азоту

Ро2 - парціальний тиск кисню

SAM - S-аденозилметіонін

TGFв - трансформуючий фактор росту в

VEGF - судинний ендотеліальний фактор росту

VHL - білок фон Хіппель-Ліндау

Вступ

парціальний тиск проліферацій соматичний

Актуальність теми. Культури клітин різного походження використовують у фундаментальних дослідженнях, в експериментальній медицині, для розробок і тестування лікарських препаратів, а також для цілей клітинної терапії та регенеративної медицини [105]. На сьогодні одним із найбільш перспективних методів клітинної терапії є застосування аутологічних та алогенних мезенхімальних стовбурових клітин (МСК), отриманих із різних тканин організму [108, 138, 255]. Однак, з віком кількість стовбурових клітин (СК) в організмі знижується. Так, у новонародженого одна СК зустрічається на 10 тисяч, у віці до 20-25 років - 1 на 100 тисяч, до 50 - 1 на 500 тисяч диференційованих клітин [69]. Тому для практичних цілей доводиться СК, виділені з тканин, культивувати in vitro. Останнім часом приділяється багато уваги оптимізації методів культивування стовбурових клітин і масштабування клітинної біомаси для подальшого використання. З цієї точки зору клітинна лінія 4ВL, яка виділена із периферичної крові здорового донора та має властивості МСК, викликає особливий інтерес [31-32, 39]. Пошук оптимальних умов культивування МСК є актуальним напрямком досліджень.

На ростові особливості досліджуваних клітинних популяцій, у першу чергу, впливає мікрооточення: природа субстрату, на якому відбувається ріст культури, міжклітинні взаємодії, фізико-хімічний та фізіологічний склад середовища, склад газової фази, температура інкубації тощо [49, 231]. Для оптимізації умов культивування клітин мезенхімального ряду найчастіше зміни стосуються компонентів ростового середовища (вмісту поживних речовин, факторів росту, солей і амінокислот). Газовий склад традиційно залишається найбільш консервативним параметром культивування, при цьому рівень СО2 наближається до тканинного (Рсо2 = 38 мм рт. ст.), тоді як парціальний тиск кисню (Ро2) в звичайних СО2-інкубаторах відповідає атмосферному тиску 159 мм рт. ст. Проте в організмі концентрація кисню значно менша: в артеріальній крові напруження О2 становить біля 100 мм рт. ст., у венозній крові складає приблизно 35-40 мм рт. ст., а в кісткових тканинах ? від 20 до 35 мм рт. ст. [14, 176]. Культивування клітин in vitro при зниженому Ро2 дозволяє приблизити умови до фізіологічних, тобто до in vivo.

Раніше сірководень (H2S) був відомий лише як токсичний газ. Зараз його відносять до групи газових трансмітерів разом із NO і CO. Встановлено, що H2S ендогенно продукується із L-цистеїну в різних тканинах за допомогою трьох ферментів: цистатіонін-в-синтази, цистатіонін-г-ліази та 3-меркаптопіруватсульфуртрансферази [182, 216, 246]. Серед досліджених газотрансмітерів H2S найменш вивчений, але він є важливою сигнальною молекулою, яка бере участь у реалізації функціональних можливостей клітин. Тому актуально було дослідити вплив донора сірководню на процеси життєдіяльності клітин лінії 4BL людини. Показано, що знижений Ро2 та газовий трансмітер сірководень впливають на проліферацію, життєздатність, диференціювання, а також на морфологічні та імунофенотипічні показники клітин [5, 11, 164, 179, 197, 244]. Проте їх роль з'ясована недостатньо, а результати досліджень неоднозначні. Це може бути пов'язано з вибором культури клітин, а також умовами проведення експерименту, а саме: нормо- або гіпобарією, рівнем парціального тиску кисню, часовим режимом впливу, загальною тривалістю дії штучних газових сумішей, співвідношенням періодів деоксигенації та реоксигенації, кількістю циклів впливу, концентрацією донора сірководню. Все це диктує необхідність додаткових фундаментальних морфофункціональних і біохімічних досліджень для з'ясування впливу зниженого парціального тиску кисню та сірководню на проліферацію клітин лінії 4BL людини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукової тематики відділу клінічної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: «Дослідження реактивності сполучної тканини в умовах моделювання донозологічних форм патології та пошуки шляхів її корекції», № держреєстрації 0108U003915, яка входить до зведеного плану НДР НАН України.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження різних режимів впливу зниженого парціального тиску кисню та донора сірководню, як окремо так і сумісно, на проліферацію соматичних клітин людини лінії 4BL.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Порівняти вплив переривчастого і безперервного режимів подачі газової суміші зі зниженим парціальним тиском кисню на проліферацію, активність лужної фосфатази, концентрацію загального білку та амінокислотний склад культуральної рідини клітин лінії 4BL людини.

2. З'ясувати вплив донора сірководню NаHS (10-8, 10-9, 10-10, 10-12, 10-13, 10-15 моль/л) на проліферацію, активність лужної фосфатази, концентрацію загального білку та амінокислотний склад культуральної рідини клітин лінії 4BL людини.

3. Виявити особливості сумісного впливу зниженого парціального тиску кисню (23, 38 мм рт. ст.) і сірководню (10-12 моль/л NаHS) на проліферацію, активність лужної фосфатази, концентрацію загального білку та амінокислотний склад культуральної рідини клітин лінії 4BL людини.

Об'єкт дослідження - культура соматичних клітин людини лінії 4BL.

Предмет дослідження - проліферація і метаболізм клітин лінії 4BL в умовах зниженого парціального тиску кисню та додавання донора сірководню.

Методи дослідження: фізіологічні, біохімічні, фізико-хімічні (спектрофотометрія, тонкошарова хроматографія), світлова мікроскопія, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі проведено комплексне дослідження впливу різних режимів зниження парціального тиску кисню та донора сірководню NaHS, як окремо так і сумісно, на проліферацію клітин лінії 4BL людини. Вперше досліджено зміни амінокислотного складу культуральної рідини соматичних клітин людини лінії 4BL. Вперше виявлено морфологічні зміни фібробластоподібних клітин лінії 4BL людини при додаванні у живильне середовище донора сірководню NaHS. Вперше встановлені особливості кореляційних взаємовідносин між проліферацією та параметрами впливу - парціальним тиском кисню, концентрацією сірководню та їх сумісної дії.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі експериментальні результати мають як теоретичне, так і практичне значення, оскільки дають змогу доповнити сучасні уявлення про вплив зниженого Ро2 на проліферацію клітин та їхній обмін речовин. В умовах Ро2 76 мм рт. ст. (24 год) концентрація загального білку у культуральній рідині клітин лінії 4BL статистично вірогідно зростала, що може свідчити про інтенсифікацію синтезу компонентів міжклітинної речовини. Встановлено, що інкубування МСК людини лінії 4BL в середовищі з Ро2 38 і 76 мм рт. ст. (по 8 год/добу, 3 доби) активує їхню проліферацію. Такі умови здатні забезпечити отримання більшої кількості клітин за коротший час. Це може бути використано в галузі комбустіології та відновлювальної терапії.

Результати дослідження є внеском у розвиток фундаментальних знань про роль зниженого Ро2 та сірководню на процеси життєдіяльності МСК периферичної крові людини. Важливе практичне значення мають отримані в роботі експериментальні дані про гальмівний вплив H2S на проліферацію клітин (патент на корисну модель №96716). Отримані результати створюють підгрунтя для нових перспективних шляхів, направлених на пригнічення гіперпроліферативних розладів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено пошук і аналіз вітчизняної та зарубіжної наукової літератури за напрямом дисертаційного дослідження. Розробка методичної концепції роботи, головна ідея та задачі досліджень проведені у співпраці з науковим керівником заслуженим діячем науки і техніки України, д.м.н., проф. Березовським В.Я. Проведення експериментальних досліджень, аналіз і узагальнення отриманих результатів, статистична обробка даних, формулювання висновків роботи і підготовка матеріалів до публікацій проводились автором самостійно. Окремі дослідження виконано за участю співавторів публікацій.

Автор висловлює щиру подяку зав. відділу генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, д.б.н., проф. Лукаш Л.Л. за надання культури клітин лінії 4BL людини. Також автор дякує старшому науковому співробітнику відділу загальної фізіології НДІ фізіології ім. акад. Петра Богача ННЦ «Інституту біології», Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, д.б.н. Весельському С.П. за надання можливості провести визначення амінокислотного складу культуральної рідини методом тонкошарової хроматографії.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на: засіданні сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (Київ, 27 листопада, 2014), IV з'їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Ужгород, 17-20 вересня, 2014); VIIІ Міжнародному симпозіумі "Актуальні проблеми біофізичної медицини" (Київ, 14-17 травня, 2014); III Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 24-27 февраля, 2014); VI Науково-практичній конференції «Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм» (Тернопіль, 31 жовтня - 01 листопада, 2013); ІІІ Науковій конференції молодих вчених "Фізіологія: від молекул до організму" (Київ, 24-25 жовтня, 2013); VII Міжнародній конференції молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 20-23 листопада, 2012); II Конференції молодих учених «Фізіологія: від молекул до організму» (Київ, 8-9 жовтня, 2012); ІІ International symposium «Molecular mechanisms of synaptic transmission regulation» in memory of Professor Vladimir Skok (Kiev, 6-9 october 2012); VII Международном симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 17-20 мая, 2012).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 наукових праць, у тому числі 8 статей у фахових наукових журналах, 10 тез доповідей на конгресах, з`їздах, конференціях та отримано 2 патенти на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, викладення результатів дослідження, обговорення результатів, висновків і списку використаних джерел, який включає 256 посилань. Робота викладена на 149 сторінках машинописного тексту, містить 11 таблиць, проілюстрована 38 рисунками.

Розділ 1. Огляд літератури

1.1 Характеристика стовбурових клітин

Стовбурові клітини (СК) мають дві важливі риси, які відрізняють їх від інших типів клітин. По-перше, вони є неспеціалізованими клітинами і здатні до самовідновлення. По-друге, при певних фізіологічних чи експериментальних умовах, вони можуть перетворюватися в спеціалізовані клітини, такі як нейрони, скоротливі клітини серцевого м'язу, еритроцити, чи клітини підшлункової залози, які продукують інсулін [169, 192, 254]. Дослідники переважно працюють з двома типами СК тварини чи людини: ембріональними стовбуровими клітинами (ЕСК), що походять безпосередньо від бластоцисти, та дорослими стовбуровими клітинами (ДСК), що знаходяться у зрілих тканинах. У ембріонах, що розвиваються, СК можуть дифференціюватися в усі спеціалізовані ембріональні тканини. Стовбурові клітини дорослого організму діють як репараційна система для тіла, підтримуючи потрібну кількість спеціалізованих клітин.

Потенціал СК - це можливість їхнього перетворення на диференційовані типи клітин. Тотипотентні СК отримують унаслідок злиття сперматозоїду з яйцеклітиною. Клітини, що утворюються внаслідок декількох перших поділів заплідненої яйцеклітини теж тотипотентні. Вони можуть перетворитися на ембріональні та екстраембріональні (поза-ембріональні) типи клітин. Плюрипотентні СК походять від тотипотентних клітин і можуть утворити клітини трьох зародкових шарів. Мультипотентні СК можуть утворювати лише близькі типи клітин (наприклад, гематопоетичні СК утворюють червоні кров'яні тільця, білі кров'яні тільця, тромбоцити, тощо). Уніпотентні СК можуть перетворитися лише на один тип клітин, але мають здатність до самовідтворення, що відрізняє їх від спеціалізованих клітин [30]. Проаналізувавши велику кількість даних, ми склали таку схему (рис. 1.1.1).



Рис. 1.1.1. Чотири рівня можливості диференціації стовбурових клітин: І - тотипотентність, ІІ - плюрипотентність, ІІІ - мультипотентність, ІV - уніпотентність

Як вже вказувалося вище, що ДСК знаходяться в багатьох тканинах і можуть диференціюватися у спеціалізовані клітини тієї тканини, в якій вони знаходяться. ДСК мають також можливість формувати спеціалізовані клітини інших тканин - цей процес називається трансдиференціація або пластичність. Стромальні клітини кісткового мозку можуть диференціюватися в три основні типи клітин головного мозку (нейрони, олігодендроцити та астроцити) [122]. CК виділені із пульпи зуба теж здатні до нейрогенної диференціації [169]. Червоний кістковий мозок може бути одним із джерел СК [87, 144, 251]. Ми склали схему, проаналізувавши велику кількість даних (рис. 1.1.2).

Мезенхімальні (мезенхімні, або стромальні) стовбурові клітини (МСК) - мультипотентні СК, що знаходяться переважно в кістковому мозку, а також в інших мезенхімальних тканинах. У кістковому мозку ці клітини представлені нечисленною популяцією фібробластоподібних клітин строми кісткового мозку і сприяють збереженню недиференційованого стану гемопоетичних стовбурових клітин. МСК здатні до диференціювання в різні клітини сполучної тканини. Гемопоетичні стовбурові клітини (ГСК) - мультипотентні СК, що дають початок усім клітинам крові (еритроцитам, В-лімфоцитам, Т-лімфоцитам, нейтрофілам, базофілам, еозинофілам, моноцитам, макрофагам і тромбоцитам).

Рис.1.1.2. Послідовність розвитку дефінітивних клітин кісткового мозку

СК в організмі мало, з віком їх стає все менше і менше: у ембріона 1 клітина на 10 тисяч, у дорослої людини 1 клітина на декілька мільйонів (рис. 1.1.3).

Оскільки СК можна культивувати та програмувати на спеціалізацію (наприклад, отримати м'язову чи нервову тканину) завдяки методу клітинних культур, їх стали використовувати для лікування захворювань (це так звана клітинна терапія). Лікувальні технології з використанням СК посідають вагоме місце в терапії широкого ряду онкологічних, гематологічних, неврологічних та кардіологічних захворювань, переходячи з лабораторії у клінічну практику [225, 228]. В останнє десятиліття особливу увагу приділяють МСК. Міжнародне товариство з клітинної терапії домовилося називати ці клітини мультипотентними мезенхімальними стромальних клітинами (ММСК) [74].

Рис. 1.1.3. Співвідношення стовбурових клітин і клітин тіла на різних етапах онтогенезу [69]

У клітинній терапії усе ширше використовуються ММСК, особливо при лікуванні масивних і глибоких опіків [52]. Фібробластоподібні клітини синтезують і секретують білки та глікозаміноглікани, які формують компоненти міжклітинної речовини сполучної тканини, що сприяє загоєнню ран. Ці клітини у культурі зберігають проліферативний потенціал і мультипотентність. Закінчуючи цикл розвитку, фібробласти перетворюються на фіброцити. Цитоплазма фіброцитів збіднюється на органели, клітини набувають плоскої форми, проліферативний потенціал істотно знижується. Проте фіброцити зберігають здатність брати участь у регуляції обмінних процесів у тканині [10, 22-23].

ММСК вперше виявив у стромі кісткового мозку мурчаків, успішно культивував і описав Фріденштейн О.Я. у 70-х рр ХХ ст [71-72, 128-129]. ММСК- це клітини мезодермального походження, які формують сполучну тканину у всьому організмі і дають початок дефінітивним формам - фібробластам, остеобластам, хондроцитам, адипоцитам і ендотеліоцитам [52, 113, 200-201]. Встановлено, що ММСК можуть бути отримані з багатьох тканин дорослого організму: строми кісткового мозку, жирової тканини, пульпи зуба, пуповинної крові та ін. [241]. ММСК, виділені зі строми кісткового мозку ссавців і людини, в певних умовах in vitro і in vivo здатні диференціюватися в різні типи клітин: кардіоміоцити, астроцити, нейрони та ін. [166, 185, 240, 242, 248]. Поверхневими маркерами ММСК кісткового мозку людини є антигени СD44, СD29, СD63, СD105, СD73, СD166, СD10, СD13, СD73, STRO-1, SSEA-1 [51]. Показано, що ММСК синтезують і секретують ростові і трофічні фактори, такі як епідермальний фактор росту (EGF), фактор росту гепатоцитів (HGF), FGF, трансформуючий фактор росту в (TGFв) [88], BDNF, GDNF, NGF [93, 98, 101] і білки екстрацелюлярного матриксу (колаген, фібронектин, ламінін) (Chen et al., 2007). Крім того, вони є імуномодуляторами [79], виробляють антизапальні цитокіни та антиапоптотичні молекули [230]. Сприятливий вплив ММСК на відновлення периферичних нервів було показано в експериментах на різних видах тварин: гризунах [102, 114, 159-160, 180-181], кроликах [106, 232, 237], собаках [116-117] та приматах [150, 233].

У 90-х роках ХХ століття була сформована концепція о «фіброцитах периферичної крові» ? малодиференційованих клітин, отриманих із крові і здатних до розвитку у фібробластичному напрямку. Незважаючи на широке розповсюдження даного терміну, з позиції класичної гістології він є некоректним. Оскільки під фіброцитами розуміють термінальні малоактивні ланки фібробластичної лінії, не здатних до проліферації і диференціювання. У цьому випадку більш раціональним терміном є «фібробластоподібні клітини периферичної крові». Чисельність їх фракції складає біля 0,5-1,0% від загальної кількості ядровмісних клітин крові [104, 77].

Слід зазначити, що міжклітинні взаємодії відіграють важливу роль у фізіологічних функціях культури клітин. Було показано, що при сумісному культивуванні між мультипотентними МСК людини і диференційованими соматичними клітинами (ембріональними кардіоміоцитами, епітеліоцитами нирки) щура утворюються міжклітинні контакти, зокрема щілинні контакти та тунельні нанотрубочки (ТНТ). По цим контактам здійснюється міжклітинне перенесення цитоплазматичних і мембранних компонентів та органел, зокрема мітохондрій. У МСК в умовах сокультивування з соматичними клітинами запускається диференціювання по кардіо- або нефроспецифічному шляху. Цей процес значною мірою залежить від наявності специфічних контактів між клітинами. Мультипотентні МСК в умовах монокультури також утворювали ТНТ. Причому, якщо порівнювати кількість ТНТ-утворюючих клітин у монокультурах МСК і кардіоміоцитів, вона буде приблизно однаковою; тоді як у монокультурі нирки таких клітин мало. Отримані дані підтвердили утворення міжклітинних контактів по типу ТНТ (0,1 мкм в діаметрі) поряд з іншими типами цитоплазматичних тяжів (~ 3 мкм), що з'єднують клітини при сумісному культивуванні [202].

Морфогенетичні взаємодії клітин в організмі значною мірою відтворюються на культурах клітин різних типів, зокрема, епітеліоцитах і фібробластах. Культивовані клітини взаємодіють між собою за допомогою рецепторів і лігандів, які активують внутрішньоклітинні сигнальні системи. Роль лігандів грають три групи компонентів мікросередовища ? рідке середовище, позаклітинний матрикс і міжклітинні контакти. До лігандів рідкого середовища відносяться гормони, фактори росту, фактори апоптозу та інші молекули. Прикріплюючись до матриксу, клітина розпластується, її форма зі сферичної перетворюється на пласку. Зустріч двох фібробластів або двох епітеліоцитів призводить до місцевого інгібування псевдоподіальної активності ? так званому «контактному паралічу». Клітини того самого типу в тканині взаємодіють одина з одною і погоджують швидкість розмноження, щоб підтримувати належну щільність популяції. «Суспільний» контроль такого роду чітко проявляється при реакціях на пошкодження. Наприклад, коли ушкоджено епітелій, клітини по краях рани стимулюються до поділу й переміщуються на оголену поверхню доти, поки вона знову не буде закрита. На цьому етапі відбувається контактне гальмування проліферації й рух клітин припиняється. Подібне явище можна спостерігати на дисоційованих клітинах у культурі. Епітеліальні клітини або фібробласти, засіяні у чашку Петрі, будуть адгезуватися до поверхні, розпластуватися й ділитися доти, поки не утвориться суцільний моношар, у якому сусідні клітини налагоджують тісні взаємозв'язки [59]. Cлід зауважити, що вирощені in vitro клітини у моношарі поводяться і спілкуються одина з одною не зовсім так, як in vivo, тобто в умовах багатоклітинного організму. Однак, вивчати поведінку клітин у монокультурі набагато легше і зручніше, ніж у фізіологічних умовах живого організму. Проте, екстраполяція отриманих результатів до умов цілісного організму ? це питання окреме, і в багатьох випадках потребує додаткових досліджень.

1.2 Молекулярні механізми, що індукуються у клітинах при зниженому парціальному тиску кисню

Безперервне забезпечення організму киснем є абсолютною умовою існування людини і вищих тварин. Молекулярний кисень необхідний для виробництва енергії, нормального росту і функціонування клітин. У той же час, надлишок кисню у формі вільних радикалів є згубним. Тому організм підтримує концентрацію кисню у вузьких фізіологічних межах. У сучасних дослідженнях культивування клітин зазвичай здійснюють в умовах стандартної атмосфери (СА) при вмісті кисню 21% О2 з додаванням 5% СО2. Проте в організмі концентрація кисню значно менша: в артеріальній крові концентрація О2 становить біля 12,5%, у венозній крові складає приблизно 5%, а в щільних тканинах ? ще менше [49].

Гіпоксія ? це патологічний стан, при якому в тканини потрапляє недостатня кількість кисню, або клітини тканин не здатні його утилізувати. Гіпоксія виникає при багатьох захворюваннях серцево-судинної і дихальної систем, хворобах системи крові, зниженні вмісту кисню у вдихуваному повітрі і т.д. У свою чергу, патологічна гіпоксія вкрай негативно відбивається на стані клітин і тканин організму: порушується утворення енергії і біологічно активних речовин у клітинах, порушується діяльність центральної нервової, вегетативної та ендокринної систем, шлунково-кишкового тракту і т.д. [44].

Провідним транскрипційним регулятором генів ссавців, відповідальних за реакцію на нестачу кисню вважається фактор індукований гіпоксією (HIF). Цей транскрипційний фактор уперше був ідентифікований Грегом Семензой із співробітниками з університету Джона Хопкінса в Балтіморі у 1992 році як регулятор експресії еритропоетину (EPO) при злоякісному рості [213].

Комплекс HIF є гетеродимером, що складається з однієї б-субодиниці (HIF-б) і однієї в-субодиниці (HIF-в). HIF-б існує у вигляді багатьох ізоформ (HIF-1б, HIF-2б і HIF-3б) з різними біологічними властивостями. Субодиниця HIF-1в експресується конститутивно, а експресія HIF-1б при нормоксіі є дуже низькою [1, 199].

При нормальній концентрації кисню відбувається гідроксилювання амінокислотних залишків проліну вільно існуючої молекули HIF-1б в результаті активності особливого регуляторного ферменту пролілгідроксилази, який є молекулярним сенсором кисню [7]. Проаналізувавши велику кількість даних, ми склали таку схему (рис. 1.2.1).

Змінена таким чином субодиниця HIF-1б набуває здатність зв'язуватися з білком фон Хіппель-Ліндау (білок VHL ? пухлинний супресор; з мутаціями гена, що кодує цей білок, пов'язаний спадковий синдром von Hippel Lindau, для якого характерні множинні гемангіоми, а також ниркова карцинома, рак підшлункової залози, ангіома сітківки ока). Білок VHL, у свою чергу, утворює комплекс із низкою інших білків, що відносяться до класу E3-убіквітин-лігази. Активовані убіквітин-лігази утворюють ковалентний зв'язок із деякими іншими білками, будучи для останніх своєрідною «чорною міткою», яка означає, що отримав таку мітку «убіквітинізований» білок незабаром має бути направлений в протеосому і там зруйнований. Таким чином, зв'язування білка VHL з гідроксильованим проліном HIF-1б призводить до убіквітинізаціі цього білка і подальшої його протеосомной деградації [58, 81, 94, 211-212].

Рис. 1.2.1. Основні напрямки регуляторного впливу HIF-1 за умов зниженого парціального тиску кисню

HIF-2б так само, як і HIF-1б, піддається VHL-залежної деструкції протеазами. Обидва ці білка необхідні для нормальної біологічної відповіді ссавців на гіпоксію, оскільки показано, що гомозиготна інактивація хоча б одного з них у мишачого ембріона веде до летальності. В даний час вважається, що HIF-2б більш специфічний для ендотелію, але його експресія також визначена і в інших видах клітин. HIF-3б експресується при гіпоксії в більш специфічних тканинах, таких, наприклад, як рогівка ока [147, 213-214].

При гіпоксії активність пролілгідроксилази зменшується, тому що кисень є лімітуючим чинником її активності. Білкова молекула HIF-1б не гідроксилюється і залишається стабільною, уникнувши убіквітин-залежного протеолізу [187]. Субодиниці HIF-1б і HIF-1в об'єднуються, і утворений у результаті цього гетеродимерний білок HIF-1 направляється з цитоплазми в ядро, де зв'язується з особливими послідовностями ДНК в промоторних областях генів, експресія яких індукується гіпоксією [1, 221].

У даний час ідентифіковано більше 100 HIF-активуючих генів [107], продукти яких беруть участь у еритропоезі і обміні заліза [110, 186] ? еритропоетин, трансферин, трансфериновий рецептор, церулоплазмін; в ангіогенезі [141-142, 249] ? трансформуючий фактор росту в3 (TGF-в3), судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF), EG-VEGF, ММР-2, катепсини D; в регуляції судинного тонусу ? нітрооксидсинтаза-2 (iNOS), ендотелін-1, адреномедуллін, б1в-адренорецептор; в регуляції метаболізму глюкози [43, 149, 183, 234] ? транспортери 1 і 3 глюкози (GLUT1, GLUT3), гексокінази I і II, фосфоглюкоізомерази, глицеральдегідфосфатдегідрогенази, фосфогліцераткінази, енолази, піруваткінази, лактатдегідрогенази, активуючи анаеробне дихання; в регуляції клітинної проліферації та виживання [199, 211-214] ? IGF2, TGF-б, адреномедуллін; в регуляції апоптозу [44, 149] ? протеїни BNip3, Nix. Виявлено, що в умовах гіпоксії транскрипційні фактор HIF-1 бере участь не тільки в активації експресії генів, відповідальних за гліколіз, але і в гальмуванні мітохондріального біогенезу [43, 40].

Несподіване відкриття зробили вчені з Університету ім. Джона Хопкінса (Балтімор, США). У статті, опублікованій в журналі Cell Metabolism, вчені представили нові дані про функції транскрипційного фактора HIF-1 [153]. Раніше вважалося, що цей фактор бере участь тільки в запуску гліколізу в тому випадку, якщо клітина знаходиться в умовах гіпоксії. Як стало зрозуміло із серії експериментів на мишах, HIF-1 одночасно з активацією гліколізу, пригнічує цикл трикарбонових кислот у мітохондріях, за допомогою транс-активації гена PDK1 (ген кінази-1 піруватдегідрогенази), тим самим зменшуючи утворення ацетил-СоА з пірувату. Накопичення метаболітів циклу Кребса (пірувату, оксалоацетата, сукцинату і фумарату) призводить до гальмування активності пролілгідроксилази і тим самим сприяє подальшій активації HIF-1 [153]. Крім того, HIF-1 стимулює експресію гена, що кодує синтез лактатдегідрогенази. Це призводить до зниження утилізації пірувату мітохондріями і до зниження дихання [214]. HIF-1 може змінювати активність цитохром с-оксидази, збільшуючи при гіпоксії експресію тої її субодиниці, яка оптимізує активність ферменту при нестачі кисню, і сприяє деградації іншої субодиниці, яка функціонує в аеробних умовах [127].

Пригнічення мітохондріального біогенезу має важливе значення в умовах гіпоксії ? за рахунок цього клітина уникає накопичення шкідливих радикалів і, відповідно, апоптозу. Гліколіз, у свою чергу, здатний підтримати рівень АТФ, необхідний для життєдіяльності [20, 41].

Дані, отримані останнім часом, свідчать про те, що HIF-1б може індукуватися не тільки при безпосередньому впливі гіпоксії, а й іншими факторами (гормонами, білками теплового шоку, факторами росту, онкогенами). Передбачається, що активаторами HIF-1 можуть бути СоСl2 і речовини, що утворюють хелатні сполуки з іонами заліза [1, 94].

Індукторами активації різних факторів транскрипції виступають активні форми кисню (АФК), в той час, як антиоксиданти блокують активацію NF-kB, AP-1, HIF-1 та інших факторів транскрипції. Тому при активації АФК-опосередкованого окиснення відбувається індукція факторів транскрипції, що в свою чергу призводить до синтезу протекторних білків, серед яких найбільш важливими є репаративні білки, що сприяють відновленню структури та функції білків і нуклеїнових кислот, серед яких ферменти антиоксидантного захисту займають істотне місце. У той же час у міру підвищення в результаті цих процесів вмісту антиоксидантів, відбувається інгібування факторів транскрипції і, отже, синтез захисних білків припиняється [75, 58, 212].

HIF-1 індукує експресію багатьох ангіогенних факторів і насамперед основного регулятора ангіогенезу ? фактора росту ендотелію судин (VEGF) і його рецепторів. VEGF вибірково стимулює проліферацію та міграцію ендотеліальних клітин, їх попередників і моноцитів, що експресують рецептори до нього. Збільшує проникність судин, сприяючи проходженню білків плазми в близькосудинний простір, який необхідний для міграції ендотеліальних клітин. VEGF індукує експресію ендотеліальної NO-синтази та утворенню NO. Оксид азоту сприяє вазодилатації і стимулює експресію протеаз, які руйнують зв'язки між ендотеліальними клітинами і позаклітинним матриксом, що необхідно для спрямованої міграції клітин [110, 137, 141].

Найбільш відомим геном, експресія якого регулюється гіпоксією, є ген еритропоетину. Фішер із співавторами показали підвищення рівня еритропоетину з 5,7 до 5786,6 мОД/мл у сироватці мавп, які перебували 18 годин у барокамері при 0,42 атм [121]. У ряді дослідів було показано, що гем білка служить кисневим сенсором при регулюванні продукції еритропоетину у відповідь на дію гіпоксії [161]. Оскільки продукція еритропоетину не стимулюється ціанідами або іншими інгібіторами дихального ланцюга, цей гемовий білок повинен бути чутливим тільки до гіпоксії [130]. Клітини, що опиняються в умовах нестачі кисню, з одного боку, через активацію шляхів ангіогенезу і гліколізу можуть адаптуватися і вижити, а з іншого ? гинуть через механізм апоптозу [7].

У період еволюції аеробні організми виробили клітинну систему для відповіді на зміни концентрації кисню у позаклітинному середовищі, оскільки О2 є кінцевим акцептором електронів у мітохондріальному дихальному ланцюзі для продукції енергії в процесі окисного фосфорилювання. Дослідження функціонально-метаболічних внутрішньоклітинних реакцій адаптації до гіпоксії є фундаментальним аспектом фізіології.

1.3 Вплив зниженого парціального тиску кисню на проліферацію і диференціацію мезенхімальних стовбурових клітин

Мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини в культурі здатні до активної проліферації і диференціювання у різні типи клітин мезодермального ряду у відповідь на дію відповідних стимулів. Склад газового середовища виконує важливу роль у реалізації функціональних можливостей клітин. Жамбалова із співробітниками [21] досліджували диференціювальний потенціал ММСК кісткового мозку людини і експресію транскрипційного фактора, індукованого при гіпоксії (Hypoxia Inducible Factor ? HIF-1б), при культивуванні в умовах зниженого вмісту кисню (1 і 5% О2). При індукції клітин у нормоксичних (21% О2) умовах і при зниженому вмісті кисню виявлена різна ступінь здатності МСК до диференціювання в остеогенному, адипогенному і ендотеліальному напрямках. У середовищі з 5% О2 спостерігали незначне зниження здатності МСК до мінералізації позаклітинного матриксу і накопиченню ліпідних крапель у порівнянні з контролем (21% О2). В умовах 1% О2 МСК практично повністю втратили здатність до мінералізації матриксу і не могли диференціюватися в адипоцитарному напрямку. Не виключено, що ці процеси можуть регулюватися за рахунок активації індукованого гіпоксією транскрипційного фактору HIF-1б, який модулює роботу багатьох генів, активуючих синтез ростових факторів, гліколітичних ферментів, проапоптотичних білків. Методом проточної цитометрії виявлено, що рівень HIF-1б в цитоплазмі моношарових культур МСК, інкубованих при 1 і 5% вмісті кисню протягом 24 год і 7 діб, знижується в порівнянні з нормоксичним контролем (21% О2) [21].

Досліджено вплив зниженого вмісту кисню в середовищі культивування на проліферативну активність, життєздатність і імунофенотип мезенхімних стромальних клітин із ліпоаспірата людини (лМСК) [13]. Показано, що проліферативна активність клітин в умовах гіпоксії (5% О2) була в середньому в 2,9 рази вищою в порівнянні з культивуванням у стандартних умовах (20% О2). Зменшення вмісту кисню в середовищі культивування не змінювало життєздатність і імунофенотип лМСК. Таким чином, постійне культивування лМСК в середовищі зі зниженим вмістом кисню може виявитися корисним підходом для отримання більшої кількості клітин з незміненими властивостями за менший час, що може бути затребуване в області регенеративної і відновлювальної терапії [13].

У відділі генних технологій Інституту генетичної та регенеративної медицини НАМН України проводяться дослідження з розробки технології культивування МСК пуповинного канатика при знижених концентраціях кисню. Співробітниками відділу генних технологій було сконструйовано обладнання, що дозволяє створювати газові суміші з різним відсотком кисню для культивування МСК. Були проведені дослідження з культивування клітин в атмосфері з 2% кисню протягом 3 пасажів. Показано, що такі умови підвищують інтенсивність проліферації МСК. Клітини в умовах 2% О2 у порівнянні з такими, що культивувались за атмосферної концентрації кисню, мали відмінності у морфології: були дрібнішого розміру та частіше зберігали веретеноподібну форму. Характер формування моношару для культур з різним відсотковим вмістом кисню відрізнявся: при 2% О2 клітини розміщувались менш щільно, не прилягаючи одна до одної [75].

Досліджено вплив зниженого парціального тиску кисню (10% О2) на активність стромальних клітин-попередників кісткового мозку людини. Матеріалом для дослідження був кістковий мозок 13 голівок стегнових кісток, видалених під час операції ендопротезування кульшового суглоба у пацієнтів віком від 37 до 55 років. Показано, що за умов 10% О2 колонієутворююча активність стромальних клітин-попередників кісткового мозку людини збільшилася від 1,4 до 9,3 раза через 14 діб культивування. Аналіз досліджень дозволяє вважати, що знижений парціальний тиск кисню посилює проліферативну активність клітин і збільшує їх потенціал структуроутворення [5].

Панюхін Н.В. із колегами [49] вивчали вплив парціального тиску кисню в атмосфері, яке оточує культуральне середовище, на життєздатність, проліферацію і диференціювання МСК із кісткового мозку миші. Показано, що у присутності 3% кисню підвищується виживання клітин при рідкій посадці, зростає швидкість їх росту і тривалість проліферації. Вплив концентрації кисню на проліферацію проявлявся вже через декілька днів культивування. Дослідження колонієутворення МСК при різних рівнях кисню показало, що навіть преінкубація в умовах 21% кисню негативно впливає на подальший ріст клітин при 3% кисню. Культивування МСК мінімум за 9 днів до досліду при 3% кисню сприяє проліферації у присутності 21% кисню. При цьому не варто однозначно говорити про негативний вплив атмосферного кисню. Виявилось, що знижений парціальний тиск кисню гальмує остеогенне диференціювання МСК, але не спостерігалось вірогідного впливу вмісту кисню на адипогенне диференціювання. Таким чином, концентрація кисню у середовищі інкубування здатна впливати не тільки на їх проліферацію, але і на ефективність диференціювання клітин [49].

Дослідження, проведені на культурі клітин - остеоцитів, показали, що темпи клітинного росту в умовах помірно зниженого Ро2 істотно підвищуються. Проліферація остеоцитів склепіння черепа ембріонів щурів, інкубованих у середовищі, що містить 10% О2, була більш високою, ніж при 90% кисню [118]. Хрящоутворення, простежене на періостальному експлантаті проксимальної ділянки великої гомілкової кістки 2-місячних кролів у середовищах інкубації з різним вмістом кисню (від 1 до 90%), було максимальним при 12-15% О2 [196]. В експериментах по клонуванню стромальних клітин кісткового мозку людини у трьох умовах газового середовища (5, 10 і 21% кисню) показано, що максимальна регенерація клітин відбувається при 10% О2 [229]. Проліферація та диференціація клітин остеобластної лінії людини прискорювалась навіть в умовах гіпоксичного середовища з 5% кисню [5]. За результатами дослідів, проведених із 7- і 13-добовими культурами клітин остеокластів, помірна гіпоксія сприяла прогресивному збільшенню формувння остеокластів і зон резорбції. Максимальні ефекти спостерігали у разі 2% вмісту кисню у штучній газовій суміші. Формування остеокластів суттєво активувалося навіть у різко гіпоксичних (14-15 мм рт. ст.) умовах. У 3-добових культурах клітин гіпоксія такого рівня не змінювала резорбтивної діяльності остеокластів, але зменшувала час їх виживання. Автори дослідження припускають, що аналогічні процеси відбуваються й у цілістній кістці [82]. Використання штучних газових сумішей зі зниженим Ро2 може бути одним із можливих шляхів компенсації негативного впливу гіпокінезії на кісткову тканину [8-9].

Дані літератури дають підстави припустити, що основний механізм стимулюючої дії зниженого Ро2 реалізується через активацію киснечутливих сигнальних сполук. Відомо, що більшість клітин ссавців відповідають на зниження Ро2 активацією експресії генів і синтезом білків de novo. Встановлені редокс-сенситивні фактори, найвідомішим з яких є білок-активатор-1 (АР-1) та фактор індукований гіпоксією (HIF-1) [54-55, 203, 207].

Проведені дослідження по вивченню колонієутворення і диференціювання культур мезенхімальних стромальних клітин, отриманих із матеріалу окістя, з губчастої кістки і з периодонтальної зв'язки людини в залежності від парціального тиску кисню. Показано, що в усіх випадках колонієутворення в умовах зниженого Ро2 23 мм рт. ст. йде більш ефективно, ніж в умовах атмосферного кисню (159 мм рт. ст.). З трьох варіантів мезенхімальних стромальних клітин, колонії найбільшого розміру давали клітини окістя. Остеогенне диференціювання клітин, навпаки, йшло більш інтенсивно в умовах атмосферного кисню. Інтенсивність остеогенної диференціації спостерігали в монокультурі на пластику і в тривимірній культурі на колагенових краплях. Показано, що ефект зниження парціального тиску кисню на колонієутворення частково обумовлений зміною редокс-потенціалу середовища культивування. В умовах зниженої кількості кисню редокс-потенціал середовища знижується приблизно на 20 мВ і його штучна корекція дозволяє збільшити ефективність колонієутворення в умовах атмосферного кисню [14].

Риловою та співавт. [55] показано, що постійне (протягом 4-х пасажів) культивування ММСК жирової тканини людини в умовах 5% О2 знижувало гетерогенність популяції і збільшувало в ній частку веретеноподібних клітин. Було відзначено, що в ММСК при 5% О2 рівень експресії генів TUBB3, SVIL і ANK2, продукти яких (в-тубулін, супервіллін, анкерин) беруть участь у примембранній перебудові та стабілізації цитоскелету був вищим. Рівень експресії генів TPM2, ACTN1, CNN3, CDC42EP3, CDC42EP1, TAGLN, SGCG, продукти яких (тропоміозин, актинін, кальпонін, ефекторні білки Rho-ГТФази, трансгелін і саркоглікан-г) беруть участь у формуванні адгезивних контактів, взаємодії з позаклітинним матриксом і формуванні псевдоподій, був нижче, ніж в стандартних умовах культивування (21% О2). Автори припускають, що наближення концентрації кисню в середовищі до тканинного рівня забезпечує зниження ступеня окислювального стресу та збільшення гомогенності культур ММСК в умовах 5% О2 [55].

Відомо, що лужна фосфатаза (ЛФ) є ферментом, який присутній майже у всіх тканинах організму, особливо високий вміст в кістках, печінці, плаценті, кишечнику та нирках. Як збільшення, так зменшення ЛФ має вагоме клінічне значення. Збільшення активністі ЛФ головним чином зустрічається при захворюваннях кісток (хворобі Педжета, остеомаляціі, рахіті), або захворюваннях печінки (холециститі, гепатиті, саркоїдозі, гепатотоксичних випадкаї, механічній жовтяниці), метастазуванні в кістках та печінці [194, 195].

Клітини потребують постійного надходження молекулярного кисню для метаболічних процесів, що включають оксидативне фосфорилювання, в якому О2 є кінцевим акцептором вільних електронів у процесі утворення АТФ. У дослідженнях in vitro на мезенхімальних стромальних клітинах із жирової тканини людини Рилова і співавт. [54] показали, що зменшення концентрації кисню (5% О2) знижує споживання клітинами глюкози, збільшує молярне співвідношення лaктату/глюкози та зменшує трансмембранний потенціал мітохондрій. Це супроводжується підвищенням експресії генів, що кодують усі ферменти гліколітичного шляху катаболізму глюкози. Водночас активується клоногенний потенціал та проліферація МСК [54].

У клітинах постійно підтримується певний стаціонарний рівень амінокислот - фонд (пул) вільних АК. Цей фонд оновлюється за рахунок надходження АК і використовується для синтезу біологічно важливих хімічних компонентів клітини. Тобто можна виділити шляхи надходження та використання клітинного пулу АК.

Шляхи надходження вільних АК, що утворюють амінокислотний фонд у клітині при культивуванні in vitro: 1) Транспорт АК із поживного середовища, у нашому випадку це DMEM. Враховуючи, що культивування МСК відбувалось без зміни живильного середовища протягом 4 діб запаси поживних речовин поступово виснажувались і накопичувались метаболіти. 2) Синтез замінних АК - у клітині з проміжних продуктів окислення глюкози і циклу лимонної кислоти можуть синтезуватися АК. До них відносять: гліцин, серин, аланін, аспарагінову кислоту, аспарагін, глутамінову кислоту, глутамін, пролін. Серин синтезується з проміжного продукту гліколізу 3-фосфогліцерата, а аміногрупу отримує від глутамінової кислоти. Гліцин - також замінна амінокислота, основним джерелом якої служить серин. 3) Внутрішньоклітинний гідроліз білків (каталізують лізосомальні протеази) [224].

Шляхи використання амінокислотного фонду: 1) Синтез білків і пептидів - це основний шлях споживання АК (75-80% АК клітини йде на їх синтез). 2) Синтез небілкових азотовмісних сполук (пуринових і піримідинових нуклеотидів, холіну, креатину, деяких вітамінів тощо). 3) Синтез глюкози з використанням вуглецевих скелетів глікогенних АК (глюконеогенез). 4) Синтез ліпідів з використанням ацетильних залишків вуглецевих скелетів кетогенних АК. 5) Окислення до кінцевих продуктів обміну (СО2, Н2О, NH3) - це один із шляхів забезпечення клітини енергією (до 10% загальних енергетичних потреб). Усі амінокислоти, які не використовуються в синтезі білків та інших фізіологічно важливих сполук, піддаються розщепленню [210, 224].

Для МСК лінії 4BL, виділених із периферичної крові людини, дослідження впливу зниженого парціального тиску кисню на інтенсивність проліферації і диференціації до цього часу не проводились.

1.4 Механізми реалізації впливу сірководню на клітини

Регуляція фізіологічних функцій організму передбачає два основні шляхи реалізації сигнальних впливів ? гуморальний і нейрогенний. В останні роки як вітчизняні, так і зарубіжні дослідники приділяють велику увагу третьому шляху ? газовим трансмітерам. До них відносять оксид азоту (NO), монооксид вуглецю (СО) і сульфід водню (H2S) [2, 48, 235-236]. Серед досліджених газотрансмітерів H2S найменш вивчений [95]. Варто нагадати, що усі гази, у тому числі і газові трансмітери є низькомолекулярними речовинами, які мають досить важливі для біологічних процесів фізичні характеристики ? високу швидкість дифузії, різну розчинність у воді при різних температурах і парціальному тиску (табл. 1.4.1).

Таблиця 1.4.1

Розчинність біологічно активних газів у воді (у порядку зниження їх розчинності)

Речовина	Розчинність, мл розчиненої речовини на 100 г Н2О
	0єС	20єС	40єС
H2S	467	258	166
N2O	130	105	88
СО2	171	88	53
NO	7,4	4,7	3,5
O2	4,9	3,1	2,3
CO	3,5	2,3	1,8
N2	2,4	1,5	1,2

Примітка: стандартно атмосферний тиск дорівнює 760 мм рт. ст., жирним шрифтом виділено газотрансмітери.

У порівнянні з іншими газовими трансмітерами H2S має більш високу розчинність у воді і має високу ліпофільність, тому легко проникає через плазматичну мембрану клітини. Переміщається в цитоплазмі за рахунок дифузії і циклозіса, взаємодіє безпосередньо з внутрішньоклітинними ферментами [46]. Сірководень зв'язується з залізом в гемі цитохром с-оксидази, яка при цьому втрачає активність. В результаті ? зупиняється окисне фосфорилювання в мітохондріях і порушується клітинне дихання.

Сірководень продукується ендогенно в різних тканинах тварин і людини за допомогою трьох ферментів: цистатіонін-в-синтази та цистатіонін-г-ліази, що відповідають за метаболізм L-цистеїну, а також 3-меркаптопіруватсульфуртрансферази [216]. У різних органах і тканинах фізіологічні концентрації сірководню варіюють і становлять від 1 до 100 нмоль/г тканини. У плазмі крові щурів фізіологічна концентрація сірководню становить 46 мкМ, а в тканинах мозку 50-100 мкМ [206]. Цистатіонін-в-синтаза в основному діє в центральній нервовій системі, а цистатіонін-г-ліаза ? у клітинах гладкої мускулатури судинної стінки і в кардіоміоцитах. У печінці і в нирках працюють обидва фермента [53]. Один з основних механізмів дії газотрансмітерів ? модифікація білків. NO модифікує сульфгідрильні групи, СО ? залишки гістидину, а H2S відновлює дисульфідні зв'язки [57, 62, 190].

Як й інші газоподібні сигнальні молекули (NO і CO), сірководень в межах фізіологічних концентрацій релаксує гладенькі м'язи кровоносних судин, шлунково-кишкового тракту, репродуктивної і дихальної систем [127, 252-253]. Судинорозширювальну властивість сірководню виявив канадський дослідник Ван Жуй [53]. Він працював з лабораторними щурами, яким вводив у вену розчин гідросульфіду натрію (NaHS) в межах фізіологічних концентрацій. Крім того, він проводив дослідження і на ізольованих артеріях щурів. У результаті введення NaHS судини розширювалися, а артеріальний тиск різко знижувався. Частота серцевих скорочень при цьому не змінювалася. Ван Жуй, блокуючи частину генома вивів лінію генетично-модифікованих мишей, позбавлених гена цистатіонін-г-ліази. Усі мутантні миші, як гомозиготні, так і гетерозиготні, були цілком життєздатні, плідні і зовні не відрізнялись від тварин вихідного типу. Однак вміст сірководню в крові, серцевому м'язі і стінці аорти у гомозигот становив всього 20% від нормального рівня, а у гетерозигот ? 50%. Рівень H2S у сироватці крові також був нижче норми. Разом із тим відсутність гена цистатіонін-г-ліази не вплинула на рівень сірководню в тканинах мозку, де його синтез забезпечує цистатіонін-в-синтаза. З віком у мутантних мишей розвивалася гіпертонія. У дванадцятитижневих гомозиготних тварин тиск перевищував норму на 18 мм. рт. ст., тобто приблизно на 15%. Ін'єкція NaHS на деякий час знижувала кров'яний тиск, причому у мутантів сильніше, ніж у тварин вихідного типу. Мабуть у мутантних мишей знижується поріг чутливості до впливу сірководню [53, 246].

...