Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vitro и in vivo

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Министерство здравоохранения Российской Федерации

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Нижегородская государственная медицинская академия»

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vitro и in vivo

Сахарнова Татьяна Александровна

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

профессор,

доктор биологических наук И.В.Мухина

Нижний Новгород 2014

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мозг гипоксия ишемический нейротрофический

ВДА - вертикальная двигательная активность

ГДА - горизонтальная двигательная активность

Кз - коэффициент защиты

КК - каиновая кислота

ОГБГ - острая гипобарическая гипоксия

ПЭИ - полиэтиленимин

Тж - время жизни на «смертельной площадке»

Тпп - время потери позы

Твп - время восстановления позы

ЦНС - центральная нервная система

ЭКС - эндоканнабиноидная система

Akt (protein kinase B -РКВ) - протеинкиназа В

AMPA (б-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) - б-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота

AMPAR (б-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor) - рецептор б-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты

Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) - «ген выживаемости» проапоптотический ген

Bcl-XL (B-cell lymphoma-extra large) - «ген выживаемости»

BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор головного мозга

CaMK2 (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase 2) - кальций/кальмодулин зависимая протеинкиназа 2

СВ1 (cannabinoid receptor 1) - эндоканнабиноидный рецептор 1 типа

с-fos - ген раннего ответа

с-jun - ген раннего ответа

CREB (cAMP response element-binding protein) - цАМФ-зависимый транскрипционный фактор

DAG (Diacylglycerol) - диацилглицерол

DIV (Day in vitro) - день развития in vitro

ERK (Signal-regulated kinase) - сигнал-регулирующая киназа

FTF (Forkhead transcription factors) - транскрипционные факторы, влияющие на экспрессию «генов смерти»

GABA (г-aminobutyric acid) - г-аминомасляная кислота

GABARa (г-aminobutyric acid type A receptor) -рецептор гамма-аминомаслянной кислоты a типа

ICER (Inducible cAMP early repressor) - индуцибельный ранний репрессор цАМФ

IP3 (Inositol 1,4,5-trisphosphate ) - инозитолтрифосфат

LNGFR (low-affinity nerve growth factor receptor) или p75 - низкоафинный рецептор к NGF

LTP (Long-term potentiation) - долговременная потенциация

LTD (Long-term depression) - долговременная депрессия

MAPK (Mitogen-activated protein kinase) - митоген-активированная протеинкиназа

MАР2K (Mitogen-activated protein kinase-kinase) - митоген-активированная протеинкиназа киназа

MEA (Multielectrode array) - мультиэлектродная система регистрации внеклеточных потенциалов действия

Nav1.9 - Na-специфический ионный канал

NGF (Nerve growth factor) - фактор роста нервов

NMDAR (N-methyl-D-aspartate receptor) - N-метил-D-аспартат-рецептор

NF-kB (Nuclear factor-кB) - транскрипционный ядерный фактор каппа-В

NT-3 (Neurotrophin-3 ) - нейротрофин-3

NT4/5 (Neurotrophin-4/5) - нейротрофин-4/5

p75 или LNGFR (low-affinity nerve growth factor receptor) - низкоафинный рецептор к NGF

PBS (Phosphate buffered saline) - фосфатно-солевой буферный раствор

PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase) - фосфоинозитол-3-киназа

PKC (Protein kinase C) - протеинкиназа С

PLC (Phospholipase C) - фосфолипаза С

proBDNF - пронейротрофин - белок-предшественник зрелой молекулы BDNF

Raf-1 - серин-треонинкиназа

Ras - малый ГТФ-связывающий белок

RCI (Respiratory control index) - респираторный контрольный индекс

SRF (Serum response factor) - сывороточный фактор

TNFб (Tumor necrosis factor) - фактора некроза опухоли б

TNFR (Tumor necrosis factor receptor) - рецептор фактора некроза опухоли

TrkA (Tropomyosin-related kinase A) - тирозинкиназный рецептор А

TrkB (Tropomyosin-related kinase B) - тирозинкиназный рецептор В

TrkB full-length (TrkB-FL) - полноцепочечная последовательность тирозинкиназного рецептора В

TrkB-T1, Т2 (TrkB truncated-1,2) - укороченные формы тирозинкиназного рецептора В

TrkC (Tropomyosin-related kinase C) - тирозинкиназный рецептор С

VGCC (Voltage-gated calcium channels) - потенциал зависимые кальциевые каналы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Изучение механизмов регуляции биологических процессов, как в норме, так и при воздействии стресс факторов (гипоксия, ишемия, токсины и др.) является одной из значимых современных задач как биологии, так и медицины. В связи с чем остается актуальным вопрос о поиске веществ цитопротекторного действия, способных защитить клетки головного мозга от повреждающего действия стрессогенных факторов, в том числе гипоксии. Среди химических веществ, способных контролировать уровень метаболизма клетки в условиях сниженного уровня содержания кислорода, выделяют нейротрофический фактор головного мозга (англ. - Brain-derived neurotrophic factor или BDNF) (Larsen E.C. et al., 2007, Dirnagl U. et al., 2009), относящийся к семейству нейротрофинов. Нейротрофины - одни из важнейших регуляторных белков, обеспечивающих основные процессы жизнедеятельности человека и животных (Гомазков О.А., 2006, 2011), функции которых в основном связаны с работой центральной нервной системы (ЦНС). BDNF обеспечивает рост и развитие головного мозга в эмбриогенезе, а также образование и функционирование нейронных сетей в раннем постнатальном периоде (Martin J.L. et al., 2011). Недавними исследованиями показана возможность модулирования нейротрофическим фактором синаптической передачи в гиппокампе и некоторых отделах коры зрелого головного мозга (Rose C.R. et al., 2004, Edelman et al., 2014). В результате взаимодействия BDNF с тирозинкиназным рецептором В (англ. - TrkB) происходит активация нескольких сигнальных каскадов, обеспечивающих модулирующее действие нейротрофического фактора на синаптическую передачу сигнала в клетке, в частности при обучении (Aptowicz C.O. et al., 2004, Сunha C. et al., 2010, Leal G. et al., 2014).

Как в норме, так и в условиях ишемии/гипоксии действие BDNF опосредованно запуском основных сигнальных метаболических путей: митоген-активированного протеинкиназного пути (англ. - MAPK) и фосфоинозитол-3-киназного пути (англ. - PI-3) (Sun X. et al., 2008, Maddahi A. et al., 2010). Важным компонентом данных сигнальных механизмов является цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (англ. - CREB), который способствует BDNF-опосредованному выживанию нейронов в центральной нервной системе, активируя антиапоптотическую экспрессию генов на ранних стадиях постнатального развития (Choi J.S. et al., 2003, Arthur J.S.C. et al., 2004). Однако экспериментальные данные по объяснению механизмов разностороннего действия BNDF противоречивы (Markham A. et al., 2012) и являются предметом дискуссии в научном мире. Так, например, выявлено, что в раннем онтогенезе BDNF играет важную роль не только в нейропротекции, но и в патогенезе нейродегенеративных заболеваний (Mizoguchi Y. et al., 2009, Grande I. et al., 2010, Jiang Y. et al., 2010, Chen A. et al., 2013).

Кроме того, не менее важным аспектом при изучения антигипоксических свойств цитопротекторов является разработка адекватных и легко воспроизводимых моделей гипоксии и методов оценки протекторного действия. Особый интерес представляет исследование действия гипоксии на сетевом уровне организации нейронов, возможный на современном уровне развития электрофизиологической техники при помощи мультиэлектродной системы регистрации внеклеточных потенциалов действия (англ. - Мultielectrode Аrrays). Длительное культивирование клеток различных структур головного мозга на мультиэлектродных матрицах in vitro дает уникальную возможность не только исследовать при одновременой оптической визуализации изменения морфофункциональных свойств нейронов в хроническом эксперименте, но и моделировать различные патологические состояния ЦНС (Potter S.M., DeMarse T.B., 2001, Madhavan R. et al., 2006, Stegenga J. et. al., 2008, Pan L. et. al., 2009, Pimashkin A.S. et al., 2011).

По мере изучения механизмов действия BDNF на нейросетевом уровне появится возможность разработки новых лекарственных средств и соответствующих способов коррекции ишемических процессов в нервной ткани при нейродеструктивных заболеваниях.

Таким образом, целью исследования явилось изучение нейротропного действия нейротрофического фактора головного мозга на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro, а также исследование антигипоксических свойств BDNF при моделировании гипоксической гипоксии in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1. Изучить нейротропное действие BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей в культуре диссоциированных клеток гиппокампа на 7, 14 и 21 день их развития in vitro (DIV);

2. Исследовать ранние и отдаленные эффекты антигипоксического действия BDNF на активность нейронной сети первичных культур клеток гиппокампа при моделировании острой нормобарической гипоксии in vitro;

3. Изучить эффект BDNF на выживаемость, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, сохранение и воспроизведение следов долговременной памяти у экспериментальных животных в раннем и отдаленном периодах после воздействия острой гипобарической гипоксии in vivo.

Научная новизна

В диссертации впервые проведено комплексное исследование влияния нейротрофического фактора BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа на разных этапах развития in vitro. Выявлен дозо-зависимый нейротропный эффект BDNF на биоэлектрические показатели функционального состояния нейронных сетей первичной культуры гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro, заключающийся в увеличении длительности сетевой пачечной активности при отсутствии изменений в количестве спайков и повышении синхранизации активности нейронов в составе сети при формировании спонтанной сетевой пачки. Нейротропный эффект имел транзиторный характер, наступал с задержкой в 10-15 мин и длился не менее 2-х часов.

На модели острой гипоксии in vitro впервые выявлено антигипоксическое действие BDNF, наиболее выраженное при аппликация нейротрофического фактора в концентрации 1 нг/мл за 20 мин до острой нормобарической гипоксии. Установлено, что превентивное применение BDNF препятствует повреждениям и гибели нейронов в культурах диссоциированных клеток гиппокампа в отдаленном постгипоксическом периоде, что способствует нормализации спонтанной биоэлектрической активности нейронов в составе сети после гипоксии/реоксигенации. Антигипоксическое действие BDNF реализуется через взаимодействие белка с тирозинкиназным рецептором В (TrkB).

Антигипоксическое действие BDNF, выявленное на клеточном уровне in vitro, подтверждено при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo. Впервые показано, что превентивное интраназальное введение BDNF, 4 мкг/кг и 40 мкг/кг способствует выживаемости животных на «смертельной площадке», увеличению устойчивости животных к гипоксии, а также сохранению следов долговременной пространственной памяти, двигательной и исследовательской активности в постгипоксическом периоде.

Практическая и теоретическая значимость работы

Полученные в работе данные о действии нейротрофического фактора BDNF на структурно-функциональное состояние нейронных сетей гиппокампа в процессе синаптогенеза расширяют теоретические представления о роли BDNF в функционировании мозга в постнатальном периоде. Выявлены антигипоксические свойства нейротрофического фактора в условиях острой гипоксии как in vitrо, так и in vivo. Раскрытие механизмов нейропротекторного действия BDNF может способствовать разработке новых терапевтических подходов к коррекции ишемических процессов в нервной ткани при нейрососудистых заболеваниях.

Положения, выносимые на защиту

1. Нейротрофический фактор головного мозга дозозависимо модулирует спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей диссоциированных культур клеток гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro.

2. Нейротрофический фактор головного мозга является компонентом эндогенной антигипоксической системы защиты клеток мозга в постнатальном периоде, способствует повышению выживаемости нейронов и сохранению функциональности нейронных сетей как в условиях гипоксии/реоксигенации, так и в отдаленном постгипоксическом периоде через взаимодействие с тирозинкиназным рецептором В (TrkB).

3. Превентивное интраназальное введение нейротрофического фактора головного мозга увеличивает устойчивость животных к условиям острой гипобарической гипоксии, а также способствует сохранению долговременной пространственной памяти после гипоксии/реоксигенации.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на X сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н.Новгород, 2011), Седьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2011), Всероссийской молодежной конференции - школы «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011), Восьмом международном форуме по нейронауке FENS 2012 (Испания, Барселона, 2012), IV Съезде биофизиков России (Н.Новгород, 2012), IV Международном симпозиуме Topical Problems of Biophotonics - 2013 (Н.Новгород, 2013), XXII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), Восьмом международном симпозиуме по нейропротекции и нейровосстановлению (Германия, Магдебург, 2014), Международной научной школе «Горизонты современной нейронауки» (Н.Новгород, 2014), Международном конгрессе по нейронаукам (Красноярск, 2014), Девятом международном форуме по нейронауке FENS 2014 (Италия, Милан, 2014), Десятом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2014), Симпозиуме «Новейшие методы клеточных технологий в медицине» (Новосибирск, 2014).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение, регуляция экспрессии гена и белка нейротрофического фактора головного мозга

В 1982 году в институте психиатрии и нейрохимии им. Макса Планка в Германии тремя учеными из мозга свиньи был выделен второй представитель семейства нейротрофинов после фактора роста нервов (NGF) - нейротрофический фактор головного мозга (англ. - Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) (Barde Y.A. et al., 1982). Определение белка к данному семейству основывалось на его способности поддерживать выживаемость и рост культуры эмбриональных сенсорных нейронов цыпленка. В ходе последующих поисков экспрессию BDNF и его рецепторов открыли и в центральной нервной системе человека (Leibrock J. et al., 1989). На сегодняшний день молекулярное строение BDNF изучено достаточно хорошо. Известно, что это высококонсервативная молекула, первичная структура которой сходна у всех изученных млекопитающих и по аминокислотному составу на 50% идентична другим представителям семейства нейротрофинов (англ. - NGF, нейротрофин-3 (NT-3), нейротрофин-4/5 (англ. - NT4/5)). У человека зрелая молекула BDNF представляет собой димер (молекулярная масса 27кДа, 119 негликозилированных аминокислотных остатков), состоящий из двух нековалентно связанных между собой субъединиц (13,5кДа). В растворе нейротрофический фактор головного мозга представлен гомодимерной структурой. Показано, что белок в виде димера способен связываться со своими рецепторами на плазматической мембране клетки, в то время как мономерная форма полноценной связи с ними не образует (Rosental A. et al., 1991). Доказано, что человеческий ген BDNF локализован в 11 хромосоме и состоит из четырех коротких 5'-некодирующих экзонов, связанных с разными промоторами, и одного 3'-экзона, кодирующего данный белок (Jones K.R., Reichardt L.F., 1990, Maisonpierre P.C. et al., 1991). Также известно, что BDNF имеет 5 изоформ, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга (Bath K.G., Lee F.S., 2006). Подобно образованию других нейротрофинов, первоначально синтезируется пронейротрофин (англ. - proBDNF) - белок-предшественник, отличающийся от зрелой молекулы BDNF своими связывающими характеристиками и биологической активностью (Lee F.S. et al., 2001, Lee R. et al., 2001). После секреции молекула proBDNF расщепляется под действием мембраносвязанных или внеклеточных Са-зависимых протеиназ и превращается в активную форму молекулы (Chao M.V., Bothwell M., 2002).

Результаты целого ряда исследований показывают, что BDNF экспрессируется многими типами клеток: нейронами различного фенотипа и локализации, астроцитами, фибробластами, шванновскими клетками, мегакариоцитами/тромбоцитами, клетками гладкой мускулатуры (Kim et al., 2004). Особенно высокий уровень экспрессии BDNF был обнаружен в области гиппокампа и коры головного мозга, что предполагает наиболее полное выполнение белком своих основных функций в данных отделах ЦНС. Установлено, что в плазме концентрация BDNF не превышает нескольких пикограмм на миллилитр. В сыворотке за счет дегрануляции тромбоцитов содержание BDNF увеличивается в тысячу раз (Гомазков О.А., 2006, 2011).

За последние несколько лет многими исследователями было показано, что уровень экспрессии гена BDNF может меняться как в норме, так и при патологии. В экспериментах in vivo установлено, что экспрессия мРНК BDNF повышалась в результате осмотической стимуляции в гипоталамусе (Castren E. et al., 1995, Dias B.G. et al., 2003), стимуляции вибрисс в соматосенсорной области коры головного мозга (Rocamora N. Et al., 1996). В ряде работ говорится о том, что электрическая стимуляция, вызывающая долговременную потенциацию (англ. - long-term potentiation, LTP) в гиппокампе, повышает уровень экспрессии не только BDNF, но и фактора роста нервов (англ. - Nerve growth factor, NGF) (Patterson S.L. et al., 1992, Castren E. et al., 1992, Bramham C.R. et al., 1996). Существуют данные, которые свидетельствуют об увеличении экспрессии BDNF в гиппокампе при физических нагрузках (Neeper S.A. et al., 1995). В недавних экспериментах in vivo было показано, что при хроническом (долговременном) и остром (кратковременном) стрессе экспрессия мРНК BDNF и мРНК тирозинкиназного рецептора В (англ. - TrkB) подвержена изменениям. При моделировании состояния острого стресса в разных возрастных группах у крыс происходило значительное повышение уровня экспрессии мРНК и самого белка BDNF, наиболее выраженное у молодых животных. В условиях хронического стресса независимо от возраста уровни мРНК и белка BNDF снижались, но повышался уровень мРНК TrkB (Shi S.S. et al., 2010). В свою очередь при нейродегенеративных заболеваниях экспрессия BDNF снижалась (Murer M.G. et al., 2001). Доказано, что у пациентов с болезнью Альцгеймера наблюдалось снижение уровня экспрессии мРНК BDNF в гиппокампе (Phillips H.S. et al., 1991, Ferrer I. et al., 1999), при болезни Паркинсона снижался уровень белка BDNF в черной субстанции (Howells D.W. et al., 2000). Повышение уровня транскрипции BDNF в норме также зависит от белка хантингтина, функции которого в организме до настоящего момента четко не установлены. Однако в ходе развития болезни Хантингтона хантингтин подвергается мутации, в результате которой уровень хантингтин-зависимой транскрипции BDNF снижается. Впоследствии происходит потеря трофической поддержки поврежденным нейронам, состояние которых ухудшается в ходе развития заболевания (Zuccato C. et al., 2001).

1.2 Рецепторы нейротрофического фактора головного мозга

На сегодняшний день известно, что BDNF связывается с двумя типами мембранных рецепторов: низкоафинным рецептором к NGF или p75, и высокоафинным тирозинкиназным рецептором В - TrkB (Patapoutian A., Reichardt L.F., 2001).

Установлено, что взаимодействие с рецептором р75 (75 кДа) характерно не только для BDNF, но и для всех представителей семейства нейротрофинов. По своей структуре р75 относится к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли (англ. - tumor necrosis factor receptor, TNFR) и состоит из гликозилированного внеклеточного домена, обеспечивающего связь с лигандом, трансмембранного региона и короткого цитоплазматического хвоста. При связывании нейротрофина с низкоафинным рецептором р75 запускаются внутриклеточные сигнальные механизмы, активирующие транскрипционный ядерный фактор каппа-В (англ. - nuclear factor-кB = NF-кB), стресс-активируемые протеинкиназы (Jun-киназы) и реакцию сфингомиелинового гидролиза. В свою очередь NF-kB участвует в регуляции экспрессии генов клеточного цикла, иммунного ответа, программируемой клеточной гибели (апоптоза), а реакции сфингомиелинового гидролиза и Jun-киназы активируют транскрипцию генов раннего ответа с-fos и с-jun, задействованные в инициации апоптоза (Casaccia-Bonnefil P. et al., 1996, Frade J.M. et al., 1996, Roux P.P. et al., 1999, Esposito D. et al., 2001, Lee F.S. et al., 2001, Lee R. et al., 2001, Zaccaro M.C. et al., 2001, Dechant G., Barde Y.A., 2002) (рис. 1).

Доказано, что рецептор TrkB (145 кДа) помимо взаимодействия с BDNF способен связываться с меньшей степенью афинности с NT-4/5. Другие представители семейства нейротрофинов, такие как NGF и NT-3, способны активировать тирозинкиназные рецепторы А (TrkA) и С (TrkC), соответственно (Barbacid M., 1994). Установлено, что TrkB может экспрессироваться в нескольких вариантах. Первый - TrkB-FL (TrkB full-length), представлен наиболее полной последовательностью, содержащей в своей структуре внутриклеточный тирозинкиназный домен. Второй вариант экспрессии характеризуется двумя укороченными формами рецептора TrkB, не обладающими тирозинкиназной активностью - TrkB-T1 (TrkB truncated-1) и TrkB-T2 (TrkB truncated-2).

Рисунок 1. Схема сигнальных путей, активируемых BDNF через рецептор p75 (Сахарнова Т.А. и др., 2012); с-fos, с-jun - гены раннего ответа; Jun-киназы - стресс-активируемые протеинкиназы; NF-kB - транскрипционный ядерный фактор каппа-В; p75 - низкоафинный рецептор к NGF

В ряде исследований было показано, что TrkB-T1 и TrkB-T2 принимают участие в передаче сигнала, росте и развитии нервных клеток (Eide F.F. et al., 1996, Fryer R.H. et al., 1997, Yacoubian T.A., Lo D.C., 2000, Luikart B.W. et al., 2003), понижают экспрессию и функционирование TrkB (Eide F.F. et al., 1996, Haapasalo A. et al., 2001, Haapasalo A. et al., 2002) и способны повышать высвобождение кислых метаболитов (Rose C.R. et al., 2004). Также известно, что в результате травмы мозга экспрессия укороченных форм TrkB на астроцитах увеличивается (Frisen J. et al., 1993). Повышенная экспрессия TrkB-T1 и TrkB-T2 приводит к накоплению BDNF в астроцитах, тем самым в течение длительного времени регулируется концентрация белка (Biffo S. et al., 1995, Roback J.D. et al., 1995, Alderson R.F. et al., 2000). Следует отметить, что в глиальных клетках через укороченные формы рецептора осуществляется быстрая активация фосфолипазы С (англ. - PLC) и инозитол-3-фосфат(IP3)-зависимого выброса Са2+ из внутриклеточных хранилищ (Climent E. et al., 2000, Rose C.R. et al., 2004).

Многие исследователи утверждают, что основные функции, выполняемые BDNF, осуществляются при связывании белка с рецептором TrkB-FL. В результате взаимодействия BDNF с TrkB-FL происходит активация трех внутриклеточных сигнальных каскадов через: PLC-сигнальный механизм, малый ГТФ-связывающий белок Ras/митоген-активированную протеинкиназу (Ras/MAРK), фосфоинозитол-3-киназу/Akt киназу (или protein kinase B, РКВ) (PI3/Akt) (Patapoutian A., 2001). Взаимодействие BDNF/TrkB-FL активирует фосфорилирование нескольких остатков тирозина в цитоплазматическом домене рецептора (Barbacid M., 1994). Последующее автофосфорилирование TrkB-FL запускает PLCг-сигнальный путь. В результате активации фосфолипазы Сг образуются вторичные переносчики - диацилглицерол (англ. - DAG) и инозитолтрифосфат (англ. - IP3). IP3 стимулирует высвобождение из внутриклеточных депо Са2+, который в свою очередь активирует кальций/кальмодулин зависимую протеинкиназу 2 (англ. - CаMK2). CаMK2 завершает процесс фосфорилирования цАМФ-зависимого транскрипционного фактора (CREB) (Rose C.R. et al., 2004). Доказано, что CREB регулирует транкрипцию гена BDNF и многих других нейропептидов, участвует в формировании долговременной потенциации, нейрональной пластичности (Grande I. et al., 2010).

Также при фосфорилировании TrkB-FL запускается PI-3/Akt сигнальный механизм, в ходе которого Akt-киназа транслоцируется в ядро клетки, где подвергает фосфорилированию центральные транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов, которые отвечают за выживаемость клеток.

В результате активации Ras/МАРК сигнального пути происходит фосфорилирование цАМФ-зависимого транскрипционного фактора (рис. 2).



Рисунок 2. Схема сигнальных путей, активируемых BDNF через TrkB-FL рецептор (Сахарнова Т.А. с соавт., 2012). Akt - протеинкиназа В; AMPAR - АМПА-рецептор; BDNF - нейротрофический фактор головного мозга; Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) - проапоптотический ген; Bcl-XL (B-cell lymphoma-extra large) -«ген выживаемоти»; CaMK2 - кальций/кальмодулин зависимая протеинкиназа 2; CREB - цАМФ-зависимый транскрипционный фактор; DAG - диацилглицерол; FTF (Forkhead transcription factors) - транскрипционные факторы, влияющие на экспрессию «генов смерти»; GABAa - ГАМКа-рецептор; ICER - индуцибельный ранний репрессор цАМФ; IP3 - инозитолтрифосфат; LTP (long-term potentiation) - долговременная потенциация; MAPK - митоген-активирующаяся протеинкиназа; MАР2K - митоген-активирующаяся протеинкиназа киназа; NF-kB - транскрипционный ядерный фактор каппа-В; Nav1.9 - Na-специфический ионный канал; NMDAR - НМДА-рецептор; PI3K - фосфоинозитол-3-киназа; PKC - протеинкиназа С; PLC - фосфолипаза С; Raf-1 - серин-треонинкиназа; Ras - малый ГТФ-связывающий белок Ras; SRF - serum response factor; TrkB - тирозинкиназный рецептор В; VGCC (Voltage-gated calcium channel) - потенциал зависимый кальциевый канал

Показано, что Ras/MAРK сигнальный механизм участвует в поддержании выживания нейронов и росте аксонов (Segal R.A., 2003, Rose C.R. et al., 2004, Martin J.L., Finsterwald C., 2011), а при совместном действии с PI-3 сигнальным механизмом изменяет актиновую и микротубулиновую динамику, снижает активность ветвления дендритов (Grande I. et al., 2010).

Таким образом, более медленный эффект BDNF зависит от активации трех сигнальных путей, начинающихся с фосфолипазы C, PI3 киназы/Act и Ras/MAP киназы. В результате запускаются механизмы, приводящие к росту аксонов и дендритов, повышению выживаемости клеток, пластичности нейронов, транскрипции самого фактора BDNF. В тоже время, BDNF-зависимая активация CREB может привести к потенцированию эпилептогенеза (Scharfman H.E. 1997, Scharfman H.E. et al., 1999, Croll S.D. et al., 1999, Scharfman H.E. et al. 2002, Zhu X. et al., 2012). Наиболее быстрый ответ вызван активацией потенциалзависимых каналов Nav1.9, а также модуляцией работы ГАМКа рецепторов, что деполяризует мембрану и, как следствие, открывает потенциалзависимые кальциевые каналы (VGCCs), активирует NMDA рецепторы, опосредуя вход кальция в клетку и запуск процессов синаптической пластичности, в частности, формирование долговременной потенциации (LTP) (Rose C.R. et al., 2004).

1.3 Влияние BDNF на синаптическую передачу сигнала в нейронной сети

В соответствии с локализацией TrkB-рецептора в аксональных терминалях и дендритных шипиках, BDNF влияет на пресинаптическую и постсинаптическую передачу сигнала в коре головного мозга и гиппокампе (Lu B., 2003). Установлено, что BDNF участвует в процессах формирования синаптической пластичности, влияя на некоторые формы долговременной потенциации (long-term potentiation, LTP) (Figurov A. et al., 1996, Patterson S.L. et al., 1996) и долговременной депрессии (long-term depression, LTD) (Huber K.M. et al., 1998), лежащие в основе процессов обучения и памяти (Yamada K., Nabeshima T., 2003, Bekinschtein P. et al., 2008, Chunha C. et al., 2010, Edelman E.et al., 2014 ). Накопленные знания позволяют утверждать, что центральную роль в процессах обучения и памяти, процессах консолидации (перехода кратковременной памяти в долговременную) играет отдел лимбической системы головного мозга - гиппокамп. Показано, что во время непосредственного обучения в гиппокампе происходит быстрое и селективное повышение уровня экспрессии BDNF (Hall J. et al., 2000). Интересно отметить, что у обезьян в процессе формирования инструментального рефлекса наблюдается повышенный уровень BDNF в области париетальной коры (Ishibashi H. et al., 2002). В исследованиях in vivo установлено, что у мышей с повышенной экспрессией укороченных форм рецептора TrkB, с нокаутом гена BDNF ослабляется пространственное обучение. Такой же эффект наблюдался в экспериментах с применением антител, блокирующих функции BDNF (Saarelainen T. et al., 2000а, Saarelainen T. et al., 2000б, Alonso M. et al., 2002). Отмечено, что у людей единичный нуклеотидный полиморфизм гена BNDF Val66Met, при котором происходит замена в 66-ом кодоне аминокислоты валина на метионин, так же влияет на процессы памяти. Показано, что у людей с преобладанием аллели метионина страдает кратковременная память (Egan M.F. et al., 2003).

Недавние исследования показали, что сигнальная система BDNF/TrkB влияет как на потенциал зависимые натриевые и калиевые каналы, так и на глутаматные и рецепторы к GABA (г-аминомасляная кислота) (Madara J.C., Levine E.S., 2008). Выявлено, что BDNF вызывает быстрое (в течение 10 мс) открытие специфических Na+-ионных каналов (Nav1.9) (рис. 2). Данный эффект блокируется ингибитором тирозинкиназного рецептора TrkВ - k252а, что говорит об участии TrkB-FL рецепторов в данном процессе. Вероятно, быстродействие эффекта обусловлено связыванием BDNF/TrkBFL с Nav1.9 каналами прямо или косвенно, при помощи адаптерной молекулы, не используя дополнительные сигнальные пути. Повышение тока натрия в клетку вызывает деполяризацию мембраны и открытие потенциал зависимых кальциевых каналов (англ. - voltage-gated calcium channels, VGCCs). Стремительный кальциевый сигнал приводит к активации кальций/кальмодулин киназных путей передачи, активируя CREB (Rose C.R. et al., 2004).

Установлено, что BDNF повышает активность фосфорилирования NR1- и NR2B-субъединиц NMDA-рецепторов (N-метил-D-аспартат, NMDA) в гиппокампе и нейронах коры (Sheng M. et al., 1994, Lin S.Y. et al., 1998) и увеличивает количество открытых NMDA-рецепторами каналов (рис. 2). Интересно отметить, что фосфорилирование NR2B-субъединицы при участии BNDF связано с LTP в CA1 области гиппокампа. Показано, что в культуре коры головного мозга BDNF повышает трансляцию мРНК субъединицы NR1 (Schratt G.M. et al., 2004), а в гиппокампе регулирует количество NMDA-рецепторов. Предполагается, что регуляция BDNF глутаматергической активности связана с доставкой NMDA-рецепторов в плазматическую мембрану клетки (Nong Y. et al., 2004). Есть данные о том, что в культурах гиппокампа в ответ на повышение внутриклеточного кальция BNDF активирует транскрипцию NR1, NR2A, NR2B-субъединиц NMDA-рецепторов и способствует доставке к плазматической мембране те рецепторы, которые содержат в своем составе NR2B-субъединицу (Caldeira M.V. et al., 2007, Georgiev D.D. et al., 2008). Таким образом, предполагается возможность участия BDNF в синаптической пластичности за счет влияния на сборку NMDA-рецепторов на постсинаптической мембране клетки.

Спорным вопросом остается действие BDNF на ионотропные трансмембранные рецепторы глутамата, активация которых опосредует быструю синаптическую передачу в ЦНС - AMPA-рецепторы (рецептор б-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты, AMPA). В ряде работ с культурами нейронов гиппокампа было показано, что применение BDNF приводит к подавлению пропускной способности AMPA -рецепторов, зависящей от тирозин-киназной активности, что связано с активацией BDNF/TrkB-FL сигнальных механизмов (Song D.K. et al., 1998, Balkowiec A., 2000) (рис. 2). С другой стороны, существуют данные о повышении уровня поверхностной экспрессии AMPA-рецепторов, опосредованной действием BDNF (Narisawa-Saito M. et al., 2002). Таким образом, влияние BNDF на AMPA-рецепторы остается до конца неизученным и предполагает дальнейшие исследования в данном направлении.

Известно, что влияние BDNF на GABAегическую передачу меняется в период постнатального развития, что может быть связано с изменениями во внутриклеточных сигнальных путях TrkB-рецепторов (Mizoguchi Y. et al., 2003). Установлено, что в период до 6 дня постнатального развития ГАМК служит возбуждающим сигналом для нейронов через GABAa-рецепторы, являющиеся представителями семейства GABA-зависимых CL-/HCO3- ионных каналов (Farrant M., Kaila K., 2007). Возбуждающая активность GABAа-рецепторов в раннем постнатальном периоде регулирует нейрональную пролиферацию, миграцию, дифференцировку и формирование нейронной сети (Behar T.N. et al., 1996, Belhage B. et al., 1998, Davies P. et al., 1998, Haydar T.F. et al., 2000, Hensch T.K., Stryker M.P., 2004). Показано, что при деполяризации, вызываемой ГАМК, активируются потенциал-зависимые Са2+ каналы, снимается магниевая блокада на NMDA-рецепторах, что приводит к генерации постсинаптического потенциала (Leinekugel X. et al., 1995, Khazipov R. et al., 1997, Ganguly K. et al., 2001, Hensch T.K., Stryker M.P., 2004). Недавние исследования показали, что существует положительная обратная связь между возбуждающим GABAа-сигнальным путем и системой BDNF/TrkB-FL. Вход Са2+ в клетку стимулирует высвобождение BDNF и его связывание с TrkB-рецептором, запускающее PI-3 и РКС (протеинкиназа-С) сигнальные пути, в результате которых уровень экспрессии GABAа-рецепторов заметно повышается. При запуске сигнальных каскадов BDNF снижает эндоцитоз GABAа-рецепторов, тем самым повышается их количество на поверхности клетки, что приводит к увеличению чувствительности развивающихся нейронов к GABA (Tanaka T. et al., 1997). После 14 дня постнатального развития GABAa-рецепторы связаны с процессами синаптического торможения. Активируя те же пути, BDNF понижает эффективность тормозящей передачи в GABAергических синапсах посредством регуляции фосфорилирования (Tanaka T. et al., 1997, Brunig I. et al., 2001, Cheng Q., Yeh H.H., 2003, Porcher C. et al., 2011) (рис. 2).

Таким образом, во многих исследованиях было показано, что BDNF влияет на пресинаптическую и постсинаптическую передачу сигнала в клетке, принимает участие в формировании синаптической пластичности и является важным звеном для процессов обучения и памяти. В результате связывания с рецептором TrkB происходит активация потенциал зависимых натриевых и калиевых каналов, повышается количество открытых NMDA-рецепторами каналов и уровень экспресии GABAа-рецепторов через PI-3 и РКС сигнальные пути. Однако роль и механизмы действия BDNF на уровне организации нейронных сетей в процессе их развития, участие в образовании синаптических контактов и влияние данного нейротрофического фактора на спонтанную биоэлектрическую активность практически не изучены и требуют дальнейших исследований.

1.4 Нейропротекторные свойства BDNF

Как показано во многих работах, нейропротекторные свойства BDNF проявляются на различных уровнях организации клетки. Широко распространенным способом моделирования цитотоксического действия возбуждающих аминокислот является воспроизведение in vivo и in vitro эпилептиформного эффекта каиновой кислотой, которая вызывает усиленную активацию возбуждающих путей, часто сопровождающуюся деструкцией нейронов (Bidaut-Russell M. et al., 1990). В результате ряда исследований была установлена связь между BDNF и эндоканнабиноидной системой (ЭКС) и их совместное участие в оказании нейропротекторного эффекта против каиновой кислоты (КК). Показано, что фармакологическая блокада эндоканнабиноидного рецептора 1 типа (КР1) антагонистом SR141716A в эксплантатах, полученных от нормальных мышей, усиливала нейродеструктивное действие КК (Khaspekov L.G. et al., 2004). Кроме того, под действием каиновой кислоты повышалась экспрессия BDNF, устранявшаяся SR141716A. С другой стороны, добавление экзогенного BDNF ослабляло цитотоксический эффект каиновой кислоты, обусловленный блокадой каннабиноидного рецептора 1-го типа. Эти данные свидетельствуют о том, что эндоканнабиноидная система способна активировать синтез BDNF, который оказывает защитное действие при цитотоксическом действии возбуждающих аминокислот (Aguado T. et al., 2007).

В нейронах гиппокампа в результате активации Ras/MAPK, PLC и PI-3-сигнальных путей установлен положительный эффект BDNF, направленный против глутаматной токсичности (Hashimoto R. et al., 2002, Wu X. et al., 2004, Almeida R.D., 2005) (рис. 2). Многие исследователи предполагают, что особую роль в процессах клеточной выживаемости играет PI-3/Akt сигнальный механизм. В результате активации Akt-киназы происходит подавление ряда транскрипционных факторов (Forkhead transcription factors) и снижается их способность экспрессировать «гены смерти». Кроме того, Akt-киназа, активируя CREB и ядерный фактор - NF-кB, способствует повышению экспрессии «генов выживаемости», таких как Bcl-2 (англ. - B-cell lymphoma 2), Bcl-XL (англ. - B-cell lymphoma-extra large) (Schabitz W.R. et al., 2000, Downward J., 2004, Shishkina G.T. et al., 2010). Установлено, что в результате запуска Ras/MAPK и PI-3 сигнальных механизмов стимулировался синтез сывороточного фактора SRF (англ. - serum response factor), который принимает участие в реакциях, поддерживающих выживаемость нейронов (Chang S.H. et al., 2004). В недавнем исследовании на гиппокампальных прогениторных клетках линии H19-7 был изучен защитный эффект BDNF и NGF против апоптотической гибели клеток, вызванной стауроспорином. В результате связывания с рецептором TrkВ-FL, его последующим фосфорилированием и запуском PI-3/Akt сигнального механизма BDNF и NGF контролируют активацию каспазы-3, которая принимает непосредственное участие в каскаде реакций, приводящие к апоптозу клетки (Nguyen T.L. et al., 2010). В одной из работ in vivo было показано, что интраназальное введение BDNF перед окклюзией средней мозговой артерии защищает клетки головного мозга от ишемического повреждения путем регуляции уровня цитокинов, транскрипционных факторов и активации локального воспаления (Jiang Y. et al., 2010). Обнаружено, что во время ишемии при введении экзогенного BDNF снижается уровень экспрессии одного из провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухоли б (tumor necrosis factor, TNFб), играющий важную роль в развитии повреждений (Maddahi A., Edvinsson L., 2010). При этом BDNF-зависимый уровень экспрессии NF-кB увеличивался (Jiang Y. et al., 2010). Также BDNF способен активировать транскрипцию и локально повышать концентрацию противовоспалительного цитокина интерлейкина 10 (IL10) (Jiang Y. et al., 2011).

Совсем недавно было обнаружено, что существует положительная обратная связь между уровнем BDNF и функцией микроглии (Ferrini F., De Koninck Y., 2013). Во время ишемии мозга BDNF активирует микроглию, которая защищает нейроны от последствий развития глутаматной эксайтотоксичности. В свою очередь, активированная микроглия может выделять в межклеточное пространство новые порции BDNF, активирующие другие клетки микроглии (Elkabes S. et al., 1996, Zhang J. et al., 2003, Jiang Y. et al., 2010). Недавние исследования Mizoguchi и соавторов (2009) показали, что превентивное введение BDNF в мозг животных при моделировании ишемии in vivo путем окклюзии сонной артерии повышало количество фагоцитирующей глии, которая, в свою очередь, способна поглощать поврежденные клетки, усугубляющие данный патологический процесс (Mizoguchi Y. et al., 2009). Посредством активации фагоцитирующей функции микроглии BDNF способен уменьшать последствия локальной ишемии.

Таким образом, на моделях in vivo и in vitro было показано, что BDNF может выступать в качестве нейропротектора в результате активации Ras/MAPK, PLC и PI-3-сигнальных путей, при этом в качестве основного механизма действия BDNF в процессах выживаемости клеток ученые выделяют PI-3/Akt сигнальный путь. Однако данные об участии BDNF в защитных и патологических реакциях достаточно противоречивы, что обуславливает необходимость дальнейшего изучения механизмов действия данного нейротрофического фактора. В настоящее время особое внимание уделяется экспериментальным исследованиям по изучению эффектов и механизмов действия BDNF при гипоксическом повреждении.

1.5 Моделирование гипоксии in vitro и in vivo и роль нейротрофического фактора головного мозга в коррекции ишемических состояний мозга

Понимание того, что дефицит кислорода в окружающей среде оказывает огромное влияние на жизнедеятельность организма и требует специального изучения, пришло лишь в конце XIX века. Толчком для развития направления явилась гибель первых аэронавтов, поднявшихся на воздушных шарах в разреженные слои атмосферы, после чего проблемой гипоксии стали заниматься во всем мире. В 1961г. Чарным А.М. было сформулировано наиболее полное определение гипоксии, используемое до настоящего времени: «Гипоксия - патологическое состояние, наступающее в организме при неадекватном снабжении тканей и органов кислородом или при нарушении утилизации в них кислорода» (Лукьянова Л.Д., 2004). Кислородная недостаточность служит основой разнообразных патологических процессов, часто наблюдается в клинике и является одной из центральных проблем медицины. В настоящее время накоплен значительный фактический материал о механизмах действия гипоксии, что позволило установить последовательность развития нарушений, создать различные классификации гипоксических состояний и выработать ее прогностические критерии (Колчинская А.З., 1997, Чеснокова Н.П. с соавт., 2006). Однако базовым, молекулярным механизмом любой формы гипоксии, приводящим к подавлению аэробного синтеза энергии, энергозависимых функций и, в связи с этим, характерным для нее функционально-метаболическим нарушениям, является дисфункция митохондриального аппарата, выражающаяся в фазных изменениях активности митохондриальных ферментативных комплексов (Лукьянова Л.Д., 2004, Лукьянова Л.Д. с соавт., 2007).

В зависимости от причин и механизма развития различают следующие основные типы гипоксий:

1. Экзогенная гипоксия - возникает при воздействии на систему обеспечения кислородом внешних факторов, таких как изменения содержания кислорода во вдыхаемом воздухе, изменения общего барометрического давления. Экзогенные гипоксии в свою очередь подразделяются на:

а) гипоксический тип (гипо- и нормобарический);

б) гипероксический тип (гипер- и нормобарический);

2) Респираторная (дыхательная) гипоксия;

3) Циркуляторная (сердечно-сосудистая) гипоксия - к ней относится ишемия;

4) Гемическая гипоксия - возникает при анемии и вследствие инактивации гемоглобина;

5) Цитологическая гипоксия - возникает при нарушении способности тканей поглощать кислород или при разобщении окисления и фосфорилирования (гипоксия разобщения);

6) Субстратная (развивается на фоне дефицита энергетических субстратов);

7) Перегрузочная («гипоксия нагрузки») - при увеличении нагрузки на систему обеспечения кислородом;

8) Смешанная.

Помимо данной классификации по продолжительности действия выделяют: а) молниеносную гипоксию, продолжительностью действия несколько десятков секунд; б) острую - продолжительностью несколько минут; в) подострую - часы, десятки часов; г) хроническую, длящуюся неделями, месяцами, годами. По степени тяжести также выделяют: а) легкую; б) умеренную; в) тяжелую; г) критическую (смертельную) гипоксии. Нередко одновременно встречается несколько типов гипоксии, что сопровождается наиболее глубокими нарушениями метаболизма (например, сочетание гипоксической гипоксии с относительной ишемией). Независимо от этиологии гипоксических состояний в развитии и исходе основного патологического процесса решающая роль принадлежит степени насыщения тканей кислородом и его участию в метаболических процессах (Лукьянова Л.Д., 2004, Чеснокова Н.П. с соавт., 2006, Новиков В.В., Павленко А.Ю., 2009).

Приспособительные и компенсаторные реакции организма в ответ на кислородную недостаточность связаны с включением реакций, направленных на сохранение гомеостаза. Они условно разделяются на реакции, осуществляемые на уровне целого организма или его отдельных систем, и реакции на клеточном уровне. Однако, в силу определенных пределов функциональных резервов, организменные и системные компенсаторные реакции могут сменяться стадией истощения и декомпенсации, приводящей к выраженным функциональным нарушениям. Работами Araki R. и соавторов (Araki R., Nashito I., 1989) и Fukuda H. и соавторов (Fukuda H. et al., 1989) показано, что при снижении содержания кислорода в тканях выраженные метаболические изменения наступают до уменьшения потребления кислорода клетками. Рассматривая реакции клеток на гипоксию, Шахламов В.А. и Сороковой В.И. (Шахламов В.А., Сороковой В.И., 1983) выделили компенсаторную стадию полной обратимости метаболических изменений, которая в последующем сменяется стадиями частично обратимых и необратимых изменений.

В начале 90-х годов 20 века был обнаружен феномен «ишемической толерантности мозга». Суть этого феномена заключается в том, что после предъявления кратковременных не повреждающих ишемических воздействий существенно возрастает структурная резистентность нейронов уязвимых отделов мозга (в частности области СА1 гиппокампа) к последующей отсроченной тяжелой ишемии, приводящей к их гибели (Шляхто Е.В. с соавт., 2012а,б). Такие кратковременные (умеренные) воздействия, обусловливающие развитие толерантности мозга, получили название ишемического/гипоксического прекондиционирования, которое рассматривается в качестве одной из форм приспособления клеток мозга к гипоксии (Самойлов М.О., 2004). В последние годы эффекты прекондиционирования интенсивно исследуются, однако молекулярные механизмы протективного действия данного эффекта остаются до конца не изучены и являются актуальным предметом для исследований (Лукьянова Л.Д. с соавт., 2008, Lukyanova L.D. et al., 2008).

Нарушения кровообращения, сопровождающиеся гипоксией (циркуляторная гипоксия), особенно опасны для головного мозга. Частота ишемических нарушений мозгового кровообращения составляет около 70 % сосудистых заболеваний мозга, при этом в половине случаев основным патогенетическим фактором является окклюзионное поражение экстракраниальных артерий. Стенозирующие поражения сосудов, кровоснабжающих головной мозг, становятся одной из причин возникновения мозговых инсультов ишемического типа (Дривотинов Б.В. с соавт. 1997; Гусев Е.И. с соавт., 2007).

Изучение механизмов действия повреждающих факторов ишемии является важной проблемой современной неврологии и нейробиологии в целом. Вследствие ишемии возникает временная дисфункция или стойкое повреждение тканей мозга, наблюдается глубокая инвалидизация больных. В связи с этим ведётся поиск способов защиты мозга от последствий этого патологического состояния (Chen A. et al., 2013). В настоящее время многие учёные исследуют влияние ишемии на клетки, рассматривая при этом в совокупности и субстратное, и кислородное голодание (Kraig R.P. et al., 1986, Larsen E.C. et al, 2007). Использование адекватных и легко воспроизводимых моделей ишемических расстройств важно для поиска путей их фармакологической коррекции.

В большинстве экспериментальных моделей ишемии in vivo используют окклюзию сосудов. Принципиально все модели можно разделить на две группы: глобальной и фокальной ишемии (Smith M.L. et al., 1984). Однако учитывая, что в клинике нередко встречаются формы патологии, основой которых являются острые нарушения мозгового кровообращения на фоне кислородной недостаточности, в исследованиях часто используется модель острой гипобарической гипоксии, сочетающейся с ишемией головного мозга. Эта модель является промежуточной между моделями фокальной и глобальной ишемии. Впервые она предложена С. Левиным в 1960-х гг. (Levine S., 1960). Неполную ишемию мозга моделировали окклюзией общих сонных артерий под кратковременным эфирным наркозом, после чего животных «поднимали» в барокамере (скорость 50м/с, высота 8000 м) с экспозицией на высоте 90 минут. Такое сочетание гипоксии с ишемией мозга позволяет оценить защитный эффект препаратов в особенно жестких условиях (Султанов В.С. с соавт., 2010).

Наиболее подходящим условием для изучения молекулярных процессов, механизмов, действующих на клеточном уровне, служит моделирование нормобарической гипоксии in vitro. Как правило, для осуществления методики используются специальные инкубаторы, в которых можно вытеснять кислород при помощи вакуумного насоса.

В настоящее время в современной нейробиологии и медицине стоит актуальный вопрос о поиске веществ, способных защитить клетки головного мозга от повреждающего действия гипоксии. Среди химических веществ, способных контролировать уровень метаболизма клетки в условиях сниженного содержания кислорода, учёные выделяют белки семейства нейротрофинов (Dirnagl U. et al., 2009, Ferenz K.B. et al., 2012, Wang Y. et al., 2013). Особому вниманию в данном вопросе уделяется нейротрофическому фактору головного мозга BDNF (Chen A. et al., 2013).

С момента открытия способности BDNF повышать выживаемость нейронов был поставлен вопрос о его возможном использовании в лечении заболеваний центральной и периферической нервных систем. В экспериментах по моделированию гипоксии-ишемии in vivo и in vitro было показано, что BDNF способствует защите нейронов от повреждений, вызванных гипогликемией, ишемией, гипоксией и нейротоксичностью вследствие хронической этанольной интоксикации (Walton M. et al., 1999, Han B.N., Holtzman D.M., 2000, Miyata K. et al., 2001, Barnabe-Heider F., Miller F.D., 2003, Chen A. et al., 2013). В результате связывания BDNF c TrkB-рецептором возможна активация трех сигнальных каскадов: PLC-сигнального механизма, фосфоинозитол-3-киназного пути (PI-3), митогенактивированного протеинкиназного пути (MAPK) (Hetman M. et al., 1999, Han B.N., Holtzman D.M., 2000, Barnabe-Heider F., Miller F.D., 2003, Mao M. et al., 2005). Однако вопрос о конкретном сигнальном механизме, который запускается против гипоксического повреждения, остается до конца не изученным и является причиной жарких споров в научном мире. В ряде публикаций показано, что поддержание выживаемости нейронов посредством BDNF осуществляется через активацию внеклеточной сигнал-регулирующей киназы (англ. - ERK) или MAPK пути (Han B.N., Holtzman D.M., 2000, Hetman M., Gozdz A., 2004), в то время как другие исследователи представляют доказательства того, что в данном процессе участвует PI-3-киназный сигнальный механизм (Hetman M. et al., 1999, Satoh T. et al., 2000, Mograbi B. et al., 2001, Namura S. et al., 2001, Nakazawa T. et al., 2002, Veit C. et al., 2004). Также, существуют данные о том, что p38 МАРК (один из сигнальных путей активации митогенактивированных протеинкиназ) играет роль в нейропротекции (Irving E.A., Bamford M., 2002, Park J.Y. et al., 2004). Таким образом, защита нейронов, опосредованная BDNF осуществляется через различные пути в зависимости от таких факторов, как типы клеток, условия окружающей среды и стимуляция клеток.

...