Вплив парціального тиску кисню та донора сірководню на проліферацію соматичних клітин людини лінії 4BL

Рис. 3.3.2.1. Активність лужної фосфатази у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К - 159 мм рт. ст.) і дослідних (І - 38, ІІ - 76 мм рт. ст., 8 год/добу, 3 доби) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

У межах чутливості біуретового методу при впливі зниженого Ро2 переривчастого режиму не було виявлено змін в концентрації загального білку в культуральній рідині між дослідними і контрольними групами клітин.

Аналіз ступеня взаємозв`язків між активністю ЛФ і проліферативним потенціалом клітин лінії 4BL людини показав наявність високого негативного (r=-0,80) кореляційного зв'язку (рис. 3.3.2.2).

Рис. 3.3.2.2. Кореляційні зв'язки між активністю лужної фосфатази та проліферацією клітин лінії 4BL людини (А) і між концентрацією загального білку у культуральній рідині та проліферацією (Б) при дії зниженого парціального тиску кисню 38 і 76 мм рт. ст. переривчастого режиму (8 год/добу, 3 доби)

Висока позитивна кореляція (r=0,82) була встановлена між показниками проліферації і рівнем загального білку в культуральному середовищі досліджуваної лінії.

Наведені результати дозволяють зробити висновок, що остеогенна диференціація клітин лінії 4BL людини, маркерним показником якої є активність ЛФ, при рівні Ро2 38 і 76 мм рт. ст. (8 год/добу, 3 доби) відбувалася на 25% повільніше, ніж в умовах атмосферного кисню (159 мм рт. ст.). Зниження вмісту кисню у середовищі інкубування не впливало на концентрацію загального білку у культуральній рідині.

3.3.3 Концентрація вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини, що зазнавали впливу переривчастого режиму зниження парціального тиску кисню

При культивуванні клітин в умовах Ро2 38 мм рт. ст. (8 год/добу, 3 дні) на 3-ю добу у культуральній рідині вірогідно нижчою була концентрація лізину і аспарагіну на 11%, проліну і оксипроліну - на 12% порівняно з контролем (табл. 3.3.3.1). Показники концентрації усіх інших фракцій АК мали тенденцію до зниження. Виняток становила лише група АК серин і аспарагінова кислота, що мала тенденцію до зростання відповідно контролю.

Таблиця 3.3.3.1

Вплив переривчасто зниженого парціального тиску кисню (38 мм рт. ст., 8 год/добу, 3 доби) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю.

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Показано, що на 4-ту добу культивування 12 із 13 фракцій АК були нижчими за контрольне значення. Вірогідно (р<0,05) знизилась концентрація лізину і аспарагіну на 15%, серину і аспарагінової кислоти - на 20%, треоніну та ізоваліну - на 18%, проліну і оксипроліну - на 18%, лейцину - на 21% порівнюючи з контрольними даними. Показник тирозину і глутамінової кислоти був 4,25±0,22 мг/мл, що на 15% (р<0,05) вище ніж у контролі - 3,71±0,21 мг/мл.

Показано, що після дії Ро2 76 мм рт. ст. переривчастого режиму (8 год/добу, 3 дні) вірогідно знизилась у живильному середовищі концентрація Arg+His+Taurine на 17%, Tyr+Glu - на 12%, Thr+Isovaline - на 16%, Pro+Hyp - на 17% порівняно з контролем на 3-тю добу культивування клітин лінії 4BL людини (табл. 3.3.3.2).

Таблиця 3.3.3.2

Вплив переривчасто зниженого парціального тиску кисню (76 мм рт. ст., 8 год/добу, 3 дні) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю.

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Встановлено, що 5 фракцій АК мали тенденцію до зростання, а саме: Cys, Ser+Asp, Ala+Gln, Val+Trp, Leu. У 4-х інших групах вільних АК (Lys+Asn, Gly+Met, Phe, Ile) спостерігали тенденцію до зниження їх концентрацій щодо контрольних значень.

На 4-ту добу культивування МСК показано зниження 12 із 13 фракцій вільних АК у живильному середовищі. Виняток становила лише концентрація тирозину і глутамінової кислоти, що вірогідно була вищою на 17% порівняно з контролем. Статистично значимо (р<0,05) щодо контролю зменшилась кількість Cys на 16%, Arg+His+Taurine - на 20%, Lys+Asn - на 28%, Ser+Asp - на 24%, Thr+Isovaline - на 27%, Pro+Hyp - на 22%, Leu - на 22%.

У дослідженнях, проведених на молодих щурах, які дихали 28 сеансів саногенною гіпоксією по 30 хв на добу, концентрація більшості АК у сироватці крові вірогідно зменшувалась. З 14 досліджених груп АК зниження відмічено в 11 випадках. Виняток становили 3 групи: гліцин і метіонін; аланін і глутамін; тирозин і глутамінова кислота [33].

Вміст 7 фракцій АК в сироватці крові дорослих 12-міс тварин вірогідно зростав після 28 сеансів 30-хвилинного дихання дозованою гіпоксичною газовою сумішшю. У кістковій тканині дорослих щурів, на відміну від молодих, значно підвищилась концентрація лізину і аспарагіну, гліцину і метіоніну, аланіну і глутаміну, тирозину і глутамінової кислоти, проліну і оксипроліну. Автори стверджують [33], що з двох досліджених ними режимів гіпоксичної активації метаболізму кісткової тканини, максимально сприятливим для молодих щурів є дозована киснева депривація протягом 2 годин в режимі 10 хв деоксигенації, 30 хв реоксигенації. Такий режим переривчастої саногенної дозованої гіпоксії має найбільшу кількість циклів деоксигенації/реоксигенації. Можливо, саме ця особливість подачі газової суміші надає процедурі максимальну ефективність за рахунок кількості «тригерних» впливів на адаптивні системи організму [33].

Для дорослих щурів сприятливі результати отримані при режимі, в якому гіпоксичну газову суміш подавали 30 хв безперервно. Періодичне дихання газовою сумішшю з помірно зниженим парціальним тиском кисню (Ро2 = 76 мм рт. ст.) при оптимальному співвідношенні періодів деоксигенації і реоксигенації і дозованої інтенсивності гіпоксичного впливу може бути одним із біофізичних факторів активації процесів фізіологічної регенерації кісткової тканини, темпи якої з віком зменшуються [33].

Отримані в наших дослідах результати дають підстави для заключення, що концентрація вільних АК у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини зменшувалась після переривчастого впливу зниженого Ро2 38, 76 мм рт. ст., а саме: лізину і аспарагіну; серину і аспарагінової кислоти; треоніну та ізоваліну; проліну і оксипроліну; лейцину. Можна припустити, що вони включалися у синтез колагену, оскільки являються головними амінокислотами у первинній структурі даного білка.

3.4 Вплив донора сірководню на клітини лінії 4BL людини

Відомо, що H2S є важливою сигнальною молекулою, яка бере участь у регуляції судинного тонусу, передачі нервових імпульсів, опосередковує цитопротекцію на моделях ішемічно-реперфузійного пошкодження міокарда [73, 53, 246]. Зазвичай дослідження проводять на щурах, кролях, мишах, або інших тваринах. Частина експериментів проводиться також на ізольованих органах (різних типах судин, міокарді) [61, 66, 182]. Проте вплив H2S на культури клітин вивчено недостатньо. Тому одним із напрямків нашого дослідження стало вивчення впливу донора сірководню NаHS на клітини in vitro.

У літературі наведено дані щодо наявності 20-80 мкМ H2S у плазмі крові людини та до 100 мкМ H2S у головному мозку [182, 198]. Потрібно зазначити, що такий рівень відображає не лише концентрацію вільного сірководню, але і концентрації гідросульфід (HS-) і сульфід-аніонів (S2-). За допомогою новітніх методів газової хроматографії та полярографічних методів аналізу було показано, що концентрація вільного газоподібного сірководню у плазмі крові становить 14-15 нМ [131, 173]. Тому у наших дослідженнях по впливу сірководню на проліферативну активність та інші процеси життєдіяльності МСК лінії 4BL людини in vitro ми використовували фізіологічні концентрації NаHS (10-8, 10-9, 10-10, 10-12, 10-13 і 10-15 моль/л).

3.4.1 Проліферація клітин лінії 4BL людини культивованих в умовах додавання донора сірководню

Показано, що проліферація фібробластоподібних клітин людини лінії 4BL людини вірогідно знижувалася відносно контрольних значень при додаванні у живильне середовище донора сірководню NаHS (10-8, 10-9 і 10-10 моль/л). На третю добу культивування при NаHS кількість клітин була у І-й групі 10,45 тис клітин/мл; у ІІ-й - 12,1 тис клітин/мл; у ІІІ-й - 15,95 тис клітин/мл, а у контролі - 181,5 тис клітин/мл (рис. 3.4.1.1, А).

Рис. 3.4.1.1. Проліферація клітин лінії 4BL контрольних (К) і дослідних (І - 10-8 моль/л, ІІ - 10-9 моль/л, ІІІ - 10-10 моль/л NaHS) груп на третю (А) та четверту (Б) добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Через 96 годин культивування в дослідних варіантах у середньому на чашках Петрі виросло 37-47 тис клітин/мл, у контролі кількість клітин збільшилась до 379,5 тис клітин/мл (рис. 3.4.1.1, Б). Проліферативний потенціал досліджуваних МСК був вірогідно (р<0,05) меншим відносно контролю при 10-12 М NaHS на 42%, при 10-13 моль/л - на 29% і при 10-15 моль/л - на 18% на третю добу культивування. (рис. 3.4.1.2).

Рис. 3.4.1.2. Проліферація клітин лінії 4BL контрольних (К) і дослідних (І - 10-12 моль/л, ІІ - 10-13 моль/л, ІІІ - 10-15 моль/л NaHS) груп на третю добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Таким чином, спостерігали зростання проліферації клітин лінії 4BL людини при зниженні концентрації донора сірководню. Максимальна кількість клітин була у контрольній групі, яка росла без додавання NaHS. Можливо нам не вдалося підібрати фізіологічну концентрацію даного газотрансмітера, щоб отримати стимулюючий ефект на культуру клітин.

Наші дослідження показали, що донор сірководню в межах досліджуваних концентрацій (10-8, 10-9, 10-10, 10-12, 10-13 і 10-15 моль/л NaHS) знижував проліферацію клітин лінії 4BL людини. Це явище, ймовірно, пов'язано з цитотоксичною дією газотрансмітера. H2S є ліпофільною молекулою, що може вільно проникати через плазматичну мембрану клітини та інгібувати клітинне дихання, послаблюючи активність цитохром-с-оксидази електронно-транспортного ланцюга мітохондрій [61].

Відомо, що сірководень здатний пригнічувати ріст клітин, знижувати їхню адгезію до субстрату [136], викликати ушкодження ДНК і змінювати експресію генів апоптозу [83].

Таким чином, результати наших досліджень свідчать, що донор сірководню у досліджуваних концентраціях здатний впливати не тільки на проліферацію фібробластоподібних клітин, але і на їхню морфологію. Культивування соматичних клітин людини лінії 4BL з NaHS призводить до появи атипових клітин та істотно знижує швидкість їхньої проліферації, що може свідчити про цитотоксичну дію сірководню.

3.4.2 Зміни активності лужної фосфатази і концентрації загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню

Аналіз результатів проведених нами дослідів показав, що концентрація загального білку в культуральній рідині при додаванні 10-8, 10-9 і 10-10 моль/л NaHS вірогідно не відрізнялась від контрольних значень (рис. 3.4.2.1). Можливо це пов'язано із некрозом клітин, внутрішній вміст яких опинився назовні.

Концентрація загального білку в культуральній рідині при додаванні 10-12 моль/л NaHS була 4,45±0,38 г/л; при 10-13 моль/л - 4,52±0,43 г/л; при 10-15 моль/л - 4,39±0,33 г/л порівняно з контролем - 3,71±0,33 г/л на третю добу культивування. Спостерігали деяку тенденцію до збільшення порівняно з контрольним значенням.

Рис. 3.4.2.1. Концентрація загального білку в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К) і дослідних (І - 10-8 моль/л, ІІ - 10-9 моль/л, ІІІ - 10-10 моль/л NaHS) груп на третю (А) та четверту (Б) добу культивування

Встановлено, що активність ЛФ на третю добу культивування вірогідно (р<0,05) знизилась у І-й групі на 24%, у ІІ-й групі - на 26%, а у ІІІ-й групі - на 16% порівняно з контрольними значеннями (рис. 3.4.2.2, А). На 4-ту добу цей показник був менший у І групі на 23%, у ІІ групі - на 22%, а у ІІІ групі - на 11% щодо контролю (рис. 3.4.2.2, Б).

Рис. 3.4.2.2. Активність лужної фосфатази в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К) і дослідних (І - 10-8 М, ІІ - 10-9 М, ІІІ - 10-10 М NaHS) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Результати наших досліджень показали, що при додаванні у живильне середовище 10-12, 10-13, 10-15 М NaHS активність ЛФ була вірогідно нижчою на 15, 13 і 17% відповідно щодо контрольних значень на третю добу культивування (рис. 3.4.2.3).

Зниження активності ЛФ у наших дослідженнях можна розглядати як підтвердження гальмівної дії Н2S на інтенсивність метаболізму і на початок остеогенної диференціації МСК лінії 4BL людини. Активність ЛФ є одним із маркерних показників початку диференціації МСК в остеобласти (клітини кісткової тканини) [50]. Концентрація загального білку в культуральній рідині при введені NaHS вірогідно не змінювалась.

Відомо, що МСК кісткового мозку миші ендогенно синтезують H2S з метою регулювання їх самооновлення і остеогенної диференціації через сульфгідратацію залишків цистеїну Са2+-каналів. Дефіцит газотрансміттера призводив до остеопорозу у мишей [179]. H2S бере участь у ремоделюванні пародонта, особливо в процесі переміщення зубів [174].

Рис. 3.4.2.3. Активність лужної фосфатази в культуральній рідині клітин лінії 4BL людини контрольних (К) і дослідних (І - 10-12 моль/л, ІІ - 10-13 моль/л, ІІІ - 10-15 моль/л NaHS) груп на третю добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

За допомогою методів статистичного аналізу був виявлений високий позитивний кореляційний зв'язок (r=0,75) між показниками активності ЛФ і проліферації клітин лінії 4BL людини. Низька позитивна кореляція (r=0,08) була встановлена між рівнем загального білку в культуральній рідині МСК і активністю проліферації досліджуваної лінії при додаванні різної концентрації NaHS у живильне середовище (рис. 3.4.2.4).

Рис. 3.4.2.4. Кореляційні зв'язки між активністю лужної фосфатази та проліферацією клітин лінії 4BL людини (А) і між концентрацією загального білку у культуральній рідині та проліферацією (Б) при дії донора сірководню у 10-8, 10-9, 10-10, 10-12, 10-13, 10-15 моль/л NaHS.

Таким чином, збільшення кількості клітин у культурі корелює із зростанням активності ЛФ. Ці результати підтверджуються даними досліджень на культурі СК кісткового мозку людини, що піддавалися впливу фармакологічних речовин хондроїтину сульфату, глюкозаміну гідрохлориду та їх комбінації [27].

3.4.3 Концентрація вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню

У цьому експерименті, ми дослідили зміни амінокислотного складу живильного середовища при дії донора сірководню NaHS у 10-8, 10-9, 10-10, 10-13, 10-15 моль/л на МСК лінії 4BL людини. Показано, що на 3-тю добу культивування при 10-8 моль/л NaHS концентрація 12 із 13 фракцій АК мала тенденцію до збільшення порівняно з контролем (рис. 3.4.3.1).

Рис. 3.4.3.1. Концентрація фракцій вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню 10-8 моль/л NaHS на третю добу культивування

Аналогічну тенденцію до збільшення 7 груп АК спостерігали при додаванні 10-9 моль/л NaHS. Вірогідно вищим був вміст лізину і аспаргіну на 32% (р<0,05), гліцину і метіоніну - на 19%, аланіну і глутаміну - на 15%, треоніну та ізоваліну - на 22% відповідно контрольним значенням (рис. 3.4.3.2).

Рис. 3.4.3.2. Концентрація фракцій вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню 10-9 моль/л NaHS на третю добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

За умов додавання у живильне середовище 10-10 моль/л NaHS на третю добу культивування виявлено тенденцію до зростання показників 10 фракцій АК (рис. 3.4.3.3). Це можна розглядати як ознаку більш інтенсивного поглинання вільних АК клітинами контрольної групи, які не піддавалися впливу сірководню. Збільшення концентрації АК у культуральній рідині можливо пов'язано із загибеллю самих клітин, внутрішній вміст яких опиняється назовні, та із деградацією білків, що знаходяться у живильному середовищі.

Рис. 3.4.3.3. Концентрація фракцій вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню 10-10 моль/л NaHS на третю добу культивування

Аналіз результатів проведених нами дослідів показав, що на 4-ту добу культивування МСК при 10-8 М NaHS вірогідно нижчою була концентрація аланіну і глутаміну на 24%, лейцину - на 17%. Показники усіх інших фракцій АК залишались на рівні контролю. Концентрація 11 із 13 досліджуваних груп АК в культуральній рідині при введені 10-9 моль/л NaHS вірогідно не змінювалась. Лише вміст аланіну і глутаміну був нижчим на 17% (р<0,05), а проліну і оксипроліну - на 36% порівняно з контролем (рис. 3.4.3.4).

Рис. 3.4.3.4. Концентрація фракцій вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню 10-9 моль/л NaHS на четверту добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Через 96 год культивування клітин лінії 4BL у присутності 10-10 моль/л NaHS вірогідно більшою буда концентрація 3-х фракцій АК у живильному середовищі, а саме: аргініну, гістидину і таурину - на 20%, лізину і аспарагіну - на 12%, а гліцину і метіоніну - на 30% порівняно з контролем. У тих же умовах статистично значимо знизився рівень тирозину і глутамінової кислоти на 16%, а треоніну і ізоваліну - на 13% (рис. 3.4.3.5).

Рис. 3.4.3.5. Концентрація фракцій вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини інкубованих в умовах додавання донора сірководню 10-10 моль/л NaHS на 4-ту добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем.

Показано, що додавання 10-13, 10-15 моль/л NaHS викликало зміну концентрацій АК у культуральній рідині на третю добу культивування. Вміст лізину і аспарагіну був вірогідно нижчим на 18, 31% (р<0,05); гліцину і метіоніну - на 16, 22%; валіну і триптофану - на 12, 18% відповідно порівняно з контролем (табл. 3.4.3.1).

Таблиця 3.4.3.1

Вплив гідросульфіду натрію 10-13 і 10-15 моль/л на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем;

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю

У літературі описано мало результатів досліджень, що стосуються метаболізму амінокислот у стовбурових клітинах поза їх загальної ролі в синтезі білків.

Shyh-Chang N. зі співавт. [218] вивчав метаболізм треоніну у плюрипотентних мишачих ембріональних стовбурових клітинах (ЕСК). Ізотопне маркування ЕСК показало, що незамінна АК треонін використовується для синтезу білків. Виявлено, що треонін і цикл S-аденозилметіоніна (SAM) з'єднані в метаболізмі плюрипотентних стовбурових клітинах, що призводить до регуляції метилювання гістонів. Треонін під впливом треонінальдолази розпадається на гліцин і оцтовий альдегід (останній далі перетворюється в ацетил-КоА і ацетоацетил-КоА). Ацетил-коА є необхідним для синтезу SAM. Виснаження треоніну у живильному середовищі, або треонін дегідрогенази у ЕСК, призводить до зменшення рівня SAM і зниження триметилювання гістона H3 лізину 4 (H3K4me3), що призводить до сповільнення росту і диференціації клітин. Таким чином, при наявності вільного треоніну, з'являється велика кількість SAM, що впливає на метилювання гістонів H3K4me3 у ядрі, забезпечуючи можливий механізм, за допомогою якого модуляція метаболічного шляху може впливати на долю стовбурових клітин [218].

Дослідження Chen G. та співавт. [99-100] демонструють, що треонін бере участь у епігенетичних модифікаціях хроматину, необхідних для самооновлення і підтримки плюрипотентності ЕСК миші.

В експериментах in vitrо, проведених на культурі людських МСК кісткового мозку, показано, що аргінін (0; 0,1; 1 і 10 мкМ) впливав на проліферацію і диференціацію клітин. Посилював проліферацію на 36% при концентрації 10 мкМ аргініну протягом перших 48 год. Починаючи з 3-ї до 10-ї доби культивування, аргінін в дозах від 0,1-10 мкМ не стимулював проліферацію МСК. Це може свідчити про те, що аргінін не впливає на проліферацію МСК на даному етапі. Показано, що аргінін індукує остеогенну диференціацію МСК кісткового мозку людини та інгібує адипогенну диференціацію шляхом залучення Wnt5a і NFATc сигнального шляху [152]. Проте результатів досліджень впливу сірководню на амінокислотний склад культуральної рідини стовбурових клітин ми не знайшли.

Результати наших досліджень показали, що концентрація 10-12 фракцій вільних АК у культуральній рідині МСК лінії 4BL мала тенценцію до зростання, або вірогідно збільшувалась при додаванні донора сірководню NaHS у 10-8, 10-9, 10-10 моль/л на 3-тю добу культивування порівняно з контролем. Це можна пояснити малою кількістю клітин у досліджуваних групах (див. рис. 3.4.1.1). Клітини контрольної групи мали високу проліферативну активність, тому інтенсивно поглинали вільні АК із живильного середовища. У присутності 10-13 і 10-15 моль/л NaHS рівень 9-10 фракцій АК залишався близьким до контрольних значень. На 4-ту добу культивування вірогідно знизилась концентрація Ala+Gln і Leu при 10-8 моль/л, Ala+Gln і Pro+Hyp при 10-9 моль/л, Thr+Isovaline і Tyr+Glu при 10-10 моль/л NaHS. Відомо, що МСК синтезують компоненти міжклітинного матриксу, зокрема колаген, мономерними одиницями якого є АК [80]. Зменшення вмісту вільних АК корелює із підвищенням кількості клітин.

Підсумовуючи вищенаведене, слід зазначити, що при 10-8, 10-9, 10-10 моль/л NaHS концентрація майже всіх фракцій вільних АК у середовищі мала тенденцію до зростання, або була вірогідно більшою порівняно з контролем на третю добу культивування. Збільшення концентрації АК у культуральній рідині можливо пов'язано із загибеллю самих клітин, внутрішній вміст яких опиняється назовні, та із деградацією білків, що знаходяться у живильному середовищі. Також, це може бути пов'язано із зростанням трофічних потреб контрольної популяції клітин, що активно проліферують і тим самим збільшують свою кількість. При додаванні у живильне середовище донора H2S у більш низьких концентраціях 10-13, 10-15 моль/л вірогідно знижувало концентрацію лізину і аспарагіну (на 18 і 31%), гліцину і метіоніну (на 16 і 22%), валіну і триптофану (на 12 і 18%) порівняно з контролем. Фракції інших АК залишались на рівні контролю. Це можна пояснити інтенсивним поглинанням даних АК клітиною, що включалися у біосинтез білка, або використовувались у енергетичному метаболізмі.

3.5 Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на культуру клітин лінії 4BL людини

З літературних джерел відомо, що і низьке Ро2 і різні концентрації H2S впливають на процеси життєдіяльності клітин [5, 11, 56, 96, 109, 132]. Проте їх сумісний вплив на проліферацію і диференціацію МСК у доступній для нас літературі не описано. Тому ми дослідили сумісний вплив донора сірководню 10-12 моль/л NаHS та 24-годинного зниженого Ро2 23 і 38 мм рт. ст. (що еквівалентно 3 і 5% О2) на культуру клітин лінії 4BL людини.

3.5.1. Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на проліферацію клітин лінії 4BL людини

Наші дослідження показали, що культивування в умовах зниженої концентрації кисню (3%, 5% О2, 24 год) та у присутності донора сірководню (10-12 моль/л NаHS) гальмувало проліферацію соматичних клітин людини лінії 4BL. На третю добу культивування у контролі кількість клітин була 165 тис клітин/мл, у І групі - 95,7 тис клітин/мл, у ІІ - 59,4 тис клітин/мл, а у ІІІ - 39,6 тис клітин/мл (рис. 3.5.1.1, А).

На четверту добу кількість клітин знизилась у І групі на 29% (р<0,05), у ІІ - на 33%, а у ІІІ - на 54% порівняно з контролем (рис. 3.5.1.1, Б). Слід відмітити, що зниження концентрації кисню, при наявності у культуральній рідині NаHS, супроводжувалося додатковим зменшенням кількості клітин. Отже, ми зареєстрували посилення несприятливого впливу одного фактору (NаHS) дією іншого фактору (3%, 5% О2).

Зниження загальної кількості клітин можливо пов'язано із цитотоксичним впливом сірководню. Відомо, що Н2S може зупиняти клітинне дихання [162-164]. Механізм токсичної дії Н2S пов'язаний здебільшого із інгібуванням металовмісних ферментів. Таким чином, сірководень блокує передачу електронів із цитохромоксидази, ензима мітохондріального дихального ланцюга, на кисень. Внаслідок такої дії гальмується вивільнення енергії в клітинах.

В наших дослідженнях показано, що за умов культивування при 10-12 моль/л NаHS як окремо та і разом із 3%, 5% О2 пригнічувалась проліферація соматичних клітин людини лінії 4BL у культурі.

Рис. 3.5.1.1. Проліферація клітин лінії 4BL контрольних (К) і дослідних (І - 21% О2 + 10-12 моль/л NaHS; ІІ - 5% О2 + 10-12 моль/л NaHS; ІІІ - 3% О2 + 10-12 моль/л NaHS) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

3.5.2 Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на активність лужної фосфатази і концентрацію загального білку у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини

При додаванні 10-12 моль/л NaHS та сумісного впливу зі зниженим Ро2 23, 38 мм рт. ст. концентрація загального білку в культуральній рідині не відрізнялася від контролю.

Одним із маркерних показників початку остеогенної диференціації МСК є активність лужної фосфатази [50]. Показано, що активність ЛФ на 3-тю добу культивування вірогідно (р<0,05) знизилась у І групі на 29%, у ІІ групі - на 47%, а у ІІІ групі - на 55% порівняно з контрольними значеннями (рис. 3.5.2.1, А).

Рис. 3.5.2.1. Активність лужної фосфатази в культуральній рідині клітин лінії 4BL контрольних (К) і дослідних (І - 21% О2+10-12 моль/л NaHS; ІІ - 5% О2+10-12 моль/л NaHS; ІІІ - 3% О2+10-12 моль/л NaHS) груп на 3-тю (А) та 4-ту (Б) добу культивування. *р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

На 4-ту добу активність ЛФ в культуральній рідині клітин лінії 4BL була нижче у І групі на 21%, у ІІ групі - на 35%, а у ІІІ групі - на 46% щодо контролю (рис. 3.5.2.1, Б). Інгібування активності ЛФ, а отже і гальмування остеогенної диференціації при Н2S показано й іншими дослідниками. Встановлено, що сірководень є потужним інгібітором диференціації остеобластів і фосфатно-індукованої кальцифікації гладком'язових клітин судини [250]. Гідросульфід натрію - донор Н2S - пригнічував диференціацію остеокластів і остеобластів у клітинах періодонтальної зв'язки людини [171].

Аналіз ступеня взаємозв`язків між дослідженими показниками за умов сумісного впливу зниженого Ро2 23, 38 мм рт. ст. і 10-12 моль/л NaHS показав наявність високого позитивного кореляційного зв'язку (r=0,76) між активністю ЛФ і проліферацією клітин (рис. 3.5.2.2). Між кількістю клітин досліджуваної лінії і концентрацією загального білку - середній позитивний кореляційний зв'язок (r=0,5).

Рис. 3.5.2.2. Кореляційні зв'язки між активністю лужної фосфатази та проліферацією клітин лінії 4BL людини (А) і між концентрацією загального білку у культуральній рідині та проліферацією (Б) при дії донора сірководню у 10-12 моль/л NaHS та сумісного впливу зі зниженим парціальним тиском кисню 23, 38 мм рт. ст.

Отримані результати ми схильні розглядати як свідоцтво гальмівної дії Н2S на остеогенну диференціацію МСК лінії 4BL людини. Важливо також зазначити, що несприятливий вплив 10-12 М NaHS на диференціацію в остеогенному напрямку підсилювався при зниженні Ро2.

3.5.3 Сумісний вплив гідросульфіду натрію та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітин лінії 4BL людини

Обмін речовин, або метаболізм ? складає основу життєдіяльності клітини. Із зовнішнього середовища у клітину поступають вода, іони солей, неорганічні і органічні молекули. Через плазматичну мембрану із клітини виводяться продукти обміну, а також речовини, синтезовані у клітині (білки, вуглеводи, гормони). Амінокислоти є мономерними одиницями білків, тому ми дослідили зміни їх концентрацій у культуральній рідині МСК.

Показано, що на третю добу культивування МСК лінії 4BL при 10-12 моль/л NaHS був вірогідно (р<0,05) знижений вміст наступних вільних амінокислот у культуральній рідині: серину і аспарагінової кислоти ? на 12%, а також треоніну і ізоваліну ? на 12% порівняно з контролем (табл. 3.5.3.1). Концентрація 11 із 13 фракцій вільних АК була на контрольному рівні.

На четверту добу культивування клітин досліджуваної лінії при додаванні 10-12 моль/л NaHS у живильне середовище зросла концентрація аланіну і глутаміну (на 14%); аргініну, гістидину і таурину (на 19%); гліцину і метіоніну (на 46%). Концентрація цистеїну і цистину була нижча на 22%, валіну і триптофану - на 27%, проліну і оксипроліну - на 30%, серину і аспарагінової кислоти - на 35%, фенілаланіну - на 16% i лейцину - на 20% щодо контролю (див. табл. 3.5.3.1).

Таблиця 3.5.3.1

Вплив гідросульфіду натрію (10-12 моль/л) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини при атмосферній концентрації кисню (мг/мл, М±m)

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю;

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Гідросульфід натрію у досліджуваній концентрації при 5% О2 по-різному впливав на амінокислотний склад культуральної рідини МСК лінії 4BL людини (табл. 3.5.3.2). Ми наведемо дані тих фракцій амінокислот, що змінювалися вірогідно (р<0,05). Так, на 4-ту добу концентрація цистеїну і цистину, які зміцнюють сполучну тканину, була нижчою відносно контрольних значень на 51%; серину і аспарагінової кислоти ? на 38%; валіну і триптофану ? на 53%; тирозину і глутамінової кислоти - на 31%, ізоваліну і треоніну ? на 22%; а проліну і оксипроліну, які входять до складу колагену ? на 50%. Збільшився вміст аргініну, гістидину і таурину на 33%, аланіну і глутаміну ? на 35%, гліцину і метіоніну ? на 24% порівняно з контролем (див. табл. 3.5.3.2).

Таблиця 3.5.3.2

Сумісний вплив гідросульфіду натрію (10-12 моль/л) та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню (38 мм рт. ст., що еквівалентно 5% О2 у газовій суміші) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю;

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Культивування клітин при додаванні 10-12 моль/л NaHS в умовах зниженої концентрації кисню до 3% змінювало амінокислотний склад культуральної рідини МСК лінії 4BL людини (табл. 3.5.3.3).

Таблиця 3.5.3.3

Сумісний вплив гідросульфіду натрію (10-12 М) та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню (23 мм рт. ст., що еквівалентно 3% О2 у газовій суміші) на концентрацію вільних амінокислот у культуральній рідині клітинної лінії 4BL людини (мг/мл, М±m)

Д - різниця між показником дослідного варіанту відносно контролю;

*р<0,05 - статистична вірогідність порівняно з контролем

Показано, що на четверту добу концентрація цистеїну і цистину була вірогідно (р<0,05) нижчою на 41%; серину і аспарагінової кислоти ? на 54%; валіну і триптофану ? на 40%; ізоваліну і треоніну ? на 23%; а проліну і оксипроліну ? на 35% порівняно з контрольними даними. Збільшився вміст Arg+His+Taurine на 46%, Lys+Asn - на 20%, Ala+Gln ? на 21%, Gly+Met ? на 72%, Tyr+Glu - на 22% порівняно з контролем.

Знижений рівень амінокислот у культуральній рідині може свідчити про їх більш інтенсивне поглинання клітиною. Незамінні амінокислоти, на відміну від замінних, не синтезуються у людському організмі і повинні обов'язково надходити з їжею. До них відносять наступні амінокислоти: валін, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, треонін, триптофан, фенілаланін, гістидин (для дітей), аргінін (для дітей та осіб похилого віку) [100]. У наших дослідах, зниження концентрації фенілаланіну, лейцину, валіну і триптофану у живильному середовищі клітинної лінії 4BL людини можна пояснити їх незамінністю.

Цистеїн входить до складу багатьох білків, тому він активно поглинається клітиною. До складу цистеїну входить тіольна група -SH, завдяки чому дві молекули (чи їх залишки у складі пептидів) цієї речовини можуть з'єднуватись дисульфідним зв'язком, що формується шляхом окиснення -SH груп, утворюючи сполуку цистин. Такі зв'язки важливі для формування і підтримання третинної структури білків. Відомо, що ендогенний H2S синтезується із L-цистеїну за допомогою цистатіонін-в-синтази, цистатіонін-г-ліази і 3-меркаптопіруватсульфуртрансферази [61].

У літературі ми не виявили даних щодо впливу донора сірководню на амінокислотний склад культуральної рідини стовбурових клітин в умовах зниженої концентрації кисню. Проте Аніскіна А.І. зі співавторами [4] дослідили вплив 20 амінокислот (0,05 нг/мл) на клітинну проліферацію і апоптоз в органотиповій культурі тканин (селезінка, печінка, нервова тканина) молодих (1-місячних) і старих (18-місячних) щурів. Виявлено стимуляцію зони росту при дії чотирьох амінокислот - лізину, аспарагіну, аргініну і глутамінової кислоти в культурі тканин селезінки і печінки. Інші амінокислоти інгібували, або не впливали на проліферацію клітин. Протилежні ефекти спостерігали в експлантатах кори головного мозку. Стимулюючу дію мали амінокислоти з високою гідрофобністю: аспарагінова кислота, тирозин, валін, треонін, метіонін, лейцин, а інгібуючу - гліцин, пролін, триптофан [4].

Будь-яка із замінних амінокислот може синтезуватися в організмі у необхідних кількостях. При цьому вуглецева частина амінокислоти утворюється з глюкози, а б-аміногрупа вводиться з інших амінокислот шляхом трансамінування [134]. Слід відмітити, що у всіх дослідних варіантах нашого експерименту у культуральній рідині зростала концентрація аргініну, гліцину, аланіну і глутаміну, які є замінними амінокислотами, а концентрація серину і аспарагінової кислоти, навпаки, знижувалася. Таку закономірність можна пояснити тим, що гліцин синтезується із серину під дією сериноксиметилтрансферази у присутності тетрагідрофолієвої кислоти. Серин утворюється з гліколітичного проміжного продукту 3-фосфогліцерату. Аланін, аспартат (попередник аспарагіну), глутамат (попередник глютаміну, аргініну) утворюються із пірувату, оксалоацетату й б-кетоглутарату ? відповідно. Аргінін у клітині служить джерелом NO [139]. Під дією аргінази аргінін перетворюється на амінокислоту орнітин, яка не входить до складу білків організму. З орнітину синтезуються поліаміни: путресцин, спермідин і спермін. Вони мають великий позитивний заряд, легко зв'язуються з негативно зарядженими молекулами ДНК і РНК, входять до складу хроматину і беруть участь у реплікації ДНК, стимулюють процеси транскрипції і трансляції. Їх концентрація сильно зростає при інтенсивній проліферації тканин [139].

Отримані нами дані подібні до результатів досліджень Higuera G зі співавторами [146]. За допомогою високоафінної рідинної хроматографії вони дослідили закономірності метаболізму амінокислот у МСК кісткового мозку людини при статичному (на пластику, 8 діб) та динамічному (у біореакторі, 5 діб) культивуванні. Клітини секретували у культуральну рідину аланін, гліцин, глутамат та орнітин, а поглинали - глутамін, гістидин, серин, тирозин, аспартат і 8 незамінних амінокислот [146].

Отримані нами дані свідчать, що поєднаний вплив гіпоксії (3%, 5% О2) і сірководню знижує проліферацію соматичних клітин людини лінії 4BL. Зміни вмісту вільних амінокислот у культуральній рідині мали свої особливості. Зменшувалась концентрація вільних амінокислот, що беруть участь у синтезі колагену (пролін, оксипролін) та інших білків. Підвищувалася концентрація амінокислот (гліцину, аланіну, аргініну, глутаміну), які можуть включатися в енергетичний обмін.

Підсумовуючи результати досліджень сумісного впливу гідросульфіду натрію (10-12 моль/л) та 24-годинного зниженого парціального тиску кисню (23 і 38 мм рт. ст.), наведені у підрозділі 3.5, можна зробити наступні узагальнення:

1. У культуральній рідині всіх дослідних груп клітин лінії 4BL людини при сумісному впливі зниженої концентрації кисню (5%, 3% О2) та донора сірководню (10-12 моль/л NаHS) вірогідно (р<0,05) підвищувалася концентрація трьох фракцій амінокислот: Arg+His+Taurine, Gly+Met та Ala+Gln. Концентрація цистеїну і цистину, серину і аспарагінової кислоти, валіну і триптофану, проліну і оксипроліну знижувалася відносно контрольних значень.

2. Додавання NаHS (10-12 моль/л) у живильне середовище при 21% О2 гальмувало проліферацію соматичних клітин лінії 4BL людини в 1,4-1,7 раза та знижувало активність лужної фосфатази на 21-29%.

3. Донор сірководню, в умовах зниженої концентрації кисню (5%, 3% О2), пригнічував проліферацію клітинної лінії 4BL людини на 4-ту добу культивування на 33, 54% відповідно порівняно з контролем. За тих же умов гальмувалась остеогенна диференціація, одним із маркерних показників якої є активність лужної фосфатази, на 35, 46% відповідно щодо контрольних значень.

4. Понижений парціальний тиск кисню здатний посилювати гальмівний вплив H2S на проліферацію та інтенсивність метаболізму клітин лінії 4BL людини, тому культивування даної популяції при сумісній дії цих двох факторів не сприяє фізіологічному розмноженню клітин.

Розділ 4. Обговорення результатів дослідження

У лабораторії Фріденштейна О.Я. в 70-х рр. ХХ ст. вперше виділили з кісткового мозку щурів, мурчаків і людини, успішно культивували і описали фібробластоподібні клітини, що отримали в подальшому назву мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини [128-129]. Крім кісткового мозку, ММСК або ММСК-подібні клітини були виділені з безлічі інших тканин - скелетного м'яза [239], жирової тканини [255-256], пупкового канатика [124], синовіальної оболонки [112], периферичної крові [168], пульпи зуба [138], амніотичної рідини [204, 227], а також з ембріональних і фетальних тканин: крові, печінки, кісткового мозку і легень [91, 125, 193].

Відомо, що МСК здатні до самовідтворення, а також до диференціації в різні типи тканин мезенхімального та іншого походження, включаючи остеоцити, хондроцити, гепатоцити, адипоцити, нейрони, м'язові, епітеліальні клітини [154, 170, 200] в залежності від мікрооточення або факторів диференціювання. Показано, що МСК мають протизапальну та імуномодулювальну дію [34, 106, 191]. Завдяки своїм властивостям МСК нині знаходять усе більш широке використання в регенеративній медицині, трансплантології та тканинній інженерії [3, 120, 209].

Cучасні технології надають широкі можливості для контрольованої зміни параметрів культивування різних типів клітин. Однак найчастіше ці зміни стосуються хімічних компонентів живильного середовища (вмісту поживних речовин, факторів росту, солей і амінокислот). Газовий склад традиційно залишається найбільш консервативним параметром при культивуванні, при цьому рівень СО2 наближається до тканинного, тоді як вміст кисню в звичайних СО2-інкубаторах відповідає Ро2 в атмосферному повітрі (близько 159 мм рт. ст., що еквівалентно 21%). Питання про те, яка концентрація О2 є фізіологічною для клітин in vitro, активно обговорюється в науковій літературі [12, 45, 49, 189]. У зв'язку з цим робляться спроби вивчення стану культивованих клітин при різному вмісті кисню. Однак немає єдиної думки про те, яку концентрацію кисню треба використовувати, який час клітини повинні піддаватися впливу зміненого вмісту кисню, як при цьому слід враховувати такі фактори, як склад середовища, щільність субкультивування клітин та ін. В організмі концентрація О2 значно нижча, ніж в атмосферному повітрі, а саме: в альвеолах - 15%, у венозній крові - 5%, у кістковому мозку концентрація О2 варіює від 1 до 7%...