Вплив парціального тиску кисню та донора сірководню на проліферацію соматичних клітин людини лінії 4BL

Відомо, що функції газотрансмітерів односпрямовані, але мішені і механізми їх дії відрізняються. NO і СО активно проникають у гладеньку мускулатуру кровоносних судин і активують фермент гуанілілциклазу. Це веде до утворення циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ), який запускає ланцюг реакцій, що приводить до розширення судин [28]. Сірководень гіперполяризує мембрану, що забезпечується активністю КАТФ-каналів [56, 68, 85]. При введенні блокаторів АТФ-чутливих калієвих каналів вазодилятація пригнічувалась [103, 253]. Селективний інгібітор КАТФ-каналів ? глібенкламід ? зменшує холінергічну гіперполяризацію гладеньких м'язових клітин (ГМК) брижових артерій приблизно на 70%, але не впливає на вазодилятаторну дію донорів оксиду азоту [190]. У серцево-судинній системі сірководень пригнічує проліферацію ГМК, модулюючи МАР-кіназний сигнальний шлях [175]. Cірководень може викликати і скорочення сегментів аорти щура через зміну внутрішньоклітинної концентрації циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) або активацію Cl/НСО3 обмінника й ацидифікацію цитоплазми ГМК [167].

Вазоактивні ефекти H2S мають істотне значення для підтримки рівня артеріального тиску. Гідросульфід натрію можна розглядати, як дійсне джерело газотрансмітера, а низький рівень ендогенного H2S у крові, як патогенетичний фактор розвитку гіпертонічної хвороби, ішемічно-реперфузійних ураженнях життєво важливих органів [6, 235].

H2S впливає на судинний тонус усіх класів хребетних тварин (риб, амфібій, рептилій) і включає як вазоконстрикцію, так і вазодилятацію, що вказує на філогенетичну давнину H2S як газомедіатора і універсальність його дії [62, 162-164, 205].

Встановлено, що гліальні клітини головного мозку також мають здатність синтезувати сірководень. Він бере участь у регуляції кислотно-лужного гомеостазису нервової тканини. На відміну від нейронів, що передають сигнали шляхом генерації потенціалів дії, гліальні клітини «спілкуються» одна з іншою і нейронами шляхом регуляції кальцієвих потоків в мозку. Показано, що H2S суттєво впливає на концентрацію іонів кальцію, генеруючи так звані «кальцієві» хвилі в астроцитах і нейронах [16, 133].

Показано також, що сірководень сприяв проліферації і диференціації нейрональних стовбурових клітин гіпокампа миші C57BL/6 після гіпоксії. Тварини (вік ? 1 день) зазнавали впливу гіпоксичної газової суміші (5% кисню в азоті) протягом 2-ох годин. Внутрішньоочеревинно вводили NaHS (56 мкмоль/кг/день) протягом 30 днів. Результати дослідження показали збільшення кількості проліферативних клітин у зубчастій звивині гіпокампу мишей після 2-годинного дихання газовою сумішшю з парціальним тиском кисню 38 мм рт. ст. [178].

До захисних ефектів, які спостерігаються при дії сірководню на мітохондрії, можуть бути частково залучені мітохондріальні АТФ-залежні К+-канали [65-66]. Встановлено концентраційну залежність впливу NаHS на набрякання мітохондрій, ізольованих із тканини серця щурів. Низькі концентрації (10-12-10-8 моль/л) збільшували набрякання органел, а фізіологічні (10-6-5*10-5 моль/л) - здійснювали протекторний ефект щодо кальційіндукованого набрякання мітохондрій серця щурів [65].

Важливо також зазначити, що мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку синтезують H2S з метою регулювання їх самооновлення і остеогенної диференціації. Дефіцит H2S призводив до дефектів кісткової тканини (остеопороз) миші [179]. Крім того було показано, що сірководень (0,1 нг/мл H2S, 9 днів) стимулював диференціацію МСК кісткового мозку людини і МСК пульпи зуба у гепатоцитарному напрямку. Накопичення глікогену і синтез сечовини автори вважали маркерними показниками перетворення МСК у гепатоцити [197]. Інші дослідження виявили зниження проліферації фібробластів серця людини на 33-58% через гальмування активності К+-каналів при концентрації NaHS 100-500 µM. Також, виявлено зменшення їх диференціювання у бік міофібробластів [215].

Сірководень спричиняє цілий ряд ефектів, включаючи вазодилятацію, кардіопротекцію, регуляцію проліферації та апоптозу, ангіогенез, тому роль H2S на процеси життєдіяльності клітин потрібно розглянути більш детально.

1.4.1 Роль сірководню в регуляції апоптозу клітин

Для підтримки тривалої працездатності будь-якого органу абсолютно необхідне його постійне ремоделювання - заміна клітин на нові. Апоптоз варто розглядати як елемент фізіологічної підтримки клітинного гомеостазису. Він усуває старі або функціонально неповноцінні клітини. Порушення реалізації запрограмованої загибелі клітин є одним із патогенетичних факторів розвитку захворювань. До них відносяться серцево-судинні та нейродегенеративні захворювання, гострі та хронічні запальні процеси, цукровий діабет, злоякісні новоутворення та ін Це обумовлює актуальність досліджень, присвячених встановленню молекулярних механізмів дизрегуляціі апоптозу. Встановлено, що H2S може спричиняти як індукуючий, так і інгібуючий вплив на механізми реалізації апоптозу клітин [64, 78, 83].

Дослідження впливу донора сульфіду водню (NaHS) на апоптотичну загибель клітин лінії Jurkat (T-лімфобластна лейкемія) і мононуклеарних лейкоцитів, отриманих від здорових донорів показали, що H2S посилював апоптотичну загибель клітин після 15 хв інкубації in vitro в концентраціях 10 і 100 ммоль (до 9,70% і 13,20% відповідно) у порівнянні з контролем (4,45%) [47, 63]. Виявилося, що H2S може запускати запрограмовану загибель клітин із залученням мітохондріального шляху індукції апоптозу, активацією каспази 3 і родини МАР-кіназ [78, 83, 208]. Показано, що вплив на клітини Т-лімфобластної лейкемії NaHS протягом 24 год не призводить до змін запрограмованої клітинної смерті. Проапоптотичний ефект сульфіду водню у високих мілімолярних концентраціях супроводжується генерацією активних форм кисню, зниженням вмісту глутатіону та залученням як рецепторного (Fas-опосередкованого), так і мітохондріального шляхів реалізації апоптозу [158]. Показано також, що дія більш низьких (мілі- і мікромолярних) концентрацій газу може призводити до цитопротекторного (антинекротичного і антиапоптотичного) або проапоптотичного ефекту в залежності від типу клітин та умов експерименту [172].

Ендогенний або екзогенний сірководень здатний регулювати проліферацію клітин. Giuliana Gobbi і співавтори показали, що екзогенний сірководень знижує клональний ріст, проліферацію і клітинну адгезію кератиноцитів людини in vitro. На молекулярному рівні H2S знижує Raf / MAPK (mitogen-activated protein kinase) / ERK (extracellular signal-regulated protein kinase) сигнальних шляхів. Зниження адгезії в оброблених гідросульфідом натрію клітин (2 mM NaHS, 24-48 год) пов'язані з пригніченням експресії в4, б2 і б6 інтегринів, які необхідні для сприяння клітинної адгезії, а також антиапоптоза і проліферативної сигналізації нормальних кератиноцитів [136]. H2S може викликати пошкодження ДНК і тим самим змінювати клітинний цикл у різних клітинах ссавців. Дослідження показують, що H2S проявляє проапоптотичну дію. Наприклад, Yang G. і співавтори показали, що ендогенний H2S викликає апоптоз гладких м'язових клітин аорти людини через шлях MAP кінази [244-246]. Останнім часом повідомлялося, що NaHS (10 mM, 3 год) може індукувати апоптоз ацинарних клітин підшлункової залози миші через мітохондріальний шлях [92]. Було показано, що сірководень викликає ушкодження ДНК і змінює експресію генів апоптозу в легеневих фібробластах організму людини [83]. У цьому дослідженні, легеневі фібробласти людини культивували з донором сірководню NaHS (10-75 mM, 12-48 год). NaHS підвищував експресію генів ku 70 і ku 80, але не впливав на експресію генів інших репаративних білків, таких як ядерний антиген проліферуючих клітин (PCNA) або реплікаційний білок А (rNase protection assay). Вплив сірководню на адгезію клітин, життєздатність, проліферацію, активацію та секрецію цитокінів досліджено на різних типах клітин (лімфоцитах, макрофагах, фібробластах, кератиноцитах, гладком'язових клітинах, міобластах, ендотеліальних клітинах, ракових клітинах товстої кишки й епітеліальних клітинах кишечника і т.д .) [83, 245, 250].

Таким чином, газовий трансмітер ? сульфід водню ? здатний здійснювати модулюючий ефект на проліферацію і на запрограмовану загибель клітин. Кінцевий ефект впливу H2S на апоптоз визначається типом досліджуваних клітин, а також концентрацією і часом впливу газового трансмітера на клітини.

1.4.2 Роль сірководню у цитопротекції

Велика кількість досліджень свідчить про кардіопротекторну дію H2S при інфаркті міокарда і гіпоксії. При інфаркті порушується кровопостачання серця через ураження коронарних артерій, що супроводжується розвитком некрозу в міокарді. Після експериментально викликаного інфаркту міокарда у щурів H2S знижував розмір області некрозу і зменшував смертність тварин. Автори вважають, що судинорозширювальна дія H2S посилює коронарний кровоток при ішемічних станах і знижує клітинне пошкодження. Кардіопротекторний ефект H2S базується на активації АТФ-залежних калієвих каналів [62]. Крім того, є дані про стимуляцію сірководнем ангіогенезу ? утворення нових кровоносних судин за рахунок посиленої міграції ендотеліальних клітин [123].

Показано, що позаклітинна сигнальна регуляторна кіназа і фосфатидилінозитол-3-кіназа беруть участь у H2S-SP-індукованої кардіопротекції при ішемії в кардіоміоцитах щурів. Введення NaHS значно знижувало частоту виникнення інфаркту міокарда, а також підвищувало скоротливу функцію ізольованого серця щура. Життєздатність клітин і відсоток паличковидних кардіоміоцитів залежать від концентрації NaHS і знаходяться в межах від 1 до 100 мкмоль/л [151].

У експериментах на перфузованих за методом Лангендорфа серцях щурів вивчали ефекти донора сірководню гідросульфіду натрію на зміни функціонального стану, резервні можливості серця та його реакцію на ішемію-реперфузію (20хв/40хв). Показано, що внутрішньоочеревинне введення щурам NaHS у дозі 7,4 мг/кг супроводжувалося збільшенням функціональних резервів серця. Кут підйому кривої кінцево-діастолічного тиску у них був меншим, а плато кривої Франка-Старлінга ? тривалішим. NaHS збільшував мембранний потенціал мітохондрій серця, але не впливав на експресію гена UCP3. Ступінь відновлення показників кардіодинаміки після 20-хвилинної ішемії на тлі застосування NaHS був істотно вищим, ніж у контрольній серії внаслідок зменшення утворення мітохондріальних пор. Зроблено висновок, що донор сірководню у досліджуваній дозі має кардіопротекторний ефект [57, 73].

Відомості про роль різних типів К+АТФ-каналів у реалізації кардіопротекторного ефекту сірководню досить суперечливі. Bian і співавт. [86] виявили, що блокування К+АТФ-каналів сарколеми знімало ефект введення сірководню, а внутрішньовенне застосування специфічного блокатора мітохондріальних К+АТФ-каналів 5-гідроксидеканоату (5-HD) не впливало на розмір інфаркту ішемізованого серця. Sivarajah і співавт. [219] дійшли висновку, що Н2S не мав захисного впливу на міокард при внутрішньовенному застосуванні 5-HD. Згідно з даними Струтинської та співавт. [65], преінкубація ізольованих мітохондрій серця з 5-HD викликала ослаблення протекторного ефекту донора сірководню відносно кальційіндукованого відкривання мітохондріальних пор. Це може свідчити про участь мітохондріальних К+АТФ-каналів у Н2S-залежному інгібуванні пороутворення в серці, що спостерігається при його реперфузії [65].

Сірководень в мікромолярних концентраціях, отриманий in vitro з Na2S або NaHS [238, 243], виявляє цитопротекторні властивості, які можуть бути пов'язані з його здатністю нейтралізувати активні форми молекул (наприклад, пероксинітрити, гіпохлоритну кислоту і гомоцистеїн). H2S модулює функціонування внутрішньоклітинних каспаз або кіназ (p-38, c-JUN N-термінал протеїнкіназа 1/2, ERK1/2, PI3K), активацією ядерного фактору ? кВ і кВ-залежних протеїнів (індуцибельна NO-синтаза, циклоокисигеназа-2, міжклітинна адгезивна молекула-1), а також зі зниженням антиапоптотичного фактору Bcl-2 [226]. Показано, що пригнічення ендогенного синтезу сірководню збільшує цитотоксичну дію на клітини організму екзогенного H2S [46]. Встановлено, що для захисту тканин нирки від ушкодження при ішемії?реперфузії необхідний ендогенний H2S. Введення NaHS зменшує ступінь виникнення дисфункцій і морфологічних змін нирок [226].

Найбільш загальним ефектом дії ендогенного H2S є вазодилятація. Показано, що в центральній нервовій системі ендогенний сірководень функціонує як нейромодулятор, але може виконувати і протекторну функцію при оксидативному стресі або порушеннях кровопостачання мозку. Відомо, що відновлений глутатіон виконує роль одного з основних антиоксидативних протекторів мозку. Підвищення фізіологічного рівня синтезу сірководню в мозку збільшує вміст глутатіону, що захищає нейрони від апоптозу в умовах оксидативного стресу, що запускається підвищеним рівнем L-глутамату [165]. Донор H2S (100 µM NaHS) здійснював цитопротекторний вплив на первинну культуру ембріональних щурячих нейронів при використанні моделі окиснювального стресу, індукованого глутаматом (1 mM, 2 год). Газотрансміттер підвищував внутрішньоклітинну концентрацію антиоксиданту глутатіону через активацію експресії г-глутамілцистеїнсинтази [165].

Внутрішньоклітинні газові трансмітери необхідні для фізіологічного функціонування практично всіх органів і тканин. Сірководень продукується багатьма клітинами організму. Це свідчить про те, що в процесі еволюції H2S виявився важливим елементом спочатку гуморальної, а потім і нейрогенної регуляції життєвих властивостей ? проліферації, фізіологічної регенерації й апоптозу. Фізіологічні концентрації ендогенного H2S забезпечують церебро- і кардіопротекцію, відносно постійний артеріальний тиск, зберігаючи здоров'я людини і тварин у складних динамічних умовах зовнішнього середовища. Проте роль Н2S в мінімальних концентраціях на життєздатність і метаболізм МСК лінії 4BL людини не досліджувалась.

Розділ 2. Матеріали і методи дослідження

2.1 Умови культивування соматичних клітин людини лінії 4BL

Для вирощування клітин лінії 4BL використовували середовище Ігла у модифікації Дюльбекко (DMEM ? Dulbeccoґs modified Eagleґs medium) (“Sigma”, США) із додаванням 100 ОД/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 10% ембріональної сироватки теляти (“Sigma”, США). Клітини культивували при 37 °С у скляних чашках Петрі (d=35 мм). Контрольні клітини тримали в стандартних умовах СО2-інкубатора: 5% СО2 і 95% повітря (21% О2).

Клітинна лінія 4BL - це мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини, одержані з периферичної крові здорового донора і переведені в умови стандартної моношарової культури. Лінію клітин 4BL отримано і досліджено у відділі генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України [31-32, 39].

У наших дослідженнях для культивування клітин лінії 4BL людини газову суміш зі зниженим (відносно атмосферного повітря) парціальним тиском кисню (Ро2) подавали в двох режимах - безперервному і переривчастому (табл. 2.1.1). Мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини лінії 4BL зазнавали впливу зниженого Ро2 в переривчастому режимі: 8 годин деоксигенація і 16 годин реоксигенація протягом 3-х діб. У безперервному режимі клітини інкубувались у газових сумішах 24 години, а потім переносились у СО2-інкубатор без змін поживного середовища. У кожному варіанті досліда по 12 чашок Петрі. Загальна тривалість експерименту становила 4 доби (96 годин).

Таблиця 2.1.1

Схема експерименту

№ досліду	Група	Умови культивування клітин лінії 4BL людини (n=12)
І	Контроль	Стандартні умови СО2-інкубатора: 5% СО2 і 95% повітря (Ро2 159 мм рт.ст.)
ІІ	Вплив зниженого Ро2 24 год безперервно	22-23 мм рт.ст. (3% О2, 5% СО2, 92% N2) 37-38 мм рт.ст. (5% О2, 5% СО2, 90% N2) 75-76 мм рт.ст. (10% О2, 5% СО2, 85% N2)
ІІІ	Вплив зниженого Ро2 переривчасто 8 год/добуЧ3 дні=24 год	37-38 мм рт.ст. (5% О2, 5% СО2, 90% N2) 75-76 мм рт.ст. (10% О2, 5% СО2, 85% N2)
IV	Вплив донора сірководню NаHS	10-8 М 10-9 М 10-10 М 10-12 М 10-13 М 10-15 М
V	Cумісний вплив Ро2 (24 год безперервно) + NаHS	22-23 мм рт.ст. +10-12 М NаHS 37-38 мм рт.ст. +10-12 М NаHS

Донором сірководню був гідросульфід натрію (NaHS, “Sigma”, США).

2.2 Оцінка проліферації клітин у культурі

Для визначення проліферації клітини досліджуваної лінії висівали по 50 тис. клітин на чашку Петрі і додавали по 2 мл живильного середовища. Клітини знімали за допомогою суміші 0,25% трипсину і 0,02% ЕДТА (рН 7,5; 1:1) на третю (72 год) й четверту (96 год) добу культивування. Підраховували їхню кількість у лічильній камері Горяєва [70] під світловим мікроскопом у 15-20 полях зору для оцінки середнього арифметичного.

Морфологічні зміни оцінювали візуально під світловим мікроскопом Jenaval (“Carl Zeiss”, Німеччина). Знімки отримували за допомогою фотоапарата Canon PowerShot 640А, приєднаного до мікроскопу. МСК фіксували і фарбували за методом Романовського-Гімзи.

2.3 Визначення концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини

Концентрацію загального білку в культуральній рідині визначали за допомогою біуретового методу [19].

Принцип методу: оснований на утворенні забарвленого у фіолетовий колір комплексу пептидних зв'язків білка з іонами двовалентної міді (сульфату міді) в лужному середовищі. Інтенсивність забарвлення розчину прямопропорційна концентрації білку і визначається фотометрично.

Реагенти: Біуретовий реактив (СuSO4, KNaC4H4O6 i NaOH).

До 0,1 мл культуральної рідини добавили 5 мл робочого розчину біуретового реактиву, уникаючи утворення піни. Через 30 хвилин виміряли екстинцію на фотометрі в кюветі з товщиною шару 1 см при довжині хвилі 540 нм (зелений світофільтр) проти біуретового реактиву. Розрахунок проводили по калібровочному графіку. Калібровочний графік будували використовуючи серію стандартних розчинів курячого білку різної концентрації.

Формула розрахунку:

Ед / Ест Ч 5 = мг/мл, де

Ед - екстинція дослідної проби;

Ест - екстинція стандартної проби.

2.4 Визначення активності лужної фосфатази в культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини

Використовували стандартний набір реактивів ("Філісіт-Діагностика", Україна).

Принцип методу: лужна фосфатаза (ЛФ) розщеплює фенілфосфат при рН 10,4 з утворенням фенолу та фосфату, відповідно до наступної реакції:

фенілфосфат + H2O ЛФ фенол + фосфат.

Окисне сполучення фенолу з 4-амінофеназоном утворює червоний барвник, інтенсивність забарвлення якого визначається фотометрично. Активність ферменту є пропорційною прирощенню оптичної щільності розчину.

Реагенти:

1. Буферний концентрат:

- карбонат натрію - 32,0 г/л,

- бікарбонат натрію - 16,8 г/л,

- 4-амінофеназон - 10,2 г/л.

2. Субстрат: дінатрійфенілфосфат - 64 мг.

3. Окислювач: періодат натрію 50 г/л.

4. Калібрувальний розчин фенолу - 2,5 ммоль/л.

До контрольної і дослідної пробірки додавали по 2,1 мл субстратно-буферного розчину. Потім у дослідну пробірку вносили 0,07 мл культуральної рідини, перемішували та інкубували 10 хвилин при 37єС. Після чого додавали в обидві пробірки по 2,1 мл окисного розчину. У контрольну пробу додавали ще 0,07 мл культуральної рідини. Витримували 5 хвилин при кімнатній температурі і вимірювали оптичну щільність дослідної проби (А) проти контрольної проби при л=540 нм, І=10 мм.

Активність ферменту у пробі розраховували за формулою:

А (проби) = К Ч Е (проби)

де К - коефіцієнт, вирахуваний по калібрувальному графіку,

Е (проби) - оптична щільність дослідної проби, виміряна проти відповідної контрольної проби.

Перерахунок одиниць робили з урахуванням того, що 1 кат/л = 1 моль/с*л, або 1 мккат/л = 60 МО/л.

2.5 Визначення концентрації вільних амінокислот у культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини

До 1 мл культуральної рідини додавали 2 мл спирт-ацетона (1:3), перемішували і через 30 хв центрифугували (10 хв при 3 000 хв-1). Супернатант випарювали до 1 мл і наносили на хроматографічний папір "FN" (Німеччина) по 20 мкл. Амінокислоти розділяли на 13 фракцій:

1) цистеїн, цистин (Cys);

2) аргінін, гістидин, таурин (Arg+His+Taurine);

3) лізин, аспарагін (Lys+Asn);

4) гліцин, метіонін (Gly+Met);

5) серин, аспарагінова к-та (Ser+Asp);

6) аланін, глутамін (Ala+Gln);

7) валін, триптофан (Val+Trp);

8) тирозин, глутамінова к-та (Tyr+Glu);

9) треонін, ізовалін (Thr+Isovaline);

10) пролін, оксипролін (Pro+Hyp);

11) лейцин (Leu);

12) фенілаланін (Phe);

13) ізолейцин (Ile).

Для розгонки використовували систему розчинників, яка включала ізоаміловий спирт, бутиловий спирт, оцтову кислоту, мурашину кислоту та воду (9:7:4:2:5 по об'єму) [24, 29].

Після видалення хроматограм із розчинника під витяжною шафою, їх фарбували за допомогою скляного лабораторного обприскувача розчином нінгідрину. Для кількісної оцінки амінокислотного складу використовували вітчизняний денситометр ДО-1М.

2.6 Методи статистичної обробки результатів

Отримані в експериментах цифрові показники обробляли статистично з використанням критерію t Стьюдента. Визначали середнє арифметичне (М), стандартну похибку (m), коефіцієнт вірогідних змін по Стьюденту (р). Нормальність розподілу даних аналізували тестом Колмогорова-Смирнова. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними серіями досліду при р<0,05. Статистичну обробку здійснювали за допомогою програмного забезпечення OriginPro 7,5 та програми Microsoft Excell 2003. Кореляційний аналіз проводили із встановленням лінійного коефіцієнта кореляції Пірсона (r), що змінюється в межах від -1 до +1 [42].

Розділ 3. Результати досліджень

3.1 Морфологічні характеристики культивованих клітин людини лінії 4BL в умовах зниженого парціального тиску кисню та додавання донора сірководню

Морфологічних відмінностей між клітинами лінії 4BL людини контрольної (при Po2 159 мм рт. ст., що еквівалентно 21% О2) та дослідних груп, що піддавалися впливу зниженого Po2 у двох режимах - безперервного 24-х год (при Po2 23, 38 і 76 мм рт. ст., що еквівалентно 3, 5 і 10% О2) і переривчастого по 8 год/добу, 3 доби (при Po2 38 і 76 мм рт. ст., що еквівалентно 5 і 10% О2) - не виявлено (приклад представлено на рис. 3.1.1).

Клітини даної лінії були більш-менш однорідні за розмірами (60-120 мкм) та мали округле ядро. Під світловим мікроскопом переважна більшість клітин лінії 4BL людини мала витягнену веретеноподібну форму з відростками, але зустрічались і трикутні клітини. При низькій щільності клітин у популяції на третю добу культивування переважали фібробластоподібні клітини. Зустрічались круглі клітини, які відкріплювались від поверхні чашки Петрі та переходили у суспензію для поділу. Така морфологічна неоднорідність характерна для ММСК. Відносно фібробластів у культурі це пояснюють динамікою морфології клітин протягом клітинного циклу [76]. Попередніми дослідженнями встановлено, що клітини лінії 4BL мають властивості ММСК: здатні диференціюватися в остеогенному, адипогенному та міогенному напрямках у відповідь на дію відповідних стимулів [31-32, 39, 119].

У результаті культивування МСК лінії 4BL людини у присутності донора сірководню NаHS ми вперше спостерігали значні морфологічні відмінності. Клітини контрольної групи характеризувалися фібробластоподібною формою (довжиною 50-120 мкм) з округлим ядром (рис. 3.1.2, а; рис. 3.1.3, а). Вони мали відростки, за допомогою яких контактували між собою з утворенням сітки. З невисокою частотою зустрічались подібні до трикутника більш розпластані МСК, або округлі клітини, які відкріплювались від поверхні та переходили у суспензію. У деяких зразках у культурі з'являлися клітини-гіганти (200 мкм). Клітини дослідженої культури при підвищенні конфлюентності схильні до подовження, стоншення та набуття щільного моношару.

Рис. 3.1.1. Клітини лінії 4BL людини на 4-ту добу культивування у контролі (А) та при 24-годинному Po2 76 мм рт. ст. (Б). Фарбування за Романовським-Гімзою. Зб. Ч100 та Ч400

На третю добу культивування МСК у присутності NаHS (10-8-10-10 М) клітини набували атипової форми (рис. 3.1.2, б, в, г). Вони втрачали відростки та округлювалися. Розташовувалися поодиноко або невеликими групами з 4-8 клітин. На четверту добу ? вирізнялися плоскі веретеноподібні клітини з довгими відростками, які контактували з поверхнею сусідніх клітин (рис. 3.1.3, б, в, г). Вони утворювали ділянки моношару з 10-20 клітин. Половина клітин морфологічно залишалась округлої форми.

Рис. 3.1.2. Морфологія клітин лінії 4BL контрольної групи (а) та після впливу різних концентрацій NaHS: 10-8 М (б), 10-9 М (в), 10-10 М (г) на 3-тю добу культивування. Фарбування за Романовським-Гімзою. Зб. Ч100

Зміну морфології клітин при додаванні у живильне середовище донора сірководню можна пояснити цитотоксичною дією Н2S [83, 182]. Наші дослідження показали, що у присутності мінімальної дози 10-15 моль/л NaHS приблизно 80-90% популяції клітин мали типову фібробластоподібну форму, іноді зустрічались ниткоподібні, атипові округлі та розпластані клітини-гіганти (>200 мкм). Можливо NaHS спричиняв би менш виражений цитотоксичний вплив при додаванні його до культури адгезованих клітин, аніж при внесенні безпосередньо під час пасажування, коли більшість клітин є неприкріпленими до субстрату та округлими.

Рис. 3.1.3. Морфологія клітин лінії 4BL контрольної групи (а) та після впливу різних концентрацій NaHS: 10-8 М (б), 10-9 М (в), 10-10 М (г) на 4-ту добу культивування. Фарбування за Романовським-Гімзою. Зб. Ч100

3.2 Вплив 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на клітини лінії 4BL людини

Мезенхімальні стромальні (стовбурові) клітини людини знаходяться в кістковому мозку, жировій тканині, шкірі, тканинах серця, плаценті, пуповинній крові, а також в інших органах і тканинах [67, 115, 143, 184]. У культурі МСК мають здатність до активної проліферації. Наступна стадія розвитку - спонтанна диференціація in vitro в клітини кісткової (остеогенні клітини), жирової (адипоцити), хрящової (хондроцити), м'язової (міоцити) або сполучної тканини (фібробласти) [26]. Умови культивування (склад культурального середовища, фактори росту, індуктори диференціювання) відіграють важливу роль у реалізації функціональних можливостей клітин. Показано, що парціальний тиск кисню в позаклітинному середовищі, який зумовлює внутрішньоклітинну концентрацію кисню, також є одним з істотних факторів, що активно впливає на проліферацію, життєздатність, диференціювання, а також на морфологічні та імунофенотипічні показники клітин [5, 11-13, 15]. Проте їхні висновки неоднозначні. Це може бути пов'язано з вибором культури клітин, а також умовами проведення експерименту, а саме: використанням різного часового режиму та неоднакової інтенсивності впливу газової суміші.

Тому ми дослідили 24-годинний вплив зниженого Ро2 до 23, 38 і 76 мм рт. ст. на проліферацію, активність лужної фосфатази (один із маркерних показників початку остеогенної диференціації та показник інтенсивності метаболізму), концентрацію загального білку і зміни амінокислотного складу культуральної рідини МСК лінії 4BL людини.

3.2.1 Проліферація клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню

Результати проведених нами досліджень показали, що проліферація клітин лінії 4BL у газовій суміші з 3% О2 та в умовах стандартної атмосфери (СА) істотно відрізняються (рис. 3.2.1.1).

На третю добу культивування після 24-х годинного безперервного впливу 3% О2 кількість клітин була у 2 рази нижчою порівняно з контролем. Чисельність клітин при 5 і 10% кисню вірогідно не змінювалась порівняно з контролем. Через 96 годин культивування при СА в середньому на чашках Петрі налічувалось 313 - 327 тис клітин/мл. При інкубуванні клітин у газових середовищах з 5% та 10% О2 спостерігали тенденцію до збільшення кількості клітин: 330 - 363 тис клітин/мл порівняно з контролем (рис. 3.2.1.2). У І-й групі налічувалось на 37% клітин менше (р<0,05) щодо контрольних значень.

Рис. 3.2.1.1. Проліферація клітин лінії 4BL людини у контрольних (К, К1) і дослідних (І - 3%, ІІ - 5%, ІІІ - 10% О2, 24 год) груп на третю добу культивування. *р<0,05 - відносно контролю

Відомо, що вирощування ММСК при знижених концентраціях кисню у середовищі інкубування (5-10% О2) може позитивно впливати на їхній проліферативний потенціал [5, 13, 21, 49]. Зміни проліферації клітин в умовах дозованої гіпоксії пов'язують із регуляторним впливом транскрипційного фактору HIF. Активація HIF-1б є універсальною відповіддю клітин на гіпоксію і виявлена у різних типах клітин [21, 214, 221].

Наші досліди показали, що 24-годинне культивування МСК лінії 4BL людини при 3% О2 призводило до зниження проліферативного потенціалу на 37% порівняно з контролем. На відмінність, при інкубації клітин в умовах 5 та 10% О2, не тільки не виявлено пригнічення проліферації, а навпаки - спостерігалась тенденція до стимулювання поділу клітин лінії 4BL, хоча статистично вірогідних змін кількості клітин у цьому експерименті не спостерігали.

Рис. 3.2.1.2. Проліферація клітин лінії 4BL людини у контрольних (К, К1) і дослідних (І - 3%, ІІ - 5%, ІІІ - 10% О2, 24 год) груп на четверту добу культивування. *р<0,05 - вірогідні відмінності показників порівняно з контролем

3.2.2 Зміни активності лужної фосфатази і концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню

Одним із показників стану клітин в умовах in vitro може бути їхня метаболічна активність. Концентрація загального білку у безклітинному культуральному середовищі на третю добу культивування після безперервного 24-х годинного впливу у І-й і ІІ-й дослідних пробах була вищою на 14% (р<0,05), а при 10% О2 - на 35% порівняно з контролем (рис. 3.2.2.1, а).



Рис. 3.2.2.1. Концентрація загального білку у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини у контрольних (К) та дослідних (І - 3% О2, ІІ - 5% О2, ІІІ - 10% О2) груп на третю (а) та четверту (б) добу культивування після безперервного 24-х годинного впливу. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

На четверту добу спостерігали статистично вірогідне зростання концентрації білку (на 36%) при 10% О2, а у інших досліджуваних пробах цей показник практично не відрізнявся від значень контролю (рис. 3.2.2.1, б). За нашими даними зниження вмісту кисню у газовому середовищі інкубації до 10% позитивно впливає на проліферативну та метаболічну активність мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин людини.

Відомо, що лужна фосфатаза (ЛФ) - фермент з групи гідролаз, що здійснює дефосфорилювання, тобто відщеплення фосфату (PO43-) від молекул різних органічних речовин (амінокислот, вуглеводів, нуклеотидів, білків). Біологічна роль її пов'язана з участю в обміні вуглеводів, фосфоліпідів, ДНК і РНК. Рівень її вмісту в організмі слугує надійним показником інтенсивності метаболізму [23]. ММСК лінії 4BL людини можуть диференціюватися в остеобласти, що в організмі формують нові елементи кісткової тканини. Для цього в культуральній рідині вимірювали активність ЛФ, яка є також одним із маркерних показників початку остеогенної диференціації мезенхімальних клітин [50]. Згідно з отриманими нами даними, на третю добу культивування клітин при 3% О2 активність ЛФ вірогідно знизилась на 40%, при 5% О2 - на 20% і при 10% О2 - на 23% порівняно з контрольним значенням (рис. 3.2.2.2, а). На четверту добу спостерігали спадання активності ЛФ у І-й і ІІ-й групах на 60% (р<0,05), а у ІІІ-й групі цей показник практично не відрізнявся від контролю (рис. 3.2.2.2, б). Отримані нами дані узгоджуються з опублікованими раніше результатами експериментального дослідження Грінаковської О.С. і співавт. [18]. Автори цього дослідження показали, що мезенхімальні стромальні клітини з ліпоаспірату людини (лМСК), які культивувались при 5% О2, утворювали в середньому на 50% менше мінералізованого матриксу у відповідь на остеогенну індукцію, ніж у стандартних умовах (21% О2). Після перенесення лМСК, постійно культивованих при 5% О2, у нормоксичні умови (21% О2) вони синтезували стільки ж матриксу, що і лМСК, постійно культивовані при 21% О2. Автори прийшли до висновку, що умови гіпоксії уповільнюють комітування лМСК під впливом остеогенних стимулів, що може мати вагоме значення при вирішенні задач відновлювальної та регенеративної медицини [18].

Встановлено, що у молодих щурів, які знаходились у стані гіпокінезії, але дихали штучною газовою сумішшю зі зниженим Ро2 91±8 мм рт. ст. протягом 28 діб, активність ЛФ у сироватці крові залишалася близькою до контрольних значень, а у кістковій тканині мала тенденцію до зниження порівняно з контролем. Це можна розглядати як підтвердження пригнічення процесів фізіологічного відновлення кісткової тканини при гіпокінезії. У тварин, що дихали газовою сумішшю 45 діб при обмеженні рухливості, активність ЛФ у сироватці крові вірогідно (р<0,05) знизилась у 1,5 раза порівняно з конролем. Водночас активність ЛФ у кістковій тканині молодих щурів вірогідно підвищилась, що свідчить на користь нормалізуючого впливу гіпоксії саногенного рівня за умов гіпокінезії [35-38].

Рис. 3.2.2.2. Активність лужної фосфатази у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини у контрольних (К) та дослідних (І - 3%, ІІ - 5%, ІІІ - 10% О2) груп на третю (а) та четверту (б) добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

При співставленні показників активності ЛФ, концентрації загального білку та проліферативного потенціалу клітин лінії 4BL, були встановлені їх кореляційні зв'язки (рис. 3.2.2.3).

Зокрема, спостерігалась низька позитивна кореляція (r=0,24) між активністю ЛФ та проліферацією клітин. Негативний низький кореляційний зв'язок (r=-0,26) був встановлений між показниками концентрації загального білку і проліферацією. Виявили, що вказані чинники не корелюють між собою, тому не можуть використовуватись у якості додаткових факторів оцінки впливу зниженого парціального тиску кисню.



Рис. 3.2.2.3. Графічна демонстрація ступеня кореляційних зв'язків між активністю лужної фосфатази та проліферацією клітин лінії 4BL людини (А) і між концентрацією загального білку у культуральній рідині та проліферацією (Б) при 24-годинній дії зниженого парціального тиску кисню 23, 38 і 76 мм рт. ст.

Отже, в наших дослідах після 24-годинного впливу зниженого Ро2 23 і 38 мм рт. ст., на четверту добу культивування спостерігали спадання активності ЛФ у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини на 60% у обох групах. Це може свідчити про гальмування інтенсивності метаболізму та диференціації в остеогенному напрямку. При цьому концентрація загального білку залишалась на рівні контролю. Після 24-годинного впливу зниженого Ро2 76 мм рт. ст. концентрація загального білку в культуральній рідині досліджуваної лінії статистично вірогідно зростала на 36%, проте активність ЛФ практично не відрізнялась від значень контролю. Отримані результати вказують, що Ро2 може регулювати як ферментативну, так і біосинтетичну активність клітин.

3.2.3 Концентрація вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали 24-годинного впливу зниженого парціального тиску кисню

На наступному етапі нашої роботи ми виявили, що безперервний 24-годинний гіпоксичний вплив призводив до змін амінокислотного складу культуральної рідини клітин лінії 4BL людини за показниками концентрації 13-ти фракцій вільних амінокислот (АК).

Результати проведених досліджень показали, що концентрація вільних АК гліцину (дефіцит призводить до порушення структури сполучної тканини) і метіоніну у культуральній рідині при дії 10% О2 на третю добу культивування була вищою на 85% (р<0,05) порівняно з контролем, а при 3 та 5% О2 - не відрізнялась від контрольних значень (рис. 3.2.3.1, А). На четверту добу культивування, цей показник зріс лише на 9% у 3-й групі (рис. 3.2.3.1, Б). Концентрація АК у 1-й і 2-й дослідних групах за той же період була вірогідно більшою на 60 і 47% відповідно порівнюючи з контрольним зразком (рис. 3.2.3.1, Б).

У процесі культивування МСК лінії 4BL людини в умовах 24-х годинного зниження Ро2 (38 і 76 мм рт. ст.) на третю добу концентрація проліну (основний елемент колагену) і оксипроліну майже не змінювалася відносно контролю. Вірогідно нижчою на 17% (р<0,05) концентрація цієї фракції була у 1-й групі (рис. 3.2.3.2, А). На четверту добу культивування їх вміст знизився в усіх дослідних групах: у 1-й на 31%, у 2-й - 42%, у 3-й - 21% (рис. 3.2.3.2, Б). Оскільки пролін і оксипролін являються головними АК у первинній структурі колагену, можна зробити припущення, що вони включалися у синтез даного білка.



Рис. 3.2.3.1. Концентрація гліцину і метіоніну у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К - 21% О2) і дослідних (І - 3% О2, ІІ - 5% О2, ІІІ - 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - вірогідність порівняно з контролем

Отримані нами результати узгоджуються з літературними даними інших дослідників, які показали, що введення в зону перелому трубчастої кістки щурів мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин кісткового мозку, культивованих при 5% кисню сприяло збільшенню коефіцієнта потовщення кісткової мозолі і хрящової тканини [11, 15].

Вміст вільних АК серину і аспарагінової кислоти у культуральній рідині був меншим на третю добу культивування при 3% кисню на 17%, а при 5% О2 - на 18% порівняно з контрольним значенням (рис. 3.2.3.3, А). При 10% О2 концентрація цих амінокислот вірогідно зростала на 19%. На четверту добу культивування у 1-й і 2-й пробах вміст серину і аспарагінової кислоти вірогідно (р<0,05) знизився на 45% і 62% відповідно порівнюючи з контролем (рис. 3.2.3.3, Б).

Рис. 3.2.3.2. Концентрація проліну і оксипроліну у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К - 21% О2) і дослідних (І - 3% О2, ІІ - 5% О2, ІІІ - 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - вірогідність порівняно з контролем

Концентрація вільного аланіну (бере участь у синтезі колагену) і глутаміну у культуральній рідині на 3-тю добу вирощування клітин у всіх зразках вірогідно не відрізнялась від значень контролю, хоча при 3 і 5% кисню мала тенденцію до зростання (рис. 3.2.3.4, А). Рівень цих АК через 96 год культивування збільшувався у 1-й і 2-й групі на 19 та 23% (р<0,05) відповідно, і зменшувався у 3-й групі - на 12% порівняно з контролем (рис. 3.2.3.4, Б).



Рис. 3.2.3.3. Концентрація серину і аспарагінової кислоти у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К - 21% О2) і дослідних (І - 3% О2, ІІ - 5% О2, ІІІ - 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - вірогідність порівняно з контролем

Фракції дев'яти інших АК змінювались з часом культивування по-різному. Газова суміш зі зниженим Ро2 (23 мм рт. ст.), яку подавали у безперервному режимі 24 год, сприяла вірогідному (р<0,05) зменшенню концентрації вільних амінокислот 4-х фракцій, а саме: цистеїну і цистину на 29%, валіну і триптофану - 33%, треоніну і ізоваліну - 22%, ізолейцину - 38% порівняно з контролем на 4-ту добу культивування (табл. 3.2.3.1).



Рис. 3.2.3.4. Концентрація аланіну і глутаміну у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К - 21% О2) і дослідних (І - 3% О2, ІІ - 5% О2, ІІІ - 10% О2, 24 год безперервно) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - вірогідність порівняно з контролем

Рівень Arg+His+Taurine був вищим на 40%, Lys+Asn - 18%, а Tyr+Glu - 20% щодо контрольних значень. Слід відмітити, що на 3-тю добу вміст Arg+His+Taurine складав 1,44±0,07 мг/мл, що на 16% (р<0,05) більше ніж у контролі - 1,24±0,05 мг/мл, а через добу був 1,96±0,09 мг/мл. Порівняно з контролем на 72-гу год культивування вірогідно нижчою була концентрація лише валіну і триптофану на 12%. При цьому концентрація незамінних амінокислот - лейцину, фенілаланіну, ізолейцину, валіну і триптофану - мала тенденцію до спадання як у контрольних так і у дослідних групах, порівнюючи 3-тю і 4-ту добу культивування. Це може свідчити про інтенсивне поглинання цих амінокислот клітинами і включення у процеси метаболізму.

Таблиця 3.2.3.1

Безперервний вплив зниженого парціального тиску кисню (23 мм рт. ст., що еквівалентно 3% О2, 24 год) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

Показники	Контроль (3-тя доба)	3% О2 (3-тя доба)	Д, %	Контроль (4-та доба)	3% О2 (4-та доба)	Д, %
цистеїн, цистин	0,41±0,04	0,42±0,05	+2	0,38±0,03	0,27±0,02*	-29
аргінін, гістидин, таурин	1,24±0,05	1,44±0,07*	+16	1,40±0,12	1,96±0,09*	+40
лізин, аспарагін	2,77±0,22	2,59±0,12	-6	2,92±0,11	3,44±0,14*	+18
валін, триптофан	0,59±0,03	0,52±0,02*	-12	0,61±0,03	0,41±0,02*	-33
тирозин, глутамінова к-та	4,34±0,26	3,85±0,24	-11	4,80±0,23	5,74±0,24*	+20
треонін, ізовалін	2,02±0,13	2,04±0,12	+1	1,67±0,08	1,30±0,06*	-22
лейцин	1,19±0,07	1,22±0,06	+3	1,06±0,07	0,94±0,06	-11
фенілаланін	0,61±0,04	0,72±0,08	+18	0,49±0,02	0,63±0,15	+29
ізолейцин	0,14±0,02	0,13±0,02	-7	0,13±0,04	0,08±0,02	-38

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю.

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Таблиця 3.2.3.2

Безперервний вплив зниженого парціального тиску кисню (38 мм рт. ст., що еквівалентно 5% О2, 24 год) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

Показники	Контроль (3-тя доба)	5% О2 (3-тя доба)	Д, %	Контроль (4-та доба)	5% О2 (4-та доба)	Д, %
цистеїн, цистин	0,41±0,04	0,35±0,02*	-15	0,38±0,03	0,20±0,03*	-47
аргінін, гістидин, таурин	1,24±0,05	1,37±0,06*	+11	1,40±0,12	2,15±0,14*	+54
лізин, аспарагін	2,77±0,22	2,59±0,06	-6	2,92±0,11	3,43±0,17*	+17
валін, триптофан	0,59±0,03	0,62±0,02	+6	0,61±0,03	0,31±0,03*	-49
тирозин, глутамінова к-та	4,34±0,26	4,15±0,28	-4	4,80±0,23	6,08±0,32*	+27
треонін, ізовалін	2,02±0,13	2,36±0,15	+17	1,67±0,08	1,03±0,07*	-38
лейцин	1,19±0,07	1,29±0,012	+8	1,06±0,07	1,24±0,12	+17
фенілаланін	0,61±0,04	0,73±0,08	+20	0,49±0,02	0,47±0,03	-4
ізолейцин	0,14±0,02	0,11±0,03	-21	0,13±0,04	0,07±0,02	-46

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю.

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Дослідження виявило, що 24-х годинна дія Ро2 38 мм рт. ст. впливає на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини (табл. 3.2.3.2).

Таблиця 3.2.3.3

Безперервний вплив зниженого парціального тиску кисню (76 мм рт. ст., 24 год) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

Показники	Контроль (3-тя доба)	10% О2 (3-тя доба)	Д, %	Контроль (4-та доба)	10% О2 (4-та доба)	Д, %
цистеїн, цистин	0,32±0,05	0,40±0,05	+25	0,42±0,04	0,49±0,04	+17
аргінін, гістидин, таурин	1,41±0,09	1,54±0,08	+9	1,39±0,09	1,31±0,06	-6
лізин, аспарагін	2,37±0,09	2,31±0,11	-3	2,21±0,11	2,53±0,12*	+14
валін, триптофан	0,25±0,04	0,21±0,02	-16	0,18±0,02	0,18±0,04	0
тирозин, глутамінова к-та	2,99±0,14	3,23±0,16	+8	2,89±0,13	2,58±0,10*	-11
треонін, ізовалін	1,87±0,10	2,15±0,08*	+15	2,34±0,12	3,09±0,14*	+32
лейцин	0,84±0,05	0,85±0,07	+1	0,76±0,06	0,72±0,05	-5
фенілаланін	1,00±0,05	0,81±0,03*	-19	0,70±0,03	0,59±0,03*	-16
ізолейцин	0,17±0,03	0,23±0,04	+35	0,08±0,01	0,10±0,02	+25

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю.

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

На 3-тю добу культивування вірогідно вищою на 11% була концентрація Arg+His+Taurine (1,37±0,06 мг/мл) порівняно з контролем (1,24±0,05 мг/мл). За тих само умов рівень цистеїну і цистину був нижчим на 15% за відповідне контрольне значення. Через 96 год культивування підвищився рівень 3-х груп АК: Arg+His+Taurine на 54%, Lys+Asn на 17% і Tyr+Glu на 27%. Концентрація цистеїну і цистину, яка складала 0,20±0,03 мг/мл, вірогідно знизилася на 47% (р<0,05) порівняно з контролем (0,38±0,03 мг/мл). Водночас зменшився вміст вільних валіну і триптофану на 49%, треоніну та ізоваліну - на 38%. У контролі концентрація незамінної АК ізолейцину була 0,13±0,04 мг/мл, а у дослідному варіанті - 0,07±0,02 мг/мл, тобто мала тенденцію до зниження.

На 3-тю добу виявлена тенденція до зростання концентрації Cys, Arg+His+Taurine, Tyr+Glu, Ile у культуральній рідині. Це може свідчити про менш інтенсивне поглинання цих АК клітинами дослідної групи порівняно з контролем. Зафіксовано зниження вмісту фенілаланіну на 19% (р<0,05). Показано, що на 4-ту добу культивування вірогідно зросла концентрація лізину і аспарагіну на 14%, треоніну та ізоваліну - на 32%, порівнюючи з контрольними даними. Показник тирозину і глутамінової кислоти був 2,58±0,10 мг/мл, що на 11% (р<0,05) нижче ніж у контролі - 2,89±0,13 мг/мл, а фенілаланіну (0,59±0,03 мг/мл) - на 16%, порівнюючи з контрольним значенням (0,70±0,03 мг/мл). Оскільки мінімальна концентрація речовини виникає в місці її інтенсивного поглинання, ми вважаємо, що цей факт варто розглядати як свідчення зростання інтенсивності життєдіяльності клітин за цих умов.

У проведених нами дослідах виявлено, що концентрація найбільш значущих для сполучної тканини вільних амінокислот, які безпосередньо беруть участь у синтезі колагену змінювалась по-різному. Аналіз динаміки змін вільних амінокислот культуральної рідини МСК лінії 4BL людини виявив їх чутливість до змін Ро2. Ми спостерігали вірогідне односпрямоване зниження проліну і оксипроліну на 4-ту добу культивування при 24-годинній подачі штучної газової суміші з Ро2 23, 38 і 76 мм рт. ст. Важливо також зазначити тенденцію до зниження усіх незамінних АК у культуральній рідині. Тому знижений рівень цих АК вказує на інтенсифікацію процесу синтезу колагену.

3.3. Вплив переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню на клітини лінії 4BL людини

На наступному етапі досліджень ми продемонстрували, що газова суміш зі зниженим Ро2 38 і 76 мм рт. ст., яку подавали у переривчастому режимі (8 год/добу, 3 доби), впливає на процеси життєдіяльності МСК лінії 4BL людини.

3.3.1 Проліферація клітин лінії 4BL людини, що зазнавали впливу переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню

Отримані нами результати показали, що при всіх варіантах інкубування проліферативна активність МСК на 3-тю добу вірогідно не відрізнялась від контрольних значень (рис. 3.3.1.1).

Рис. 3.3.1.1. Проліферація клітин лінії 4BL людини, які культивували в умовах стандартної атмосфери (К - 159 мм рт. ст.) і зниженому парціальному тиску кисню (І - 38, ІІ - 76 мм рт. ст., 8 год/добу, 3 доби) на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу. *p<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

На 4-ту добу культивування після впливу Ро2 38 мм рт. ст. кількість клітин (р<0,05) зростала і становила 462 тис клітин/мл у порівнянні з контролем (363 тис клітин/мл). Більш виражене підвищення кількості клітин відбувалося і при рівні Ро2 76 мм рт. ст. ? 528 тис клітин/мл. Отримані нами результати свідчать, що культивування МСК людини лінії 4BL в середовищі зі зниженим вмістом кисню (5 і 10 %) може виявитися корисною модифікацією технології культивування, здатною забезпечити отримання більшої кількості клітин за менший час. Це може бути використано в галузі комбустіології та відновлювальної терапії.

Ми припускаємо, що основним регулятором пристосування клітин лінії 4BL до умов зниженого Ро2 є фактор індукований гіпоксією (HIF-1), який модулює роботу багатьох генів. Він складається з 2 субодиниць: киснечутливої HIF-1б та конститутивної HIF-1в [211-214]. Порівняльний аналіз даних, отриманих Риловою та співавт. [54-55] при дослідженні експресії генів МСК жирової тканини, показав, що в умовах зниженого до 5% вмісту кисню відбувалося збільшення рівня експресії генів, які відповідають за вступ клітин у клітинний цикл і позитивно регулюють їх проліферацію. Серед них гени родини Fos (FOSB і FOSL1), що кодують білки, які, димеризуючись із білками родини Jun, беруть участь у формуванні білка-активатора 1 (АР1); гени PCNA і CCND2, продукти яких являють собою цикліни (необхідні для переходу клітин з фази G1 в S-фазу синтезу ДНК), а також ген CKS2, який кодує регуляторну субодиницю циклінзалежної кінази. Крім того, у відповідь на знижений вміст кисню зменшувалась експресія CDKN2C ? гена-інгібітора циклінзалежної кінази. Встановлено, що максимальну активність HIF-1 виявляє при концентрації кисню близько 0,5 % [54-55, 140, 148].

Отримані нами результати дають змогу зробити висновок, що зниження концентрації кисню в газовому середовищі інкубації до 5 і 10 % при культивуванні мультипотентних МСК людини лінії 4BL збільшує їх кінцеву проліферативну активність на 27 і 45 % відповідно порівняно з контролем. При цьому максимальний ефект отримано при 10% О2. Можливо це відбувається у зв'язку з тим, що у фізіологічних умовах цілого організму тканинне Ро2 в 2-4 рази нижче, ніж в атмосферному повітрі інкубатора.

3.3.2 Зміни активності лужної фосфатази і концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали впливу переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню

Результати проведених біохімічних досліджень показали вірогідне зниження активності ЛФ у культуральній рідині на 33 % порівняно з контролем при рівні Ро2 38 мм рт. ст. на 3-тю добу культивування (рис. 3.3.2.1, А). На 4-ту добу ? активність ЛФ зменшилась як при 38 мм рт. ст., так і при 76 мм рт. ст. на 25 % (р<0,05; див. рис. 3.3.2.1, Б). Такі зміни дають змогу припустити, що початок остеогенної диференціації, одним із маркерних показників якої є активність ЛФ [50], МСК лінії 4BL людини залежить від рівня Ро2 у газовій фазі середовища. Зниження цього показника гальмує остеогенну диференціацію. Перетворення МСК у клітини кісткової тканини (остеобласти) відбувається швидше в умовах атмосферного рівня Ро2 (159 мм рт. ст.).

Отримані результати узгоджуються з літературними даними інших дослідників, які показали, що зниження концентрації кисню в газовому середовищі з 21 до 3% гальмує остеогенний потенціал культури МСК отриманої з тканин ротової порожнини людини [14] і кісткового мозку миші [49]. Жамбалова та співавт. [21] дослідили здатність мультипотентних МСК кісткового мозку людини до диференціації в умовах зниженого вмісту кисню (1 і 5% О2). При інкубації клітин у нормоксичних (21% О2) умовах і при зниженому вмісті кисню виявлена різна ступінь здатності МСК до диференціювання в остеогенному, адипогенному і ендотеліальному напрямках. У середовищі з 5% О2 спостерігали незначне зниження здатності МСК до мінералізації позаклітинного матриксу і накопиченню ліпідних крапель у порівнянні з контролем (21% О2). При концентрації 1% О2 МСК практично повністю втратили здатність до мінералізації матриксу і не диференціювалися в адипоцитарному напрямку. При культивуванні МСК протягом 3 тиж з 5 та 21% О2 вірогідних відмінностей у диференціюванні в ендотеліальному напрямку не виявлено. Характерним морфофункціональним показником ефективності такого диференціювання була здатність МСК утворювати капіляроподібні структури на екстраклітинному матриксі в культурі з додаванням ендотеліального фактора росту [21].

...