Клинико-иммунологические особенности у больных артериальной гипертонией, осложненной ишемическим инсультом

Больным АГ с ишемическим инсультом при поступлении проводили неврологический осмотр с оценкой выраженности общемозговых, оболочечных и очаговых симптомов, включали дополнительные методы обследования компьютерную или магнитно-резонансную томографию (100%).

Таблица 6 Частота основных факторов риска у больных артериальной гипертонией осложненной ишемическим инсультом (абс., %)

Формулировка диагноза, определение типа и локализации инсульта осуществлялись в соответствии с требованиями Международной классификации болезней Х пересмотра. Размеры и локализация очага инсульта определялись на основании критериев Oxfordshire Community Stroke Project - OCSP (Bamford J. et al., 1995), патогенетические подтипы ишемического инсульта - на основании критериев TOAST (Adams H. et al., 1999). В оценке выраженности проводниковых двигательных расстройств использовались критерии Л.Г. Столяровой и соавт. (1992) с помощью 5-бальной системы. При этом отсутствие нарушений двигательных функций оценивалось - 5 баллами, наиболее грубые нарушения - плегии - 0 баллов.

Ишемический инсульт был верифицирован в системе внутренней сонной артерии у 84 (82,35%) больных, в вертебро-базилярной - у 18 (17,65%). Диагноз острого ишемического инсульта в левой средней мозговой артерии был установлен у 61 (59,8%) пациента, у 23 (22,5%) - в правой средней мозговой артерии. Из полученных результатов видно, что наиболее часто острое нарушение мозгового кровообращения в виде ишемического инсульта отмечалось в бассейне левой средней мозговой артерии. Больные с легко выраженным инфарктом мозга в исследование не включались.

В течение первых 3-6 часов развивающегося инсульта в неврологическое отделение поступило - 50% больных, в течение 7 - 12 часов - 50%. Сроки поступления больных в зависимости от тяжести инсульта представлены в таблице 7. Как видно из представленных данных, в первые 3-6 часов чаще поступали больные с ишемическим инсультом тяжелой степени (47,1%), менее часто - с ишемическим инсультом средней степени (2,9%).

Таблица 7 Сроки поступления пациентов ишемическим инсультом в зависимости от степени тяжести

Проведенный анализ развития инсульта в зависимости от фазы сон - бодрствование, показал, что у 18,6% больных ишемическим инсультом он развился во время сна, у 48,4% - во время пробуждения и через некоторое время после сна, у 33% пациентов - в дневное время.

Для формализованной оценки неврологического дефицита, которая проводилась с целью дальнейшей статистической обработки клинических данных, использовалась общепринятая шкала инсульта Национального института здоровья США (NIHSS) [Brott, 1989]. Оценка неврологического статуса по шкале NIHSS проводилась при поступлении пациента и в динамике при его выписке из стационара. Инсульту средней тяжести (умеренному) соответствовала оценка от 8 баллов до 16 баллов включительно и тяжелому инсульту - свыше 16 баллов.

У обследованных пациентов средняя выраженность неврологического дефицита при поступлении составляла 17,4 баллов по NIHSS (8,3 - 21,2 баллов). Умеренно выраженный инсульт (8-16 баллов по NIHSS) наблюдался у 18 (17,6%) человек, тяжелый (>16 баллов по NIHSS) - у 84 (82,4%) человек.

Кроме того, у больных одновременно оценивали индекс повседневной активности Бартел [Dorothea Barthel,1995] и индекс мобильности Ривермид [S.Whiting, N. Lincoln, 1980; D. Wade, 1992]. Расчет индекса Бартел производился суммированием баллов, общая сумма баллов, равная 0, указывала на полную утрату способности к самообслуживанию. Максимальное количество баллов, при котором человек не нуждался в посторонней помощи было равно 100. Суммарный балл 45 и меньше соответствовал тяжелой инвалидизации. Частичному регрессу неврологических функций до умеренной инвалидизации соответствовало количество 50 - 70 баллов. Суммарный балл от 75 до 100 определял максимальный или полный уровень восстановления нарушенных функций.

У обследованных пациентов средняя сумма баллов повседневной активности Бартел составила 42,5 (от 10,0 до 65,0), что указывает на выраженное снижение способности к самообслуживанию. Причем среди женщин степень утраты способности к самообслуживанию была несколько ниже, чем у мужчин, 44,6 баллов и 39,1 соответственно. Отмечалась закономерная зависимость между тяжестью инсульта и степенью потери повседневной активности, рассчитанная по индексу Бартел. Индекс повседневной активности Бартел при умеренно выраженном инсульте (8-16 баллов по NIHSS) составил 62,8 балла, при тяжелом (>16 баллов по NIHSS) - 38,2 балла.

У больных значение индекса мобильности Ривермид составляло от 0 (невозможность самостоятельного выполнения каких-либо произвольных движений) до 15 (возможность пробежать 10 метров) баллов. Значение индекса соответствовало баллу, присвоенному вопросом, на который врач давал положительный ответ в отношении пациента. Индекс мобильности Ривермид у исследуемых пациентов в среднем составлял 4 балла (от 0 до 8 баллов), при умеренно выраженном инсульте (8-16 баллов по NIHSS) - 6,2 балла, при тяжелом (>16 баллов по NIHSS) - 3,5 балла.

Как видно из представленных результатов в таблице 8, у больных преобладал тромботический вариант (41,2%) ишемического инсульта. У этих пациентов клинические проявления развились остро, с нарастанием очаговых симптомов в течение первых часов. У 31 (30,4%) больного был установлен лакунарный инфаркт мозга и он проявлялся в виде чисто двигательных, сенсорных и речевых расстройств.

Таблица 8 Частота клинических вариантов ишемического инсульта у больных артериальной гипертонией (абс., %)

Эмболический вариант ишемического инсульта выявлен в 15,7% (16) случаев. У этих больных клинические симптомы развились остро с максимально выраженными очаговыми проявлениями и изменениями сознания. Реже встречался гемодинамический (8,82%) и гемореологический (3,9%) вариант ишемического инсульта. При этом у больных отмечалось постепенное нарастание симптомов, и в анамнезе у них был выявлена ИБС.

Как видно из представленных в таблице 9 результатов, степень тяжести заболевания зависела от характера патогенетического варианта ишемического инсульта. Больных тяжелым инсультом было в 4,7 раза больше, чем средней степени. Отмечено, что у больных ишемическим инсультом умеренной тяжести преобладали тромботический (55,6%) и эмболический (33,3%) клинический вариант инфаркта мозга, менее часто выявляли гемодинамический (11,1%), и не отмечались лакунарный и гемореологический.

Таблица 9 Распределение клинического варианта ишемического инсульта по степени тяжести у больных артериальной гипертонией (абс., %)

При тяжелой степени инсульта чаще выявляли тромботический (40,5%) и лакунарный (36,9%) вариант инсульта и существенно реже эмболический (10%), гемодинамический (8,3%) и крайне редко был диагностирован гемореологический (4,8%). Ишемический инсульт умеренной тяжести наблюдался у 18 больных (17,6%) и тяжелой степени у 84 (82,4%).

Кроме того, обнаружена прямая зависимость исхода ишемического инсульта от возраста пациентов. Установлено, что чем старше пациент, тем тяжелее инсульт и более неблагоприятный исход.

В результате КТ и МРТ исследования головного мозга у больных выявлены очаги ишемического инсульта, при этом преобладали лакунарный, малый и средний. Представленные в таблице 10 данные характеризуют величину очага ишемического инсульта и его обнаружение при поступлении в стационар и через 7 и 21 день от начала заболевания.

Таблица 10 Размер инфаркта мозга (см³) и частота его выявления у больных ишемическим инсультом при артериальной гипертонии (абс., %)

При нейровизуальной оценке размеры очага ишемического повреждения головного мозга различались в зависимости от патогенетического варианта инсульта. Результаты представлены в таблице 11. Как видно, у больных при тромботическом варианте ишемического инсульта чаще наблюдались малые 25 (59,5%) и средние размеры 17 (40,5%) инфаркта мозга. При кардиоэмболическом варианте присутствовали различные размеры очагов инфаркта мозга, чаще средние и большие. Лакунарный вариант имел лишь лакунарные (малые) размеры инсульта.

Таблица 11 Зависимость размера инфаркта мозга (см³) от патогенетического варианта ишемического инсульта в первые сутки заболевания у больных артериальной гипертонией (абс., %)

Таблица 12 Частота геморрагической трансформации и сроки ее появления в зависимости от патогенетического варианта ишемического инсульта (абс. %)

Гематомный тип одинаково часто встречался при атеротромботическом и кардиоэмболическом ишемическом инсульте, петехиальные кровоизлияния отмечались лишь при кардиоэмболическом. После семи суток гематомный тип выявлялся лишь при кардиоэмболическом ишемическом инсульте, петехиальный - одинаково часто при тромботическом и кардиоэмболическом. В первые семь суток заболевания геморрагическая трансформация наиболее часто диагностировалась при кардиоэмболическом инфаркте мозга (7; 43,8% от числа обследованных). При этом нейровизуализационный мониторинг выявил нарастающую геморрагическую трансформацию и увеличение размеров кровоизлияния в динамике.

После обследования всем больным ишемическим инсультом назначена показанная лекарственная терапия. Они получали показанную терапию, направленную на коррекцию центральной и церебральной гемодинамики, против отека мозга, а также гипотензивную терапию (ингибиторы АПФ, диуретики, бета-блокаторы, антагонисты к рецепторам ангиотензина II). Дозы лекарственных препаратов подбирали индивидуально.

Таким образом, у больных АГ с ишемическим инсультом диагностирована АГ III стадии. Выявлено, что среди пациентов преобладают женщины. Основными клиническими вариантами ишемического инсульта являются атеротромботический, лакунарный и эмболический. При этом ишемический инсульт тяжелой степени (84; 82,4%) отмечается в 4,7 раза чаще, чем умеренный (18; 17,6%) и в 2,2 раза чаще у женщин, чем у мужчин.

Для подсчета форменных элементов крови использовали автоматический гематологический анализатор «Cobas Micros-18 OT» (Hoffmann- La Roche, ABX). С помощью счетчика «Cobas Micros-18 ОТ» подсчитывали общее число лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, концентрацию гемоглобина и другие стандартные показатели. Лейкоцитарную формулу подсчитывали на 100 лейкоцитов с использованием метода световой микроскопии.

2.3.2 Феномен ауторозеткообразования в периферической крови

Подсчет эндогенных ауторозеток в крови проводили с помощью световой микроскопии (микроскоп «БИОЛАМ», ув. 90х7). У всех обследованных феномен внутрисосудистого розеткообразования изучался по методике, разработанной Д.И. Бельченко (1990). У здоровых лиц проводили забор капиллярной крови однократно, тогда как у больных, как правило, двукратно: при первом контакте и после проведенного лечения, а также при развитии осложнений.

Капиллярная кровь бралась утром натощак из 4-го пальца левой кисти с использованием игл - скарификаторов. Принимая во внимание возможное взаимодействие клеток на стекле при приготовлении мазка крови, у всех обследованных проводили забор периферической крови в одинаковых строго стандартных условиях при комнатной температуре (18-23єС). Самотеком из безымянного пальца кровь забирали в капилляр, каплю крови наносили на стекло из капилляра сразу, недалеко от его края. Мазок производили шлифованным стеклом быстро под углом в 45є впереди капли крови, не отрывая от стекла, чтобы получился ровный тонкий след, заканчивающийся в виде «усов» на стекле, затем высушивали мазок при комнатной температуре. Мазок не достигал краев стекла и заканчивался в виде следов. Фиксация мазков крови проводилась в смеси Никифорова, состоящей из равных частей абсолютного этилового 96єспирта и эфира в течение 30 мин. Окраска мазков проводилась по Романовскому - Гимзе. Рабочий раствор краски готовили из расчета 1/2 - 2 капли готовой краски на 1 мл дистиллированной воды. Краску наливали на мазок высоким слоем, длительность окраски составляла 30 - 35 мин. По истечении этого времени мазки хорошо промывали и высушивали на воздухе.

Подсчет ауторозеток производили в окрашенных мазках (на 200 лейкоцитов), в самом тонком месте, ближе к концу мазка. Проводили подсчет в одном порядке, не заходя на самый край по зигзагу, под прямым углом параллельно краю стекла. Половину клеток считали в верхней, половину - в нижней части мазка. За ауторозетку принимали клеточную ассоциацию, образованную нейтрофилом (микрофото 1) или моноцитом (микрофото 2) с плотно прилегающими к их поверхности тремя и более эритроцитами.

Подсчет ауторозеток проводили в абсолютном количестве (10⁹/ л) и в процентах на 100 лейкоцитов, по методике, разработанной Д.И. Бельченко (1991). Количество розеткообразующих клеток подсчитывали от общего числа лейкоцитов, число розеткообразующих нейтрофилов и моноцитов от их общего числа (10⁹/ л и в процентах).

Микрофотографирование мазков крови проводили посредством цифрового компьютерного микрофотографирования через лабораторный микроскоп «БИОЛАМ С-11» с цифровой насадкой (ув. х100).

2.3.3 Антитела к дезоксирибонуклеиновой кислоте в сыворотке крови

При ишемическом инсульте в результате массивного разрушения высоко-детерминированной мозговой ткани и функциональной несостоятельности структур гематоэнцефалического барьера, в сыворотке крови появляются свободные внеклеточные олигонуклеосомальные фрагменты ДНК. Фрагменты ДНК является иммунногенным и в ответ на их появление в крови больных ишемическим инсультом появляются антитела. Выяснение роли антител как в развитии так и во вторичном поражении головного мозга при ишемическом инсульте у больных АГ представляет научный интерес.

Определение антител к ДНК осуществлялось методом непрямого ИФА. Проводили сенсибилизацию полистириловых планшетов антигеном - коммерческим высокополимерным препаратом ДНК из эритроцитов цыплят фирмы Reanal (Венгрия) в фосфатном буфере. Затем испытуемые сыворотки вносили в лунки планшета и последовательно инкубировали с антигеном, растворами конъюгатов моноклональных антител к IgM и IgG, субстратом (ортофенилендиамин с перекисью водорода) с последующим промыванием лунок планшетов фосфатным буфером между фазами реакции. Затем вновь инкубировали и останавливали реакцию с помощью внесения в лунки планшета по 0,05 мл «стоп-реагента»-2М раствора серной кислоты. Приготовление рабочего разведения антигена и испытуемых сывороток проводилось в соответствии с результатами разработок А.В. Резайкиной [1988], дальнейший ход исследования осуществляли в объеме 100 мкл согласно инструкции ИФА-тест-системы "Lues Screen". Показатель оптической плотности определяли с помощью регистрирующего устройства АКИ-Ц-01 при длине волны 492 нм. Реактивность оценивали в сравнении со средними отрицательными значениями - контрольных сывороток (доноров). Значение оптической плотности пробы, превышающее М±1б отрицательной сыворотки, расценивали как положительный результат.

2.3.4 Антитела к основному белку миелина сыворотке крови

В результате разрушения мозговой ткани происходит разрушение миелина - белково-липидной мембраны клеток центральной нервной системы, 1/3 которого составляет основной белок. Основной белок миелина является иммунногенным и в ответ на их появление в крови больных ишемическим инсультом появляются антитела. Выяснение роли антител к основному белку миелина при ишемическом инсульте представляет научный интерес.

Антитела к основному белку миелина определяли методом ИФА с применением набора реагентов, разработанного фирмой «Навина» (г. Москва, кардиологический центр; Н.Е. Ястребова и Н.П. Ванеева).

Регистрация полученных данных проводилась на спектрофотометре «Multiskan» при длине волны 492 нм. ИФА осуществляли с помощью автоматических микропипеток. Набор тест-системы включал в себя иммуносорбент - планшеты полистироловые, в лунках которых был сорбирован препарат к основному белку миелина, положительный контроль - препарат из сыворотки крови человека, содержащий антитела к основному белку миелина выше диагностического уровня, и отрицательный контроль - сыворотки, содержащий антитела к основному белку миелина ниже диагностического уровня, а также конъюгат - антитела диагностические против Ig G человека, меченные пероксидазой, раствором ОФД, ФСБ -Д, ЦФБ, ЦФБ-П, стоп-реагент-2М раствор серной кислоты.

Для проведения исследования осуществляли отмывку иммуносорбента раствором (ФСБ-Д) в объеме не менее 0,2 мл, выдерживали планшет при комнатной температуре в течение 2-6 минут. Содержимое лунок удаляли встряхиванием. Отмывку повторяли еще два раза. Затем вносили образец сыворотки и инкубировали при t=36,5-37,5є С в течении 60 минут, с последующей отмывкой избытка антител и вносили конъюгат - 0,1 мл диагностических антител против иммуноглобулинов G человека, меченные пероксидазой. После чего инкубировали в течение 60 мин, отмывали от избытка конъюгата, вносили субстратно-индикаторную смесь. Затем вновь инкубировали и останавливали реакцию с помощью внесения в лунки планшета по 0,05 мл «стоп-реагента»-2М раствора серной кислоты. Для каждой испытуемой сыворотки вычисляли среднее значение оптической плотности. Средняя величина оптической плотности в контроле конъюгата должна была быть не выше 0,15. От этого значения вычитали среднее значение оптической плотности К -, и, чем выше было ее значение, тем активнее проходил патологический процесс.

2.3.5 Фактор некроза опухоли-альфа в сыворотке крови

Доказано, что в формировании ишемического инсульта большое значение принадлежит локальному воспалению в мозговой ткани и повреждению эндотелия сосудов головного мозга. В связи с этим представлялось важным изучить содержание ФНО-а (Tumor necrosis factor - TNF, ФНО-а) в сыворотке крови у больных АГ с ишемическим инсультом. Ранее установлено, что ФНО-а является провоспалительным цитокином и продуцируется макрофагами и лимфоцитами. В связи с этим ФНО-а были изучены в сыворотке крови у 37 больных ишемическим инсультом при АГ.

Содержание ФНО-а определяли с помощью набора реагентов, предназначенного для количественного анализа в исследуемых образцах методом ИФА (фирма «Цитокин» г. С.-Петербург). В состав набора входил комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов с рамкой, имеющей на внутренней поверхности лунок иммобилизированные моноклональные антитела к ФНО-а, 7 калибровочных проб аналитического буферного раствора, концентрированного раствора конъюгата стрептавин-пероксидазы, концентрированного буферного раствора для промывания лунок, субстратного буфера, 10% раствора кислоты («стоп-реагент») и гидроперита. Использовали два моноклональных антитела с различной эпитомной специфичностью к ФНО-а. Одно из них было иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе коньюгировано с биотином. На первой стадии анализа ФНО-а, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывался с антителами иммобилизированными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизированный ФНО-а взаимодействовал со вторыми антителами, меченными биотином. Количество связывающегося коньюгата было прямо пропорционально количеству ФНО-а в исследуемом образце. На последней стадии в лунки вносился коньюгат стрептавидин-пероксидазы. Во время инкубации в субстратной смеси происходило окрашивание раствора в лунках. Степень окраски была прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывали концентрацию ФНО-а в определенных образцах.

Для анализа брали 0,1 мл сыворотки крови, вносили ее в соответствующие лунки, после инкубации и декантировании во все лунки вводили 0,1 мл раствора антител, затем вносили 0,1 мл раствора коньюгата также во все лунки, тщательно перемешивали и хранили в темном месте. Добавляли 0,1 мл раствора гидроперита, вводили 0,1 мл субстрата смеси и инкубировали в темном месте в течение 15-20 мин в зависимости от степени развития окраски. Измеряли оптическую плотность в лунках при длине волны 492 нм с использованием планшетного фотометра.

Представлялось важным изучить количество антифосфолипидов (антитела к кардиолипину) в сыворотке крови у больных АГ с ишемическим инсультом. Ранее установлено, что антифосфолипиды являются маркерами эндотелиального повреждения сосудов и их действие направлено против компонентов клеточных мембран. В связи с этим антитела к фосфолипидам были изучены в сыворотке крови у 37 больных ишемическим инсультом при АГ.

Содержание антифосфолипидов изучалось по уровню антител к кардиолипину с помощью ИФА в сыворотке крови. Антитела к кардиолипину определяли с помощью тест-системы (фирма «Кардиоцентр» г. Москва). В составе набора находился планшет с иммобилизационным кардиолипином, положительная контрольная сыворотка, содержащая антитела к кардиолипину, раствор для промывания планшетов, отрицательная контрольная сыворотка, не содержащая антител к кардиолипину, раствор для разведения сывороток и конъюгата, цитратно-фосфатный буфер, пероксидазный коньюгат, субстрат для окрашивания, гидроперит. Сыворотка для определения антител к кардиолипину использовалась в разведении 1:100. При проведении ИФА производили промывку планшета, а затем вносили сыворотку, инкубировали, вновь промывали, вносили конъюгат, инкубировали и вносили субстрат для окрашивания. Остановку реакции производили добавлением в каждую лунку 50 мкл 5% раствором серной кислоты. Концентрацию антител к кардиолипину определяли в единицах оптической плотности.

2.3.7 Инструментальные методы исследования

Электрокардиографию проводили (100%) на аппарате «Schiller» cardiovit AT-5, 2002. У всех больных АГ определяли ЭКГ-критерии гипертофии левого желудочка (индекс Sokolow-Lyon ), исключали острый коронарный синдром и выявляли нарушение сердечного ритма и проводимости.