Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vitro и in vivo

цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (CREB) является одним из известных молекул-мишеней МАРК и PI-3-киназы. Это важный компонент данных сигнальных путей, ведущий к изменениям в экспрессии генов. Предполагается, что CREB способствует BDNF-опосредованному выживанию нейронов в центральной нервной системе, активируя антиапоптотическую экспрессию генов (Jain V. et al., 2013). Фосфорилирование участка CREB Ser133 нейротрофинами необходимо для активации CREB-активированных транскрипционных факторов (Bonni A. et al., 1999, Inglefield J.R. et al., 2002, Choi J.S. et al., 2003; Arthur J.S.C. et al., 2004).

В недавнем исследовании in vitro нейронов коры головного мозга в условиях циркуляторной гипоксии (гипоксии/ишемии) было показано, что энкзогенное применение BDNF способствует повышению количества выживших кортикальных нейронов после повреждающего воздействия через активацию и MAPK и PI3-киназного сигнальных путей, в то время как p38 MAP механизм в данных процессах не участвует. Также было установлено, что культуры нейронов коры головного мозга способны к активации CREB вне зависимости от добавления нейротрофического фактора в среду культивирования. Однако при аппликации BDNF эффект активации фосфорилирования СREB пролонгируется до 6 часов. В большей части данный процесс связан с внеклеточной сигнал-регулирующей киназой ERK (Sun X. et al., 2008).

В 2012 году в экспериментах in vitro было исследовано действие BDNF на метаболизм кислорода в митохондриях мозга мышей (Markham A. et al., 2012). В случае инкубации с синаптосомами, содержащими пути сигнальной трансдукции, эффект BDNF выражался в концентрационно-зависимом повышении респираторного контрольного индекса (англ. - Respiratory control index, RCI, показатель эффективности дыхательной цепи, синтеза АТФ и целостности органелл). При этом в экспериментах на выделенных митохондриях BDNF не демонстрировал подобного эффекта и усиливал окисление только в случае использования субстратов ферментативного комплекса I. Добавление в эксперимент ингибиторов BDNF, позволило сделать вывод, что митохондриальный эффект BDNF контролируется MAPK сигнальным путем, а ингибитор митохондриального ферментативного комплекса I, ротенон (компонент, вовлеченный в этиологию заболевания Паркинсона), способен in vitro и in vivo ингибировать как митохондриальный, так нейропротективный эффект BDNF. Способность нейротрофина BDNF положительно влиять на метаболические процессы мозга и эффективность утилизации кислорода через MAPK сигнальный механизм с последующей активацией проапоптотического гена Bcl-2 демонстрируют исключительную его важность как компонента нейропротекторного действия (Markham et al., 2004, Wiedemann et al., 2006, Chen A. et al., 2013).

Таким образом, на сегодняшний день существует множество экспериментальных моделей in vivo и in vitro, раскрывающие основные типы и механизмы развития гипоксии, а также пути адаптации клеток и организма в целом к повреждающему действию гипоксии. Интересен тот факт, что в результате связывания с рецептором TrkB и последующей активацией MAPK и PI3-киназного сигнальных путей, нейротрофический фактор BDNF способен повышать выживаемость нейронов в условиях моделирования ишемического состояния. Однако механизмы действия BDNF в условиях гипобарической и нормобарической гипоксии in vivo и in vitro малоизученны. Особый интерес представляет изучение сетевой активности нейронов при действии гипоксии.

1.6 Нейросетевой подход в изучении активности мозга

Нейронная сеть мозга рассматривается многими исследователями, как структурно-функциональная единица, отвечающая за процессы обработки, хранения и воспроизведения информации. Одним из маркеров функционирования нейронной сети является ее спонтанная биоэлектрическая активность, имеющая свои закономерности развития в онтогенезе и при воздействии факторов среды (Gross G.W., Kovalski J.M., 1999, Ham M.I. et al., 2008).

В настоящее время наиболее оптимальной методикой изучения нейрональной активности на сетевом уровне является мультиэлектродная система регистрации внеклеточных потенциалов действия (multielectrode arrays). Применение мультиэлектродной регистрации потенциалов в нейронных сетях имеет почти 30-летнюю историю. В 1972 году Thomas с соавторами опубликовали первую статью об использовании мультиэлектродной матрицы, содержащей 15 электродов, расположенных на расстоянии 100 мкм друг от друга, каждый их которых имел площадь 7 мкм2, для регистрации электрической активности нейронов в культуре клеток заднего рога спинного мозга крысы (Thomas C.A. et al., 1972). Позднее Pine (1980г.) удалось зарегистрировать потенциалы амплитудой около 50 мкВ у единичных нейронов в одно- и трехнедельной культуре, а также стимулировать их импульсами с амплитудой 0,5 V и длительностью 1 мс (Pine J., 1980). В 1986 году Wheeler и Novak использовали 32-электродную матрицу для регистрации электрической активности в срезе гиппокампа (Wheeler B.C., Novak J.L., 1986). Использование этими авторами метода обработки данных «The current source density analysis» показало распространение эпилептиформной активности вдоль среза гиппокампа со скоростью 250 мкм/мс. В 1989 году Gilbert и Pine создали 61-электродную матрицу, основа которой состояла из тонкого стекла и поэтому позволяла изучать структуру нейронных сетей и тканей в инвертированном микроскопе (Regehr W.G. et al., 1989). В 1991 году Chien и Pine использовали мультиэлектродную матрицу Pine lab MEA для регистрации постсинаптических потенциалов при одновременном оптическом имиджинге (voltage-sensitive dye recording) (Chien C.B, Pine J., 1991). В конце 1990-х годов группа японских ученых под руководством Kawana и Taketani создали 64-электродную матрицу для экспериментаов с диссоциированными культурами нейронов и срезами гиппокампа (Kamioka H. et. al., 1997). В настоящее время существует множество разновидностей мультиэлектродных матриц, которые могут быть использованы в различных экспериментах как in vitro, так и in vivo.

Однако изучение пространственно-временных паттернов и динамики спонтанной электрической активности центральной нервной системы в условиях in vivo является сложной задачей. Поэтому для изучения неросетевой активности особую значимость представляет использование мультиэлектродных матриц как субстрата для культивирования диссоциированных культур клеток.

В последние десятилетия изучение диссоциированных клеток нервной системы заняло ведущее место в нейробиологических исследованиях, потеснив работы, проводимые на переживающих срезах, поскольку изолированные и развивающиеся in vitro нервные и глиальные клетки можно считать почти идеальной экспериментальной моделью для решения проблем и приложения различных методов в хроническом эксперименте (Анохин К.В., 2002, Лебедев Р.Д., Бурцев М.С., 2010). Исследование динамики развития спонтанной электрической активности в культуре диссоциированных клеток является одним из ключевых вопросов для понимания формирования нейронных сетей и их значения в пластичности и адаптации (Madhavan R. et al., 2006, Stegenga J. et. al., 2008, Pan L. et. al., 2009). Спонтанная биоэлектрическая активность диссоциированных культур с высокой плотностью клеток отличается склонностью к синхронизации. Гиппокампальные нейроны после нескольких дней культивирования на мультиэлектродной матрице образуют между собой синаптические контакты, о чем свидетельствует генерирование клетками случайных спайков (внеклеточных потенциалов действия) и типичных паттернов электрической активности в виде спайков (Gross G.W., Kowalski J.M., 1999). В зависимости от возраста культуры, условий культивирования, фармакологических воздействий происходит изменение рисунка пачки (Boehler M. et al., 2007, Xiang G. et al., 2007), механизмы которого остаются до их пор не выясненными.

С точки зрения исследователей, использующих данную методику, под сетевой пачечной активностью (англ. - network burst) подразумеваются короткие периоды, в течение которых частота спайковой активности многих клеток, регистрируемая на нескольких электродах, превышает базовый уровень.

Таким образом, сетевая пачечная активность - моментальная пространственно-временная последовательность внеклеточных потенциалов действия (спайков) одного или нескольких нейронов, детектируемая на внеклеточных электродах с короткими межспайковыми интервалами.

Сетевая пачка - пачка внеклеточно регистрируемых спайков характеризуется следующими признаками:

Количество спайков в пачке не менее 4;

Межспайковый интервал не более 100 мс;

Наличие пространственной и временной синхронизации пачечной активности в нейронной сети.

По классификации S. Potter в зависимости от количества внеклеточных электродов, регистрирующих сетевую пачечную активность, различают следующие виды пачек импульсов:

Мини-пачка (англ. - Burstlet), регистрируется на одном электроде;

Комплексная пачка (англ. - network burst), регистрируется одновременно на нескольких электродах (не менее 4). Комплексные пачки подразделяются на несколько подклассов, среди которых в нашей работе были идентифицированы малые пачки (англ. - small burst) и суперпачки (англ. - superburst). Средняя продолжительность малой пачки 300-600 мс. Суперпачки состоят из малых пачек, межпачечный интервал вне последовательностей в 10 раз больше, чем внутри них (Wagenaar D.A. et al., 2006).

В настоящее время мультиэлектродные системы используются в электрофизиологических исследованиях нейронных сетей в наиболее передовых нейробиологических лабораториях мира. В отличие от традиционных электрофизиологических методов применение данной методики имеет ряд преимуществ:

1. Клеточная неинвазивность, отсутствие необходимости помещать электроды вручную;

2. Возможность одновременной регистрации сигналов и стимуляции клеток;

3. Возможность проведения хронических экспериментов (месяцы);

4. Возможность фармакологических манипуляций, в том числе, лекарственный скрининг;

5. Возможность совмещения электрофизиологических методов с методами прижизненной оптической визуализации (в частности, конфокальной лазерной микроскопии).

Совмещение культуры клеток с мультиэлектродной системой регистрации активности нейронов позволяет моделировать в динамике различные стадии развития нейронных сетей, а также может быть использовано для изучения на клеточном и сетевом уровне таких свойств нервной системы, как научение и память (Demarse T.B. et al., 2001, Li Y. et al., 2007).

Экспериментальные данные могут стать основой для проверки существующих теоретических гипотез и математических моделей работы нейронных сетей, что расширяет представления о пластичности ткани мозга и формировании функциональных систем, направленных на достижение адаптивного результата. Кроме того, культивирование клеток различных структур головного мозга на мультиэлектродной матрице дает уникальную возможность исследования изменений морфофункциональных свойств живых нейронов в хроническом эксперименте и поиска соединений, оказывающих нейропротекторный эффект при моделировании различных патологических состояний ЦНС.

Таким образом, с момента открытия нейротрофического фактора головного мозга опубликовано множество работ, однако актуальность изучения данного белка сохранилась и по сей день. Показано, что основные функции, выполняемые BDNF, связаны с взаимодействием этого белка с рецептором TrkB, при котором запускаются сигнальные механизмы, задействованные в различных процессах, происходящих в клетке. BDNF участвует в стимуляции нейрогенеза, повышает выживаемость и стимулирует рост нейронов различного фенотипа и локализации. По некоторым данным BDNF оказывает влияние на синаптическую передачу сигнала и формирование долговременной потенциации, обеспечивая пластичность нервной ткани. Наиболее интересен тот факт, что во взрослом мозге нейротрофический фактор головного мозга принимает участие в защитных механизмах при ишемическом повреждении нервной ткани. Однако данные клинических наблюдений и экспериментальных работ по данному направлению противоречивы, поэтому необходимы дальнейшие исследования in vitro и in vivo с целью более полного раскрытия механизмов нейропротекторных эффектов BDNF, по мере изучения, которых, будет появляться возможность разработки новых лекарственных средств. Кроме того, не менее интересным и неизученным является вопрос о роли BDNF как нейромодулятора или нейротрансмиттера в синаптической передаче импульсов. Раскрытие механизмов участия BDNF в информационных процессах позволит прояснить его роль в таких высших функциях ЦНС, как научение и память.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объект исследования

Материалом для исследований in vitro служили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученных от 18 дневных мышиных эмбрионов линии C57BL/6. С целью регистрации основных электрофизиологических показателей активности нейронных сетей культивирование клеток проводилось на мультиэлектроных матрицах MED64 (Alfa Med Science, Япония) и MEA60 (Multichannel Systems, Германия). Для оценки жизнеспособности после моделирования нормобарической гипоксии культивирование диссоциированных клеток проводилось на покровных стеклах размером 18x18 мм.

В опытах in vivo использовались половозрелые самцы мышей линии C57BL/6 в количестве 58 особей, массой 16-18 грамм.

Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с Этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России.

2.2 Схема экспериментов

2.2.1 Схема экспериментов in vitro

В первой серии экспериментов in vitro исследовалось влияние различных концентраций BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур клеток гиппокампа при добавлении нейротрофина в среду культивирования. Посадку диссоциированных культур осуществляли на 64-электродных матрицах. Регистрацию внеклеточных потенциалов действия проводили с помощью установки MED64 (Alpha Med Science, Япония) при стандартных условиях культивирования в инкубаторе. BDNF апплицировали на 7-й, 14-й и 21-й день развития in vitro (DIV). В первой группе культур BDNF добавляли в культуральную среду в концентрации 0,1 нг/мл, во второй группе - 1 нг/мл, третьей группе - 10 нг/мл. В качестве контроля использовали соответствующие концентрации раствора альбумина в фосфатно-солевом буфере - Phosphate Buffered Saline (PBS). Повторная 10-минутная регистрация спонтанной биоэлектрической активности осуществлялась через 24 часа после добавления исследуемых веществ (табл. 1).

Таблица 1

Распределение экспериментальных групп по сериям in vitro

Серия	Название группы	Период исследования	Количество диссоциированных культур
Влияние BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур гиппокампа	Контроль (Аlb+РBS)	7, 14, 21 DIV	27
	BDNF, 0,1 нг/мл		27
	BDNF, 1 нг/мл		27
	BDNF, 10 нг/мл		12
Антигипоксические свойства BDNF при моделировании острой нормобарической гипоксии	Нормоксия	33 - 40 DIV	28
	Гипоксия контроль (без BDNF)		28
	Гипоксия + BDNF, 1 нг/мл		28

Вторая серия экспериментов проводилась на зрелых диссоциированных культурах клеток гиппокампа (33 DIV) и заключалась в изучении антигипоксического и нейропротекторного действия BDNF при моделировании нормобарической гипоксии in vitro (табл. 1). Регистрация спонтанной биоэлектрической активности проводилась с помощью 60-электродных матриц и соответствующей установки MЕА60 (Multichannel Systems, Германия) в условиях нормоксии, в период 10 минутного острого эпизода гипоксии, через 120 минут после реоксигенации, а также в течение последующих 7 суток постгипоксического периода. Опытной группе за 20 мин до воздействия проводили аппликацию BDNF в концентрации 1 нг/мл. Оценка жизнеспособности 48 культур осуществлялась до моделирования нормобарической гипоксии, на 3 и 7 сутки постгипоксического периода.

2.2.2 Схема экспериментов in vivo

До моделирования осрой гипобарической гипоксии проводилась оценка параметров двигательной активности и ориентировочно-исследовательской рефлекторной деятельности животных в тесте «открытое поле». На следующий день после тестирования начинались сеансы навигационного научения и формирования долговременной пространственной памяти, с перерывом в 48 часов. Через 24 часа после окончания пятого сеанса обучения в «водном лабиринте Морриса» животные подвергались влиянию острой гипобарической гипоксии (ОГБГ). Предварительно за 40 мин до подъема «на смертельную площадку» животным проводили интраназальное введение BDNF в дозе 4 мкг/кг и 40 мкг/кг. Контрольной группе интраназально вводили физиологический раствор, группе сравнения - внутрибрюшинно известный препарат антигипоксического действия Реамберин (150 мг/кг) в качестве препарата сравнения.

Через 24 часа после ОГБГ выжившим животным в тесте «лабиринт Морриса» определяли отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти, в тесте «открытое поле» оценивали двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую рефлекторную деятельность с повтором на 7 и 14 сутки после ОГБГ.

В интактной группе проводили тестирование двигательной и ориентировочно-исследовательской активности в тесте «открытое поле» и навигационного научения в «лабиринте Морриса» без подъема «на смертельную площадку» в теже периоды времени (табл. 2).

Таблица 2

Распределение экспериментальных групп в исследованиях in vivo

Серия	Название группы	Тест «Открытое поле»	Тест «Водный лабиринт Морриса»	ОГБГ	Количество животных
Антигипоксические свойства BDNF при моделировании острой гипобарической гипоксии (ОГБГ)	Интактные	+	-	-	14
	Контроль (NaCl 0,9% раствор)	+	+	+	14
	Группа сравнения (Реамберин, 150 мг/кг)	+	+	+	10
	BDNF, 4 мкг/кг	+	+	+	10
	BDNF, 40 мкг/кг	+	+	+	10

2.3 Методы культивирования диссоциированных клеток гиппокампа

2.3.1 Подготовка мультиэлектродных матриц и покровных стекол

Перед посадкой первичных культур матрицы с электродами промывались в дистиллированной воде в течение 2 минут, а затем 2 часа выдерживались в 0,25% растворе трипсина (Gibco 25200-056) для очистки от адгезированных на них нейрональных клеток после предыдущей посадки клеток. После этого мультиэлектродные матрицы стерилизовались в течение получаса под ультрафиолетом. Стерилизация покровных стекол проводилась в сухожаровом шкафу при температуре 140оС в течение 90 минут. Затем матрицы с электродами и стекла покрывались положительно заряженным гидрофильным веществом - полиэтиленимином (ПЭИ) (Sigma Р3143) для повышения адгезии клеток на их поверхность, после чего несколько раз промывались стерильной деионизированной водой.

2.3.2 Культивирование диссоциированных клеток гиппокампа

Эвтаназия беременной мыши на 18 день гестации (Е18) проводилась путем дислокации шейных позвонков. Матка с эмбрионами извлекалась из брюшной полости и помещалась в стерильную чашку Петри с раствором Хэнкса (Биолот X-12-05). Далее все процедуры выполнялись в стерильных условиях.

После промывания матки в растворе Хэнкса, производили извлечение эмбрионов. В результате хирургических манипуляций под бинокуляром извлекали головной мозг с последующим отделением гиппокампа из полушарий каждого из эмбрионов.

Выделенные гиппокампы подвергались механическому измельчению, затем суспензию помещали в 0,25% раствор трипсина на 20 минут с целью разрушения связей между клетками. Затем ткань несколько раз промывалась фосфатно-солевым буфером PBS (Gibco 70011-051), суспензировалась в питательной среде, состоящая из 92,5% нейробазальной среды (NeurobasalTM (Invitrogen 21103-049)), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS (ПанЭко К055)), 2% биоактивной добавки B27 (Invitrogen 17504-044), 0,5% глутамина (L-glutamin (Invitrogen 25030-024)) и центрифугировалась в течение 1-2 мин при 1500 об/мин. Надосадочная жидкость удалялась, осадок подвергался ресуспензированию, после чего диссоциированные культуры были готовы к посадке. Суспензию клеток раскапывали по 30 мкл в центр матрицы или стекла, инкубировали в течение 2 часов для лучшего прикрепления клеток к субстрату, после чего в каждую культуру добавляли 1,5 мл питательной среды. Исходная плотность клеток составляла 9000 кл/мм2 согласно разработанному протоколу (Мухина И.В. и cоавт., 2009, Vedunova M.V. et al., 2013).

2.3.3 Поддержание жизнеспособности первичных культур гиппокампа

Жизнеспособность диссоциированных культур гиппокампа поддерживали в условиях СО2-инкубатора (MCO-18AIC, Sanyo) при температуре 35,5оС и газовой смеси, содержащей 5% СО2. На следующий день после посадки 30% культуральной среды заменялась на среду с меньшим содержанием сыворотки (94,5% Neurobasal, 4% B27, 1% L-glutamin, 0,5% FCS). В дальнейшем замена питательной среды проводилась по мере ее закисления в культуре (в среднем раз в 3 дня).

2.4 Мультиэлектродные методы исследования спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети гиппокампа in vitro

2.4.1 Мультиэлектродная матрица MED64 системы (Alfa MED Science, Япония)

Мультиэлектродная матрица MED64 основана на технологии плоских микроэлектродов, позволяет стимулировать и делать долговременную запись внеклеточных потенциалов нейронов первичной культуры гиппокампа. Благодаря небольшому импедансу микроэлектродов регистрация биоэлектрической активности осуществляется с низким уровнем шума (3-5 мкВ). Массив микроэлектродов содержит многослойные нанопластины, через которые передаются сигналы нейронов к усилителю (рис. 3).

Рисунок 3. Общий вид зонда с электродами, расположение электродов на мультиэлектродной матрице MED64 (Alfa Med Science, Япония) и их структура

Система MED64 состоит из четырех компонентов: усилитель, зонд с матрицей электродов, коннектор, и набор программного обеспечения Conductor™ для регистрации и анализа данных. Стеклянное основание зонда (50x50x0,7мм) содержит цилиндрическую камеру диаметром 22 мм и высотой 5 мм, в центре которой на площади 1 мм2 расположена 64-электродная матрица для регистрации спонтанной активности и электрической стимуляции нейронов. Квадратные микроэлектроды состоят из прозрачного оксида индия и олова (Indium Tin Oxide, ITO), покрытого черной платиной. Размер электродов - 50х50 мкм, межэлектродное расстояние - 150 мкм. Изолирующее покрытие - полиакриламид.

2.4.2 Мультиэлектродная матрица MEA60 системы (Multichannel Systems, Германия)

Аналогом системы MED64 является мультиэлектродная матрица MEA60 (Multichannel Systems, Германия) (рис. 4), состоящая из 60 планарных круглых электродов, каждый диаметром 30 мкм, с межэлектродным расстоянием 200 мкм.



Рисунок 4. Общий вид установки MEA60 (Multichannel Systems, Германия). 1 - общий вид матрицы MEA60; 2 - расположение электродов на матрице MEA60; 3 - усилитель MEA1060-Inv-BC; 4 - термоконтроллер; 5 - USB MEA-128; 6 - персональный компьютер

Электроды сделаны из нитрида титана и изолированы нитридом кремния, что позволяет MEA60 подвергать стерилизации при высоких температурах (125оC) перед посадкой культур и использовать их длительное время.

В возбужденном состоянии нейроны создают потоки ионов через мембраны, изменяя напряжение внутри и снаружи клетки. При регистрации электрической активности нейронов, электроды на матрицах преобразовывают изменение напряжения окружающей среды (ионные потоки), в потоки, переносимые электронами (электрический ток). При регистрации электрической активности, амплитуда потенциала на электроде обратно зависит от расстояния электрода до продуцирующей потенциал клетки.

2.4.3 Регистрация и анализ спонтанной биоэлектрической активности

Регистрация спонтанной биоэлектрической активности проводилась с использованием мультиэлектродной системы MED64 и MEA60 при стандартных условиях окружающей среды: температуре 35,5оС, газовой смеси, содержащей 5% СО2, 100% влажности. Для получения и первичного анализа данных использовался набор программного обеспечения Conductor™ (Alpha Med Science, Япония) и MC RackTM (Multichannel Systems, Германия).

Анализ сетевой активности нейронов проводился с использованием разработанного в программной среде MATLAB оригинального пакета алгоритмов MEAMAN (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2012611190).

Детектирование спайков (внеклеточных потенциалов действия) осуществляли по следующему алгоритму: выбиралась граница, равная 8у, где у - среднеквадратичное число. При условии превышения амплитудой спонтанной активности данного порога, событие считалось спайком, если не превышало, активность распознавалась как шум и не учитывалась при анализе данных.

Исследовались основные характеристики спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети: количество малых сетевых пачек в записи; количество спайков в пачке; длительность малой пачки импульсов, с. Критерием малой сетевой пачки являлось наличие спайков минимум на 4-х различных электродах матрицы с межспайковым интервалом не более 100 мс (Pimashkin et al., 2011).

Дополнительно для характеристики функциональной структуры сетевой активности был проведен анализ последовательности спайков внутри вызванной пачки, обусловленых сложной сетевой динамикой, способной варьироваться в разных пачках. Времена возникновения спайков в сетевой пачке обладают меньшей вариабельностью от стимула к стимулу, чем последующая активность в пачке. Исходя из этого, были изучены паттерны активации - времена возникновения первых спайков после стимула. Для анализа функциональных характеристик всех регистрируемых клеток был проведён следующий анализ паттернов активации. Для каждой пачки был определён 64-х мерный паттерн активации - время первого спайка на каждом электроде после временной точки , равное времени начала пачки (Рис. 5).



Рисунок 5. Схематическое изображение паттерна активации (Pimashkin et al., 2011). A - Штрихами обозначены времена спайков на различных электродах, красным отмечены первые спайки в пачке, формирующие паттерн активации; Б - пример паттернов активации малых сетевых пачек в составе суперпачки

2.5 Экспериментальное моделирование гипоксии in vitro

2.5.1 Моделирование нормобарической гипоксии in vitro

Моделирование нормобарической гипоксии проводилось на 33 день развития культуры in vitro (DIV) путем замены нормоксической культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода в течение 10 минут. В опытных группах за 20 минут до гипоксии в культуральную среду добавляли BDNF в конечной концентрации 1 нг/мл. В контрольную группу вошли культуры, которым гипоксия проводилась без превентивного добавления нейротрофического фактора.

Для получения культуральной среды с обедненным содержанием кислорода использовался герметичный сосуд, в котором воздух был замещен на инертный газ - аргон. Аргон способен вытеснять кислород из жидкостей, так как имеет большую растворимость, чем кислород. По своим химическим свойствам аргон не способен вступать в химические реакции, что обеспечивает идеальные условия для проведения эксперимента.

Для приготовления среды с низким содержанием кислорода использовалась установка, представленная на рисунке 6.

Из баллона с инертным газом по газоотводной трубке, на конце которой находилась игла, под давлением 1-1,5 МПа аргон проходил через культуральную среду в герметичном сосуде. Для того, чтобы в сосуде не накапливалось избыточное давление, выше уровня жидкости находился конец второй газоотводной иглы, которая была соединена с выходящей газоотводной трубкой (Ведунова М.В. c cоавт., 2012, Ведунова М.В. c cоавт., 2013).

Для оценки эффективности вытеснения кислорода из культуральной среды определяли концентрацию растворенного кислорода методом йодометрического титрования (Лурье Ю.Ю., 1973).

Рисунок 6. Установка для приготовления культуральной среды с низким содержанием кислорода. 1- баллон с газом (аргоном), 2 - кран газового баллона, 3- редуктор, 4,9 - газовые шланги, 5 - игла для приведения газа, 6 - сосуд для обработки среды, 7- культуральная среда, 8 - газоотводная игла

Метод Винклера основан на способности гидроксида марганца (II) окисляться в щелочной среде до гидроксида марганца (IV), количественно связывая при этом кислород. В кислой среде гидроксид марганца (IV) снова переходит в двухвалентное состояние, окисляя при этом эквивалентное связанному кислороду количество йода. Выделившийся йод оттитровывают раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала в качестве индикатора.

MnCl2 + 2 NaOH = Mn(OH)2 + NaCl,

2 Mn(OH)2 + O2 + 2 H2O = 2 Mn(OH)4,

Mn(OH)4 + 2 H2SO4 + 2KI = I2 + 4H2O + MnSO4 + K2SO4,

I2 + 2Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6

Точность метода составляет ±0,1 мг/л (Лурье Ю.Ю., 1973).

Поскольку в среде содержится ph-зависимый краситель, конечную точку титрования определяли с помощью спектрофотометра Synergy MX (BioTek).

Исходное содержание растворенного кислорода в культуральной среде, определяемое по методу Винклера, составило 4,66 мг/л (3,26 мл/л). После 10-минутной обработки аргоном при помощи предложенной установки содержание кислорода снижалось до 0,53 мг/л (0,37 мл/л), что составляет 10% от исходного значения (Ведунова М.В. c cоавт., 2012, Ведунова М.В. c cоавт., 2013).

2.5.2 Оценка выживаемости нейронов после воздействия нормобарической гипоксии in vitro

Оценка жизнеспособности клеток проводилась в период нормоксии (33 DIV), на 3-и (36 DIV) и 7-е (40 DIV) сутки постгипоксического периода.

Для изучения жизнеспособности при моделировании кратковременной нормобарической гипоксии проводили окраску клеточных культур пропидий иодидом (Sigma 81845-25MG) и бис-бензимидом (Sigma 14530-100MG) с целью обнаружения погибших клеточных ядер и общего количества клеток в диссоциированной культуре соответственно. При возбуждении длиной волны 488 нм пропидий иодид флуоресцирует в красном диапазоне видимого спектра, максимум эмиссии составляет 562-588 нм. Максимум поглощения бис-бензимида составляет 350 нм, а эмиссии в диапазоне 510-540 нм.

Визуализация окрашенных клеток проводилась с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа DMIL HC (Leica, Германия) с подсчетом числа клеточных ядер, окрашенных пропидий иодидом и ядер, окрашенных бис-бензимидом. Количество живых клеток рассчитывалось как процентное соотношение между бис-бензимид позитивными и пропидий иодид позитивными клетками (Ведунова М.В. c cоавт., 2012, Ведунова М.В. c cоавт., 2013).

2.6 Экспериментальное моделирование гипоксии in vivo

2.6.1 Моделирование острой гипобарической гипоксии in vivo

Для моделирования острой гипобарической гипоксии использовалась вакуумная проточная барокамера. Внешняя температура воздуха составляла 20--22оС. За 40 мин до подъема на высоту проводилось интраназальное введение BDNF в дозе 4 мкг/кг и 40 мкг/кг. Контрольной группе интраназально вводили физиологический раствор, группе сравнения - внутрибрюшинно Реамберин (150 мг/кг).

Затем мыши помещались в герметичную камеру, в которой подвергались условиям, соответствующие подъему на высоту «смертельной площадки» 10000--10500 м (170-185 мм рт. ст.) со скоростью 183 м/c (Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств, 1990). Особи находились на «смертельной площадке» в течение 10 минут либо до появления второго агонального вдоха, после чего животных подвергали немедленному «спуску» с моделируемой высоты.

2.6.2 Методы оценки антигипоксического действия BDNF при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo

2.6.2.1 Оценка выживаемости животных в условиях острой гипобарической гипоксии

При моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo проводилась регистрация следующих параметров:

1. Время жизни (Тж, мин) на «смертельной площадке» - отсчитывается от момента подъема на площадку до наступления летального исхода, либо появления второго агонального вдоха;

2. Время потери позы (Тпп, мин) - период от начала подъема в барокамере до момента, когда животное принимает боковое положение и утрачивает способность поддерживать позу;

3. Время восстановления позы (Твп, мин) - период времени от остановки дыхания до момента, когда животное при немедленном «спуске» на землю снова приобретает способность стоять на конечностях.

4. При моделировании ОГБГ в популяции животных отмечались особи низкоустойчивые к гипоксии (НУ) с Тж менее 3 мин, среднеустойчивые (СУ) с Тж от 3 до 9 мин и высокоустойчивые (ВУ), которые выживают на «смертельной площадке» более 9 мин без видимых проявлений гипоксического повреждения.

5. Эффективность антигипоксических свойств (коэффициент защиты, Кз) нейротрофического фактора BDNF оценивали по изменению времени жизни опытных животных на «смертельной площадке» относительно времени жизни контрольных животных (Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств, 1990).

Оценка Кз проводилась по формуле:

Кз=(а/б+1)/(в/д+1), где:

«а» и «б» - число выживших животных в опыте и контроле;

«в» и «д» - общее число животных в группах.

2.6.2.2 Поведенческие тесты

Тест «Открытое поле». Установка для теста «Открытое поле» представляет собой круглую камеру диаметром 90 см с пластиковыми стенками высотой 28 см. Пол изготовлен из белого пластика, на нем черной краской нанесена решетка, делящая его на 25 равных квадратов со стороной 15 см. Лампы накаливания (4 лампы по 75 Вт) располагаются по кругу диаметром 60 см на высоте 80 см от поверхности поля. Освещенность площадки во время опыта 200 Лк. Животное помещалось в центральный квадрат и над ним велось автоматическое наблюдение с помощью видеокамеры. Визуально подсчитывалось количество отдельных поведенческих актов.

С целью определения ориентировочно-исследовательской активности животных в «открытом поле» регистрировались следующие показатели поведенческой активности мышей: горизонтальная двигательная активность (ГДА) - число пересеченных квадратов в «открытом поле»; вертикальная двигательная активность (ВДА) - число стоек - подъемов на задние лапы. Также отмечались реакции принюхивания, замирания, верчения, пячения, акты груминга и дефекации (Буреш Я. с соавт., 1991).

Метод исследования навигационного научения и долговременной памяти в тесте «Водный лабиринт Морриса». Лабиринт представляет собой циркулярный бассейн (диаметром 90 см), заполненный непрозрачной водой, в которую погружена небольшая платформа (диаметром 10 см), не видимая животному.

Протокол теста состоял из пяти сеансов обучения, по пять попыток в каждом. Сеансы проводились в одно и то же время через 48 часов. Помещение животных с края бассейна в течение всего эксперимента производилось в одном и том же секторе лабиринта, выбранного случайным образом. Максимальная длительность первого сеанса составляла 90с. В том случае, если животное не могло самостоятельно найти платформу, экспериментатор помогал ему. После обнаружения платформы, животное находилось на ней 30с. Последующие 4 сеанса по продолжительности составляли 60с. В случае не обнаружения платформы, животное вынималось из бассейна и находилась за границами лабиринта в течение 30с. Расположение платформы за все время проведения теста не менялось и находилось в противоположном от запуска животного секторе на границе зоны тигмотаксиса.

После окончания обучения животные подвергались условиям острой гипобарической гипоксии. Повторное тестирование на сохранение следов долговременной памяти проводили через 24 часа после острой гипоксии. Тест состоял из одной пробы длительностью 60 с. При этом платформа в лабиринте отсутствовала. Траектория движения животного фиксировалась с помощью установки для видеорегистрации объектов. Анализ данных выполнялся с помощью разработанного в программной среде Matlab оригинального пакета алгоритмов MouseTrack и Traceman. При оценке результатов значимыми считались следующие показатели: время достижения платформы, траектория свободного плавания при поиске платформы.

Кроме того, для каждой группы животных рассчитывался отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти (оКс). оКс - доля времени пребывания мыши в квадранте, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания особи в «водном лабиринте Морриса». При этом считается нормой, если животное провело в квадранте, где находилась платформа, около 23-27% общего времени пребывания в лабиринте (D'Hooge R. and De Deyn P.P., 2001).

2.7 Методы статистической обработки результатов

Результаты, полученные in vivo и in vitro, обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel и SigmaPlot 11.0. Данные представлены в форме «среднее значение ± стандартная ошибка среднего». Проверка гипотезы о нормальном распределении проводилась с применением критерия Пирсона, который не зависит ни от вида распределения случайной величины, ни от ее размерности. Достоверность статистических различий выборок, имеющих нормальное распределение, проверялась с помощью t-теста Стьюдента. Различия между выборками, имеющим распределение, отличающееся от нормального, оценивались с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни в программе SigmaPlot 11.0, ANOVA. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05 (Гланц С., 1999).

3ю РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Влияние нейротрофического фактора головного мозга на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей диссоциированных культур клеток гиппокампа на разных этапах развития in vitro

3.1.1 Влияние BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур гиппокампа на 7 день развития in vitro

На 3-4 день развития in vitro спонтанная биоэлектрическая активность представляла собой последовательность спонтанных внеклеточных потенциалов действия (спайков) длительностью 1,5 мс и амплитудой 25±2,4 мкВ, регистрируемых на 64 электродах мультиэлектродной матрицы MED64 (Alfa MED Science, Япония) (рис. 7).

Рисунок 7. Пример записи спонтанной биоэлектрической активности, регистрируемой с 1 электрода мультиэлектродной матрицы MED64 (Alfa MED Science, Япония): А - запись на 4 день развития культуры in vitro; Б - запись на 5 день развития культуры in vitro; В - запись мини-пачек на 7 день развития культуры in vitro; Г - запись сетевых пачек с 4-x электродов на 7 день развития культуры in vitro

На 7-й день развития диссоциированных культур клеток гиппокампа in vitro происходило формирование сетевой пачечной активности, представленной в виде последовательности спайков, возникающих на разных электродах матрицы с коротким интервалом следования (1-50 мс) (рис. 7 В). Промежуток времени между окончанием одной сетевой пачки и возникновением другой варьировал от 5 до 20 сек.

На 7-й DIV в среду культивирования добавляли нейротрофический фактор BDNF в конечной концентрации 0,1 нг/мл и 1 нг/мл. Контрольной группе культур осуществлялась аппликация раствора альбумина в PBS. Регистрацию спонтанной биоэлектрической активности проводили в исходном состоянии, в течение 30 минут после добавления веществ и через 24 часа.

В результате проведенного исследования было показано, что в ответ на аппликацию BDNF спонтанная биоэлектрическая активность не изменялась как в течение 30 минут поле воздействия, 2 часов, так и через 24 часа. Установлено, что параметры «количество малых сетевых пачек/5 мин», «количество спайков в сетевой пачке», «длительность малой cетевой пачки импульсов» статистически достоверно не отличались от исходного уровня как в контрольной, так и в опытных группах (рис. 8 А, Б, В).

Однако седует отметить, что при анализе структуры индивидуальной сетевой активности, определяемой по паттерну активации нейронов в сети, было обнаружено увеличение доли нейронов, активирующихся при распространении возбуждения в сети с временем активации не более 100 мс. В результате паттерн активации сетевой активности после добавления в среду BDNF отличался от контрольных значений (рис. 9) даже через сутки после воздействия.

Таким образом, аппликация нейротрофического фактора BDNF (0,1 нг/мл, 1 нг/мл) в раннем периоде развития нейронных сетей на 7 DIV не вызывала активацию спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа, но влияла на перераспределение активации нейронов в составе нейронных сетей культуры диссоциированных клеток гиппокампа.

Эффект длился не менее 1 суток.

Рисунок 8. Влияние нейротрофического фактора BDNF на (А) количество малых сетевых пачек/5 мин; (Б) количество спайков в сетевой пачке; (В) длительность малой cетевой пачки импульсов на 7 день развития культуры in vitro. * - статистически значимые различия с исходным уровнем активности, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

Ранее в лаборатории клеточных технологий ЦНИЛ НижГМА было показано, что на 7 DIV в нейронной сети первичнй кулльтуры гиппокампа среди межклеточных контактов преобладают электрические синапсы, химические синаптические контакты единичны (Широкова с соавт., 2013). Поскольку предполагается, что действие нейротрофического фактора на спонтанную биоэлектрическую активность опосредовано влиянием сигнальной системы BDNF/TrkB не только на специфические Na+-ионные каналы (Nav1.9) (Rose C.R. et al., 2004), но и на постсинаптические NMDA- и GABA-рецепторы, экспрессирующиеся в химических синапсах, нейротропный эффект BDNF на биоэлектрическую активность нейронов не может реализоваться на раннем этапе развития нейронной сети по причине отсутствия полноценных химических синапсов.

Рисунок 9. Паттерн активации спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур гиппокампа в сетевой пачке (DIV 7). Слева - активность культур до аппликации, справа - через 24 часа после аппликации. А - контрольная культура (раствор альбумина в PBS); Б - BDNF, 0,1 нг/мл; В - BDNF, 1нг/мл. Цветовая диаграмма - время появления спайков в сетевой малой пачке, регистрируемых с различных электродов, мс

3.1.2 Влияние BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур клеток гиппокампа на 14 день развития in vitro

На 14 день развития in vitro в среду культивирования в опытных группах добавляли нейротрофический фактор BDNF в конечной концентрации 0,1 нг/мл, 1 нг/мл и 10 нг/мл, а в контрольной группе - раствора альбумина в PBS. Регистрацию спонтанной биоэлектрической активности осуществляли до аппликации веществ, в течение 20 минут после добавления, через 2 и 24 часа.

В результате проведенного исследования было показано, что при добавлении в среду культивирования нейротрофического фактора BDNF происходят изменения спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур. Наиболее значимые изменения были выявлены при анализе длительности малой сетевой пачки импульсов (рис. 10). Так, обнаружено, что на временном промежутке 15-20 минут после добавления в среду культивирования BDNF, 0,1 нг/мл данный показатель достоверно (p<0,05) увеличился по сравнению с исходным уровнем в среднем на 70% (от 0,65±0,16 с до 1,11±0,19 с). Кроме того, длительность малой сетевой пачки достоверно (p<0,05) возросла относительно активности контрольных культур. Однако нейротропный эффект носил транзиторный характер (не менее 20 минут), и через 2 часа после аппликации BDNF спонтанная биоэлектрическая активность возвращалась к исходным значениям и не отличалась от активности контрольных культур, получавших раствор альбумина.

Схожая динамика изменений спонтанной биоэлектрической активности наблюдалась в группе первичных культур гиппокампа с применением BDNF в концентрации 1 нг/мл (рис. 10).



Риунок 10. Влияние нейротрофического фактора BDNF на (А) количество малых сетевых пачек/5 мин; (Б) количество спайков в сетевой пачке; (В) длительность малой cетевой пачки импульсов на 14 день развития in vitro. * - достоверность различий с исходным уровнем; # - достоверность различий с контрольной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

Однако эффект действия нейротрофического фактора в данной концентрации был более выражен и проявлялся в более ранний период по сравнению с культурами, получавшими BDNF, 0,1 нг/мл. Через 10-15 минут длительность малой сетевой пачки была достоверно больше (p<0,05) как относительно исходной активности, так и от активности контрольных культур и культур с аппликацией BDNF, 0,1 нг/мл. На 20 минуте регистрации спонтанной биоэлектрической активности длительность пачки в среднем достоверно (p<0,05) превысила исходные значения на 83% (с 0,698±0,09 с до 1,286±0,21 с), но уже не отличалась от значений, полученных в группе с меньшей концентрацией BDNF. Через 2 и 24 часа после добавления нейротрофина спонтанная биоэлектрическая активность группы культур BDNF, 1 нг/мл статистически не отличалась от первоначальных и контрольных значений.

При оценке длительности малой сетевой пачки в группе с добавлением в среду культивирования BDNF, 10 нг/мл показано, что к 10-15 минуте (рис. 9) наблюдения обнаружено статистически достоверное (p<0,05) увеличение длительности малой сетевой пачки как относительно исходных, контрольных значений, так и значений, полученых при аппликации BDNF, 0,1 нг/мл, но не относительно значений, регистрируемых при аппликации BDNF, 1 нг/мл. Таким образом, повышение концентрации BDNF в 10 раз не вызвало дальнейшего увеличения длительности малой пачки. Таким образом, нейротропное действие BDNF в концентрации 1 нг/мл и 10 нг/мл было одинаковым и превышающим эффект от влияния BDNF, 0,1 нг/мл.

Нейротропный эффект BDNF длился кратковременно и через 2 часа после добавления нейротрофического фактора в различных концентрациях активность нейронных сетей возвращалась к исходному уровню, статистически достоверных различий относительно исходной активности и активности контрольных культур не было обнаружено.

Кроме этого, аппликация различных концентраций нейротрофического фактора приводила к изменениям функциональных характеристик сетевой пачки импульсов, отражающих индивидуальную структуру нейронной сети диссоциированных культур клеток гиппокампа. В отличие от контрольной группы культур, в которой добавление альбумина на 14 DIV не вызывало изменения интегративного показателя автивности функциональной сети - «паттерна активации», в опытных группах аппликация BDNF (0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 10 нг/мл) вызывала изменение внутренней структуры функциональной нейронной сети. Добавление в среду культивирования нейротрофического фактора повышало, вероятно, эффективность синаптической передачи, что приводило к увеличению количества нейронов, время активации которых было не более 50 мс. Подобная синхронизация нейронов в сети наблюдалась через 24 часов после аппликации (рис. 11).

Рисунок 11. Паттерн спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур гиппокампа (DIV 14). Слева - активность культур до аппликации, справа - через 24 часа после аппликации. А - контрольная культура; Б - BDNF, 0,1 нг/мл; В - BDNF, 1 нг/мл; Г - BDNF, 10 нг/мл. Цветовая диаграмма - время появления спайков в сетевой малой пачке, регистрируемых с электродов, мс

Следует отметить, что степень синхронизации спайков зависела от концентрации добавляемого нейротрофического фактора. Наибольший эффект был отмечен при применении BDNF (10 нг/мл), на большинстве электродов время появления спайков в сетевой пачке было не более 15 мс.

Таким образом, в результате аппликации нейротрофического фактора BDNF на 14 DIV происходило изменение спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа, регистрируемое по увеличению длительности малой сетевой пачки импульсов при отсутствии изменения в количестве спайков в пачке. В зависимости от концентрации добавляемого в среду культивирования нейротрофина, увеличение длительности малой сетевой пачки развивалось в течение 15 минут в случае применения BDNF в концентрации 1 нг/мл и 10 нг/мл и 20 минут в случае применения BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Кроме того, изменения происходили в структуре и функциональных характеристиках самой сетевой пачки импульсов. Аппликация различных концентраций BDNF дозо-зависимо приводила к общей синхронизации работы нейронных сетей, за счет снижения времени активации нейронов при развитии сетевой пачки.

Ранее (Агрба, Мухина, 2013, Широкова с соавт., 2013) было показано, что 14 день развития диссоциированных культур клеток гиппокампа in vitro высокой плотности характеризовался началом развития зрелых популяций синапсов с преобладанием аксошипиковых и аксодендритных асимметричных контактов между близлежащими нейронами и формированием сетевой пачечной активности с варьируемой частотой следования сетевых пачек импульсов. Поскольку изменение спонтанной биоэлектрической активности в ответ на добавление нейротрофического фактора развивалось только на 14 DIV при появлении зрелых химических синапсов и не в течение секунд, а в течение 10-15 минут и длительностью не менее 10 минут, следует предположить, что полученный положительный нейротропный эффект является медленным TrkB-зависимым и обусловлен, вероятно, непрямой активацией постсинаптических AMPA-, NMDA- и GABAа-рецепторов (Caldeira M.V. et al., 2007, Porcher C. et al., 2011), а также, возможно, специфических Na+-ионных каналов (Nav1.9) (Rose C.R. et al., 2004).

3.1.3 Влияние BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур гиппокампа на 21 день развития in vitro

21 день развития in vitro является заключительным этапом формирования синаптичских контактов и нейронной сети в первичной культуре гиппокампа при плотности клеток не менее 1500 - 2000 кл/мм2. Спонтанная биоэлектрическая активность диссоциированных культур клеток гиппокампа на данном сроке развития становится стабильной и представлена в виде регулярных сетевых пачек импульсов длительностью 0,15-0,35 с и межпачечным интервалом 5-7 с. В последующие дни культивирования (до 40 дня) активность сети сохранялась стабильной, позволяющей рассматривать данный период культивирования как период работы зрелой нейронной сети первичной культуры гиппокмпа.

Поскольку в предыдущих экспериментах по исследованию дозо-зависимости не было выявлено различий в эффекте действия BDNF в концентрации 1 нг/мл и 10 нг/мл, в последующих сериях мы использовали BDNF только в концентрациях 0,1 нг/мл и 1 нг/мл.

Добавление на 21 DIV в среду культивирования нейротрофического фактора BDNF в концентрации 0,1 нг/мл и 1 нг/мл приводило к активации спонтанной биоэлектрической активности культур диссоциированных клеток гиппокампа только при аппликации BDNF в концентрации 1 нг/мл. При этом время начала увеличения длительности пачки сдвинулось с 10 мин до 20 мин (рис. 12).



Рисунок 12. Влияние нейротрофического фактора BDNF на: (А) количество малых сетевых пачек/5 мин; (Б) количество спайков в сетевой пачке; (В) длительность малой cетевой пачки импульсов на 14 день развития in vitro. * - достоверность различий с исходным уровнем; # - достоверность различий с контрольной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

...