1.1 Нейтрофилы, их характеристика

Полиморфноядерные (сегментоядерные) гранулоциты, или нейтрофилы, составляют преобладающую популяцию лейкоцитов в крови млекопитащих и реализуют первую линию защиты в системе врожденного иммунитета, обеспечивая ответ организма на бактериальные и грибковые инфекции. Нейтрофилы образуются в костном мозге из стволовых мультипотентных гемопоэтических клеток в миелопоэзе. Последовательные этапы дифференцировки миелоидных предшественников нейтрофилов (миелобласт, промиелоцит и миелоцит) завершаются фазой созревания нейтрофилов в метамиелоцит, палочкоядерную и зрелую сегментоядерную формы, которые характеризуются ультраструктурными изменениями ядра и гранул. После цикла дифференцировки, который составляет в зависимости от степени активности процесса от 7 до 10 дней, около 10% созревших нейтрофилов попадают из костного мозга в кровоток, большая часть зрелых нейтрофилов депонируется в синусах костного мозга. Пополнение зрелых клеток в кровяном русле ежедневно составляет порядка 1011 клеток, а концентрация нейтрофилов в крови варьирует в диапазоне 3-5Ч106/мл. Доля циркулирующих в крови зрелых сегментоядерных нейтрофилов составляет от 45% до 75% от общего количества лейкоцитов человека. Эти клетки также представлены в виде регионального пула, выстилающего внутреннюю поверхность капилляров в ткани легких, печени и селезенки [Peters, 1998].

Средняя продолжительность циркуляции нейтрофилов в кровотоке составляет 8-20 ч, после чего, если их не активируют факторы воспаления, нейтрофилы мигрируют в ткани. После миграции в ткани продолжительность жизни нейтрофилов составляет, как правило, 1-2 дня, затем они подвергаются спонтанному апоптозу и уничтожаются макрофагами, тем самым минимизируя повреждения ткани цитотоксическим содержимым своих гранул [Fox et al., 2010]. Пролонгация времени жизни нейтрофилов связана с их реакцией на цитокины воспаления и ассоциирована с персистенцией воспаления [Galligan and Yoshimura, 2003]. Развитие апоптоза в нейтрофилах может ингибироваться при добавлении интерлейкинов IL-1в, IL-6, фактора некроза опухоли альфа (TNFб), гамма-интерферона (IFNг), гранулоцитарно-макрофагального колонестимулирующего фактора (GM- CSF), гранулоцитарного колонестимулирующего фактора (G-CSF), липополисахарида (LPS) [Colotta et al., 1992].

Апоптоз может запускаться различными механизмами: внутренним (митохондриальным), внешним (рецептор-опосредованным) и механизмом, опосредованным развитием стресса эндоплазматического ретикулума (ER- стресса). В нейтрофилах реализуются все три описанных механизма апоптоза [Binet et al., 2010].

Средний размер зрелых нейтрофилов составляет 12-15 мкм. Эти клетки имеют сложную систему актинового цитоскелета, которая ответственна за процессы хемотаксиса, фагоцитоза и экзоцитоза. Клеточное ядро зрелых нейтрофилов имеет характерный внешний вид, оно состоит из 2-5 сегментов, связанных хроматином.

1.1.1 Нейтрофильные гранулы

Азурофильные гранулы являются самыми крупными в цитоплазме нейтрофилов и образуются раньше других гранул, еще на этапе промиелоцита, что позволяет считать их первичными. Несмотря на высокое содержание в азурофильных гранулах кислых гидролаз, характерных для

лизосом, на мембране этих гранул отсутствуют лизосомальные мембрано- ассоциированые белки LAMP-1 и LAMP-2, что отличает эти гранулы от истинных лизосом [Dahlgren et al., 1995; Cieutat et al., 1998].

Азурофильные гранулы относятся к секретируемым гранулам, их компоненты высвобождаются не только в фагосому в процессе фагоцитоза, но и на поверхность нейтрофилов, а также во внеклеточное пространство при дегрануляции. Азурофильные гранулы содержат белки и пептиды, обладающие микробицидными свойствами, такие как миелопероксидаза, гемосодержащий фермент, который образует одну из систем генерации активных форм кислорода (АФК). Компонентами азурофильных гранул являются также нейтральные (сериновые) протеиназы: катепсин G, эластаза, протеиназа 3, азуроцидин [Pederzoli et al., 2004; Durant et.al., 2010], а также дефенсины, фактор BPI (bactericidal/permeability-increasing protein), обладающий LPS-связывающей и нейтрализующей активностью, лизоцим и др. [Levy, 2000]. Основное содержимое этого типа гранул составляют высококатионные белки, которые находятся в связанном состоянии с негативно заряженными сульфатными протеингликанами на внутренней поверхности азурофильных гранул. Такая модификация белков внутри гранул позволяет находиться протеолитическим ферментам в инактивированном состоянии до момента их высвобождения [Owen et al., 1995].

Вторичные, или специфические, гранулы являются секретируемыми гранулами. Этот тип гранул содержит маркерный белок лактоферрин, который является хелатором ионов железа и меди, необходимых для роста бактерий, и катализирует образование гидроксил-радикала [Bullen and Armstrong, 1979; Winterbourn, 1983]. Специфические гранулы заключают в себе бактериостатические и бактерицидные вещества: щелочную фосфатазу, белок связывающий витамин В-12 (кобалофилин), активатор плазминогена, коллагеназу, две трети от общего количества лизоцима, липокалин

[Bundgaard et al., 1994], желатиназу [Hibbs and Bainton, 1989]. Коллагеназа расщепляет коллаген, что позволяет нейтрофилам свободно двигаться к очагу воспаления и повреждения. При дефиците специфических гранул нейтрофилы обладают слабой активностью, что, по-видимому, связано с нарушением их миграции [Witko-Sarsat et al., 2000].

Основным содержимым третичных гранул, как следует из названия, является желатиназа. Этот фермент облегчает миграцию нейтрофилов в окружающие их ткани. Помимо этого, в третичных гранулах обнаружены небольшие количества ацетилтрансферазы и лизоцима. Наряду с дегрануляцией специфических гранул, при стимуляции нейтрофилов происходит дегрануляция содержимого этих типов гранул. Одним из основных мембранных компонентов как специфических, так и желатиназных гранул являются рецепторы адгезии Mac-1 (CD11b/CD18) [Borregaard and Cowland, 1997].

Четвертый тип гранул, называемый секреторными везикулами, появляется на стадии созревания нейтрофилов. Известно, что основым содержимым секреторных везикул является белок плазмы - альбумин, что указывает на их эндоцитозное происхождение [Borregaard et al., 1992]. Эти органеллы в нейтрофилах являются наиболее мобильными внутриклеточными структурами, способными к быстрому процессу экзоцитоза. Одной из функций этих гранул является сохранение запаса мембранных компонентов. Мембрана этого типа гранул богата рецеторами, которые в процессе экзоцитоза интегрируются в состав плазматической мембраны. Компонент NADPH-оксидазы, основного продуцента АФК, в виде

комплекса gp91phox-p22phox (цитохром b558) локализован на мембране

секреторных везикул [Segal, 2005]. Также в своем составе они имеют щелочную фосфатазу, рецептор к пептидному продукту бактерий fMLP (formyl-1-methionyl-1-leucyl-1-phenylalanine), рецептор к компоненту системы комплемента CR1 [Sengelov et al., 1994]. Секреторные везикулы способны

высвобождаться на поверхности нейтрофилов даже при отсутствии внеклеточного Ca2+ [Sengelov et al., 1993].

Лизосомы выделяют в качестве отдельного гранулярного компартмента. Они содержат кислые гидролазы, высвобождение содержимого лизосом в фагосому происходит позднее, чем высвобождение содержимого азурофильных гранул. [Segal et al., 1980].

1.1.2 Поверхностные маркеры нейтрофилов

Некоторые рецепторы распознают патоген-ассоциированные молекулы (к аминопептидазе N - СD13, к компоненту бактериальной стенки LPS - CD14, TLR (Toll-like receptors); другие рецепторы распознают факторы, которые выделяются в тканях в процессе воспаления (TNFб/вR). Также на поверхности нейтрофилов охарактеризованы рецепторы для взаимодействия с Fc-фрагментами антител, рецепторы для белковых фрагментов системы комплемента С3b/С4b и iC3b/C4b - СR1 (CD35) и СR3 (CD11b/CD18), соответственно.

При появлении в организме патогена, нейтрофилы первыми реагируют на медиаторы воспаления - хемоаттрактанты, которые высвобождаются из бактерий, мертвых клеток или продуцируются стромальными и эндотелиальными клетками в воспаленных участках. Классическими хемоаттрактантами для нейтрофилов принято считать fMLP, LTВ4 (лейкотриен B4), PAF (platelet activating factor), компонент системы комплемента С5а, цитокин CXCL8 (IL-8), что определяются присутствием на поверхности нейтрофилов соответствующих рецепторов. Эти рецепторы принадлежат к суперсемейству трансмембранных гликопротеиновых «серпентиновых» рецепторов GPCR, связанных с внутриклеточными GTP- связанными белками, которые инициируют активацию двух параллельных путей сигналинга. Один из них опосредован активирующим действием через вторичные посредники фосфолипаз С на протеинкиназу С и регуляцию потока Ca2+. Другой путь запускается при активации фосфатидилинозитол-3- киназы (PI3К) с последующим образованием фосфатидилинозитол-3,4,5 трифосфатов в качестве вторичных посредников. Эти посредники вовлечены в процессы дегрануляции и активации NADPH-оксидазы [Li et al., 2000]. Также описано, что в дегрануляции и респираторном взрыве участвуют активированные с помощью GPCR тирозиновые киназы (Srс-семейства) и митоген-активированные протеинкиназы (MAP) [Mуcsai et al., 1997].

Важным этапом миграции нейтрофилов к месту воспаления является прикрепление нейтрофилов к эндотелию сосудов и трансэпителиальная миграция с участием молекул адгезии, таких как в2-интегринов, эндотелиальных Р- и Е-селектинов, и L-селектина, экспрессируемого нейтрофилами. Охарактеризованы основные рецепторы адгезии нейтрофилов: бмв2-интегрины Mac-1 и высокоафинный LFA-1 (CD11a/CD18), а также лиганды к P-селектину и к E-селектину - PSGL-1 и ESL-1, соотвественно [Witko-Sarsat et al., 2000]. Агонистами, запускающими активацию интегринов в нейтрофилах, являются упомянутые выше хемоаттрактанты (fMLP, IL-8, C5a), LPS, TNFб и GM-CSF. Нейтрофилы интегрируют сигналы от рецепторов при кластеризации интегринов и взаимодействии с субстратом адгезии с поступающими в это же время сигналами от воспалительных цитокинов и/или хемоаттрактантов. Это приводит к активации различных тирозиновых киназ [Fuortes et al.,1999;

Abram and Lowel, 2009], малых G-белков, активации актин-зависимых процессов, приводящих к дегрануляции и избыточной продукции АФК [Lowell and Berton, 1999]. Показано, что наличие в составе адгезивных белков специфической аминокислотной последовательности Arg-Gly-Asp (RGD - последовательность) влияет на характер их взаимодействия с интегринами, угнетая активацию нейтрофилов, возможно, защищая от спонтанной активации в кровяном русле [Gresham et al., 1989].

Наиболее важные рецепторы, экспрессируемые на поверхности нейтрофилов, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные рецепторы, экспрессирующиеся на поверхности нейтрофилов.

С изменениями из [Futosi et al., 2013]

1.2 Функции нейтрофилов и их роль в системе иммунитета

Нейтрофилы выполняют свои эффекторные функции благодаря способности распознавать чужеродные субстанции. В ходе последовательных реакций осуществляется комплекс следующих событий: фагоцитоз и внутриклеточное переваривание, высвобождение бактерицидных цитотоксических факторов при дегрануляции во внеклеточное пространство, продукция АФК и ряда хемокинов, образование внеклеточных ловушек. Собственная продукция нейтрофилами цитокинов влияет на активацию клеточного ответа Th1 или Th2, обеспечивая взаимодействие звеньев гуморального и клеточного иммунитета [Di Carlo et al., 2001].

1.2.1 Фагоцитоз

Нейтрофилы интернализуют как опсонизированные, так и неопсонизированные частицы. Фагоцитоз опсонизированных частиц является рецепторно-опосредованным. Наиболее важными для этого процесса считаются экспрессируемые на поверхности нейтрофилов рецепторы для иммуноглобулинов Fc-рецепторы (FcгRIIA, или CD32) и для фрагмента компонента системы комплемента CR3, а также корецепторы к ним FcгRIIIB (CD16) и CR1, соответственно. Низкоафинные FcгR не только взаимодействуют с опсонизированными иммуноглобулинами микроорганизмами, но и играют важную роль в активации нейтрофилов иммунными комплексами [Coxon et al., 2001].

Помимо рецепторов к IgG на поверхности нейтрофилов выявлены рецепторы к другому классу иммуноглобулинов - IgA, которые, как полагают исследователи, самостоятельно или в качестве корецепторов к FcгRIIA участвуют в усилении фагоцитоза и процессов дегрануляции и индукции окислительного взрыва, а также рецепторы к IgЕ, что может объяснить участие нейтрофилов в аллергическом ответе [Mazengera and Kerr, 1990; van der Steen et al., 2012; Monteseirin et al., 2001].

Сигнальные пути, запускаемые в процессе фагоцитоза Fc-рецепторами и рецепторами к компонентам комплемента, имеют ряд различий. Поглощение опсонизированного антителами микроорганизма происходит при их контакте с FcгRIIA на поверхности нейтрофилов, фосфорилировании цитоплазматических сигнальных последовательностей ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) при участии тирозиновых киназ, которые состаляют ключевой путь: Src-киназы /ITAMs/Syk-киназа. Syk-киназа фосфорилирует ряд белков, участвующих в запуске фагоцитоза, процессe слияния мембран и формирования фагосомы [Kobayashi et al., 1995; Garcнa-Garcнa and Rosales, 2002]. Внутри фагосомы выделяются АФК, сопутствующие развитию окислительного стресса, и протеолитические ферменты. Респираторный взрыв, сопровождающий Fc-опосредованный фагоцитоз, имеет немитохондриальную природу, он происходит при усиленной продукции АФК ферментным комплексом NADPH-оксидазы в процессе потребления кислорода, не связанного с дыханием и потреблением энергии для метаболизма [Suh et al., 2006].

Во втором случае, при фагоцитозе частиц, опсонизированных фрагментом комплемента iС3b с участием рецептора СR3, задействован механизм активации нейтрофилов, независимый от содержания ионов свободного Ca2+ в цитоплазме [Lew et al., 1985]. Сам по себе комплемент- опосредованный фагоцитоз не приводит к развитию респираторного взрыва. Этот путь фагоцитоза возможен лишь при наличии дополнительных факторов активации, которые фосфорилируют корецептор CR1, после чего увеличивается активность рецептора СR3 [Zhou and Brown, 1994]. Вероятно, два вышеописанных механизма активации фагоцитоза являются взаимосвязанными, например, через активацию Syk-киназы [Tohyama and Yamamura, 2006]. Описаны эффекты усиления окислительного стресса и

развития апоптоза в нейтрофилах при одновременной активации двух механизмов фагоцитоза. При этом в роли агониста выступает комплемент- опосредованный механизм [Zhou and Brown, 1994].

Существует несколько точек зрения на то, какой механизм активации фагоцитоза превалирует при уничтожении микроорганизма: окислительный или неокислительный. Ранее считалось, что действие свободных радикалов и других АФК, продуцируемых NADPH-оксидазой, а также продуктов миелопероксидазы, обеспечивает достаточную токсичность, чтобы разрушить бактерию. В настоящее время полагают, что процесс разрушения бактерий происходит благодаря первичной роли высвобождаемых из гранул ферментов в фагосому и переваривания патогена. Например, нарушение сборки ферментного комплекса NADPH-оксидазы и уменьшение продукции АФК при хроническом грануломатозе в ряде случаев не отменяет сохранение резистентности к некоторым микроорганизмам [Reeves et al., 2002]. Техника направленного мутагенеза позволила также оценить влияние таких белков, как эластаза, катепсин G, содержащихся в гранулах, на эффективность микробицидной активности в мышиных моделях [Tkalcevic et al., 2000]. Нарушение продукции этих белков приводят к невозможности разрушения микроорганизма даже при нормальных значениях продукции АФК. Однако продукция АФК влияет на физико-химические параметры в гранулах нейтрофилов [DeCoursey et al., 2003]. Обобщая, можно заключить, что внутрифагосомное разрушение микроорганизмов происходит по кислород- зависимому ферментативному механизму.

При «состоявшемся» фагоцитозе бактерия захватывается мембраной нейтрофила со всех сторон, попадает в цитоплазму, где происходит ее разрушение, посредством активации сигнальных путей, запускающих процессы накопления АФК и высвобождения содержимого нейтрофильных гранул в образовавшуюся фагосому. Процесс захвата и активации киллинга происходит в результате образования комплекса, состоящего из фагосомы и

специфической гранулы, затем, в течение десятков секунд, происходит слияние с азурофильными гранулами и высвобождение содержащихся в них микробицидных ферментов. При достижении оптимальных значений рН, при которых гидролитические ферменты могут переваривать микроорганизмы, с этим комплексом сливается лизосома и образуется фаголизосома [Segal et al., 1980].

1.2.2 Дегрануляция

Дегрануляция микробицидных факторов происходит также и во внеклеточное пространство. Такой тип секреции характерен для «несостоявшегося» фагоцитоза, который может происходить, например, в силу особенностей патогена, но преимущественно вызвается растворимыми молекулами, включая большинство хемоаттарктантов. Такой механизм дегрануляции в основном реализуется при воспалении, он приводит к деструкции тканей высвождаемыми из гранул ферментами. По мере увеличения концентрации стимулирующих молекул первыми секретируются специфические гранулы, затем компоненты азурофильных гранул, возможно, из-за разной чувствительности к концентрации ионов Са2+ в цитозоле [Lew et al., 1986]. Очевидно, что высвобождение антимикробных компонентов может происходить при разрушении нейтрофилов в результате некроза и выброса клеточных компонентов, в том числе цитоплазматических гранул.

Достоверно не установлено, могут ли такие компоненты эффективно функционировать за пределами фаголизосомы. Показано, что гистоны и цитозольный белок калпротектин обладают антимикробной и бактериостатической активностью вне клеток, они секретируется в результате разрушения клетки при некрозе [Voganatsi et al., 2001].

Механизмы, контролирующие дегрануляцию нейтрофилов, до сих пор активно изучаются. Известно, что слияние мембран гранул и везикул с плазматической мембраной во время фагоцитоза и экзоцитоза обеспечивает семейство белков SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-fusion-protein attachment protein receptor). При активации нейтрофилов форболовым эфиром PMA (phorbol meristat acetate) представитель семейства SNARE- белок SNAP-23 транслоцируется на клеточную мембрану. На мембране SNAP-23 взаимодействует с другим белком синтаксином-6, блокирование антителами этих белков предотвращает дегрануляцию желатиназных гранул [Martin-Martin et al., 2000]. Также рецептор-опосредованное высвобождение гранул зависит от активации сигнальных молекул, включающих src- семейство тирозин-киназ, тирозин-фосфатазу MEG2, киназы MARCK, Rab, а также молекулы Rho GTPase, Rac2 [Lacy and Eitzen, 2008].

Механизмы, лежащие в основе секреции морфологически различных популяций гранул, запускаются в определенной последовательности, которая, скорее всего, связана с их количественным присутствием в цитозоле. При стимуляции нейтрофилов в первую очередь происходит мобилизация секреторных везикул, затем высвобождение содержимого желатиновых гранул, специфических гранул и, наконец, азурофильных гранул [Cassatella M., 2010] (Рис. 1).

С изменениями из [Cassatella M., 2010].

Рис.1. Характеристика нейтрофильных гранул.

1.2.3 Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Еще одним механизмом уничтожения бактерий нейтрофилами является образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET, от Neutrophil Extracellular Traps) [Brinkmann and Zychlinsky, 2007]. При наблюдении за нейтрофилами был описан эффект, при котором активация клеток приводила к высвобождению разветвленных структур волокон, состоящих из деконденсированных ДНК в комплексе с цитозольными белками, белками из гранул и гистонами. По данным масспектрометрии определено не менее 24 различных белков в составе NET [Urban et al., 2009]. Такой комплекс локально обеспечивает достаточно высокую концентрацию антимикробных компонентов, чтобы уничтожить патоген независимо от поглощения. Хотя механизм образования ловушек до конца не изучен, известно, что их образование зависит от активности NADPH-оксидазы [Palmer et al., 2012]. В то же время супероксид анион-радикал, продуцируемый экзогенно с помощью NADPH-оксидазы, обладает ограниченной пермеабилизирующей способностью и не может убивать бактерию непосредственно [Klebanoff, 1974]. В дополнение к антимикробным свойствам, нейтрофильные внеклеточные ловушки могут создавать барьер, предотвращающий распространение патогена.

1.2.4 Активные формы кислорода в нейтрофилах

Понятие АФК включает в себя соединения, так или иначе связанные с первичным образованием супероксид анион-радикал O2* из кислорода. Как фагоцитирующие лейкоциты, нейтрофилы, помимо потребления кислорода для дыхания, в ответ на соответствующие стимулы генерируют АФК. Основное количество молекул кислорода потребляется при дыхании в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях для энергетических и катаболических целей, и до 15% кислорода расходуется на

образование АФК в процессе нормальной жизнедеятельности клеток [Vladimirov and Proskurnina, 2009].

Несмотря на то, что АФК играют важную биологическую роль в повышении устойчивости организма к патогенам, широкий спектр патологических состояний обусловлен нарушениями регуляции продукции АФК: как в сторону избыточной генерации АФК и развития окислительного стресса, так и при их дефиците.

АФК регулируют внутриклеточные сигнальные пути, клеточный цикл, развитие апоптоза [Suzuki et al., 1997]. Высокие концентрации АФК (в особенности перекись водорода H2O2) обладают способностью ингибировать синтез ДНК и деление клеток, а также могут активировать апоптоз [Halliwell, 2007]. Также АФК влияют на накопление ионов Са2+ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в результате активации, главным образом, протеинкиназы С и тирозинкиназ, а также ингибирования протеинфосфатаз [Dubinina, 2001]. Показано, что АФК и липидные радикалы в низких концентрациях индуцируют экспрессию генов (в том числе протоонкогенов) и деление клеток. АФК активируют белки Ras, играющие важную роль в передаче сигналов в ядро клетки [Hole et al., 2010].

Показано, что накопление АФК приводит к активации транскрипционного фактора NF-кВ, индуцирующего синтез ряда цитокинов и рецепторов, участвующих в развитии иммунного и воспалительного ответа [Morgan and Liu, 2011]. Известно об участии АФК в промежуточных реакциях синтеза гормонов, в том числе эйкозаноидов и иодтиронинов [Кулинский, 1999].

1.2.4.1 Пути образования и метаболиты АФК в нейтрофилах