Помимо вышеупомянутого белка HSP40, к таким молекулам относятся белки Bag-l, Hsc70-interacting protein (Hip) and Hsc70-Hsp90-organizing protein (Hop) [Hцhfeld, 1998]. Белок Bag-l совместно с другим белком CHIP (от Сarboxyl terminus of the Hsc70-interacting protein) участвуют в процессе утилизации необратимо денатурированных белков-субстратов, транспортируя их в протеасомы [Tsukahara and Maru, 2010].

Рис.2. Структура HSP70.

1.4.2 Внутриклеточные функции HSP70

Молекулы HSP70 принимают участие в правильной укладке новосинтезированных или денатурированных полипептидных цепей, их стабилизации, деградации неправильно свернутых белков, предотвращении белковой агрегации, формировании нативной конформации белков для их дальнейшего импорта в различные органеллы, такие как митохондрии и эндоплазматический ретикулум.

Появление и накопление в клетке поврежденных белков увеличивает экспрессию Hsp70. После термического воздействия, вызывающего денатурацию клеточных белков, концентрация Hsp70 может составлять до 20% от всех цитоплазматических белков. Действие Hsp70 лежит в основе термотолерантности - феномена адаптации к повышению температуры и увеличения температурного порога чувствительности путем стабилизации белковых молекул с помощью Hsp70 при первичном, менее сильном нагреве [Lindquist, 1986]. Введение нейтрализующих антител к Hsp70 в нейроны приводит к повышению чувствительности клеток к ТШ [Khan and Sotelo, 1989]. В ранний постстрессорный период накопленный Hsp70 может распределяться в разных компартментах. Различная внутриклеточная локализация HSP70 белков определяет их функциональную роль [Jaattela, 1999]. Кратковременное накопление этих белков происходит в первую очередь в клеточном ядре. Считается, что Hsp70 участвует в защите генетического материала [Kotoglou et al., 2009].

В разных типах клеток транскрипцию генов и трансляцию Hsp70 могут запускать различные факторы. К индукции Hsp70 могут приводить не только патологические для клетки воздействия, такие как, например, гипертермия или оксислительный взрыв, но и разнообразные физиологические сигналы, среди которых адренокортикотропные и глюкокортикоидные, тиреоидные гормоны, истощение гликогена и др. [Blake et al., 1991; Valen et al., 2000; Febbraio et al., 2002; Maloyan et al., 2002].

Белки HSP70 необходимы для клеточного восстановления и выживания в стрессовых условиях: их количество коррелирует с тяжестью протекания разных патологических состояний, таких как ишемия, воспаление, аутоиммунные процессы, злокачественные опухоли, бактериальные и вирусные инфекции, патологическая беременность, травма, гипертония, нейродегенеративные заболевания [Tan et al., 2007; Pockley et al., 2002, 2003]. В патогенезе некоторых нейродегенеративных заболеваний, в том числе

болезней Альцгеймера и Хантингтона, лежит агрегация определенных внутриклеточных белков. Поэтому при этих расстройствах важную роль играют HSP70 и их шаперонная активность [Westerheide and Morimoto, 2005]. Увеличение продукции Hsp70 при гипоксии связано с развитием толерантности миокарда к более длительным эпизодам ишемии. Одним из доказательств этого является тот факт, что при повышенной экспресии Hsp70 увеличение размера миокарда и выход креатинкиназы, которые являются маркерами инфаркта, ингибируются [Marber et al., 1995].

HSP70 облегчают транспортировку ряда белков через клеточные мембраны [Young, 2003]. Как шапероны, HSP70 образуют комплексы с внутриклеточными антигенными пептидами, которые затем могут высвобождаться наружу или экспонироваться на клеточной мембране. Доказано, что Hsp70 участвует в процессинге антигенов. Белок Hsp70 в комплексе с антигенным пептидом усиливает связывание пептида-антигена с рецепторами антиген-презентирующих клеток (АПК), способствует интернализации антигена и последующей его презентации на поверхности АПК в составе комплекса с молекулыми MHC класса I [Theriault et al., 2005]. С другой стороны HSP70 защищает антигенные пептиды в процессе их транспортировки в ЭПР для связывания с белками МНС класса I [Srivastava, 2002]. Таким образом, HSP70 обладают иммуностимулирующим и адъювантным эффектом для АПК.

Белки HSP70 играют роль в процессах клеточной дифференцировки и пролиферации. Эти белки образуют комплексы с регуляторными белками, такими как р53, MAPKs, Src-киназа, с рецепторами тирозиновых киназ, NF- kB [Helmbrecht et al., 2000; Guzhova et al., 1997].

Изменение экспрессии внутриклеточных HSP70 оказывает модулирующее влияние клеточный цикл. Во-первых, Hsp70 непосредственно участвует в процессах восстановления митотической центросомы [Hut et al.,

2005]. Во-вторых, индукция синтеза этого белка может приводить к смещению баланса в сторону S-фазы [Liu et al., 2011].

Гиперпродукция в клетках HSP70 ингибирует развитие аутофагии, как альтернативный, более «радикальный» механизм клеточного ответа на стресс [Dokladny et al., 2013].

В опухолевых клетках, по сравнению с нормальными клетками, регистрируется повышенный базальный уровень Hsp70, что может объяснять более выраженную устойчивость к стрессу, например, при дефиците питательных веществ, гипоксии, облучении и/или химиотерапии. На линиях опухолевых клеток показано, что молекула Hsp70 является ингибитором индукции апоптоза. Введение в культуру раковых клеток лимфомы Molt4 антисмысловых мРНК к Hsp70 вызывало развитие апоптоза [Wei et al., 1995], такой же эффект регистрировался и на линиях опухолевых клеток легких [Nylandsted et al., 2000].

Aнтиапоптозный эффект HSP70 опосредован их взаимодействием со многими ключевыми белками, участвующими в развитии апоптоза. Описано, что Hsp70 вызывает супрессию сигнальных путей с участием MAP-киназы, модулирующей высвобождение цитохрома с - необходимого компонета запуска каспазного каскада. Также Hsp70 препятствует образованию апоптосомы путем блокирования фактора Apaf-1, участвующего в активации про-каспазы-9 [Beere, 2004 и 2005]. По другим данным, при блокировании синтеза Hsp70 развитие апоптоза происходит независимо от активации каспаз и супрессии противоапоптогенного белка Bcl-2 [Nylandsted et al., 2000]. Член семейства HSP70, белок Grp78, является одним из ключевых белков, негативно регулирующий развитие ER-стресса, который развивается вследствие нарушения активации адаптивных механизмов фолдинга и деградации белков и, в конечном итоге, приводит к активации апоптоза [Xu et al., 2005].

Также было продемонстрировано, что Hsp70 защищает от развития апоптоза немитохондриального происхождения. Белок Hsp70 ингибирует TNFб-индуцированный апоптоз [Guzhova and Margulis, 2006], а также эффективно супрессирует развитие Fas- и TRAIL- (от TNF-related apoptosis- inducing ligand) опосредованного апоптоза в разных типах клеток. Накопление в клетке HSP70 увеличивает устойчивость клеток к стауроспорину, доксорубицину - известных индукторов апоптоза [Mayer and Bukau, 2005].

С другой стороны белки HSP70 могут иницициировать развитие апоптоза. Один из таких механизмов опосредуется связываением локализованного на поверхности опухолевых клеток Hsp70 с молекулой гранзима В и активацией NK-клеток [Gross et al., 2003]. Второй механизм является каспазо-зависимым и заключается в том, что Hsc70 усиливает развитие апоптоза путем связывания с каспазо-активированными ДНК-азами через Т-клеточный рецептор [Liu et al., 2003].

Grp78 участвуют в процессе синтеза иммуноглобулинов. В литературе Grp78 часто обозначается как BiP (от Binding immunoglobulin Protein). Эти белки связываются с тяжелыми цепями, что препятствует образованию агрегатов из тяжелых цепей. Впоследствии легкая цепь вытесняет молекулу BiP и формируется полная иммуноглобулиновая молекула. [Satoh et al., 1993].

Таким образом, внутриклеточные HSP70 обладают широким спектром цитопротекторных и регуляторных свойств, принимают участие во многих внутриклеточных событиях, включая представление антигена при кросс- презентации.

1.4.3 Внеклеточные функции HSP70

Разные виды клеточного стресса приводят не только к увеличению внутриклеточного содержания HSP70. В ряде случаев стресс индуцирует процессы транслокации HSP70 на плазматическую мембрану и/или высвобождение этих белков во внеклеточное пространство, что приводит к формированию внеклеточного пула этих белков, циркулирующих в организме. Впервые факт высвобождения HSP во внеклеточное пространство был зафиксирован при исследовании нервных клеток. Было доказано, что HSP могут высвобождаться из клеток глии [Tytell et al., 1986; Hightower and Guidon, 1989]. Установлено, что помимо нервных клеток другие клетки тоже способны высвобождать Hsp70 во внеклеточное пространство [Hunter-Lavin et al., 2004; Mambula and Calderwood, 2006].

Как и внутриклеточные, циркулирующие Hsp70 способствуют выживанию клеток в условиях стресса [Robinson et al., 2005]. Установлено, что их уровень в крови коррелирует с выживанием больных, перенесших тяжелые травмы [Pittet et al., 2002]. В то же время показано, что при гипертонической болезни, атеросклерозе, заболеваниях почек, уровень циркулирующего Hsp70 достоверно увеличивается [Pockley et.al., 2002]. Вместе с тем, и у здоровых доноров в ответ на физические нагрузки происходит увеличение концентрации циркулирующего Hsp70 [Pockley, 2002; Campisi and Fleshner, 2003]. Таким образом, высвобождение этого белка может рассматриваться не только в контексте патологического процесса, но может служить нормальным адаптивным ответом на стресс, вызванным физиологическими или физическими факторами, эндогенными сигналами.

Внеклеточные HSP70 играют роль медиаторов в процессах клеточных взаимодействий и транспорта белков. После высвобождения этих белков во внеклеточное пространство они могут связываться с клеточной поверхностью по аутокринному или паракринному механизму. Альтернативный механизм клеточного взаимодействия с участием Hsp70 может быть связан с мембранными везикулами, содержащими Hsp70. Эти везикулы могут высвобождаться из клеток и затем поглощаться другими клетками за счет слияния мембран или посредством рецепторного взаимодействия [De Maio, 2011].

В одной из первых публикаций на эту тему описано, что после высвобождения Hsp70 из глии во внеклеточное пространство этот белок затем может интернализовываться в окружающие нейроны в аксональной области синапсов, где концентрация внутриклеточного белка меньше, чем в теле нейрона [Tytell et al., 1986].

Разнообразие рецепторов, взаимодействующих с Hsp70 или опосредованно активированных с участием Hsp70, указывает на то, что эти белки взаимодействуют со множеством типов клеток и выполняют целый комплекс функций вне клетки.

В нескольких исследованиях продемонстрировано, что HSP70 оказывают различные эффекты на клетки иммунной системы [Srivastava, 2002; Calderwood et al., 2005]. HSP70 обладают иммунорегуляторными свойствами, воздействуя на клетки врожденной иммунной системы через рецепторы клеточной мембраны, такие как CD91 [Basu et al., 2001], TLR2 и TLR4 [Asea et al., 2002], СD40 [Becker et al., 2002]. Как известно, активация CD40 на АПК имеет важную костимулирующую роль для развития Т- клеточного ответа и взаимодействия компонентов врожденного и приобретенного иммунитета. Следует учесть, что данные о способности Hsp70 активировать CD40 противоречивы [Becker et al., 2002; Binde, 2009].

Ряд рецепторов к модифицированным липопротеинам из семейства скавенджер-рецепторов, LOX-1 и SREC-1, FEEL-1/CLEVER-1 могут не только связываться с HSP70, но и способствовать интернализации HSP70 [Thйriault et al., 2006].

Показано, что Hsp70 может активировать фрагмент С1q системы комплемента и запускать каскад системы комплемента по классическому пути [Prohaszka et al., 2002].

Hsp70 обладает способностью к индукции продукции и высвобождения провоспалительных маркеров. Через связывание с рецепторами TLR2 и TLR4 запускаются воспалительные сигналы в макрофагах, дендритных клетках (ДК), нейтрофилах. Показано, что связывание внеклеточного Hsp70 с TLR2 или TLR4 на плазматической мембране моноцитов и макрофагов вызывает активацию потока ионов Ca2+, чего не происходит при активации этих рецепторов с помошью LPS. В дальнейшем в этих клетках происходит активация транскрипционного фактора NF-kappaв и усиление экспрессии провоспалительных цитокинов TNFб, IL-1в, IL-6 и IL-12 совместно с активацией CD14 в качестве корецептора [Asea et al., 2000]. При совместной инкубации АПК с внеклеточным Hsp70 возрастает продукция NO, потенциально апоптогенного медиатора [Panjwani et al., 2002].

Таким образом, экзогенный Hsp70 может выступать в качестве сигнала опасности для системы врожденного иммунитета и стимулировать иммунный ответ.

Было показано, что за иммунологические эффекты отвечают специфические фрагменты молекулы Hsp70. Пептид, локализованный в С- терминальном домене (359-610 а.о.) индуцирует продукцию хемокинов, созревание ДК, продукцию цитокинов, таких как IL-12, стимулирующих иммунный ответ по типу Th1, тогда как N-терминальный домен такими свойствами не обладает [Wang et al., 2002].

Многие исследователи акцентируют внимание на том, что используемый в экспериментах in vitro рекомбинатный Hsp70 может давать стимулирующий иммунный ответ за счет контаминации LPS. В моделях in vitro на мышиных и крысиных макрофагах было показано, что очищенный от LPS Hsp70 не стимулировал высвобождение воспалительных цитокинов [Gao

and Tsan, 2003; Johnson and Fleshner, 2006]. Однако последующие эксперименты с использованием рекомбинантного Hsp70 небактериального происхождения подтвердили способность этого белка проявлять иммунорегуляторные свойства [Zheng et al., 2010]. Было доказано in vivo, что стресс-индуцируемый внеклеточный Hsp70 эндогенного происхождения обладает активирующим действием на клетки иммунной системы [Vega et al., 2008; Kovalchin et al., 2006; Gastpar et al., 2004].

Показано, что Hsp70 может проникать через сосудистую стенку локально в очаг воспаления, обусловленного бактериальным заражением. Локальное увеличение концентрации внеклеточного Hsp70 после стресса коррелировало с усилением иммунного ответа в месте введения патогена, ограничиением распространения очага заражения и более быстрым течением восстановления после заражения. Введение ингибитора проницаемости сосудов (антагониста гистаминовых рецепторов H1 кетотифена) не увеличивало локальную концентрацию внеклеточного Hsp70. Описанные эффекты отменялись при нейтрализации антителами против Hsp70 в очаге воспаления [Johnson and Fleshner, 2006].

Аутоиммунные заболевания, такие как артриты, рассеянный склероз, инсулинзависимый диабет, сопровождаются хроническим воспалением и деструкцией тканей. В крови больных этими заболеваниями повышен уровень циркулирующих HSP в виде потенциальных аутоантигенов, и антител к ним. Описан эффект ингибирования развития процесса хронического воспаления в моделях некоторых аутоиммунных заболеваний при иммунизации экзогенными HSP, в частности, Hsp70 бактериального происхождения. Считают, что этот эффект опосредован активацией популяции низкоаффинных аутореактивных CD4+ регуляторных T-клеток, синтезирующих противовоспалительный цитокин IL-10. Такая иммуносупрессивная Т-клеточная активация возможна в результате узнавания на поверхности АПК эпитопов собственных Hsp70 в комплексе с МНС класса II, высокогомологичных бактериальным эпитопам [Hauet-Broere et al., 2006].

В то же время, известно, что при аутоиммунных заболеваниях стресс- индуцируемая экспрессия Hsp70 на клеточной поверхности усугубляет развитие хронического воспаления. Считается, что происходит активация АПК и Тh1-клеточного ответа при возрастании концентрации аутоантигена Hsp70 за счет высвобождения из поврежденных тканей, а также в результате кросс-реактивности T-клеток на эпитопы собственных Hsp70, гомологичных чужеродным эпитопам Hsp70 патогена. Активации АПК со стороны Hsp70 сопровождается усиленной продукцией иммуностимуллирующего цитокина IFNг, что обуславливает усиление воспалительного иммунного ответа [Pockley et al., 2008].

Как было доказано в моделях на крысах, HSP70 может оказывать антисептическое действие и эффективно защищать от эндотоксинового шока, а также модулировать ответ миелоидных клеток при стимуляции LPS, увеличивая выживаемость и стабилизируя гемостаз и ряд других гемодинамических характеристик [Rozhkova et al., 2010].

Hsp70 был обнаружен на поверхности многих опухолевых клеток, в том числе в комплексе с опухолевыми антигенами [Multhoff et al., 1997; Sapozhnikov et al., 2002]. Поверхностная экспрессия Hsp70 на опухолевых клетках играет важную роль в клеточных взаимодействиях, усиливая распознавание опухоли клетками иммунной системы [Bausero et. al., 2005].

Все эти особенности HSP легли в основу изучения противоопухолевой активности HSP70 в составе вакцин. Иммунизация комплексом HSP70- опухолевый пептид усиливает синтез антител к пептидам, снижает уровень метастазирования опухолевых клеток в мышиных моделях, благодаря активации специфического СD8+ T-клеточного ответа, тогда как введение чистого HSP70 такого эффекта не вызывает [Udono H. and Srivastava P.K. 1993]. Противоопухолевые вакцины на основе HSP70 потенциально

стимулируют не только адаптивный, но и врожденный противоопухолевый иммунитет. Это возможно благодаря взаимодействию молекул NKG2A на поверхности NK-клеток с молекулой Hsp70, экспрессируемой опухолевым клетками [Srivastava, 2002].

В то же время, описаны механизмы с участием Hsp70, которые обеспечивают активацию роста опухоли. В основном это связано с уже описанным ранее противоапоптозным действием HSP70, а также за счет взаимодействия Hsp70 с незрелыми формами клеток миелоидного происхождения MDCS с фенотипом CD11b+CD33+HLA-DR- (у человека) или Ly-6C/G CD11b (у мышей), количество которых в организме, где развивается опухоль, возрастает. При воздействии на MDCS опухолевыми экзосомами, содержащими Hsp70, индуцируется антиген-специфическая толерантность CD8+ T-клеток. Молекула Hsp70 может запускать активацию в MDCS транскрипционного фактора Stat3 через TLR2 и аутокринную продукцию IL- 6 [Chalmin et al., 2010].

Внеклеточные HSP70 рассматриваются как шаперокины, то есть проявляют свою активность не только в качестве шаперонов, но и цитокинов [Asea et al., 2000].

Преобладающее большинство литературных данных, освещающих внеклеточные функции HSP70, относятся к индуцируемой форме этого белка Hsp70, но среди них встречаются публикации, в которых описывается роль конститутивной формы Hsc70 вне клетки. Так, на тепловой ответ в нервных клетках активируется синтез не только Hsp70, но также процесс транслокации эксперссируемого Hsc70 в области синапсов, где эта молекула осуществляет нейропротективные функции во время стресса [Chen and Brown, 2007].

Таким образом, можно сделать вывод, что влияние, оказываемое in vitro и in vivo внеклеточным Hsp70, может быть активирующим или ингибирующим. Эти эффекты зависят от множества факторов. К таким

факторам относятся происхождение Hsp70 (из нормальной клетки, из клетки, инфицированной вирусом, из опухолевой клетки, из бактерии); локализация белка (циркуляция или транслокация на внешней клеточной поверхности); вид стресса (окислительный стресс, бактериальная или вирусная инфекция, физическая нагрузка).

1.4.4 HSP70 в нейтрофилах

На основании морфологических данных об особенностях хроматиновой структуры ядра и незначительном количестве эндоплазматического ретикулума и рибосом некоторое время считали, что нейтрофилы препрограммированы на функционирование без значительной биосинтетической активности [Сline, 1966; Murphy, 1976]. Позднее было обнаружено, что в этих клетках происходит активация генов и синтез белков, в частности ряда хемокинов, и что это играет значительную роль в клеточных взаимодействиях при воспалении [Jack and Fearon, 1988; Shaun et al., 1992; Beaulieu et al., 1992].

С помощью метода включения меченого метионина [35S] и разделения клеточного лизата в градиентном геле была продемонстрирована способность нейтрофилов синтезировать Hsp70 [Eid et al., 1987].

Несмотря на то, что ранее считалось, что Hsp70 экспрессируется на поверхности лишь опухолевых клеток [Multhoff et al., 1995], была определена локализация Hsp70 на поверхности нейтрофилов [Giraldo et al., 2010]. Внеклеточные Hsp70 стимулируют хемотаксис нейтрофилов, и этот эффект является дозозависимым [Ortega et al., 2009]. Индукция HSP70 в апоптозных нейтрофилах способствует усилению продукции TNFб макрофагами [Zheng et al., 2004].

1.5 HSP70 и окислительный стресс

В модели эндотелиальных клеток была исследована возможность окислительного стресса индуцировать экспрессию HSP. Нагревание, добавление H2O2 и последующий анализ с помощью Вестерн-блоттинга показал, что ТШ индуцирует быстрое и значительное увеличение уровня мРНК Hsp70. Добавление H2O2 тоже приводит к такому эффекту, но количество накопленных мРНК на порядок меньше. Кинетика синтеза Hsp70 коррелирует с накоплением мРНК [Jornot et al., 1991].

Продемонстрировано, что шаперонная активность очищенных Hsp70 и Hsc70 возрастает в условиях окислительного стресса [Callahan et al., 2002].

У трансгенных по Hsp70 дрозофил экспрессия Hsp70 увеличивается при усилении продукции АФК, что дает авторам основание предположить наличие совместной работы HSP и антиоксидантных компонентов [Gupta et al., 2007].

Экзогенный HSP70 значительно ингибирует LPS-индуцированную продукцию АФК в различных миелоидных клетках [Rozhkova et al., 2010].

Показано, что ТШ или обработка клеток ионами металла кадмия, которые индуцируют синтез HSP, в том числе Hsp70, в нейтрофилах вызывают временное ингибирование NADPH-оксидазы, без изменения их фагоцитозной активности. [Maridonneau-Parini et al., 1988]. Однако в безъядерных цитопластах после воздействия ТШ продукция O2* также временно ингибируется, вероятно, потому, что ТШ изменяет механизм транслокации и сборки компонентов NADPH-оксидазы. С другой стороны, первичное нагревание нейтрофилов, предотвращало ингибирование продукции O2* при вторичном нагревании, что, могло быть связано с термотолерантностью. При блокировании синтеза HSP во время первичного нагревания, эффект ингибирования NADPH- оксидазы выявлялся вновь во время повторного ТШ. Таким образом, была продемонстрирована взаимосвязь между защитным механизмом от продукции O2* и синтезом HSP,

однако не исключено, что активность NADPH-оксидазы и синтез HSP являются хотя и сопутствующими, но не прямо связанными явлениями [Maridonneau-Parini et al., 1993].

В то же время продемонстрировано взаимодействие HSP70 и NOX4 (конститутивно активный фермент NADPH- оксидазы, преимущественно экспрессируемый в гладкомышечных клетках) в клетках проксимальных почечных канальцев. После транслокации HSP70 на мембрану активность NADPH-оксидазы уменьшается, чего не наблюдается при инкубации с антителами против HSP70. Таким образом, транслокация HSP70, снижая активность NOX4, оказывает цитопротективный эффект [Bocanegra et al., 2010].

1.6 Механизмы секреции HSP70

В настоящее время известно, что высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство может происходить как пассивным путем при клеточной гибели путем некроза, так и посредством активной секреции [De Maio, 2011].

Продемонстрировано, что апоптоз, индуцированный облучением, не приводит к высвобождению HSP70, тогда как некроз, вызванный многократным замораживанием и оттаиванием, приводит к выбросу клеточного содержимого, в том числе и HSP70 [Basu et al., 2000].

Механизмы активного высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство до сих пор обсуждаются. Считается, что HSP70 не секретируются по механизму классического экзоцитоза, так как аминокислотная последовательность молекул внутриклеточных HSP70 не содержит лидирующего пептида, который необходим для экзоцитоза по классическому механизму через систему транспорта ЭПР-Гольджи [Mambula et al., 2007]. Однако полученные иммуногистохимическими методами данные указывают на то, что в клетках HeLa новосинтезированная молекула Hsp70 локализуется в комплексе Гольджи [Schneider et al., 2002]. Несмотря на то, что в большинстве исследований ингибитор классического экзоцитоза брефелдин А не оказывал влияния на уровень секреции белка, есть данные, что в клетках карциномы А431 брефелдин А все же ингибировал процесс высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство [Evdonin et al., 2006].

Подобно молекулам без лидирующей последовательности IL-1б и -1в, для которых известны несколько механизмов высвобождения, в литературе также описаны разнообразные альтернативные пути высвобождения Hsp70 в отсутствие некроза, реализованные по неклассическому механизму секреции или нетрадиционными путями.

Для IL-1в описан путь секреции в составе секреторных лизосомных эндосом, или эндолизосом, которые сливаются с плазматической мембраной и высвобождают свое содержимое во внеклеточное пространство[Andrei et al., 1999]. Hsp70 был обнаружен внутри лизосом [Nylandsted et al., 2004]. Впоследствии возможность высвобождения HSP70 в составе секреторных эндосомальных лизосом была показана для некоторых опухолевых клеток и макрофагов. Предполагается, что в процессе транслокации Hsp70 в лизосому может участвовать транспортная система ABC-транспортеров (АTP-binding cassette) [Mambula and Calderwood, 2006]. В то же время представлены данные, что в клетках производных кератиноцитов в высвобождение Hsp70 вовлечен везикулярный транспорт, при котором секреторные гранулы, содержащие Hsp70, не несут специфических маркеров эндосом, лизосом и липидов, но несут маркер секреторных гранул - хромогранин А [Evdonin et al., 2006].

Одним из альтернативных механизмов рассматривается выход во внеклеточное пространство в составе секреторных внеклеточных везикул, к которым относят экзосомы, микрочастицы и эктосомы. Экзосомы представляют собой везикулы, образованные из плазматической мембраны в результате эндоцитоза и упакованные в мультивезикулярные тельца в результате инвагинации эндосомной мембраны. Эти тельца могут сливаться с клеточной поверхностью и экзосомы высвобождаются наружу. Этот механизм отличается от механизма образования микрочастиц и эктосом непосредственно из плазматической мембраны в результате ее выпячивания.

Высвобождение Hsp70 в составе экзосом наблюдали в макрофагах [Bhatnagar et al., 2007], в В-клетках, подвергнутых ТШ, и в мононуклеарных клетках, нативных и стрессированных нагреванием [Clayton et al., 2005; Hunter-Lavin et al., 2004; Lancaster and Febbraio,2005]. Экзосомный механизм высвобождения Hsp70 описан при стимуляции провоспалительными цитокинами IFNг и IL-10 опухолевых клеток [Bausero et al., 2005]. Следует уточнить, что при такой стимуляции высвобождение в экзосомах было частичным, так как Hsp70 высвобождался и в свободной форме. Одним из факторов, способствующих высвобождению Hsp70 в составе экзосом, может являться активация симпатической нервной системы. Высвобождение норадреналина и последующая активация б1-адренорецепторов увеличивает запас внутриклеточного Ca++, что, как считают авторы, может стимулировать секрецию экзосом с содержащимся в них Hsp70 [Johnson and Fleshner, 2006]. Более того, по всей видимости, существует два пути высвобождения Hsp70 в составе экзосом. В ответ на ТШ на В-лимфоцитах увеличивается количество высвобождаемых экзосом, содержащих внутри Hsp70 [Clayton et al., 2005], в то время как в моноцитах человека в ответ на стресс увеличивается концентрация Hsp70 внутри и на поверхности экзосом без увеличения их количества [Lancaster and Febbraio, 2005].

Также было показано, что после стресса Hsp70 интегрируется в липидный бислой мембраны и высвобождается во внеклеточное пространство в мембрано-ассоциированном состоянии в виде везикул. Внеклеточные мембраны, заключающие в себе Hsp70, многократно эффективнее, чем очищенный рекомбинантный белок, индуцировали продукцию ТNFб на макрофагах в качестве индикатора их активации, возможно, за счет многократно увеличенной локальной концентрации Hsp70 [Vega et al., 2008].

В настоящее время известно, что Hsc70 тоже детектируется вне клетки. Легкая стимуляция IFN-г и IL-10, не приводящая к развитию клеточной смерти, индуцировала активный процесс высвобождения Hsc70 из опухолевых клеток в составе экзосом [Barreto et al., 2003].

На клетках почки хомячка BHK-21 было показано, что в секрецию Hsp70 и Hsc70 не вовлечены экзосомы, и эта секреция не зависит от синтеза белка de novo. Зато метил-в-циклодекстрим, вещество, которое разрушает детергент-устойчивые микродомены - липидные рафты, уменьшает секрецию обоих белков HSP70. [Evdokimovskaya et al., 2010]. Хотя в уже упомянутой работе [Lancaster and Febbraio, 2005] в мононуклеарных клетках человеческой периферической крови метил-в-циклодекстрим не влияет на процесс высвобождения белка, а значит, этот процесс не затрагивает липидные рафты.

Целый пласт исследований посвящен изучению взаимодействия Hsp70 с мембраной, что могло бы обяснить механизм появления Hsp70 на клеточной поверхности.

Белки Hsp70 и Hsc70 способны интегрироваться в липидный бислой липосом, где участвуют в формировании АТФ/ АДФ-зависимых катионных каналов, а также индуцируют агрегацию липосом [Arispe et al., 2002]. Кинетика агрегации и проводимость каналов отличается для Hsp70 и Hsc70. Позже было продемонстрировано, что специфичность этих белков к липидной мембране коррелирует с экспрессией фосфатидилсерина на мембране [Arispe et al., 2004].

Таким образом, до сих пор не известен универсальный или преимущественный механизм секреции HSP70 для клеток иммунной системы вообще и для нейтрофилов в частности.

1.7 Причины и иммунологические аспекты процесса старения

1.7.1 Основные теории развития старения

Изменения экспрессии специфических генов, случайные накапливающиеся множественные молекулярные повреждения, нарушение устойчивости к клеточному стрессу, клеточное старение рассматриваются как важнейшие факторы старения организма [Franceschi et al., 2000а; Kirkwood, 2005; Saunders and Verdin, 2009].

Известная теория старения Хармана основана на том, что накопление молекулярных повреждений клеток и тканей, вызванное чрезмерным образованием АФК, является одной из основных причин, определяющих развитие процесса старения, и индукция окислительного стресса вовлечена в патогенез ассоциированных с возрастом заболеваний [Harman, 1956]. Накоплено много данных, как подтверждающих такую теорию старения, так и противоречащих ей [Balaban et al., 2005]. Поэтому теория Хармана пересматривалась и дополнялась несколько раз. В настоящее время повреждающие эффекты АФК в старении рассмотриваются во взаимосвязи с нарушениями в защитной системе клеток и нарушении белкового гомеостаза [Kregel and Zhang, 2007; Hцhn et al., 2013]. Некоторые авторы считают, что усиление продукции АФК, а также накопление повреждений, вызванных окислительной модификацией молекул, могут сопровождать старение, но не являются его причиной [Blagosklonny, 2012a; Edrey and Salmon, 2014]. Одна из новейших теорий старения рассматривает этот процесс как квази- программируемую часть жизненного цикла, связанную с работой сигнального пути mTOR. Гиперактивация TOR ускоряет процесс старения, что частично проявляется в развитии возрастных заболеваний, которые являются признаком старения. Факторы, замедляющие пути развития метаболизма mTOR, замедляют старение и «отодвигают» развитие возрастных заболеваний, увеличивая продолжительность жизни. Согласно этой теории, увеличение продукции АФК и накопление случайных молекулярных повреждений способствуют преждевременному проявлению возрастных заболеваний и ограничивают продолжительность жизни гораздо медленнее, чем старение и смерть, спровоцированные активацией TOR-пути [Blagosklonny, 2008].

Изменения в иммунной системе также играют важную роль в старении человека. Было замечено, что иммунная система пожилых людей часто характеризуется состоянием хронического воспаления, так называемого "Inflamm-aging" [Franceschi et al., 2000b]. Одной из особенностей этого состояния является постоянная слабая активация макрофагов и нейтрофилов в организме.

1.7.2 Ассоциированные с возрастом изменения в нейтрофилах

Известно, что патогенез ряда заболеваний, связанных с возрастом, таких как рак, ревматоидный артрит, нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания, прямо или косвенно опосредован изменениями активности нейтрофилов [Edwards and Hallett, 1997; Halliwell, 1989; Jaillon et al., 2013].

С одной стороны, недостаточная активация нейтрофилов приводит к повышению восприимчивости к бактериальным инфекциям в пожилом возрасте. С другой стороны, чрезмерная активность нейтрофилов, например, связанная с задержкой апоптоза, может быть разрушительной для самих клеток-продуцентов и тканей из-за индукции хронического воспаления. Многочисленные исследования показывают, что нейтрофилы изменяются в процессе старения. Однако существуют значительные противоречия в данных, описывающих изменения в функционировании нейтрофилов. С одной стороны известно, что при старении количество циркулирующих нейтрофилов остается неизменным [Fortin et al., 2008], в то же время есть данные, что хроническое воспаление у пожилых доноров может быть связано с нейтрофилией и повышением уровня воспалительных белков [Ferrando- Martнnez et al., 2013]. Многие функции нейтрофилов - хемотаксис, фагоцитоз, внутриклеточное переваривание и формирование нейтрофильных ловушек - изменяются со старением [Fulop et al., 2004; Hazeldine et al., 2014]. Спонтанный апоптоз нейтрофилов остается неизменным или незначительно увеличивается, однако цитокин-опосредованная задержка апоптоза при старении нарушается [Tortorella et al., 1998; Fulop et al., 1997]. Снижение антиоксидантной защиты в нейтрофилах пожилых людей способствуют сокращению времени жизни этих клеток [Oishi et al., 1997; Tortorella et al., 2006]. В то же время недавно у пожилых доноров было продемонстрировано наличие долгоживущих нейтрофилов [Solana et al., 2012].

Индуцированный ответ нейтрофилов на раздражитель в виде продукции АФК с возрастом у людей снижается [Fortin et al., 2008]. В то же время, уровень спонтанной продукции АФК нейтрофилами с возрастом, как правило, увеличивается и вносит вклад в развитие хронических воспалительных процессов, часто регистрируемых в пожилом возрасте [Ogawa et al., 2008; Squier, 2001; Peters et al., 2009].

1.7.3 HSP70 при старении

Один из механизмов защиты клеток от неблагоприятных последствий действия АФК может обеспечиваться высоко консервативными HSPs посредством участия в правильной укладке белка и предотвращении их агрегации [Bernadett et al., 2009; Niforou et al., 2014]. При повреждении HSP70-зависимых механизмов нарушается белковый гомеостаз, что может быть одним из факторов, ускоряющих старение. Это предположение вызвало серию исследований возрастных изменений экспрессии HSP70. Анализ данных позволяет заключить, что параметры внутриклеточного и сывороточного содержания HSP70 зависят от возраста. В частности, было показано, что базальный внутриклеточный уровень HSP70 в мононуклеарных клетках крови выше у пожилых доноров, чем у молодых [Njemini et al., 2007]. Напротив, способность этих клеток индуцировать в ответ на стресс синтез

HSP70, как и другие типы реакции на стресс, снижается с возрастом [Njemini et al., 2002; Calderwood et al., 2009].

Как уже упоминалось, циркулирующий в сыворотке Hsp70 обнаруживаются в норме, но его уровень меняется с возрастом. Концентрация Hsp70 в сыворотке у людей старше 90 лет, т.е долгожителей, резко снижается по сравнению с молодыми донорами до 40 лет, тогда как уровень антител к этому белку наоборот, имеет тенденцию к увеличению с возрастом, что, как утверждают авторы, демонстрирует снижение с возрастом отвечать на стресс [Rea et al., 2001; Njemini et al., 2011]. Выявлена положительная взаимосвязь между сывороточным уровнем Hsp70 и маркерами воспаления (TNF-б, С-реактивный белок, фибриноген) у пожилых людей, что подтверждает вовлеченность этих белков в вопалительные заболевания при старении [Njemini et al., 2004]. В то же время было показано, что уровень сывороточного Hsp70 связан с продолжительностью жизни [Terry et al., 2006]. В нейтрофилах у пожилых доноров была выявлена взаимосвязь между определенным параметром продукции АФК и уровнем HSP70 в плазме крови [Ogawa et al., 2008].

Таким образом, нейтрофилы как источник внутриклеточных и внеклеточных форм АФК играют значительную роль в процессе старения организма. В связи с этим представляется важным разностороннее изучение возрастных изменений взаимосвязи содержания белков HSP70, на которых основан один из механизмов защиты клеток, с продукцией нейтрофилами АФК.

2. Материалы и методы

2.1 Реагенты

Моноклональные антитела: анти-HSP70 (клон BRM-22, Sigma-Aldrich, CША), анти-Hsp70 (клон С92F3A-5, Enzo Life Sciences, США), анти-Hsc70 (клон 1B5, Enzo Life Sciences, США), анти-в-актин (клон AC-15, Sigma- Aldrich, США); CD63-FITC (BioLegend, США); CD66b-FITC (BioLegend, США); CD107a-PE-Cy5 (клон eBioH4A3, eBioscience, США); CD14-PE (Сорбент, РФ).

Поликлональные антитела: анти-NOX2/gp91phox (Abcam, США); анти- Hsp70/Hsc70 (Santa-Cruz Biotechnology, США); анти-Fab-фрагмент IgG мыши (Sigma-Aldrich, США) или крысы (eBioscience, США), PE-конъюгированные; анти-Ig мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США), анти-Ig кролика, AF488-конъюгированные (Life Technologies, США) (где FITC - флуоресцеинизотиоцианат, PE - фикоэритрин, PE-Cy5 -циано- фикоэритрин, AF488 - Alexa Fluor 488 нм.

Реагенты для выделения нейтрофилов из периферической крови человека и подготовки образцов: градиентная среда для выделения Polymorphprep (Axis-Shield, Швеция); фосфатно-солевой буфер DPBS, pH 7.2-7.4; бесцветный раствор Хэнкса; синтетическая среда RPMI-1640 (все ПанЭко, РФ); эмбриональная телячья сыворотка HyClone (Thermo Scientific, США); L-глутамин (ПанЭко, РФ); HEPES; циклогексимид, глибенкламид (все Sigma-Aldrich, США); хлорид аммония (Химмед, РФ).

Реагенты для оценки жизнеспособности, фиксации и пермеабилизации нейтрофилов: трипановый синий (ПанЭко, РФ); пропидия йодид (PI) (Sigma- Aldrich, США). Параформальдегид (Riedel-de Haen, Германия); тритон X-100 (Хеликон, РФ); бычий сывороточный альбумин (BSA) (ПанЭко, РФ); набор для внутриклеточного окрашивания Cytofix/Cytoperm (Beckton Dickinson, США).

Реагенты для лизирования нейтрофилов и Вестерн-блоттинга: смесь ингибиторов протеаз (Thermo Scientific, США); реагент Брэдфорда (BioRad,

США); нитроцеллюлозная мембрана (Sigma-Aldrich, США); Tween 20 (Хеликон, РФ); обезжиренное сухое молоко (Roth, Германия); диаминобензидин (Sigma-Aldrich, США); акриламид, бис-акриламид (Пан- Эко, РФ); натрия додецилсульфат (SDS) (Panreac, США); персульфат аммония (PSA) (Sigma-Aldrich, США); преокрашенный маркер малекулярных масс (Bio-Rad, США); неорганические соли (Пан-Эко, РФ).

Реагенты для определения АФК: 2'-7'-дихлорфлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) (Invitrogen, США); люминол (Serva, Германия); зимозан A; формил-метил-лейцил-фенилаланильный пептид (fMLP) (все Sigma Aldrich, США).

Реагенты для выделения тотальной РНК, обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции (PCR) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR): TRIzol реагент (MRC, Великобритания); РНК-аза А (Sigma-Aldrich, США); ДНКаза I (Thermo Scientific, США); обратная транскриптаза MINT; реакционная смесь для RT- PCR qPCRmix-HS SYBR (все Евроген, РФ); набор для проведения PCR GenPak PCR MasterMix Core (Isogene Lab., РФ).

2.2 Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов

Образцы периферической крови доноров получали при условии информированного добровольного согласия доноров, в соответствии с основными этическими принципами проведения медицинских исследований, изложенными в Хельсинской декларации. В корреляционный анализ были включены данные от 65 добровольцев обоих полов. Группу молодых составили 26 доноров в возрасте от 20 до 59 лет (медиана 30.5 лет, 13 мужчин, 13 женщин); группу пожилых доноров составили 24 добровольца в возрасте 60-89 лет (медиана 73.5 года, 9 мужчин, 15 женщин); в группу долгожителей вошло 15 доноров в возрасте 90 лет и старше (медиана 91 год,

7 мужчин, 8 женщин), наблюдающихся в Российском геронтологическом

научно-клиническом центре. Критериями включения добровольцев в исследование являлись отсутствие у них патологии в активной фазе (острые инфекции, опухоль, инсульт, инфаркт), лечения кортикостероидами или нестероидными противовоспалительными средствами, способность самообслуживания.

Периферическую кровь собирали закрытым способом в стерильные пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта гепарин (Vacutube, Италия). Начало выделения клеток производили не позднее двух часов после забора крови. Процедуру выделения нейтрофилов проводили по методике градиентного разделения клеток с использованием коммерческой среды Polymorphprep. Цельную кровь наслаивали на среду в соотношении 1:1, затем проводили центрифугирование в течение 30 мин при 500 g и 23°C в режиме без торможения. Собирали нижнюю интерфазу, соответствующую популяции полиморфноядерных лейкоцитов (нейтрофилов), с последующей двукратной отмывкой при 400 g в течение 15 мин в DPBS, или, в случае измерения внутриклеточных АФК, в растворе Хэнкса. После процедуры отмывки нейтрофилы переводили в среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ L- глутамина, с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 15 mM HEPES (полная среда). В этой среде проводили все последующие манипуляции с клетками. Жизнеспособность клеток проверяли с помощью окрашивания трипановым синим (она составляла, как правило, более 95%). Готовили образцы, содержащие по 500 мкл клеточной суспензии с концентрацией 2Ч106 клеток/мл. Часть образцов подвергали нагреванию на термостатируемой водяной бане (BioSan, Латвия). Контрольные образцы, а также образцы подвергнутые тепловому шоку (далее ТШ) до момента окрашивания антителами инкубировали необходимый период времени (5 мин, 30 мин, 60 мин и т. д.) в условиях повышенной влажности, при температуре 37°C в атмосфере с 5% СО2.

В ряде экспериментов перед ТШ проводили предварительную инкубацию нейтрофилов с глибенкламидом (0.5 мМ, 2 ч), хлоридом аммония (50 мМ, 2 ч) либо циклогексимидом (100 мкМ, 30 мин).

2.3 Проточная цитофлуориметрия

В работе использовали цитофлуориметр FACSСalibur (BD Biosciences, США), укомплектованный двумя лазерами 488 и 640 нм со стандартными детекторами и фильтрами. Нейтрофилы определяли по морфологическим параметрам на диаграмме малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния и по окрашиванию антителами CD14 либо СD66b. Метод проточной цитометрии использовали для оценки в нейтрофилах внутриклеточного уровня HSP70, поверхностной локализации HSP70, внутриклеточной продукции АФК, поверхностной экспрессии маркеров дегрануляции. При каждом цитометрическом измерении анализировали не менее 5000 событий в выделенном регионе. Данные обрабатывали с помощью специализированных программ для обсчета цитометрических данных CellQuest ver. 3.3 (BD Biosciences, США), и FlowJo ver. 7.6.2. (FlowJo, LLC Software, Ashland, США).

2.3.1 Оценка жизнеспособности нейтрофилов

После выделения нейтрофилов клетки окрашивали трипановым синим, доля живых нейтрофилов (не окрашенных реагентом) составляла не менее 95%.

Процентное содержание некрозных и апоптозных клеток в образцах нейтрофилов определяли с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя PI. Для определения некрозных (PI-позитивных) нейтрофилов окрашивание образцов, содержащих живые интактные либо подвергнутые гипертермии нейтрофилы после их часовой инкубации, проводили в растворе DPBS, содержащем 2 мкг/мл PI.

Для определения апоптозных клеток образцы фиксировали в охлажденном 70% растворе этанола (60 мин) с последующей двукратной

отмывкой, и переводили для измерения в раствор DPBS, содержащий 20 мкг/мл PI и 50 ед./мл РНК-азы А. В каждом образце проводили подсчет не менее 10x103 нейтрофилов в популяции, включающей как живые, так и погибшие клетки. Клетки с пониженным содержанием ДНК оценивали как апоптозные.

2.3.2 Цитометрический анализ внутриклеточного уровня HSP70

Уровень поверхностной экспрессии HSP70 сравнивали в образцах интактных клеток и в образцах, подвергнутых ТШ. Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензии нейтрофилов первичнымими антителами (коммерческими антителами к HSP70, Hsp70, Hsc70, гибридомными антителами к разным концевым участкам белков HSP70) проводили через 30 мин после окончания нагревания в полной среде в объеме 100 мкл (30 мин при 4°C). После двукратной отмывки раствором PBA (DPBS с добавлением

0.2% BSA и 0.05% NaN3) проводили окрашивание вторичнымими флуоресцентномечеными антителами в растворе PBA (30 мин при 4°C). Вновь клетки отмывали, ресуспендировали в PBS и подвергали цитометрическому анализу. Использовали рекомендованное производителем количество антител, в некоторых случаях проводили их предварительную титровку. Уровень поверхностной экспрессии HSP70 вычисляли в условных единицах, аналогично внутриклеточному уровню HSP70.

Аналогичную процедуру иммунофлуоресцентного окрашивания проводили для анализа поверхностной экспрессии СD63, CD66b, CD107a. В положительном контроле нейтрофилы активировали индуктором окислительного взрыва и дегрануляции fMLP (2 мкМ).

2.3.4 Цитометрическое измерение внутриклеточной продукции АФК

Спонтанную продукцию АФК в нейтрофилах определяли с помощью DCFH-DA, уровень флуоресценции которого пропорционально зависит от внутриклеточной концентрации основного продукта АФК - пероксида водорода. К образцам нейтрофилов, переведенных в полную среду в объеме 500 мкл, добавляли DCFH-DA в конечной концентрации 5 мкг/мл. Затем проводили инкубацию образцов при 37°C в атмосфере 5% СО2 в течение 20 мин для проникновения DCFH-DA в клетки, после которой клетки двукратно отмывали холодным DPBS при 4°C. Флуоресценцию клеток, облученных лазером 488 нм, анализировали в канале FL1.

2.4 Анализ внутриклеточного содержания HSP70 методом Вестерн- блоттинга

Нейтрофилы в количестве 2-5 млн лизировали буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl (pH7.5), 150 мМ NaCl, 1 мМ Na2EDTA, 1% тритон X-100 и смесь ингибиторов протеаз в объеме 100 мкл в течение 5 мин на льду. После центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин отбирали надосадок и проводили измерение концентрации тотального белка в лизированных образцах нейтрофилов с использованием реагента Брэдфорда. Фракционирование белков проводили в условиях денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле с концентрацией разрешающего геля 10%. Общее количество белка, вносимого в лунку, в каждом образце было выравнено и составляло в среднем 50 мкг/лунку. После процедуры переноса на нитроцеллюлозную мембрану, проводили блокирование мембраны в буфере T-TBS (20 мМ Трис-HCl (pH7.6), 138 мМ NaCl, 0.1% Tween 20) c 5% содержанием обезжиренного сухого молока с последующей отмывкой в T-TBS. Затем мембрану окрашивали моноклональными антителами против HSP70 (BRM22) и в-актина (AC-15), разведенных в T- TBS с 5% BSA в течение 12 ч при 4°C с последующей двукратной отмывкой, а затем антителами против Ig мыши, меченных пероксидазой хрена. Иммуноблот проявляли, используя субстрат, содержащий диаминобензидин и перекись водорода (0.003%). Результат фиксировали с помощью системы гель-документации (Vilber Lourmat, Франция). Анализ блотов проводили в программе обработки денситомтерических даных ImageJ 1.38х (Wayne Rasband, NIH, США).

2.5 Измерение продукции АФК с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции

Для индукции избыточной продукции АФК нейтрофилы (1 млн/мл) стимулировали зимозаном A, опсонизированным свеже приготовленной сывороткой от 10 доноров, в конечной концентрации 20 мг/мл. Реакцию проводили при 37°C в 96-луночных темных планшетах (SPL, Корея) в 200 мкл раствора Хэнкса с добавлением 1 µM люминола. Уровень хемилюминесценции в образцах измеряли на хемилюминометре 3603 (Dialog Joint Venture, Moscow), регистрируя число импульсов в минуту (cpm). Спонтанную продукцию АФК измеряли в точке инициации реакции. За уровень зимозан-индуцированной продукции АФК брали максимальное

значение cpm, которое регистрировали в течение 30 мин. Каждый образец измеряли в дублях.

2.6 Статистический анализ данных

Анализ данных и статистическую обработку проводили в программе SigmaPlot версия. 11.0 (Systat Software Inc., США). При наличии нормального распределения для анализа достоверности различий между двумя группами использовали параметрический t-тест для независимых выборок. При отсутствии нормального распределения данных для анализа, применяли непараметрический тест Манна-Уитни (U-test). Для проведения корреляционного анализа использовали метод ранговой корреляции Спирмана. Достоверными считались различия между группами при р<0.05.

2.7 Измерение транскрипционной активности генов HSP70 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR)

Тотальную РНК для каждого образца выделяли из 6х106 нейтрофилов с использованием TRIzol-реагента в соответствии с инструкцией производителя. Образцы выделенной РНК подвергали обработке ДНКазой I с целью избавления от возможной примеси тотальной ДНК. Измерение концентрации выделенной РНК (нг/мкл) производили на спектрофотометре NanoVue Plus при длинах волн 260/280 нм (GE Healthcare Life Science, Великобритания). Концентрацию рассчитывали с использованием калибровочной кривой. Процедуру обратной транскрипции для синтеза кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы MINT и рандомных гексамерных праймеров по методике, указанной в прилагаемой производителем инструкции. Гексамерные праймеры (12 пмоль) добавляли в смесь объемом 10 мкл, содержащую 2 мкг тотальной РНК. Смесь прогревали в течение 2 мин при 70°C, а затем переносили в лед на 10 мин. Для инициации реакции синтеза кДНК, реакционную смесь инкубировали при 42°C и 70°C в течение 120 и 15 мин, соответственно. Специфические праймеры (5'-3') к отдельным генам белков HSP70 и референсному гену были подобраны с помощью программного обеспечения Primer Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) и программы OligoAnalyzer 3.1. Были выбраны и синтезированы (Евроген, РФ) следующие последовательности (название гена: прямой праймер, обратный праймер). HSPA1: AGGTGCAGGTGAGCTACAAG, CTCGGCGATCTCCTTCATC; HSPA8: TGCTGCTCTTGGATGTCACT, AAGGTCTGTGTCTGCTTGGT;