Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vitro и in vivo

Начиная с 20 минуты после воздействия BDNF в концентрации 1 нг/мл наблюдалось достоверное (p<0,05) увеличение длительности пачки импульсов относительно исходной активности и активности контрольных культур, длящееся в течение последующих 2 часов и превышающим в среднем на 62% контрольные значения. Однако эффек был транзиторный и через 24 часа после добавления в среду культивирования нейротрофического фактора длительность пачки не отличалась от первоначальных и контрольных показателей.

Проведение анализа функциональных характеристик сетевой пачки импульсов, отражающих индивидуальную структуру нейронной сети, установило, что добавление в среду культивирования контрольного раствора, не повлияло на «паттерн» сетевой пачки диссоциированных культур на 21 DIV (рис. 13 А).

Рисунок 13. Паттерн спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа (DIV 21). Слева - активность культур до аппликации, справа - через 24 часа после аппликации (DIV 22). А - контрольная культура; Б - BDNF, 0,1 нг/мл; В - BDNF, 1 нг/мл. Цветовая диаграмма - время появления спайков в сетевой малой пачке, регистрируемых с электродов, мс

В отличие от контрольной группы добавление в культуральную среду BDNF, в концентрации 0,1 и 1 нг/мл привело сокращению времени появления спайка в сетевой пачке, что повысило синхронизацию работы нейронов, сохраняющуюся в течение 24 часов после аппликации нейротрофина, также, как и на 14 DIV.

Таким образом, при добавлении в среду культивирования нейротрофического фактора BDNF на 21 DIV наблюдалсь тот же нейротропный эффект, что и на 14 DIV, выражающийся в увеличении длительности малой сетевой пачки импульсов, усилении синхронизации нейронов.

3.2 Антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга в условиях нормобарической гипоксии in vitro

Моделирование нормобарической гипоксии проводилось в период стабильной работы зрелых сетей первичных культур гиппокампа, на 33 день развития культур in vitro путем замены нормоксической культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода в течение 10 минут. Предварительно за 20 минут до начала эксперимента в опытной группе в среду культивирования добавляли BDNF в концентрации 1 нг/мл. Контрольным культурам моделирование гипоксии проводилось без аппликации нейротрофического фактора. Интактная группа воздействию нормобарической гипоксии не подвергалась.

В результате проведенного исследования было показано, что воздействие острой нормобарической гипоксии негативно влияет на спонтанную биоэлектрическую активность первичных гиппокампальных культур. Так, со второй минуты пребывания первичных культур контрольной группы в гипоксической среде зарегистрировано существенное снижение количества малых сетевых пачек (рис. 14A). На временном промежутке 3-10 минут сетевая активность по данному показателю статистически достоверно отличалась как от исходной активности культур, так и от активности интактной группы. Схожая динамика наблюдалась и по частоте внеклеточных потенциалов действия (рис. 14Б).

По сравнению с культурами, которые не подвергались гипоксическому воздействию, со второй минуты регистрации в контрольной группе происходил резкий спад активности и, начиная с третьей минуты и до окончания моделирования нормобарической гипоксии, мультиэлектродной матрицей регистрировались единичные внеклеточные потенциалы действия.

На данном интервале времени частота спайков контрольной группы была достоверно ниже исходного уровня активности. Также для культур, которые находились в гипоксической среде, выявлены достоверные различия по количеству внеклеточных потенциалов действия от интактной группы.

Аналогично в группе с превентивным добавлением BDNF, 1 нг/мл наблюдалось снижение спонтанной биоэлектрической активности в течение 10-минутного эпизода нормобарической гипоксии (рис. 14).

Рисунок 14. Динамика спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа в течение 10-минутной нормобарической гипоксии. А - количество малых сетевых пачек; Б - количество спайков в секунду. * - достоверность различий с исходным уровнем активности, # - достоверность различий с группой "Нормоксия", а - достоверность различий с группой "Гипоксия", p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

Однако данное снижение развивалось медленнее, чем в контрольной группе. Достоверное снижение числа малых сетевых пачек относительно интактных культур произошло на 5 минуте действия гипоксии и на 6 минуте по сравнению с исходным уровнем активности. Количество малых сетевых пачек и частота внеклеточных потенциалов действия опытных культур были достоверно выше показателей контрольной группы.

Таким образом, применение нейротрофического фактора способствовало поддержанию сетевой пачечной активности культур во время действия нормобарической гипоксии. Тем не менее, на фоне гипоксического воздействия происходило изменение структуры сетевой пачки импульсов. Показано, что на временном промежутке 3-10 минут частота внеклеточных потенциалов действия статистически достоверно снижалась относительно исходного уровня активности, и отличалась от значения интактной группы в интервале 5-7 минут.

Реоксигенация вызывала усиление сетевой активности нейронов относительно исходного уровня в контрольной группе. Паттерн спонтанной биоэлектрической активности изменялся за счет увеличения количества малых сетевых пачек (количество пачек за 10 минут до гипоксии составлял 38,2±7,83, после реоксигенации 101,7±23,67) и незначительном увеличении среднего числа спайков в пачке (до гипоксии 251,8±102,1, после реоксигенации 432,7±141,3). Однако через 2 часа после моделирования гипоксии происходило необратимое снижение спонтанной биоэлектрической активности (количество пачек за 10 минут 3±5,67, среднее число спайков в пачке 508±232,98).

Проведено исследование спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа в тдленном постгипоксическом периоде. Как видно из рисунка 15, количество малых сетевых пачек в культурах, которые не подвергались воздействию нормобарической гипоксии, в течение всего времени наблюдения достоверно не изменялось.

При рассмотрении спонтанной биоэлектрической активности опытных групп было показано, что кратковременная нормобарическая гипоксия вызывает необратимые изменения сетевой активности нейронов в отдаленном постгипоксическом периоде. Так, на первые сутки после воздействия количество малых сетевых пачек в контрольных культурах достоверно снизилось относительно исходной активности в 4,9 раза. Статистически достоверное снижение спонтанной биоэлектрической активности обнаружено и в группе с превентивным введением BDNF, 1 нг/мл. Однако количество малых сетевых пачек было достоверно выше значений контрольной группы, а снижение активности относительно исходного уровня произошло лишь в 1,5 раза.

На 3 сутки постгипоксического периода количество малых сетевых пачек в опытных группах осталось статистически достоверно ниже относительно исходного уровня активности. Следует отметить, что по отношению к первым суткам постгипоксического периода в группе с аппликацией BDNF, 1 нг/мл данный показатель не изменился.

На 7 сутки после моделирования нормобарической гипоксии в контрольной группе малые сетевые пачки не зарегистрированы, в то время как у культур с превентивным добавлением BDNF, 1 нг/мл достоверных различий с исходным количеством малых сетевых пачек не обнаружено.

Таким образом, кратковременная нормобарическая гипоксия приводила к ингибированию сетевой пачечной активности культур в отдаленном постгипоксическом периоде, что, вероятно, обусловлено редукцией синаптических контактов и гибели функционально активных нейронов. Применение нейротрофического фактора нивелировало негативные последствия кислородного голодания, сохраняя сетевую пачечную активность культур клеток гиппокампа на определенном функциональном уровне с дальнейшем восстановлением в постгипоксическом периоде.

Рисунок 15. Количество малых сетевых пачек диссоциированных культур гиппокампа, регистрируемых за 10 мин записи на 1, 3 и 7 сутки постгипоксического периода. * - достоверность различий с исходным уровнем, # - достоверность различий с группой "Гипоксия", p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Влияние кратковременной нормобарической гипоксии также негативно сказывалось на структуре сетевых пачек (рис. 16). Уже на первые сутки после острого кислородного голодания в контрольной группе установлено статистически значимое снижение количества спайков в пачке. Данная тенденция сохранялась на протяжении всего периода наблюдения. На 7-е сутки после кратковременной нормобарической гипоксии были зарегистрированы лишь единичные внеклеточные потенциалы действия.

Эффект BDNF проявлялся в сохранении среднего числа спайков в пачке в отдаленном постгипоксическом периоде. Достоверных различий по сравнению с исходной активностью культур не обнаружено.

Рисунок 16. Количество спайков в пачке диссоциированных культур клеток гиппокампа, регистрируемых за 10 мин записи на 1, 3 и 7 сутки постгипоксического периода. * - достоверность различий с исходным уровнем, # - достоверность различий с группой "Гипоксия", p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Следовательно, можно предположить, что превентивное добавление нейротрофического фактора предотвращало изменения структуры сетевой пачки импульсов, вызванные гипоксическим воздействием. Данное предположение было подтверждено при анализе паттернов активации спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа (рис. 17).

Также, как и в случае аппликации BDNF в культуры с нормоксическими условиями культивирования, добавление нейротрофического фактора в культуры с острой гипоксией вызывало уменьшение времени активации нейронов в составе сетевой пачки, обуславливая развитие более синхронизированного начала пачечной активности сети в целом.

Рисунок 17. Паттерн активации спонтанной биоэлектрической активности диссоциированной культуры гиппокампа. А - активность контрольной культуры до гипоксии и через 24 часа после реоксигенации; Б - активность культуры до аппликации BDNF (1нг/мл) и через 24 часа после аппликации и гипоксии. Цветовая диаграмма - время появления спайков в сетевой малой пачке, регистрируемых с электродов, мс

Мы предположили, что снижение спайковой активности нейронов в составе нейронной сети в контрольной группе в течение суток после воздействия нормобарической гипоксии, связано с гибелью нейронов. В группе с предварительным введением нейротрофического фактора, вероятно, наблюдалось сохранение нейронов в отдаленном постгипоксическом периоде. Для подтверждения этого предположения, мы оценили жизнеспособность нейронов в отдаленном постгипоксическом периоде.

Оценка жизнеспособности диссоциированных культур клеток гиппокампа проводилась на 33 DIV до моделирования нормобарической гипоксии и на 3 и 7 сутки постгипоксического периода. Показано, что количество живых клеток в интактных культурах на протяжении всего периода наблюдения не изменялось (и составляло 88-92%). Кратковременная нормобарическая гипоксия приводила к гибели основной части клеток в течение первых трех суток постгипоксического периода.

Уже через 24 часа после острого 10-минутного эпизода гипоксии появляются первые морфологические изменения в контрольной группе культур в виде некротизированых и апоптотических клеточных элементов, число которых увеличивалось в течение 7 последующих дней (рис. 18).

Рисунок 18. Процент мертвых (пропидиум иодид положительных клеток) в диссоциированных культурах гиппокампа до гипоксии (33 DIV), на 3 (36 DIV) и 7 (40 DIV) сутки постгипоксического периода (0,37 мл/л О2). * - достоверность различий с исходным уровнем; # - достоверность различий с контрольной группой, p < 0,05 (критерий Стьюдента).

Установлено, что количество мертвых клеток в группе без предварительной аппликацией нейротрофического фактора за первые трое суток статистически достоверно увеличилось в 4 раза по сравнению с нормоксическими условиями и составило 43% от общего числа клеток.

При исследовании морфологической структуры и жизнеспособности за семидневный постгипоксический период группы культур с превентивным добавлением BDNF, 1нг/мл было установлено, что количество мертвых клеток значительно ниже по сравнению с контрольными клеточными культурами. Через 7 суток после гипоксии количество мертвых клеток в среднем составляло всего 20% от общего числа клеток в культуре, что достоверно в 2,35 раза ниже, чем в контрольной серии (р<0,05 критерий Манна-Уитни).

Таким образом, проведенные эксперименты выявили, что 10-минутная нормобарическая гипоксия вызывает необратимые изменения в спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур гиппокампа. Наблюдалось снижение количества сетевых пачек импульсов и количества спайков в пачке и их ингибирование через 2-3 минуты после начала воздействия. Кроме того, в первые трое суток после моделирования нормобарической гипоксии в 4,2 раза возрастает количество мертвых клеток в контрольных культурах. Применение BDNF, 1нг/мл за 20 минут до 10-минутного эпизода гипоксии предупреждает все обнаруженные негативные эффекты кислородного голодания. В условиях гипоксии наблюдалось частичное сохранение биоэлектрической активности, после реоксигенации количество мертвых клеток достоверно ниже, чем в культурах без добавления нейротрофического фактора.

Антигипоксическое защитное действие BDNF в условиях кислородного голодания вероятно обусловлено сохранением окислительного фосфорилирования как основной функции митохондриальной дыхательной системы клеток. Однако вопрос о конкретном сигнальном механизме, который запускается нейротрофинами при гипоксии и приводит к повышению резистентности клеток, остается до конца не изученным.

Действие BDNF на клетки нервной системы связано с активацией большого числа внутриклеточных метаболических каскадов, опосредованных взаимодействием молекулы нейротрофина с двумя типами мембранных рецепторов (Сахарнова и др., 2012): низкоафинным рецептором к NGF (low-affinity nerve growth factor receptor, LNGFR), или p75, и высокоафинным тирозинкиназным рецептором В - TrkB (Patapoutian A., Reichardt L.F., 2001). Для изучения роли высокоафинного рецептора TrkB использовался селективный антагонист k252а (Sigma, K2015).

Показано, что применение k252а (150 нМ) полностью нивелирует положительные эффекты BDNF (1 нг/мл) при действии гипоксии (рис. 19).

Рисунок 19. Влияние нейротрофического фактора BDNF на изменение показателей спонтанной биоэлектрической активности первичной диссоциированной культуры гиппокампа через 7 суток после моделирования острой нормобарической гипоксии. * - достоверность различий с группой «Нормоксия»; ** - достоверность различий с группой «Гипоксия», (ANOVA , р<0,05, n=16)

Анализ спонтанной биоэлектрической активности через 7 дней после воздействия гипоксии показал полное угнетение сетевой пачечной активности при применении антагониста TrkB. При использовании k252а (150 нМ) более чем у 72% культур через 7 суток после гипоксии не выявлено сетевой пачечной активности. Исследование жизнеспособности клеток в первичной диссоциированной культуре гиппокампа также показало, что применение антагониста тирозинкиназного рецептора достоверно (р<0,01) увеличивает количество погибших клеток после воздействия гипоксии (рис. 20).

Рисунок 20. Количество мертвых (пропидиум иодид положительных) клеток в диссоциированных культурах гиппокампа на 7 сутки постгипоксического периода. Данные нормированы относительно группы "Нормоксия". * - достоверность различий с группой "Нормоксия"; # - достоверность различий с группой "Гипоксия", ANOVA, p < 0,05, n=12

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, о том, что все положительные эффекты, оказываемые нейротрофическим фактором головного мозга во время гипоксии, связаны с TrkB-рецептором. Блокада данного рецептора полностью нивелирует антигипоксические и нейропротективные эффекты BDNF (1 нг/мл) при гипоксии.

В ряде публикаций показано, что поддержание выживаемости нейронов посредством BDNF осуществляется через активацию внеклеточной сигнал-регулирующей киназы (ERK) или MAPK пути (Han B.N. et al., 2000, Hetman M. et al., 2004), в то время как другие исследователи представляют доказательства того, что в данном процессе участвует PI-3-киназный сигнальный механизм (Nakazawa T. et al., 2002, Veit C. et al., 2004). Также существуют данные о том, что p38 МАРК (один из сигнальных путей активации митогенактивированных протеинкиназ) играет роль в нейропротекции (Irving E.A., Bamford M., 2002, Park J.Y. et al., 2004). Одним из известных молекул-мишеней МАРК и PI-3-киназы является цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (CREB). Это важный компонент данных сигнальных путей, ведущий к изменениям в экспрессии генов. Предполагается, что CREB способствует BDNF-опосредованному выживанию нейронов в центральной нервной системе, активируя антиапоптотическую экспрессию генов. Фосфорилирование участка CREB Ser133 нейротрофинами необходимо для активации CREB-опосредованных транскрипционных факторов (Arthur J.S.C. et al., 2004). В недавнем исследовании in vitro нейронов коры головного мозга в условиях циркуляторной гипоксии (гипоксии/ишемии) было показано, что экзогенное применение BDNF способствует повышению количества выживших кортикальных нейронов после повреждающего воздействия через активацию и MAPK, и PI3-киназного сигнальных путей, приводящих к активации фосфорилирования СREB. В большей части данный процесс связан с внеклеточной сигнал-регулирующей киназой ERK (Sun X. et al., 2008).

В 2012 году в экспериментах in vitro было исследовано действие BDNF на метаболизм кислорода в митохондриях мозга мышей (Markham A. et al., 2004, 2012). В случае инкубации с синаптосомами эффект BDNF выражался в концентрационно-зависимом повышении респираторного контрольного индекса (Respiratory control index, RCI, показатель эффективности дыхательной цепи, синтеза АТФ и целостности органелл). При этом в экспериментах на выделенных митохондриях BDNF не демонстрировал подобного эффекта и усиливал окисление только в случае использования субстратов митохондриального ферментативного комплекса I. Митохондриальный эффект BDNF контролировался MAPK сигнальным путем, а ингибитор митохондриального ферментативного комплекса I, ротенон, способен in vitro и in vivo ингибировать как митохондриальный, так нейропротективный эффект BDNF (Markham A. et al., 2004, 2012).

Таким образом, способность BDNF положительно влиять на метаболические процессы и эффективность утилизации кислорода в мозге демонстрирует исключительную его важность как компонента антигипоксической системы защиты клеток, способного повышать выживаемость нейронов и сохранять функциональность нейронных сетей в условиях гипоксии.

3.3 Антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга в условиях гипоксии in vivo

Влияние BDNF на выживаемость животных при моделировании острой гипобарической гипоксии

При моделировании острой гипобарической гипоксии у мышей регистрировались следующие поведенческие и жизненно важные показатели, характеризующие устойчивость особей к острой кислородной недостаточности: время жизни на высоте (Тж, мин), время потери позы (Тпп, мин), время восстановления позы (Твп, мин), рассчитывался коэффициент защиты (Кз). Предварительно за 40 минут до проведения ОГБГ опытным группам интраназально вводили BDNF в дозе 4 мкг/кг и 40 мкг/кг. Контрольной группе животных применялась интраназальная инъекция физиологического раствора, группе сравнения внутрибрюшинно вводили препарат антигипоксического действия - Реамберин в дозе 150 мг/кг.

В результате оценки времени жизни на высоте (Тж, мин), которое отсчитывалось от момента подъема на «смертельную площадку» до появления второго агонального вдоха, либо наступления летального исхода, было установлено, что по сравнению с остальными животными, подвергшимися ОГБГ контрольная группа особей находилась в барокамере наименьший период времени (рис. 21).

Рисунок 21. Оценка времени жизни на высоте мышей линии C57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии. * - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

Тж мышей с превентивным введением физиологического раствора в среднем составляло 6,18±0,76 мин. Применение нейротрофического фактора BDNF существенно увеличивало время пребывания животных в барокамере. Установлено, что время нахождения на «смертельной площадке» опытных особей статистически достоверно (p < 0,05) превышало время контрольной группы. Тж мышей с интраназальной инъекцией BDNF (4 мкг/кг) в среднем составило 9,4±0,4 мин. Менее продолжительно в барокамере находились животные с превентивным применением высокой дозы нейротрофического фактора, время жизни «на высоте» которых составило 8,6±0,49 мин. Следует отметить, что Тж опытных групп не отличалось от показателей группы сравнения, которой перед помещением в барокамеру внутрибрюшинно вводили препарат Реамберин. Следовательно, можно предположить, что при моделировании ОГБГ превентивное введение BDNF повышает устойчивость животных к острой кислородной недостаточности, увеличивая период пребывания особей в барокамере. По времени пребывания на «смертельной площадке» все животные были распределены по степени устойчивости к воздействию острой гипобарической гипоксии. Так, в группах встречались особи низкоустойчивые к гипоксии (НУ) с Тж менее 3 мин, среднеустойчивые с Тж от 3 до 9 мин и высокоустойчивые, которые находились в барокамере более 9 мин без видимых проявлений гипоксического повреждения (рис. 22).

Рисунок 22. Распределение степени устойчивости в группах мышей линии С57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии. Данные представлены в % от общего числа особей в группе.

Было показано, что низкоустойчивые животные встречались только в контрольной группе, которой перед подъемом «на высоту» вводили физиологический раствор. В группе с превентивным применением препарата сравнения и у опытных мышей с интраназальной инъекцией BDNF (40 мкг/кг) обнаружено равное количество среднеустойчивых и высокоустойчивых животных и составляло по 50% от общего числа мышей в группе. Интересно отметить, что у мышей с интраназальным введением низкой дозы нейротрофического фактора количество высокоустойчивых животных оказалось выше, чем в группе, которой перед воздействием ОГБГ внутрибрюшинно вводили препарат сравнения Реамберин, и составляло 70% от общего числа особей, принадлежащих к данной группе. Большой процент высокоустойчивых животных указывает на эффективность применения BDNF (4 мкг/кг) как антигипоксанта в условиях острой гипобарической гипоксии.

Эффективность антигипоксических свойств (коэффициент защиты, Кз) нейротрофического фактора BDNF оценивали по изменению времени жизни опытных животных на «смертельной площадке» относительно времени жизни контрольных животных и группы сравнения. Показано, что коэффициент защиты опытной группы с превентивным введением BDNF (4 мкг/кг) не отличался от значений группы Реамберина и составлял 1,3. Интересен тот факт, что Кз особей с BDNF (40 мкг/кг) превышал в 1,23 раза показатель группы сравнения и составил 1,6.

При моделировании ОГБГ проводилась оценка времени потери позы (Тпп, мин) (рис. 23).

Данный показатель рассчитывался как период от начала подъема в барокамере до момента, когда животное принимает боковое положение и утрачивает способность поддерживать позу. В результате оценки Тпп достоверных различий между группами не обнаружено.

После моделирования острой гипобарической гипоксии у особей исследовался показатель времени восстановления позы (Твп, мин), который рассчитывался как период времени от остановки дыхания или немедленного «спуска с высоты» до момента, когда животное снова приобретает способность уверенно стоять на конечностях (рис. 24). Показано отсутствие достоверных различий между группами по данному показателю.

Рисунок 23. Время потери позы мышей линии C57BL/6 в барокамере при моделировании острой гипобарической гипоксии, p<0,05 (критерий Манна-Уитни)

Твп контрольной группы в среднем составило 4,29±1,17 мин. Установлено, что у 62,5% животных данной группы время, затраченное на попытки уверенно встать на конечности, достоверно отличалось от показателей как группы с инъекцией антигипоксанта (p<0,01), так и контрольной группы (p<0,05). Также следует отметить, что данный процент особей пребывали в условиях острой кислородной недостаточности наиболее продолжительный период времени и являлись высокоустойчивыми животными.

Статистически значимых различий между Твп особей с интраназальным применением BDNF высокой концентрации и животными, получившими инъекции физиологического раствора и Реамберина, не установлено.

Таким образом, в результате проведенного эксперимента было обнаружено, что острая кислородная недостаточность существенно влияет на поведенческие и жизненно важные показатели животных.

Рисунок 24. Время восстановления позы мышей линии C57BL/6 после «спуска» со «смертельной площадки» при моделировании острой гипобарической гипоксии, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

Так, в контрольной группе показана низкая устойчивость особей к воздействию ОГБГ. Также мыши с интраназальной инъекцией физиологического раствора пребывали в барокамере наименьший период времени.

Превентивное применение нейротрофического фактора BDNF повышало устойчивость мышей к условиям острой гипобарической гипоксии. В опытных группах отмечаются высокие показатели времени жизни на высоте, которые статистически достоверно отличались от контрольных значений. Среди всех животных, подвергшихся ОГБГ, в группе BDNF (4 мкг/кг) установлен наибольшее время жизни «на смертельной площадке». Тж особей с интраназальной инъекцией BDNF (40 мкг/кг) сопоставимо с показателями группы сравнения. У животных с превентивным применением Реамберина и у мышей с инъекцией BDNF (40 мкг/кг) обнаружено равное количество среднеустойчивых и высокоустойчивых животных, а процент высокоустойчивых особей в группе BDNF (4 мкг/кг) на 20% превышал показатели группы сравнения. Следовательно, нейротрофический фактор BDNF обладает выраженными антигипоксическими свойствами.

Выявленное влияние BDNF на жизненные и поведенческие показатели животных указывает на потенциальную эффективность его применения как антигипоксанта в условиях острой гипобарической гипоксии наравне с применением препарата Реамберина.

3.3.2 Влияние BDNF на показатели двигательной и ориентировочно-исследовательской активности мышей в тесте «Открытое поле»

Согласно классическим представлениям в тесте «Открытое поле» у мышей при попадании на открытое пространство с повышенной освещенностью наблюдаются стрессовые ориентировочно-исследовательская и защитно-оборонительная поведенческие реакции (Буреш Я. с соавт., 1991). Как правило, ориентировочно-исследовательская реакция животного оценивается по горизонтальной и вертикальной двигательной активности, количеству реакций принюхивания. В то время как, эмоциональный статус животного оценивают по времени замирания, количеству реакций дефекации, мочеиспускания, груминга, верчения и пячения (Худякова Н.А., Баженова Т.В., 2012). Показано, что при действии различных повреждающих факторов (таких как гипоксия, травма и т.д.) или введении фармакологических препаратов, данные показатели могут меняться, что изменяет структуру поведения животного, тем самым влияя на гуморальные и метаболические процессы в организме (Новиков В.Е., 2005).

При тестировании животных в «открытом поле» выявлено, что исходный уровень горизонтальной активности статистически не отличался во всех группах животных (рис. 25).

Рисунок 25. Влияние ОГБГ на изменение горизонтальной двигательной активности мышей. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия относительно исходного уровня активности; # - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (Критерий Манна-Уитни).

В интактной группе на втором и третьем этапе наблюдения в тесте «открытое поле» обнаружено достоверное снижение количества пересеченных квадратов относительно исходной активности. На последний момент регистрации уровень горизонтальной двигательной активности оставался низким, однако статистически не отличался от исходных значений. Схожую динамику поведения при сравнении с начальными показателями продемонстрировали опытные группы с интраназальным введением перед проведением ОГБГ низкой дозы BDNF и с внутрибрюшинной инъекцией препарата Реамберина. У данных животных на 14 сутки после ОГБГ количество пересеченных квадратов статистически не отличалось от показателей, которые были зарегистрированы до подъема на «смертельную площадку».

Как видно из рисунка 25, на первые сутки после ОГБГ уровень горизонтальной двигательной активности, как опытных групп, так и интактной группы достоверно снизился относительно исходных значений. Достоверных различий в показателях разных групп не обнаружено.

На 7-е сутки после подъема «на высоту» в контрольной группе было установлено достоверное снижение количества пересеченных квадратов относительно интактных животных. В группах с интраназальным введением BDNF 4 мкг/кг и 40 мкг/кг статистически значимых различий с интактными животными и группой с внутрибрюшинной инъекцией препарата Реамберина не обнаружено.На 14-е сутки после моделирования острой гипобарической гипоксии показатели горизонтальной двигательной активности животных контрольной и опытной группы BDNF (40 мкг/кг) статистически достоверно оставались ниже исходных значений, в отличие от показателей других групп, уровень которых возвращался к исходным значениям. Однако достоверных различий между показателями опытных, интактной и контрольной групп не зафиксировано.

Таким образом, у всех групп животных наблюдалось достоверное снижение горизонтальной двигательной активности. Данная динамика отражает пассивно-оборонительную тактику поведения мышей в ответ на стрессорное воздействие теста «водного лабиринта». Однако следует отметить, что после окончания обучения в «водном лабиринте» в интактной группе происходит постепенное восстановление горизонтальной двигательной активности. Такая же направленность изменений обнаружена в группе сравнения и у животных с интраназальной инъекцией BDNF (4 мкг/кг). Следовательно, восстановление горизонтальной двигательной активности в этих группах может свидетельствовать о нейрозащитном действии BDNF в концентрации 4 мкг/кг и препарата сравнения (Реамберина). Особый интерес представляет тот факт, что в группе с превентивным введением BDNF в дозе 40 мкг/кг наблюдалась только тенденция к восстановлению двигательной активности.

При исследовании ориентировочно-исследовательской активности животных проводилась оценка изменения уровня вертикальной двигательной активности (количество вертикальных стоек) и количество реакций принюхивания.

Анализ полученных данных показал, что во всех группах исходное количество вертикальных стоек статистически не отличалось друг от друга. После обучения в водном лабиринте Морриса в интактной группе наблюдалось резкое достоверное снижение вертикальной двигательной активности относительно исходных значений. Через неделю уровень ориентировочно-исследовательской активности повысился, однако оставался достоверно ниже исходных показателей. На последнем этапе тестирования наблюдалась тенденция к возвращению вертикальной двигательной активности к исходным значениям. Разница между показателями после обучения в «водном лабиринте» и последним тестом статистически значима (p<0,05) (рис. 26).

Схожая динамика поведения обнаружена в контрольной группе, группе сравнения и у животных с интраназальной инъекцией BDNF (4 мкг/кг). Однако в данных группах повышение количества вертикальных стоек не достигло статистических значений.

Также следует отметить, что в течение двух недель после «подъема на высоту» уровень вертикальной двигательной активности контрольных и опытных животных не отличался от показателей интактной группы.

Рисунок 26. Влияние ОГБГ на изменение ориентировочно-исследовательской активности мышей. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия относительно исходных показателей; # - статистически значимые различия уровня активности в сравнении с первым этапом наблюдения, p < 0,05 (Критерий Манна-Уитни)

Таким образом, обнаружено достоверное снижение ориентировочно-исследовательской активности мышей как интактной, так и опытных групп относительно исходных показателей, что можно обусловить со стрессорным воздействием теста «водного лабиринта». В интактной группе после окончания навигационного научения наблюдалось постепенное восстановление исследовательской активности, в то время как в опытных группах количество вертикальных стоек к исходным показателям не приближалось. Однако следует отметить, что у животных с превентивным введением Реамберина, физиологического раствора и BDNF (40 мкг/кг) через 2 недели после «подъема на высоту» наблюдается тенденция к восстановлению вертикальной активности.

При исследовании ориентировочно-исследовательской активности по количеству реакций принюхивания обнаружено, что у всех групп животных исходные показатели статистически не отличались друг от друга (рис. 27).

Показано, что в интактной группе после обучения в водном лабиринте Морриса происходило достоверное снижение количества актов принюхивания относительно исходного уровня. В течение последующего времени наблюдения уровень активности животных по данному показателю повысился, однако оставался достоверно ниже исходных значений.

На 1 сутки после ОГБГ в контрольной группе обнаружено заметное снижение количества актов принюхивания. Как видно из рисунка 27 уровень ориентировочно-исследовательской активности ниже остальных групп и статистически значимо отличался от значений препарата сравнения. На последующих этапах тестирования наблюдалась тенденция к возвращению ориентировочно-исследовательской активности к исходным значениям. Разница между показателями первых суток после ОГБГ и последним тестом статистически значима (рис. 27).

В отличие от других групп у животных с внутрибрюшинной инъекцией Реамберина не отмечалось тенденции к восстановлению ориентировочно-двигательной активности. В течение 2 недель наблюдения количество актов принюхивания существенно не изменялось и оставалось достоверно ниже исходных показателей. Достоверных отличий данной группы относительно активности интактной группы не обнаружено.

Несмотря на отсутствие статистической значимости интересно отметить, что динамика поведения опытной группы с интраназальным введением BDNF (4 мкг/кг) схожа с активностью интактной группы. Через сутки после моделирования ОГБГ количество актов принюхивания достоверно снизилось относительно исходных показателей. В дальнейшем наблюдается тенденция к восстановлению ориентировочно-исследовательской активности, однако количество реакций принюхивания оставалось достоверно ниже исходных значений.

Рисунок 27. Влияние ОГБГ на количество актов принюхивания мышей. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия относительно исходных показателей; ** - статистически значимые различия по сравнению с 1 сутками после ОГБГ; #- статистически значимые различия с группой Реамберина; ## - статистически значимые различия с группой физиологического раствора (NaCl, 0,9%), p < 0,05 (Критерий Манна-Уитни)

Наибольший интерес представляет опытная группа с превентивным введением BDNF (40 мкг/кг). Из рисунка 27 видно, что уровень ориентировочно-исследовательской активности данных животных после «подъема на высоту» выше относительно показателей остальных групп. Установлено, что на первые сутки после ОГБГ количество актов принюхивания группы с высокой дозой BDNF было достоверно (p<0,05) выше значений контрольной группы. На 7 сутки после подъема в барокамере уровень исследовательской активности был значимо (p<0,05) выше показателей группы препарата Реамберина.

Также было показано, что в группе BDNF (40 мкг/кг) происходило восстановление ориентировочно-исследовательской активности до исходных показателей. Через неделю после ОГБГ количество реакций принюхивания не имело достоверных отличий относительно исходных значений. Исходя из вышесказанного, следует вывод о том, что в данной опытной группе восстановление ориентировочно-исследовательской активности по количеству актов принюхивания происходит быстрее, чем у интакных животных, даже, несмотря на то, что группа с применением BDNF (40 мкг/кг) была подвергнута острой кислородной недостаточности. Данный факт представляет особый интерес, поскольку время пребывания опытных животных «на высоте» было достоверно (p<0,05) выше, чем в контрольной и эталонной группах. Длительное пребывание в барокамере подразумевает более выраженные повреждения головного мозга, что должно было сказаться, в том числе и на показателях ориентировочно-исследовательской активности.

Таким образом, во всех группах количество реакций принюхивания после проведения сеансов водного лабиринта Морриса достоверно снижалось относительно исходного уровня активности. Также следует отметить, что комплексное воздействие навигационного научения и ОГБГ существенно повлияло на ориентировочно-исследовательскую активность животных с превентивным введением физиологического раствора. Количество актов принюхивания контрольной группы на 1-е сутки после воздействия было достоверно ниже группы сравнения и опытной группы BDNF (40 мкг/кг).

В группе с интраназальной инъекцией BDNF (40 мкг/кг) к 7-ым суткам после «подъема на высоту» количество актов принюхивания возвращалось к исходным показателям. Кроме того, уровень активности группы животных, получавшие высокую дозу BDNF достоверно выше, чем у групп сравнения и контрольной группы. Показатели группы с интраназальным введением BDNF (4 мкг/кг) после «подъема на высоту» свидетельствуют о тенденции к восстановлению ориентировочно-исследовательской активности. Таким образом, можно предположить, что BDNF способствует сохранению ориентировочно-исследовательской деятельности по показателю реакций принюхивания животных после воздействия ОГБГ.

При исследовании эмоционального статуса животных в тесте «открытое поле» проводилась оценка времени замирания, количества реакций дефекации, мочеиспускания, груминга, верчения и пячения.

В результате проведенного эксперимента было показано, что стрессорное воздействие теста «водного лабиринта» не повлияло на такие показатели как количество реакций дефекации, мочеиспускания, груминга, верчения и пячения. Достоверные различия наблюдались только по времени замирания животных (рис. 28). Исходный уровень показателей у всех групп статистически не отличался друг от друга.

Как видно из рисунка 28, со второго этапа регистрации в «открытом поле» время замирания животных как интактной, так и опытных групп увеличивается. В интактной группе повышение данного показателя достигает статистической значимости относительно исходного уровня к последнему этапу тестирования.

Время замирания группы с внутрибрюшинной инъекцией Реамберина становится достоверно выше исходных показателей к 7-ым суткам после воздействия ОГБГ. Статистических различий с интактной группой не обнаружено.

Показано, что эмоциональный статус животных с интраназальным введением физиологического раствора по данному показателю существенно не изменялся. Через неделю после теста «смертельной площадки» время замирания у данной группы возвращалось к исходным значениям, а также не отличалось от показателей интактной группы.

Динамика поведения опытной группы BDNF (40 мкг/кг) имеет определенную схожесть с активностью интактных животных, однако статистических различий между группами не обнаружено. К 14 суткам после ОГБГ время замирания достоверно (p<0,05) повышается по сравнению с исходными показателями, а также со значениями, зарегистрированными на первые сутки после моделирования острой гипоксии.

Рисунок 28. Влияние ОГБГ на время замирания животных. * - статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем; # - статистически значимые различия по сравнению с 1 сутками после ОГБГ, p<0,05

Изменения в эмоциональном статусе животных опытной группы BDNF (4 мкг/кг) по времени замирания имели неоднозначный характер. На 1 сутки после ОГБГ данный показатель статистически достоверно был выше относительно исходных значений. Через неделю после моделирования ОГБГ уровень активности восстанавливался до исходного. Однако через 2 недели после подъема «на смертельную площадку» время замирания снова статистически значимо повышалось относительно исходных показателей.

Таким образом, время замирания характеризует оборонительную реакцию животного на потенциальную опасность и адаптивную значимость, так как неподвижность уменьшает возможность акустического или зрительного обнаружения животного хищниками. Показано, что с каждым последующим этапом проведения теста «открытое поле» время замирания как интактной, так и опытных групп увеличивалось относительно исходных значений, что свидетельствует о повышении уровня тревожности животных. Исключение составляет контрольная группа с превентивным введением физиологического раствора, показатели которой через неделю после подъема «на высоту» возвращались к исходному уровню активности. Несмотря на отсутствие статистических различий, следует отметить, что эмоциональные статусы животных с интраназальной инъекцией BDNF (40 мкг/кг) и интактной группы потенциально схожи. В группе с превентивным введением низкой дозы BDNF наблюдалось временное восстановление эмоционального статуса к исходным значениям. Кратковременное повышение пассивно-оборонительной тактики поведения животных в «открытом поле», по всей видимости, связано со стрессорным воздействием «водного лабиринта».

Проведенное тестирование животных по методике «открытое поле» показало, что во всех группах происходило снижение ориентировочно-исследовательской активности и защитно-оборонительных поведенческих реакций. Снижение двигательной активности отражало кратковременное развитие пассивно-оборонительной тактики поведения мышей в ответ на стрессорное воздействие «водного лабиринта». В отдаленном периоде наблюдения в интактной группе происходило постепенное восстановление ориентировочно-исследовательской активности к исходным показателям. Показано, что в группе с превентивным введением BDNF в концентрации 40 мкг/кг наблюдалась выраженная тенденция к восстановлению горизонтальной и вертикальной двигательной активности. Ориентировочно-исследовательская активность по показателю реакций принюхивания восстанавливалась к 7 суткам после воздействия ОГБГ. Применение BDNF (4 мкг/кг) способствовало сохранению горизонтальной активности, наблюдалась выраженная тенденция к восстановлению количества актов принюхивания и вертикальных стоек. Следовательно, можно предположить, что BDNF как в высокой, так и низкой концентрации обладает нейрозащитным действием в ответ на воздействие гипоксии и способствует сохранению ориентировочно-исследовательской активности, активируя сложный набор интегрированных поведенческих реакций, отражающих тревожность и стремление исследовать новую территорию.

3.3.3 Влияние BDNF на показатели навигационного научения и долговременной памяти мышей в тесте «Водного лабиринта Морриса»

На следующий день после оценки двигательных и ориентировочно-исследовательских показателей животные тестировались в водном лабиринте Морриса, с перерывом между сеансами в 48 часов. После проведения пяти сеансов навигационного научения были установлены основные стратегии поиска скрытой под водой платформы. Показано, что при первом помещении в водный лабиринт большинство особей выбирали хаотический поиск цели. Животные плавали вдоль стенок бассейна, что можно объяснить врожденной программой поведения - тигмотаксисом. При анализе последующих попыток у мышей наблюдались процессы формирования пространственной памяти. Было установлено, что время нахождения платформы сокращалось, поиск цели становился направленным, как правило, характеризующимся циркулярными и радиальными движениями (рис. 29). После окончания сеансов обучения животные подвергались воздействию острой гипобарической гипоксии. Через сутки после подъема «на высоту» проводилось отсроченное тестирование в водном лабиринте, включающего в себя одиночную попытку длительностью в 60 секунд при отсутствии в бассейне платформы. Для оценки состояния долговременной памяти после воздействия ОГБГ осуществлялся расчет отсроченного коэффициента сохранения (оКс) как доли времени пребывания особи в секторе бассейна, где ранее располагалась платформа, по отношению к общему времени нахождения в водном лабиринте (табл. 3).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рисунок 29. Процесс формирования пространственной памяти у мышей в водном лабиринте Морриса. Показан пример траектории движения особи в бассейне на первом и пятом сеансах обучения

Таблица 3

Значения отсроченного коэффициента сохранения долговременной памяти (оКс) у мышей линии С57BL/6j после воздействия острой гипобарической гипоксии, %

* - достоверное отличие от группы сравнения, # - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Выявлено, что воздействие острой гипобарической гипоксии приводило к нарушению процессов воспроизведения долговременной памяти у мышей при отсроченном тестировании в водном лабиринте. Так, после моделирования ОГБГ наихудший результат продемонстрировала контрольная группа животных с превентивным введением физиологического раствора. Показатели оКс данных особей оказались ниже значений интактных животных и выходили за границы нормы. Применение антигипоксанта Реамберина перед подъемом «на высоту» также не способствовало сохранению долговременной памяти. Доля пребывания в секторе, где ранее находилась платформа, оказалась на нижней границе установленной нормы посещаемости.

Наибольший интерес представляют опытные группы с интраназальным применением BDNF (4 мкг/кг, 40 мкг/кг). Показатели оКс данных групп не только не отличались от значений интактных животных (как в случае с BDNF 4 мкг/кг), но и превышали их в среднем на 5% (BDNF 40 мкг/кг). Наилучший эффект отмечен у особей с превентивным применением высокой дозы BDNF, процент оКс которой статистически достоверно оказался выше показателей групп с инъекцией препарата сравнения и физиологического раствора. Таким образом, можно предположить, что нейротрофический фактор головного мозга обладает нейропротекторным действием. Превентивное применение BDNF (40 мкг/кг) не только предотвращает возможное ухудшение пространственной памяти после воздействия ОГБГ, но и способствует ее закреплению.

Для исследования процессов воспроизведения долговременной памяти после воздействия острой гипобарической гипоксии проводилась оценка изменения стратегии животного в поиске платформы при отсроченном тестировании в водном лабиринте. С помощью пакета программ, разработанных в среде Matlab бассейн был разделен на секторы, и подсчитывалось число посещений каждого из них до момента, когда особь достигала бы платформы, если бы она присутствовала в лабиринте.

При построении графиков посещаемости секторов бассейна, было установлено 3 основных стратегии поиска платформы (табл. 4): Таблица 4

Основные стратегии поиска цели при отсроченном тестировании в водном лабиринте Морриса

1) прямое достижение цели - животное непосредственно направлялось к месту бывшего расположения платформы (время трека составляло 3-10сек); 2) активный поиск - с учетом предыдущего опыта время нахождения платформы невелико (10-20сек); 3) хаотический поиск - отсутствие выраженной стратегии достижения цели (более 20 сек). Таккже встречались особи, которые не нашли бы платформу за все время пребывания в водном лабиринте.

В результате оценки графиков посещаемости секторов бассейна, было показано, что в группе, не подвергшейся ОГБГ, не встречалось животных с неудачным поиском цели (рис. 30). Основной процент особей непосредственно двигались к месту, где ранее располагалась платформа (55,55%) или, опираясь на предыдущий опыт обучения, активно искали ее, осуществляя характерные циркуляторные и радиальные движения (27,7%). 16,7% животных выбирали хаотическую тактику достижения цели.

Рисунок 29. Распределение стратегий поиска цели в группах животных при отсроченном тестировании в водном лабиринте Морриса после воздействия ОГБГ, %

По сравнению с интактными животными в опытных группах после воздействия острой гипобарической гипоксии стратегия поиска платформы существенно изменилась. Так, наибольшее количество животных с внутрибрюшинной инъекцией антигипоксанта Реамберина не опиралось на предыдущий опыт поиска, и применяло хаотическую тактику достижения цели (37,7%) (рис. 30). В группе обнаружены особи с отрицательной попыткой найти платформу (12,5%). Равная доля животных выбирала прямой и активный поиск цели (25%). В контрольной группе с интраназальным введением физиологического раствора по сравнению с другими группами обнаружено наибольшее количество особей с отрицательным результатом поиска платформы (23,26%). Равное число контрольных животных применяли прямую и хаотическую стратегию поиска цели (23,07%). Доля особей, активно искавших платформу, составило 30,7%.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что острая гипобарическая гипоксия вызывает грубые нарушения мнестических функций у мышей, тем самым вызывая смену выбора стратегии нахождения платформы при отсроченном тестировании в водном лабиринте Морриса.

Интраназальное применение нейротрофического фактора BDNF (4 мкг/кг, 40 мкг/кг) перед воздействием ОГБГ способствовало сохранению стратегии поиска платформы в лабиринте. Установлено, что в данных опытных группах направленное перемещение к месту, где ранее располагалась платформа, являлось основной тактикой поведения особей в бассейне. Прямой поиск цели выбрали 55,55% животных с превентивным введением 40 мкг/кг BDNF и 50% особей, получивших 4 мкг/кг BDNF. Доля мышей, использовавших предшествующий опыт обучения в водном лабиринте и избравших тактику активного поиска платформы, оказалась выше значений интактной группы и составила 33,3% (для группы BDNF, 40 мкг/кг) и 37,5% (для группы BDNF, 4 мкг/кг). Небольшой процент особей двигались в бассейне хаотически. Животных с неудачным поиском платформы в обеих группах не обнаружено. Следовательно, превентивное введение нейротрофического фактора снижает негативные последствия острой гипобарической гипоксии и сохраняет мнестические функции у мышей, выбирая при этом оптимальные тактики поиска платформы с наименьшими затратами времени для достижения цели.