Внутриклеточное содержание белков теплового шока 70 кДа и его взаимосвязь с продукцией активных форм кислорода в нейтрофилах человека при старении

b-актин:CACCACACCTTCTACAATGAG, GTCTCAAACATGATCTGGGTC.

b-Актин использовали в качестве референс-гена, для нормализации количества кДНК в каждой временной точке измерения.

Специфичность подобранных праймеров проверяли после проведения PCR и электрофореза продуктов PCR в 3% агарозном геле по наличию одного продукта с ожидаемой мол. массой.

2.7.1 Проведение qRT-PCR

Экспрессию генов в режиме qRT-PCR оценивали в образцах интактных, подвергнутых ТШ при разных режимах ( 43°C, 10 мин; 40°С, 40 мин) спустя разные промежутки времени после окончания тепловой обработки. Каждый образец для проведения qRT-PCR (конечный объем составил 25 мкл) содержал 5 мкл коммерческой реакционой смеси qPCRmix-HS SYBR, 1 мкл 3 mM праймеров (прямого и обратного), 0.5 мкл кДНК и 17.5 мкл подготовленной (очищенной от РНК) воды. Реакцию амплификации проводили на приборе LightCycler480 (Roche Diagnostics, Германия). Применяли следующий протокол: прединкубация (95°C, 5 мин), затем 40 циклов, включающих режимы денатурации (95°C,10 с), отжига праймеров (60°C,10 с), и удлинения ДНК (72°C, 10 с). Перед окончанием реакции амплификации, кривая диссоциации была представлена в виде графика, чтобы подтвердить специфичность продукта. Каждую точку для амплификации вносили в триплетах. Для коррекции количества внесенного

материала в каждой временной точке, анализ результатов проводился с нормализацией по эндогенному референс-гену b-актину.

2.7.2 Статистическая обработка данных RT-PCR

Уровень накопления мРНК оценивали по алгоритму с определением коэффициента эффективности отжига праймеров. Для этого использовали программные приложения LightCycler480 версия SW 1.5.1, Exor4, LinRegPCR, LC480Conversion. Разбросы данных представлены в виде стандартной ошибки среднего.

2.8 Оценка внеклеточного уровня HSP70 с помощью ИФА

Уровень внеклеточного содержания HSP70 оценивали в супернатантах образцов нейтрофилов с помощью наборов для иммуноферментного анализа. В работе использовали два типа набора: для определения Hsp70 (Enzo Life Sciences, США) и Hsc70 (StressMarq, Канада). Для анализа отбирали культуральную жидкость из образцов, которые не подвергали ТШ (контроль), сразу после проведения ТШ, а также спустя разные промежутки времени после окончания ТШ. До проведения ИФА супернатанты держали замороженными при -20°С.

Культуральную жидкость, отобранную из восьми идентичных образцов (2 млн/мл, 500 мкл), концентрировали на приборе SpeedVak Concentrator (ThermoSavant, CША) в 10 раз. В лунки планшета с иммобилизованными на их поверхности антителами к Hsp70 или Hsc70 наносили стандартные (раствор антигенного белка определ?нной концентрации) и исследуемые (концентрированные супернатанты) образцы.

После инкубации (в условиях, указанных в инструкции производителя) и трехкратной промывки лунок от несвязавшегося антигена входящим в набор буфером для отмывки добавляли биотинилированные антитела к Hsp70 или Hsc70. После получасовой инкубации вновь три раза промывали лунки буфером для отмывки и добавляли в каждую лунку входящий в состав набора раствор конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена.

После очередной инкубации и трехкратной отмывки добавляли субстрат тетраметилбензидин (ТМВ) для развития цветной реакции. Реакцию останавливали через 30 мин добавлением в лунки блокирующего буфера на основе серной кислоты. Измерение оптической плотности образцов проводили на фотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, CША) при длине волны 450 нм (референсной длине волны 620 нм).

По стандартным образцам строили калибровочную кривую зависимости величины оптической плотности от концентрации Hsp70 и Hsc70 (пг/мл), и по ней вычисляли концентрацию исследуемых белков в образцах.

3. Результаты

3.1 Внутриклеточное содержание HSP70 в интактных нейтрофилах в разных возрастных группах

Учитывая, что устойчивость к стрессу, опосредованная системой белков семейства HSP70, является важным фактором, влияющим на процессы клеточного старения, на первом этапе была поставлена задача оценить содержание HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах: 20-59 (молодые), 60-89 (пожилые) и 90 и более лет (долгожители).

Детекция внутриклеточных HSP70 была проведена методом проточной цитометрии с использованием модифицированной методики фиксации и пермеабилизации клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводилось с помощью антител BRM-22, специфичных к консервативному участку белков семейства HSP70, распознающих как индуцированный Hsp70, так и конститутивный Hsc70 белки.

Не было выявлено достоверных возрастных изменений в исходном содержании HSP70 (HSP70базальный) в нейтрофилах (Рис. 1). Однако наблюдалась тенденция к снижению значения медианы этого параметра с возрастом.

Рис.1. Внутриклеточное содержание HSP70 (HSP70базальный) в нейтрофилах, измеренное в разных возрастных группах методом проточной цитометрии с помощью антител BRM-22 (распознающих как индуцированный Hsp70, так и конститутивный Hsc70 белки семейства HSP70). Здесь и далее отмечены и даны значения медианы в каждой группе.

3.2 Динамика изменения уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Эффективность работы репарационной системы, к которой относятся белки HSP70, опосредована не только содержанием этих белков в интактных клетках: важным параметром является способность клеток реагировать на стресс и индуцировать синтез HSP70. Поэтому на следующем этапе работы была проанализирована способность нейтрофилов индуцировать синтез HSP70 в ответ на классический индуктор синтеза этих белков - тепловой шок (далее ТШ). Методами RT-PCR и проточной цитометрии были определены транскрипционная активность генов и содержание белков HSP70, а также динамика изменения этих параметров в нейтрофилах человека в условиях гипертермии, как модели клеточного стресса.

3.2.1 Транскрипционная активность генов белков HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Чтобы подобрать условия ТШ, при котором будет происходить активация транскрипции генов белков HSP70, в работе использовали две модели гипертермии in vitro: 40°C, 40 мин и 43°C,10 мин. Это позволило сравнить кинетический профиль внутриклеточного содержания HSP70, который сильно зависит не только от типа клеток, но от того, стрессирующему воздействию какой интенсивности и продолжительности подвергаются клетки или организм [Eid et al., 1987; Wang et al., 2003]. Транскрипционная активность генов семейства HSP70 в ответ на гипертермию оценивали как для гена HSPA1 индуцируемого белка Hsp70, так и для гена HSPA8 конститутивного белка Hsc70.

Для того, чтобы нормировать количество клеток, из которых выделяли мРНК в каждой временной точке, в качестве референс-гена был выбран один из наиболее распространенных и часто анализируемых генов в-актин. Известно, что ТШ может временно ингибировать синтез большинства белков в клетке. Исследователями было показано, что воздействие ТШ (43°С, 20 мин) на мононуклеарные клетки не вызывает статистически значимых отличий уровня экспрессии таких генов белков «домашнего хозяйства», как рибосомальные белки, в-актин, в2-микроглобулин, GAPDH [Sonna et al., 2002].

В нашей работе экспрессия гена 18S-рибосомальной субъединицы была очень низкая, что соотносится с малым количеством рибосом в нейтрофилах, поэтому этот ген не мог быть использован в качестве референс-гена. Учитывая это, уровень транскрипционной активности генов белков HSP70 был представлен в виде отношения накопленных мРНК гена HSPA1 и HSPA8 к гену в-актина.

Из представленных данных видно, что индукция синтеза мРНК происходит в режиме проведения ТШ 43°C, 10 мин и практически отсутствует при режиме термообработки 40°C, 40 мин.

Индукция происходит как для генов HSPA1, так и для HSPA8 с максимальным уровнем накопленной мРНК в интервале между 0.5 и 3 ч после окончания термической обработки в режиме 43° C, 10 мин.

Таким образом, для большинства последующих экспериментов был выбран режим ТШ 43°C, 10 мин.

Было выяснено, что такие условия проведения тепловой обработки существенно не влияют на жизнеспособность нейтрофилов. Об этом свидетельствует отсутствие достоверных отличий в содержании некрозных (PI-позитивных) клеток между образцами, содержащими интактные либо подвергнутые гипертермии нейтрофилы после их часовой инкубации, а также в содержании апоптозных нейтрофилов между образцами, содержащими интактные либо подвергнутые ТШ клетки после их четырехчасовой инкубации.

3.2.2 Анализ динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Для изучения динамики внутриклеточных HSP70 в нейтрофилах под действием ТШ уровень HSP70 определяли методом проточной цитометрии в интактных клетках и сразу после тепловой обработки, затем анализировали изменение этого уровня через каждый час до 7 ч., а также в более поздние сроки (15-17 ч после окончания ТШ).

Как правило, сразу после проведения ТШ в нейтрофилах определяли значительное возрастание уровня внутриклеточных HSP70 по сравнению с исходным уровнем. В течение 15-30 мин после завершения термического воздействия наблюдали фазу снижения этого уровня (типичные кривые динамики представлены на Рис. 4А.

Необходимо было учитывать, что стресс-индуцированное увеличение внутриклеточного количества белков HSP70 происходит с учетом периода восстановления клеток, длительность которого может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от типа и условий обработки клеток [Eid et al., 1987; Wang et al., 2003; Polla et al., 1995; Schneider et al., 2002]. В используемой нами модели клеточного стресса с помощью метода проточной цитометрии не удалось выявить значительного увеличения внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах в промежуток времени 1-7 ч после нагревания, а также через 15 ч после ТШ (Рис. 4Б).

Методами проточной цитометрии (Рис. 4В) и Вестерн-блоттинга (Рис. 4Г) ярко выраженного накопления индуцируемого Hsp70 с использованием специфических антител, в промежутке времени 1-7 ч после нагревания в нейтрофилах обнаружено тоже не было.

Аналогичные эксперименты были проведены при температурном режиме 40°С, 40 мин. Как и ожидалось, в отсутствие индукции накопления мРНК для Hsp70 и Hsc70, при ТШ 40°С, 40 мин, не удалось выявить увеличения внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах в течение 4.5 ч после термообработки и через 15ч.

А Б

50

40

10

9

8

7

Рис. 4. Динамика внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах в ответ на ТШ (43°C, 10 мин), оцененная методами проточной цитометрии и Вестерн-блоттинга. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток проводили с помощью антител BRM-22 (А, Б) и антител С92F3A-5, распознающих только Hsp70 (В). А. Измерение уровня HSP70 проводили до ТШ (точка 0 мин), сразу после окончания ТШ (точка 10 мин), а также через 15,30 и 60 мин после окончания ТШ. Представлены результаты независимых экспериментов с нейтрофилами, полученными от четырех разных доноров в возрасте от 25 до 91 года, выбранных случайным образом. Б. Измерение уровня HSP70 проводили до ТШ, сразу после окончания ТШ и каждый час в течение 7 ч, а также через 15 ч с момента окончания ТШ. Представлены данные от двух независимых экспериментов. В. Измерение уровня Hsp70 до ТШ и каждый час после окончания ТШ в течение 7 ч, где 1 и 2 - доноры. Г. Анализ методом Вестерн-блоттинга внутриклеточного содержания Hsp70; в качестве референсного белка использовали в-актин. Здесь и далее разброс данных рассчитывали в виде ошибки среднего.

3.3 Анализ экспрессии HSP70 в мононуклеарных клетках человека

Анализ внутриклеточной экспрессии HSP70 в условиях гипертермии был проведен в клетках периферической крови моноцитарного ряда: лимфоцитах и моноцитах, в которых, как показано в целом ряде статей, происходит индукция и накопление Hsp70 в ответ на ТШ. Данные клетки были использованы в качестве положительного контроля, чтобы подтвердить, что используемые в данной работе цитометрические методы позволяют адекватно оценивать в клетках индукцию синтеза HSP70. Было проведено измерение уровня HSP70 при двух режимах гипертермии in vitro, используемых в публикациях: 43°С, 20 мин и 40°С, 90 мин.

Помимо оценки с использованием антител BRM-22 общего уровня белков HSP70, с помощью соответствующих антител (С92F3A-5) была проанализирована динамика содержания индуцируемого Hsp70 в моноцитах и лимфоцитах.

В популяции моноцитов при окрашивании антителами BRM22 регистрировали ярко выраженное накопление HSP70, тогда как в лимфоцитах такого увеличения не наблюдалось. В моноцитах при окрашивании антителами С92F3A-5 индукция Hsp70 происходила при воздействии 43°С, 20 мин и была слабовыраженной при 40°С, 90 мин. В лимфоцитах при 43°С, 20 мин индукция Hsp70 была на порядок (в 10 раз) меньше по сравнению с моноцитами, и отсутствовала при воздействии на клетки в режиме 40°С, 90 мин. Сравнительный анализ экспрессии Hsp70 в лимфоцитах и нейтрофилах в нашей модели клеточного стресса показал, что в нейтрофилах индукция этих белков существенно слабее, чем в лимфоцитах, или, у некоторых доноров, отсутствует.

Для анализа содержания белков HSP70 использовали также метод Вестерн-блоттинга). Данные об индукции синтеза белков HSP70 под действием ТШ в лимфоцитах и моноцитах, полученные методами проточной цитометрии и Вестерн-блоттинга, оказались хорошо согласованы между собой.

На основании полученных цитометрических результатов можно заключить, что: 1) используемый в данной работе метод проточной цитометрии позволяет регистрировать изменение экспрессии HSP70; 2) увеличение экспрессии HSP70 зависит от температуры и времени воздействия ТШ; 3) индукция Hsp70 в лимфоцитах происходит существенно слабее, чем в моноцитах; 4) использование антител BRM22 позволяет регистрировать ярко выраженное (более чем в десять раз) стресс- индуцируемое увеличение содержания HSP70, вероятно, за счет преимущественного связывания антител с превалирующим в клетках белком Hsc70, количество которого под действием стресса практически не изменяется.

3.4 Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Дальнейшая работа была сосредоточена на двухфазной динамике внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах, связанной с быстрым действием ТШ (43°C,10 мин), зарегистрированной с помощью проточной цитометрии.

В серии экспериментов было выявлено, что при снижении температуры воздействия резкое увеличение внутриклеточного уровня HSP70 после окончания ТШ также выявляется, но изменяется его амплитуда.

Так, инкубация нейтрофилов при снижении температуры на 1°C (42°C, 10 мин) приводит к значительному меньшему возрастанию HSP70 по сравнению с инкубацией при 43°С.

Значительная разница в динамике внутриклеточного уровня HSP70 была найдена при использовании двух способов пермеабилизации нейтрофилов. Модифицированная методика, с помощью которой были получены вышеописанные результаты, основана на добавлении тритона X-100 в качестве детергента, в то время как коммерческий набор Cytofix Cytoperm (Becton Dickinson, США) включает в качестве детергента сапонин.

Как видно из рисунка, при пермеабилизации нейтрофилов сапонином двухфазная динамика c быстрым возрастанием и падением уровня внутриклеточных HSP70 в течение 15-30 мин после завершения ТШ выявляется, но со значительно меньшей амплитудой по сравнению с результатами, полученными при пермеабилизации тритоном Х-100. В то же время, независимо от способа пермеабилизации клеток, ярко выраженного увеличения внутриклеточного уровня HSP70 и Hsp70 с учетом времени восстановления на более поздних этапах зарегистрировать не удалось.

Можно предположить, что быстрое увеличение внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах после ТШ связано со стресс- индуцированным синтезом этих белков. Чтобы установить, связано ли зарегистрированное увеличение уровня HSP70 в нейтрофилах с процессом активации трансляции, была проведена серия экспериментов с использованием ингибитора белкового синтеза циклогексимида. Предварительная инкубация нейтрофилов с циклогексимидом не приводила к ингибированию фазы увеличения детектируемых внутриклеточных HSP70 после тепловой обработки. Эти данные указывают на то, что увеличение уровня HSP70 сразу после проведения ТШ не связано с синтезом белка de novo.

Для проверки полученных методом проточной цитометрии данных об увеличении уровня внутриклеточных HSP70 после ТШ было проанализировано содержание в нейтрофилах HSP70 методом Вестерн- блоттинга. Нам не удалось зарегистрировать увеличение количества HSP70 после ТШ. Это свидетельствует о том, что увеличение содержания HSP70 в нейтрофилах сразу после термического воздействия не связано с усилением синтеза этих белков.

Необходимо было выяснить, с какой формой белка связано индуцированное ТШ двухфазное изменение внутриклеточного уровня HSP70. С этой целью динамика содержания HSP70 в нейтрофилах была проанализирована с использованием двух коммерческих антител, распознающих либо индуцируемый (Hsp70), либо конститутивный (Hsc70) белки HSP70. Зависимость внутриклеточного уровня этих белков от времени оказалась сходной для указанных типов антител.

Как и с использованием антител BRM22, с помощью антител к Hsp70 и Hsc70 были выявлены связанные с ТШ фазы увеличения и последующего cнижения уровня HSP70. Таким образом, вклад в зарегистрированный методом проточной цитометрии двухфазный профиль динамики вносили как конститутивный, так и индуцируемый белки HSP70.

Поскольку ранее было продемонстрировано, что увеличение уровня HSP70 после ТШ не связано с синтезом белка de novo, то можно предположить, что оно может быть связано с изменением молекулярной конформации молекулы HSP70.

Внутриклеточное содержание HSP70 было проанализировано с помощью панели из шести моноклональных антител к HSP70, полученных нами ранее [Ветчинин и др., 2010 а, б]. Предварительно, также было показано, что антитела клеточных клонов гибридом 2Е4, 2Е11, 2F3 обладают специфичностью к консервативным эпитопам субстрат-связывающего СOOH-терминального домена HSP70. Антитела гибридом 6G2, 2E5, 3C5 специфичны к участку молекулы Hsp70 консервативного NH2-терминального домена с АТФ-азной активностью [Бойко и др., 2014]. Сравнительный анализ взаимодействия моноклональных антител, специфичных к С-фрагменту HSP70, и моноклональных антител, специфичных к N-фрагменту Hsp70, показал, что динамика уровня внутриклеточных белков HSP70 в ответ на ТШ, зарегистрированная методом проточной цитометрии, для указанных групп гибридом различна. С помощью антител 6G2, 2E5, 3C5 не удалось выявить фазу увеличения внутриклеточного уровня HSP70 сразу после окончания ТШ, в то же время антитела 2E4, 2E11, 2F3 позволили это увеличение зарегистрировать.

Таким образом, индуцируемое тепловой обработкой возрастание внутриклеточного уровня HSP70, по-видимому, опосредовано усилением доступности эпитопов субстрат-связывающего домена белка специфичными к этому домену антителами.

В пользу сделанного нами заключения о конформационных изменениях белков HSP70 свидетельствуют данные следующего эксперимента, в котором образцы с нейтрофилами подвергали тепловой обработке 43°С, 10 мин (ТШ1 и ТШ2), с периодом восстановления клеток (инкубация 37°С, 2 ч, 5% СО2) между ТШ1 и ТШ2. Двухфазная динамика внутриклеточного уровня HSP70 в ответ на ТШ1 и ТШ2 оказалась сходной.

Таким образом, обобщая данные, можно сделать вывод, что повышение внутриклеточного уровня HSP70, вызванное ТШ, связано с изменением конформации белков, что, по-видимому, обусловлено частичной диссоциацией субстрата из комплекса с HSP70. С этой точки зрения данный параметр косвенно может указывать на количество белков HSP70, взаимодействующих с измененными белками, нуждающимися в стабилизации белками-шаперонами

3.5 Воздействие гипертермии на уровень HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах

Интенсивность стресс-индуцированного ответа на многие стимулы в старости снижается [Calderwood et al., 2009]. Для того чтобы оценить, как с возрастом в нейтрофилах в нашей модели клеточного стресса меняется уровень HSP70, было произведено сравнение уровня этого белка после воздействия ТШ в разных возрастных группах. Аналогично уровню HSP70базальный, уровень белка, зарегистрированный сразу после окончания ТШ (HSP70ТШ) достоверно не отличался между молодыми, пожилыми донорами и долгожителями.

В то же время, значение параметра, который рассчитывался в виде разницы между HSP70ТШ и HSP70базальный (ДHSP70ТШ) для каждого донора, с возрастом достоверно увеличивалось (Рис.12Б).

Таким образом, параметр ДHSP70ТШ, который, как мы предполагаем, косвенно указывает на количество HSP70, взаимодействующего с нарушенными белками-субстратами, связан с процессом старения.

3.6 Высвобождение HSP70 из нейтрофилов во внеклеточное пространство

Известно, что клеточный стресс в ряде случаев инициирует транслокацию HSP70 на плазматическую мембрану и/или высвобождение этих белков во внеклеточное пространство.

В данной модели клеточного стресса методом проточной цитометрии не удалось зарегистрировать HSP70 на поверхности нейтрофилов ни одними из используемых в работе коммерческих (в том числе к Hsp70 и Hsc70) и полученных к разным концевым участкам моноклональных антител. Поверхностная экспрессия белков была зарегистрирована только при окрашивании клеток поликлональными антителами к HSP70. Это можно объяснить тем, что нейтрофилы экспонируют на своей поверхности слишком мало HSP70 с доступными для распознавания эпитопами.

В то же время, на моноцитах, в которых индукция белков HSP70 ярко выражена, с помощью большинства имеющих в нашем распоряжении антител, распознающих HSP70, была зарегистрирована поверхностная экспрессия этих белков, что подтверждает предположение о том, что на поверхности не всех клеток экспрессируются белки HSP70 либо представлено достаточное количество HSP70 с доступными для распознавания эпитопами.

Содержание внеклеточных HSP70 было измерено в культуральной среде нейтрофилов с помощью иммуноферментного анализа с использованием двух коммерческих тест-систем для определения конститутивного (Hsc70) и индуцируемого (Hsp70) белков семейства HSP70. Анализу подвергались образцы надосадочной жидкости, полученной от интактных, а также подвергнутых тепловой обработке нейтрофилов сразу после ТШ и через 60 мин после его окончания. Результаты экспериментов показали, что содержание внеклеточных HSP70 возрастает после ТШ, причем это относится как к индуцируемой, так и конститутивной формам белка.

Как было упомянуто выше, в течение анализируемого периода времени жизнеспособность нейтрофилов практически не изменялась. Следовательно, присутствие внеклеточных белков HSP70 в клеточном надосадке не являлось следствием пассивного высвобождения исследуемых белков из некротических нейтрофилов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что в нейтрофилах в условиях клеточного стресса реализуется высвобождение как конститутивного, так и индуцируемого белков HSP70.

3.7 Анализ механизмов, регулирующих высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство из нейтрофилов

Серия экспериментов была направлена на изучение механизмов высвобождения белков HSP70 из нейтрофилов в используемой модели клеточного стресса. Механизмы активного высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство описаны в литературе противоречиво, не исключено, что универсального для всех типов клеток пути секреции этих белков не существует.

Поскольку дегрануляция нейтрофилов сопровождается высвобождением содержимого гранул, включающего разнообразные белки, была поставлена задача выяснить, связано ли, и, если связано, то с каким типом гранул стресс- индуцированное высвобождение HSP70. Для этого было проведено окрашивание плазматической мембраны интактных клеток и клеток, подвергнутых ТШ, антителами к маркерными белкам азурофильных и специфических гранул.

Применяли антитела CD63 (входит в состав мембран азурофильных гранул), CD66b (рецептор содержится в специфических гранулах и в небольшом количестве в секреторных гранулах). В качестве положительного контроля использовали активатор fMLP, который индуцирует в нейтрофилах развитие процесса дегрануляции.

Результаты показали, что в ответ на ТШ дегрануляции и увеличения поверхностной экспресии азурофильных и специфических гранул не происходит. Таким образом, вероятно, процесс высвобождения HSP70 в ответ на ТШ не сопряжен с дегрануляцией охарактеризованных типов гранул.

На следующем этапе была поставлена задача исследовать вовлеченность эндосомальных лизосом в процесс стресс-индуцируемой секреции HSP70.

Ранее была показана локализация HSP70 в составе лизосом [Nylandsted et al., 2004], а также возможность высвобождения HSP70 в составе секреторных эндосомальных лизосом для некоторых опухолевых клеток и макрофагов [Mambula and Calderwood, 2006]. С другой стороны, было продемонстрировано, что транспорт HSP70 во внеклеточное пространство осуществляется в секреторно-подобных гранулах, не несущих специфических маркеров лизосом [Evdonin et al., 2006]. Вначале мы проверили, является ли ТШ индуктором выброса лизосом, следствием которого является увеличение экспрессии на поверхности плазматической мембраны маркера лизосомального мембрано-ассоциированого белка (LAMP1, или CD107a.

Оказалось, что ТШ индуцирует увеличение экспрессии LAMP1 на мембране нейтрофилов, однако такой эффект наблюдается на клетках, составляющих 10-13% от всех анализируемых нейтрофилов. В то же время, активация нейтрофилов fMLP увеличивает экспрессию LAMP1 во всей популяции.

Известно, что для слияния эндосом с содержащимися в них белками с лизосомой необходимым условием является низкий рН. Чтобы исключить или подтвердить, что процесс созревания лизосом может влиять на динамику уровня HSP70 в нейтрофилах, было смоделировано нарушение созревания лизосом, для чего был использован лизосомотропный агент хлорид аммония, который является слабым основанием и способен проникать в лизосомы в протонированной форме, увеличивая внутрилизосомальный рН. Предварительная инкубация нейтрофилов с хлоридом аммония приводила к значительному возрастанию детектируемого сразу после ТШ уровня белков HSP70, преимущественно за счет превалирующей в клетках конститутивной формы, а также отмене последующего снижения уровня HSP70 после окончания тепловой обработки .

Полученные результаты, с одной стороны, могут свидетельствовать о том, что вызванное хлоридом аммония изменение созревания лизосом препятствует высвобождению HSP70 из нейтрофилов в составе эндолизосом. С другой стороны, возможно, что обработка клеток хлоридом аммония способствует удержанию связанных с эндолизосомами белков HSP70 в диссоциированном состоянии, свободном для связывания с антителами.

Было сделано предположение, что в процессе транслокации HSP70 в лизосому в нейтрофилах может участвовать транспортная система суперсемейства АTP-binding cassette (ABC)-транспортеров - трансмембранных белков, принимающих участие в транслокации широкого спектра продуктов через внутриклеточные и наружные мембраны. Ранее было показано, что процесс секреции HSP70 в некоторых типах клеток происходит с вовлечением представителей ABC-транспортеров [Mambula and Calderwood, 2006]. Для того, чтобы определить, реализуется ли такой механизм транслокации/секреции HSP70 в нейтрофилах, был использован неспецифический ингибитор ABC-транспортеров, блокатор ATФ-зависимых калиевых каналов глибенкламид.

Предобработка клеток глибенкламидом приводила к частичной или полной отмене фазы снижения внутриклеточного уровня HSP70, регистрируемой спустя 15-30 мин после окончания ТШ. Сходное действие глибенкламида было показано в отношении как индуцируемого (Рис. 18Б), так и конститутивного белков (Рис. 18В). При этом глибенкламид не влиял на начальный уровень белков HSP70 в нейтрофилах. Полученные данные указывают на то, что снижение уровня HSP70 после ТШ в нейтрофилах может частично отражать процесс стресс-индуцируемого высвобождения HSP70, которое регулируеется с участием ABC-транспортеров.

3.8 Спонтанная и индуцированная продукция АФК в разных возрастных группах

Для того чтобы выяснить, участвуют ли HSP70 в регуляции процессов продукции АФК нейтрофилами, мы оценили продукцию АФК в нейтрофилах и провели корреляционный анализ взаимосвязи параметров HSP70 и АФК в разных возрастных группах доноров.

На первом этапе была измерена спонтанная продукция АФК в неактивированных выделенных нейтрофилах в указанных возрастных

группах. Несмотря на то, что интенсивная продукция АФК является одним из маркеров активированных нейтрофилов, без каких-либо дополнительных стимулов нейтрофилы разных доноров продуцировали разные количества АФК, что может отражать особенности их состояния еще до выделения, в кровеносном русле. Спонтанную продукцию АФК в неактивированных нейтрофилах измеряли двумя способами, с помощью проточной цитометрии, используя проницаемый флуоресцентный зонд DCFH-DA (DCF) и с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХ).

Исходный (т.е. спонтанный) уровень продукции АФК, измеренный с помощью ЛЗХ (АФКЛЗХ спонт) в группах как пожилых людей, так и долгожителей был значительно выше, чем уровень АФКЛЗХ спонт в группе молодых доноров. Эти данные хорошо соотносятся с теорией Хармана о накоплении с возрастом АФК [Харман, 1956].

Спонтанная продукция внутриклеточных АФК, зарегистрированная с помощью DCF (АФКDCF спонт), также была значительно выше в группе пожилых доноров, однако в группе долгожителей уровень АФКDCF спонт оказался сходным с аналогичным параметром в группе молодых доноров, в противоположность полученным данным для параметра АФКЛЗХ спонт.

Не удалось выявить достоверных корреляций между параметрами

АФКDCF спонт и АФКЛЗХ спонт ни в одной из групп доноров, что может указывать на то, что используемые нами методы позволяют различать АФК из различных источников.

Также были проанализированы возрастные изменения индуцированной с помощью опсонизированного зимозана продукции АФК нейтрофилами (АФКЛЗХ инд) для того, чтобы оценить потенциальный функциональный ответ нейтрофилов на предполагаемый патоген. Этот параметр был рассчитан для клеток каждого донора, как отношение разницы между максимальным (АФКЛЗХ макс инд) и исходным уровнями продукции АФК к исходному уровню [АФКЛЗХ инд = (АФКЛЗХ макс инд - АФКЛЗХ спонт)/АФКЛЗХ спонт]. Следует отметить,

что в зависимости от индивидуальных особенностей доноров значения АФКЛЗХ макс инд достигались в диапазоне от 10 до 20 мин после внесения зимозана. Никаких достоверных отличий значений медиан АФКЛЗХ инд между группами долгожителей и молодых доноров найдено не было; в то же время, уровень АФКЛЗХ инд в группе пожилых был значительно ниже по сравнению с группой молодых доноров.

Таким образом, анализ возрастных изменений продукции АФК в нейтрофилах человека выявил, что функциональный ответ нейтрофилов в группе долгожителей не был снижен относительно контрольной группы молодых доноров в отличие от группы пожилых, у которых такой ответ был снижен. Спонтанная внеклеточная продукция АФК с возрастом увеличивалась, в то время как спонтанная внутриклеточная продукция АФК в группе долгожителей не отличалась от уровня этого параметра в группе молодых, а в группе пожилых указанный параметр был достоверно выше.

3.9 Анализ взаимосвязи между продукцией АФК и содержания HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах

Учитывая, что белки теплового шока принимают участие в клеточных механизмах защиты от накопления поврежденных белков, в том числе в результате воздействия АФК, следующей задачей в работе являлось изучение взаимосвязи методом корреляционного анализа между параметрами продукции АФК, описанных выше, и внутриклеточных уровней HSP70 в нейтрофилах в разных возрастных группах. Принимая во внимание, что большинство параметров, рассматриваемых в исследовании (АФКDCF спонт, АФКЛЗХ спонт, АФКЛЗХ инд, ДHSP70ТШ), зависят от возраста, мы проанализировали корреляции этих параметров между собой в группах молодых, пожилых доноров и долгожителей. В анализ также были включены параметры, которые по нашим данным, не имели возрастных отличий: HSP70базальный, HSP70ТШ (Таблица 1).

Несколько достоверных корреляций между определенными параметрами АФК и HSP70 были выявлены во всех возрастных группах, указывающих на существование взаимосвязи между внутриклеточными HSP70 и продукцией АФК в нейтрофилах. Однако обнаруженные корреляции не были постоянными в разных возрастных группах, поэтому, вероятно, такая связь является непрямой. Кроме того, в разных возрастных группах корреляции между параметрами HSP70 и АФК носили как положительный, так и отрицательный характер.

В группе молодых доноров параметр HSP70базальный отрицательно коррелировал с АФКЛЗХ спонт (Таблица 1), что означает, что низкий уровень спонтанной, преимущественно внеклеточной, продукции АФК связан с увеличенным внутриклеточным содержанием HSP70 в нейтрофилах. Эта связь исчезает с возрастом: никакой взаимосвязи между HSP70базальный и АФКЛЗХ спонт в группах пожилых доноров и долгожителей найдено не было.

Таблица 1. Корреляционный анализ внутриклеточного уровня HSP70 и продукции АФК в нейтрофилах в разных возрастных группах (r - коэффициент корреляции, p - величина достоверности).

Параметр 1	Молодые	Пожилые	Долгожители	Параметр 2
HSP70базальный	r = -0.086, p = 0.698	r = -0.063, p = 0.834	r = -0.319, p = 0.258	АФКDCF спонт
	Отрицательная r = -0.634, p = 0.014	r = 0.082, p = 0.778	r = 0.273, p = 0.377	АФКЛЗХ спонт
	r = 0.220, p = 0.435	Положительная r = 0.615, p = 0.024	r = -0.329, p = 0.284	АФКЛЗХ инд
HSP70ТШ	r = -0.033, p = 0.880	r = -0.203, p = 0.513	Отрицательная r = -0.61, p = 0.020	АФКDCF спонт
	Отрицательная r = -0.719, p = 0.003	r = 0.297, p = 0.313	r = -0.182, p = 0.557	АФКЛЗХ спонт
	r = -0.073, p = 0.797	Положительная r = 0.692, p = 0.008	r = -0.070, p = 0.817	АФКЛЗХ инд
ДHSP70ТШ	r = 0.029, p = 0.896	r = -0.217, p = 0.484	Отрицательная r = -0.626, p = 0.016	АФКDCF спонт
	r = -0.007, p = 0.976	r = 0.396, p = 0.173	Отрицательная r = -0.671, p = 0.015	АФКЛЗХ спонт
	r = -0.420, p = 0.129	Положительная r = 0.560, p = 0.044	r = 0.301, p = 0.329	АФКЛЗХ инд

Вместе с тем, поскольку в группе молодых корреляции между параметрами АФКЛЗХ спонт и ДHSP70ТШ не наблюдается, то можно предположить, что отрицательная взаимосвязь между HSP70 и продукцией внеклеточных форм АФК не связана с белками HSP70, вовлеченными в функциональные взаимодействия с белковыми субстратами.

Множественные взаимосвязи между HSP70 и АФК были выявлены в группе пожилых доноров. Заметные положительные корреляции были обнаружены между АФКЛЗХ инд и всеми анализируемыми в работе параметрами HSP70 (HSP70базальный, HSP70ТШ , ДHSP70ТШ ) (Таблица 1). Таким образом, в этой возрастной группе высокий уровень содержания

HSP70 в нейтрофилах связан с высокой индуцированной продукцией АФК и, следовательно, с более яркой иммунной реакцией. Можно предположить, что в возрасте между 60 и 89 лет, когда стимулированная продукция АФК в нейтрофилах значительно снижается, наличие внутриклеточных HSP70 каким-то образом становится критическим для сохранения адекватного уровня продукции АФК на патоген в нейтрофилах. Важно отметить, что в группе долгожителей, в которой индуцированная продукция АФК не изменяется по сравнению с группой молодых доноров, никаких достоверных взаимосвязей между АФКЛЗХ инд и параметрами HSP70 найдены не были, как и в группе молодых доноров.

Единственная взаимосвязь параметра ДHSP70ТШ с продукцией АФК была выявлена в группе долгожителей. Уровень ДHSP70ТШ отрицательно коррелировал со спонтанной продукцией АФК (как АФКDCF спонт, так и АФКЛЗХ спонт). Это может свидетельствовать в пользу того, что накопление HSP70, «готового» взаимодействовать с новым субстратом в нейтрофилах, функционально связано с низкой спонтанной продукцией АФК (как внутриклеточной, так и внеклеточной) и может являться определенным критерием долголетия. Отсутствие взаимосвязи ДHSP70ТШ с параметрами АФК в более раннем возрасте можно объяснить тем, что большинство доноров в этих группах, по-видимому, не попадут в группу долгожителей.

Таким образом, на основе корреляционного анализа, выявлена взаимосвязь между определенными параметрами внутриклеточных HSP70 и продукции АФК в нейтрофилах, которая носит возраст-зависимый характер.

4. Обсуждение

Внутриклеточные белки HSP70 относятся к защитной системе за счет шаперонной активности. Количество HSP70 в клетке отражает эффективность репарации, и, в идеальном случае, должно возрастать по мере накопления поврежденных белков. С другой стороны, ассоциированное с возрастом накопление поврежденных, неправильно упакованных и агрегированных белков, в том числе из-за окислительной модификации биологических молекул в результате избыточной продукции и повреждающего действия АФК, может происходить на фоне снижения эффективности репарационной системы.

В данной работе в интактных нейтрофилах при анализе внутриклеточного содержания HSP70 (HSP70базальный) не было выявлено никакой существенной разницы между тремя возрастными группами доноров, хотя ранее в мононуклеарных клетках было зарегистрировано увеличение внутриклеточного содержания HSP70 с возрастом [Njemini et al., 2007].

Известно, что помимо окислительного стресса, в очаге воспаления, куда мигрируют нейтрофилы, эти клетки подвергаются воздействию гипертермии. Необходимо учитывать, что ТШ вызывает два типа эффектов на клетки. Прямые эффекты выражены в изменениях конформации и активности белков, белок-белковых взаимодействий в результате различных химических модификаций. Вторичные эффекты опосредованы активацией определенных сигнальных путей и индукцией экспрессии HSP для последующей защиты клеток. С целью вызвать изменения в экспрессии HSP70 мы подвергали нейтрофилы воздействию ТШ. Было зарегистрировано увеличение транскрипционной активности генов белков HSP70 при воздействии ТШ в режиме 43°C, 10 мин. Интересно, что уровень мРНК не только для индуцируемого (Hsp70), но и для конститутивного (Hsc70) белков HSP70, хотя и в разной степени, увеличивался после ТШ. О способности нейтрофилов быстро изменять экспрессию генов белков как Hsp70, так и Hsc70 в ответ на воспалительные стимулы было известно из ранее опубликованных данных [Zhang et al., 2004]. В то же время, в нейтрофилах не удалось выявить значительной индукции синтеза белков HSP70 в ответ на нагревание клеток. Вполне возможно, что для такой короткоживущей клеточной популяции как нейтрофилы не характерно значительное накопление белков HSP70. Известно, что пост-транскрипционная активность экспрессии Hsp70 в ответ на ТШ регулируется стабильностью мРНК [Theodorakis and Morimoto, 1987]. Незначительные увеличение уровня Hsp70 может быть связано с трансляционной активностью предсуществующих в нейтрофилах мРНК, без увеличения транскрипции генов, что ранее было показано на нейтрофилах в отношении синтеза цитокинов [Lindemann et al., 2004]. Также ранее был описан феномен, когда ТШ, несмотря на активацию HSF1, являющегося обязательным фактором для транскрипции генов белка Hsp70, не инициировал экспрессию этого белка [Mathur et al., 1994].

В используемой модели клеточного стресса в виде ТШ с помощью метода проточной цитометрии удалось выявить двухфазную динамику, характеризующуюся увеличением уровня HSP70 непосредственно после ТШ и последующим снижением этого уровня в течение 15-30 мин после завершения термического воздействия.

Оказалось, что разница между первоначальным и зарегистрированным сразу после окончания ТШ уровнями внутриклеточных HSP70 (ДHSP70ТШ), зависела от температуры ТШ, а завершение фазы увеличения было связано с окончанием тепловой обработки. Помимо этого, использование двух способов пермеабилизации нейтрофилов позволило обнаружить отличие в двухфазной динамике внутриклеточного уровня HSP70. Известно, что способ пермеабилизации клеток является одним из наиболее важных шагов для обеспечения чувствительности обнаружения антителами внутриклеточных антигенов, растворимых или локализованных в разных органеллах. Наиболее часто при внутриклеточном окрашивании используют такие детергенты, как сапонин и тритон Х-100. Сапонин является мягким детергентом, взаимодействует с мембраносвязанным холестерином, селективно удаляя его и оставляя отверстия в мембране, и наиболее подходит для цитоплазматических антигенов или антигенов, локализованных на внутренней поверхности плазматической мембраны [Willingham, 1983]. В то же время, тритон Х-100, помимо плазматической мембраны, частично нарушает ядерную и митохондриальную мембраны, и поэтому позволяет детектировать более полно репертуар белков (в данном случае HSP70) с более разнообразной локализацией [Goldenthal et al., 1985].

В работе было показано, что вклад в двухфазную динамику HSP70 вносили как конститутивный, так и индуцируемый белки HSP70. Тот факт, что в нейтрофилах даже в отсутствие клеточного стресса обнаруживается индуцируемый белок Hsp70, был ранее продемонстрирован другими исследователями [Giraldo et al., 2010]. Присутствие Hsp70 в интактных нейтрофилах может быть связано с высокой реактивностью этих клеток.

С помощью панелей гибридом, продуцирующих антитела, распознающие либо N-концевую часть, либо C-концевую часть молекулы HSP70, было показано, что в ответ на ТШ антитела позволяют проследить различную динамику внутриклеточных уровней HSP70. Вероятно, увеличение внутриклеточного уровня HSP70 сразу после окончания термического воздействия, зарегистрированного с помощью антител к С- концевому участку, связано с конформационными изменениями в молекуле HSP70, приводящими к увеличению доступности определенных эпитопов субстрат-связывающего домена и усилению эффективности связывания с антителами. Это предположение подтверждает и тот факт, что параметр ДHSP70ТШ не был обусловлен синтезом белка de novo.

Подробная информация о конформационных изменениях в молекуле HSP70, при взаимодействии с белками, недавно была опубликована [Zhuravleva et al., 2012]. Можно предположить, что величина параметра ДHSP70ТШ связана с распадом собственных агрегатов этого белка либо отражает количество HSP70, которое высвобождается из комплексов с другими белками, и соответствует уровню шаперона, готовому для взаимодействия с новым субстратом. Белки HSP70 практически не встречаются в свободном от субстрата состоянии in vivo и находятся во взаимодействии с белками, нуклеотидами, мембранами, а также образуют аутоагрегаты (димеры, триммеры, олигомеры). Аутоагрегаты не обладают шаперонной активностью, при переходе белков в неагрегированное состояние активность восстанавливается. Соотношение в клетке олигомеров- мономеров HSP70 зависит от температуры и определяется присутствием денатурированных белков [Angelidis et al., 1999].

Важно отметить, что в представленном анализе ДHSP70ТШ был единственным параметром HSP70, который изменяется с возрастом. Было обнаружено достоверное увеличение значений медианы ДHSP70ТШ как в группе пожилых доноров, так и в группе долгожителей в сравнении с контрольной группой молодых добровольцев. Учитывая, что процесс старения сопровождается накоплением агрегированных и неправильно свернутых белков [Cuanalo-Contreras et al., 2013], возможно, уровень ДHSP70ТШ косвенно определяет количество поврежденных белков, которые провзаимодействовали с HSP70 в нейтрофилах, в то время как ТШ провоцирует смену поврежденных белков.

Высвобождение внутриклеточных HSP70 в окружающую среду является иммунологически значимым событием: экспонированные на поверхности плазматической мембраны и циркулирующие в организме белки HSP70 рассматриваются как «сигнал опасности» для иммунокомпетентных клеток. Источником внеклеточных HSP70 могут служить сами клетки иммунной системы. Методом проточной цитометрии на поверхности нейтрофилов удалось зарегистрировать экспрессию HSP70 только при использовании поликлональных антител к этим белкам. Ранее уже было показано, что не все антитела к Hsp70 обладают способностью взаимодействовать с белком, связанным с плазматической мембраной [Multhoff and Hightower, 2011].

В данной работе удалось показать, что в нейтрофилах происходит высвобождение не только индуцируемого, но и конститутивного белков HSP70. Феномен стресс-индуцируемого экзоцитоза в нейтрофилах был описан только для Hsp70 [Giraldo et al., 2010].

Локализация внутриклеточных HSP70 весьма разнообразна: они обнаружены в цитоплазме, ядре и некоторых других клеточных компартментах, где они выполняют различные функции [Daugaard et al., 2007]. Локализованные в лизосомах HSP70 играют важную роль в стабилизации их мембраны [Agarraberes and Dice, 2001]. В нейтрофилах, методом протеомного анализа HSP70 были найдены в специфических и желатиназных гранулах [Lominadze et al., 2005]. Поэтому можно было допустить, что высвобождение HSP70 в нейтрофилах сопряжено с процессом дегрануляции. Оказалось, что ТШ (43°C, 10 мин) не индуцирует увеличение экспрессии на поверхности плазматической мембраны нейтрофилов маркеров азурофильных, специфических гранул. В представленной работе в нейтрофилах ТШ инициировал появление на поверхности нейтрофилов маркера лизосом LAMP1. Это позволило предположить, что HSP70 могут высвобождаться в составе лизосом. Так как доля LAMP1-позитивных нейтрофилов после ТШ составляла не более 10%, а также учитывая скудное содержание этих белков в нейтрофилах, например, по сравнению с моноцитами, нейтрофилы нельзя рассматривать в качестве иммунологически значимого продуцента внеклеточных HSP70. Стресс-индуцированное высвобождение Hsp70 в составе лизосом ранее было продемонстрировано на опухолевых клетках [Mambula and Calderwood, 2006].

Нейтрофилы являются основными продуцентами АФК, которые регулируют протекание разнообразных клеточных сигнальных каскадов и экспрессию генов, а также окислительно модифицируют молекулы, число которых накапливается с возрастом [Squier,. 2001]. Поэтому в рамках работы была охарактеризована способность нейтрофилов в разных возрастных группах продуцировать АФК.

Данное исследование показало, что продукция АФК в нейтрофилах зависит от возраста. Нейтрофилы у пожилых доноров обладали менее эффективным ответом на стимул в виде продукции АФК (АФКЛЗХ инд) по сравнению с группой молодых, тогда как спонтанная продукция АФК (АФКЛЗХ спонт) в этой группе увеличивалась. В целом, это совпадает с опубликованными данными о возрастной зависимости продукции нейтрофилами АФК [Fortin et al., 2008; Ogawa et al., 2000]. Ранее уже было описано, что для пожилых характерно изменение кинетики индуцированной продукции АФК и снижение ответа на стимул [Fulop et al., 2004; Klut et al., 2002]. Внеклеточная продукция АФК, которая увеличивается с возрастом, может вносить вклад в состояние слабого воспаления, или статус «Inflamm - aging», которое почти всегда сопровождает процесс старения [Peters et al., 2009]. С другой стороны, высокий уровень АФКЛЗХ спонт у долгожителей не соотносится с предположением, что увеличение продукции АФК является причиной уменьшения продолжительности жизни.

Выявление особенностей клеточных параметров у долгожителей может быть полезным в контексте изучения модели «успешного старения» [Cevenini et al., 2008]. Нейтрофилы старых людей (старше 80 лет) по некоторым характеристикам (хемотаксис, фагоцитоз, экспрессия молекул адгезии, развитие апоптоза, параметры антиоксидантной системы и др) меньше отличаются от нейтрофилов молодых людей, по сравнению с нейтрофилами пожилых (60-70 лет) [Niwa et al., 1989; Moroni et al., 2005; Alonso-Fernбndez et al., 2008].

В нашем исследовании значения некоторых из параметров продукции АФК, зарегистрированных в группы долгожителей (90 лет и больше), были сходны со значениями аналогичных параметров в группе молодых доноров. В частности, медиана значений индуцированной продукции АФК (АФКЛЗХ инд) в группе долгожителей достоверно не отличалась от значений в группе молодых добровольцев, тогда как в группе пожилых доноров медиана была ниже. Это указывает на то, что функции антимикробной иммунной защиты лучше выражены у долгожителей по сравнению с пожилыми донорами.

Также уровень спонтанной внутриклеточной продукции АФК (АФКDCFспонт) в нейтрофилах долгожителей существенно не отличался от значений, зарегистрированных в группе молодых доноров, тогда как в группе пожилых этот уровень повышался. Это может означать, что регуляция внутриклеточных антиоксидантных механизмов происходит лучше в нейтрофилах долгожителей, чем в нейтрофилах пожилых доноров. Следовательно, высокая продукция АФК в нейтрофилах пожилых свидетельствует о высоком риске воздействия окислительного стресса на клетки.

Учитывая, что уровень АФКЛЗХ спонт с возрастом возрастал, можно утверждать, что увеличение внеклеточной продукции АФК (АФКЛЗХ спонт) не подразумевает обязательного увеличения внутриклеточных АФК (АФКDCFспонт). Подтверждает это отсутствие взаимосвязи между спонтанным уровнем продукции АФК, зарегистрированной с помощью методов проточной цитометрии и ЛЗХ (АФКDCF спонт и АФКЛЗХ спонт, соответственно). По-видимому, внеклеточная продукция АФКЛЗХ спонт опосредована преимущественно работой NADPH-оксидазы, локализованной на внешней плазматической мембране, а продукция внутриклеточных АФК (АФК DCF спонт) связана с другими источниками. Соответственно, различные источники продукции АФК могут регулироваться по-разному. В то же время, разные методы измерения АФК могут определять разные формы АФК. Например, флуоресценция зонда DCF-DA считается пропорциональной концентрации перекиси водорода в клетках [Bass et al., 1983], тогда как другие типы АФК, в том числе супероксидный анион, могут быть измерены неспецифически ЛЗХ [Vladimirov and Proskurnina, 2009].

Один из основных вопросов, поставленных в этой работе, - есть ли связь между продукцией АФК и уровнем внутриклеточных HSP70 нейтрофилах.

Для того, чтобы ответить на этот вопрос, был проведен корреляционный анализ между параметрами HSP70 и АФК. Ряд корреляций (как положительных, так и отрицательных) выявил существование взаимосвязей между этими параметрами. Ранее уже было показано, что феномен термотолерантности клетки к термическому воздействию, обусловленному накоплением HSP70 в ответ на предварительный более щадящий ТШ, отменяет ингибирование активности ферментов NADPH-оксидазы после гипертермии, тем самым поддерживая постоянный уровень продукции АФК в фагоцитарных клетках [Polla et al., 1995]. Также известно, что спонтанная продукция АФК нейтрофилами отрицательно связана с концентрацией циркулирующих в плазме HSP70 [Ogawa et al., 2008].

...