Патогенетическое обоснование принципов коррекции нарушений иммунологической реактивности при инфекционном процессе на фоне низкодозового рентгеновского облучения

В настоящее время также активно проводятся исследования, посвященные влиянию радиации на функциональное состояние макрофагов, так как эти клетки играют центральную роль в генерации неспецифического иммунного ответа. В частности, в макрофагах в ответ на активацию различных рецепторов опознавания паттернов через взаимодействие с MAP- киназами осуществляются процессы, связанные с клеточной пролиферацией, дифференцировкой, апоптозом, синтезом цитокинов и NO, а также фагоцитозом [122]. Narang et al. было изучено влияние ионизирующего излучения на две самых важных MAP- киназы - ERK и JNK в перитонеальных макрофагах самцов линии Swiss, облученных в дозе 2 Gy. Было показано, что воздействие радиации приводит к активации обеих киназ, что выражалось в повышении частоты фосфорилирования и нитрования данных ферментов, однако затем активность этих реакций резко падала. Также было установлено, что облучение in vitro культуры макрофагов, полученных от мышей линии C57BL/6, в дозе 4 Gy приводит к повышению уровня аргиназы и снижению синтеза iNOS2, что говорит о переключении макрофагов на противовоспалительный профиль M2. В случае облучения в той же дозе макрофагов мышей линии CBA/Ca происходит активация этих клеток по провоспалительному M1 типу. Процессы активации, наблюдаемые после облучения, также сопровождались активацией ряда сигнальных молекул и инициацией соответствующих сигнальных путей.

Авторами [122] высказано предположение, что изменения в экспрессии генов в результате облучения являются не прямым следствием этого типа воздействия, а следствием совокупности косвенных эффектов, возникающих за счет передачи сигналов, генерируемых облученными клетками. Это предположение подтверждается в некоторой степени данными, полученными, согласно которым облучение ионами углерода макрофагов линии RAW 264,7 приводило только к снижению уровня IL-1в и усилению фагоцитарной активности. В то же время, взаимодействие облученных клеток с ЛПС, лигандом Toll-рецепторов, приводило к резкому повышению уровня провоспалительных цитокинов и NO по сравнению с контролями (интактные клетки и нормальные клетки, активированные ЛПС). Эти данные косвенно подтверждают правомерность гипотезы об участии «эффекта очевидца» в патогенезе радиационно-индуцированных нарушений.

Liu et al. [94, 120], было установлено, что г-облучение в дозе 2 Gy существенно ингибирует регуляцию и активацию экспрессии CCR7 и IL-10 за счет ЛПС в дендритных клетках мышей линии C57BL/6. Дендритные клетки (ДК) относятся к антигенпрезентующим клеткам и играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа, а миграция ДК во вторичные лимфоидные ткани также играет важную роль в инициации реакций врожденного и приобретенного иммунитета. Они активируются ЛПС, в результате чего происходит индукция синтеза провоспалительных цитокинов и других медиаторов за счет активации TLR4, что запускает сложную программу фенотипического и функционального созревания, включая рецептор хемокина CCR7. Последний повышает реактивность ДК по отношению к лигандам CCR7, что обеспечивает миграцию ДК из периферических тканей во вторичные лимфоидные органы, такие как лимфоузлы, а также в селезенку, где происходит презентация антигенов Т-клеткам и инициируется иммунный ответ. Нарушение нормального синтеза CCR7 приводило к снижению миграции ДК к CCL19 in vitro и in vivo, результатом чего в перспективе была задержка генерации имунного ответа. При этом в другом исследовании [124] было показано, что более низкие дозы ионизирующей радиации (0,02 - 1,0 Gy) приводят к повышению синтеза IL-2, IL-12 и IFN-г в ДК мышей линий Balb/c и С57BL/6. Также совместное культивирование ДК, подвергшихся воздействию малых доз радиации, с наивными Т-клетками приводило к резкому повышению уровня пролиферации Т-клеток по сравнению с контролем и дифференцировке последних по Th1-типу, по всей видимости, за счет резкого повышения уровня соответствующих цитокинов.

В исследованиях Soule et al. на тучных клетках [125] были изучены такие параметры, как активация и выживание тучных клеток мышей и человека in vitro и in vivo, а также динамика высвобождения ими медиаторов, цитокинов и IgE после воздействия облучения в дозах от 2 до 400 sGy. Авторами было установлено, что тучные клетки, действительно, являются резистетными к цитотоксическому воздействию излучения. При этом облучение временно ингибирует FcR-зависимую деградацию метаболитов и синтез цитокинов под воздействием IgE. В частности, за счет такого воздействия резко снижается уровень синтеза IL-8 и колониестимулирующего фактора гранулоцитов и моноцитов (GM-CSF) на фоне повышения уровня TNF-б и IL-6. Также наблюдается резкое повышение уровня гистамина. Последнее обстоятельство может быть одной из причин развития симптомов радиационного повреждения [125].

При этом следует отметить, что радиация нарушает сигнальные каскады, связанные с рецепторами IgE и ряда других медиаторов, в то время как каскады синтеза цитокинов, зависящие от активации TLR, остаются интактными. Также радиация не нарушает способность этих клеток к дегрануляции и фагоцитозу E. coli. В совокупности, полученные исследователями данные подтверждают высокую резистентность этого типа клеток к облучению, однако временные нарушения, вызываемые радиацией, вкупе с воздействием на менее резистентные клетки, могут быть причиной развития радиационно-индуцированных нарушений [126, 127].

В ситуации, когда эпителиальный барьер скомпроментирован, к примеру, после локального облучения желудка, происходит активация иммунных клеток и инициируется рекрутинг провоспалительных клеток, и их количество, за счет миграции, увеличивается на несколько порядков. Когда рекрутинг клеток из других мест, помимо облученного участка, изменяется за счет развития системной супрессии иммунитета, активированные иммунные клетки, в основном нейтрофилы, макрофаги и цитотоксические Т-клетки, атакуют и разрушают близлежащие клетки. Это осуществляется прямо либо опосредованно - за счет высвобождения растворимых факторов, таких как активные метаболиты кислорода и азота, цитотоксические белки, литические ферменты или цитокины [128]. Значимость этих изменений в контексте изменения паттерна экспрессии генов в клетках кишечника и превращения брюшной полости в «воспалительный орган» фактически не изучена [19, 129,130].

В ряде работ высказывалось предположение о том, что ионизирующая радиация индуцирует предпочтительную дифференцировку Th-клеток в Th2-клетки в селезенке [129 - 132].

Профили экспрессии специфичных генов в основном коррелировали с количеством воспалительных клеток в слизистой оболочке. В то время как специфичные для нейтрофилов гены характеризовались низким уровнем экспрессии все время исследования, для ряда генов макрофагов была характерна тенденция к корреляции с количеством макрофагов в разные периоды после облучения. И наконец, профили экспрессии генов тяжелой цепи Ig коррелировали с количеством В-клеток слизистой оболочки, а гены рецепторов Т-клеток - с содержанием Т-лимфоцитов в слизистой оболочке кишечника после облучения [127, 133-135].

Воспалительная реакция является классическим следствием воздействия радиации, и предполагается, что она играет ключевую роль в развитии острой и отложенной реакций на воздействие облучения во многих тканях.

Инфекция является основной причиной смерти после высокодозного общего радиационного поражения. Как было описано выше, нарушения иммунной системы, вызванные облучением в малых дозах, могут привести к снижению резистентности к инфекции как у непосредственно облученных особей, так и у их потомства, облученного в антенатальном или эмбриональном периоде. При инфицировании непосредственно после облучения кроме повышения чувствительности к бактериальной инфекции имеет место возрастание процента смертности вследствие инфекции [12, 13, 16, 98]. Следует упомянуть, что в случае инфицирования через определённый промежуток времени после облучения, параметры чувствительности к инфекции и смертность сопоставимы с таковыми у контроля [12, 16].

Вследствие сложного характера влияния низкоинтенсивного ионизирующего облучения и большое количество связанных с этим нюансов, необходимо постепенное, систематизированное изучение влияния конкретных доз ионизирующего облучения на состояние иммунной системы и дальнейших последствий подобных нарушений, к примеру, чувствительности к инфекции.

Воздействие ионизирующей радиации увеличивает для хозяина риск эндогенных и экзогенных инфекций. Одним из потенциальных источников инфекции являеться грибковая инфекция. Кандидоз относится к оппортунистической инфекции, поэтому развивается, как правило, у иммунокомпрометированных больных. В иммунной защите организма ведущее значение принадлежит врожденному иммунитету, особенно прямой фагоцитоз грибковых клеток нейтрофилами и макрофагами. Кроме клеток врожденного иммунитета, дополнительный защитный эффект оказывается клеточным приобретенным иммунитетом, который в этом случае представлен Th лимфоцитами. Он способствует локализации инфекции, активации других факторов резистентности и уничтожению возбудителя. При этом основную протективную функцию выполняют Т-лимфоциты - эффекторы замедленной гиперчувствительности CD8+ и Т-клетки CD4+ 1 типа [136, 141-150].

Известна важнейшая роль неспецифических факторов, в частности, фагоцитарной системы, в резистентности организма к Candida spp. Макрофаги и нейтрофилы выполняют основную работу по избавлению макроорганизма от Candida spp. Адгезия клеток гриба к фагоцитам может осуществляться непосредственно (только у макрофагов за счет рецепторов на их поверхности), или опосредованно, как у нейтрофилов и других клеток, с участием опсонинов: антител или факторов комплемента. Непосредственное распознавание осуществляется, в основном, за счет маннозосвязывающего рецептора, расположенного на макрофагах. Активация и передача сигнала с маннозосвязывающего рецептора идет при участии ионов Ca++ . Опосредованное опсонинами связывание обеспечивается рецепторами к Fc-фрагментам антител и рецепторам комплемента CR1 (многие виды Candida) и СR3. Экспрессия и тех, и других рецепторов повышается под действием цитокинов [147 - 150].

Важная роль окислительного звена защиты доказывается усилением фунгицидной активности макрофагов под действием рекомбинантной миелопероксидазы. Дефицит миелопероксидазы приводит к незавершенности фагоцитоза и считается одним из наиболее важных факторов, предрасполагающих ко всем формам кандидоза [143].

Система оксида азота макрофагов в настоящее время рассматривается как один из основных фунгицидных механизмов. Клетки профессиональных макрофагов располагают высокоактивной "индуцибельной" синтазой оксида азота (iNOS). Индукция этого фермента происходит под влиянием IFN и TNF, угнетение - под влиянием IL-4, IL-10, TGF-в [67]. Деятельность оксида азота заключается в подавлении многих ферментных систем гриба, нарушает гликолиз и дыхательные цепи, взаимодействует с протеинкиназами, расстраивает метаболизм фосфатов и транспортные системы. В итоге это ведет к цитостатическим и гибельным для клеток эффектам. Системы производных кислорода и азота работают во взаимодействии, причем их компоненты могут взаимно подавлять и потенцировать эффекты друг друга [145].

К неокислительным фунгицидным механизмам относят различные протеолитические белки фагоцитов, дефензины, лизоцим и низкую рН в фагосомах [143]. Эти факторы препятствуют жизнедеятельности поглощенных Candida spp., нейтрализуют их вирулентность, дестабилизируют мембраны. Важным фактором защиты является лактоферрин, выделяемый внутри фагоцитов или экскретируемый в кровь и другие биологические жидкости. Лактоферрин связывает железо, отнимая его у грибов. Отмечается существенное усиление функции фагоцитов при добавлении лактоферрина [143].

Активация иммунного ответа макрофагами осуществляется за счет ряда цитокинов: IL-1, IL-6, GM-CSF и TNF, являющихся ростовыми факторами и активаторами для многих популяций клеток, в т. ч. самих макрофагов, и стимулирующих индукцию разных цитокинов и белков острой фазы. Особенно важными считаются два цитокина, IL-10 и IL-12. Доказана способность макрофагального IL-12 к активации Th1 звена клеточного иммунитета и NK-клеток [146], что за счет действия IFN усиливает фунгицидную активность фагоцитов. Влияние IL-10, для которого можно было бы ожидать обратные эффекты, пока не доказано. Несмотря на высокую активность, максимальную специализацию и незаурядные регуляторные способности макрофагов, эти клетки из всех фагоцитов являются наиболее зависимыми от Т-клеточной регуляции и в большей степени чувствительны к ее расстройствам, например, при СПИД [146].

В начале 1990-х гг. группой итальянских исследователей (Bistoni et al.) в эксперименте было показано, что активность Th1-лимфоцитов ассоциируется с улучшением состояния/излечением от кандидоза [145 - 147]. Повышенная активность Th2, преимущественно перед Th1-клетками, напротив, ассоциируется с ухудшением состояния и смертью лабораторных животных. Деятельность Th2-клеток приводит к подавлению активности Th1- лимфоцитов, стимулирует антителообразование, в т. ч. продукцию IgA и IgE, угнетает фагоцитоз и фунгицидное действие макрофагов и нейтрофилов. Главная роль Th1-клеток заключается в опосредованной IFN стимуляции ими фагоцитоза, представления антигена фагоцитами, кислородных и NO-зависимых фунгицидных механизмов [148], а также секреции опсонинов. Отмечено, что преобладание Th1 или Th2 типов иммунного ответа зависит от длительности течения инфекции и массы инфицирующих клеток. Значение баланса двух подтипов Т-хелперов, возможно, заключается в том, что макроорганизм предпочитает относительно безопасный Th2 (антительный) ответ, а не сильный фунгицидный Th1 (клеточный) иммунный ответ с обширным разрушением тканей в тех случаях, когда он не справляется с массой возбудителей. Переключение на Th2-ответ может происходить и на промежуточных этапах, в целях контроля за избыточной деструктивной деятельностью фагоцитов. CD8+- лимфоциты способны уничтожать макрофагов с незавершенным процессом фагоцитоза и расположенными в цитоплазме клетками гриба. За счет продукции IFN и IL-2 CD8+-лимфоциты стимулируют Th1 и NK-клетки, повышают эффективность фагоцитоза, угнетают Th2-ответ. Кроме того, CD8+-лимфоциты могут оказывать непосредственный фунгицидный эффект, взаимодействуя с клетками C. albicans [149].

При кандидозе вырабатываются антитела. Повышенные титры IgM отмечаются на ранних стадиях инфекции, снижаясь со временем и особенно заметно - при успешной противогрибковой терапии. В эксперименте доказана защитная роль антител класса IgM к маннановой фракции клеточной стенки C. albicans, выполняющей функцию адгезии. Высокий или нарастающий титр IgA, особенно титр секреторных антител (sIgA), отражает активную инфекцию, оказывает прямое фунгицидное действие, препятствовует адгезии, лизису белков макроорганизма через активацию системы комплемента [150-152].

Роль специфических IgG при кандидозе заключается в опсонизации грибковых клеток. Антитела класса IgG к маннанам C. albicans активируют комплемент по классическому пути. Антитела класса IgE к маннановым и белковым антигенам C. albicans обнаруживают и при инфекции, и при носительстве, наиболее часто у лиц с атопической предрасположенностью. Поскольку усиленная продукция IgE отражает активность Тh2-клеток, угнетающую противогрибковый клеточный иммунитет и способствующую развитию инфекции, обнаружение растущего или высокого титра специфического IgE может служить диагностическим и прогностическим показателем [151, 152].

Роль комплемента в защите макроорганизма при глубоком кандидозе представляется несомненной. Однако конкретные механизмы действия комплементарной системы и их взаимодействие между собой и другими факторами иммунитета остаются не уточненными. Вообще, роль комплемента заключается в связывании (прямом по альтернативному пути и опосредованном антителами по классическому пути), с опсонизацией или непосредственным уничтожением, микробов, а также в образовании факторов, обеспечивающих хемотаксис фагоцитов. Антитела класса IgG к маннановым антигенам способны запускать активацию фактора С3 по классическому пути, элиминация опсонизированных клеток C. albicans обеспечивается как CR3, так и другими рецепторами [151, 152].

В последние годы изучается проблема модуляции иммунного ответа, вызванной C. albicans. Были высказаны предположения о возможной индукции клеток-супрессоров с помощью антигенов C. albicans. В качестве клеток-супрессоров предлагались CD8+-лимфоциты-супрессоры или CD4+-Th2-клетки, подавляющие активность фагоцитоза с помощью IL-4 и IL-10 [146]. Достоверных доказательств активной кандидной иммуносупрессии, т. е. направленного изменения иммунного ответа в пользу гриба за счет его антигенов в настоящее время нет. Недавние исследования показали, что в ходе регуляции иммунного ответа макрофаги выделяют IL-12 в течение определенного ограниченного периода времени. В последующем активность IL-12 и опосредованных им IFN-зависимых реакций снижается, уступая место IL-4 и IL-10, подавляющим клеточный иммунитет. Подобный механизм может обеспечивать защитное действие, ограничивая по времени (дозируя) выброс макрофагами токсичных и для гриба, и для макроорганизма производных кислорода и азота. С другой стороны, иммуномодуляция может обеспечивать выживание гриба при незавершенном фагоцитозе. Продолжающаяся после неэффективного выброса радикалов антигенная стимуляция ведет к преобладанию реакций Th2-типа, подавляющих дальнейшую фунгицидную активность. Возможность участия специфических антигенов C. albicans, например, фрагментов маннана или белков теплового шока, в модуляции иммунного ответа, а также антигенная мимикрия C. albicans в настоящее время активно изучаются [151, 152].

Представленные в данном обзоре результаты отечественных и зарубежных исследований, направленных на изучение системных и локальных изменений в иммунной системе под воздействием облучения, позволяют расширить наши представления об этих процессах и могут быть предпосылками для разработки подходов с целью коррекции повреждений, вызванных воздействием малых доз ионизирующей радиации.

1.3 Принципы коррекции нарушений иммунологической реактивности

Раскрытие роли иммунологической реактивности в физиологических и патофизиологических процессах создало предпосылки для разработки методов коррекции, основанных на направленной регуляции иммунных реакций, дозировкой и временем введения.

Методы регуляции иммунных реакций разделяют на специфические и неспецифические в связи с возможностью влияния иммунотропных препаратов, которые могут одновременно оказывать влияние на звенья специфического и неспецифического иммунного ответа. Иммунофармакологические агенты или иммуномодуляторы могут быть разделены для удобства на две группы: иммуносупрессорные препараты и иммуностимулирующие препараты (включая адьюванты), в соответствии с их применением в терапии [46-48].

Необходимость применения иммуностимулирующих средств (иммуномодуляторов) связана не только с патогенетическими особенностями заболеваний, но и с методами их лечения. Антибиотическое актериальное лечение инфекционных болезней, химио- и лучевая терапия опухолей, любые оперативные вмешательства, а также неблагоприятные экологические факторы, в том числе и радиация, приводящие к дальнейшему повреждению структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови, усугубляя вторичную иммунную недостаточность [46-48].

Вовлечение в патологический процесс иммунокомпетентных клеток с последующей активацией выработки ими целого комплекса биологически активных веществ, усугубляющих клеточные и сосудистые нарушения, представляет собой одно из наиболее универсальных звеньев развития воспаления. Поэтому логичной стратегией в патогенетической терапии воспалительных заболеваний вне зависимости от этиологии представляется воздействие на это ключевое звено с целью обратимых стимуляции или подавления избыточной активности моноцитов/макрофагов в острый период болезни [62, 82-84, 146].

При изучении патогенеза различных по этиологии инфекционных воспалительных заболеваний выявлены некоторые наиболее общие и обязательные звенья развития воспалительных реакций. Первыми клеточными элементами, которые сталкиваются с инфекционным агентом после его проникновения через эпителий слизистых и кожных покровов, являются макрофаги, а также другие иммунокомпетентные клетки. Именно от их дальнейшего «поведения» зависят выраженность и характер ответных реакций организма на внедрение возбудителя (46-48).

Основной задачей иммунофармакологических исследований является выявление источников наиболее эффективных иммуностимуляторов, адьювантов и иммуносупрессоров. Возникает вопрос - следует ли использовать богатый арсенал эндогенных молекул (в основном пептидов), которые служат в качестве средств, обеспечивающих взаимодействие клеток в иммунной системе, или надо искать иммуномодуляторы (или, как их часто называют, модификаторы биологических реакций) среди практически бесконечного количества природных или синтетических химических соединений, которые могут быть протестированы в лаборатории на наличие у них возможных иммуномодулирующих свойств (26-34).

Без сомнения, некоторые эндогенные полипептиды иммунной системы (цитокины и связанные с ними факторы) могут использоваться в различных режимах иммуностимулирующей терапии. К примеру, IFN применяется при хронической инфекции вирусом гепатита B, IL-2 - при лечении метастатической карциномы клеток прямой кишки, а колониестимулирующие факторы (GM-CSF и G-CSF), ускоряющие восстановление нейтрофилов - после хемотерапии злокачественных заболеваний, включая интенсивную терапию, применяемую при трансплантации костного мозга. IL-1б также имеет широкий спектр свойств и используется при различных инфекционных заболеваниях (СПИД, лейшманиоз, малярия, туберкулез, шистосомиаз) и некоторых злокачественных состояниях. С другой стороны, терапевтический потенциал использования цитокинов включает также разнообразные болезни, при которых в патофизиологических процессах задействован ряд цитокинов (TNF, IL-1, -4, -6), - воспалительные, ревматические, СПИД (153-160).

В настоящее время разрабатываются антагонисты таких цитокинов, в том числе и специфичные к ним моноклональные антитела, растворимые рецепторы, антагонисты к рецепторам, а также рассматривается вариант иммунокоррекции при помощи антагонистичных к цитокинам олигонуклеотидов [19, 52].

Непосредственное применение цитокинов или их антагонистов, так же как и лечение in vitro иммунными клетками, при котором последние вводятся в кровоток пациента, а также транспорт генов (к примеру, транспорт гена, кодирующего TNF) - все это лишь немногие из стратегий, которые получают все большее распространение. Следует, однако, осознавать, что цитокины плейотропны по своим свойствам и что следует учитывать побочные эффекты (которые могут быть фатальными), наблюдающиеся при клинических испытаниях цитокиновой или антицитокиновой терапии. У здорового человека разные цитокины эффективно взаимодействуют друг с другом, несмотря на их плейотропизм и обилие, но искусственное введение дополнительного количества определенного цитокина может нарушить это равновесие, что объясняет тот факт, что при применении цитокиновой терапии возникают сложные проблемы с дозировкой и временем введения [154 - 160].

Другим терапевтическим подходом является поиск иммуностимулирующих и адьювантных свойств у экзогенных молекул, натуральных (к примеру, бактериального происхождения) либо полу- или полностью синтетических. Спектр возможностей здесь неограничен, и поиск подобных агентов облегчается широким спектром тестов in vitro и in vivo, которые позволяют выявить и проанализировать имеющиеся иммуностимулирующие свойства, такие как повышение сопротивляемости к инфекциям, отторжение пересаженных опухолей, повышение продукции антител либо генерирование реакций гиперчувствительности замедленного типа против разнообразных антигенов [ 153, 158].

Конечно же, следует осознавать, что свойства различных иммуностимулирующих веществ экзогенного происхождения должны, по большому счету, реализовываться за счет их взаимодействий (либо уже выявленных, либо еще требующих прояснения) с системой цитокинов, и, таким образом, противоречий между прямым и непрямым подходом нет. Явным преимуществом экзогенных иммуностимуляторов является то, что, по сравнению с полипептидами иммунной системы, некоторые из них имеют меньшую молекулярную массу, являются синтетическими и обладают легко выявляемыми фармакокинетическими характеристиками, например, циклоферон стимулирует в организме человека выработку собственного интерферона, что способствует защите организма от инфицирования вирусами и другими инфекционными агентами, ингибированию роста злокачественных клеток. Препарат является индуктором смешанного иммунного ответа Th1/Th2, повышает функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, активирует фагоцитоз [153].

Решение проводить биологические и клинические исследования экзогенных иммуностимуляторов может получить еще одно обоснование, если рассмотреть ситуацию с антагонистами этих лекарств - иммуносупрессивными препаратами. В то время как область фармакологической иммуностимуляции все еще на ранней стадии развития, иммуносупрессивная терапия стала частью повседневной практики. Она применяется либо для того, чтобы предотвратить отторжение аллогенных трансплантатов почек, сердца, легких и печени, либо при лечении разнообразных аутоиммунных состояний, таких как ревматоидный артрит, инсулинозависимый диабет, красная волчанка, болезнь Крона, и, возможно, в будущем других состояний [159-161]. За исключением моноклональных антител к маркеру Т-лимфоцитов CD3, все иммуносупрессивные препараты, используемые в медицинской практике либо проходящие клинические испытания, - молекулы экзогенного происхождения или являющиеся вторичными метаболитами бактерий (как циклоспорин, макролиды рапамицин и такролимус, 15-дезоксиспергуалин, микофелонат) (153).

В Европе, к примеру, некоторые препараты бактериального происхождения продаются на рынке исключительно в качестве противоинфекционных иммуностимуляторов. Эти бактериальные иммуностимуляторы принимаются либо перорально, либо интраназально. Удивительным представляется тот факт, что эти же препараты проявляют иммуномодулирующие свойства, которые потенциально могут быть полезны при лечении аутоиммунного заболевания - ревматоидного артрита [162].

Из всех бактериальных продуктов, оказывающих стимулирующее влияние на функции иммунной системы за счет взаимодействия с макрофагами, моноцитами и лимфоцитами, наиболее мощными по своему влиянию являются липополисахариды (ЛПС). Они выполняют широкий спектр биологических функций: усиливают резистентность лабораторных животных к бактериальным, вирусным, грибковым и паразитарным инфекциям, вызывают некроз опухолей, причем все эти эффекты сопровождаются повышением продукции и высвобождением разнообразных цитокинов, таких, IL-1, IL-6, TNF, тимические пептиды [27, 162].

Производные нуклеиновых кислот представляют собой другой источник иммуностимулирующих агентов, представленных пиримидинонами, производными гуанозина, производными инозин-5'-метилмонофосфата и гипоксантина.

Все эти исследования были проведены in vivo, и очень немногие желательные эффекты были продемонстрированы in vitro. Оказывается, что первичными эффекторными клетками, активируемыми пиримидинонами, являются макрофаги и NK-клетки [162].

Ряд описанных выше соединений способен оказывать особый тип иммуностимулирующего влияния, а именно проявлять адъювантную активность. Последняя заключается в способности существенно усиливать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ на твердые или растворимые антигены. Это свойство представляет значительный практический интерес для разработчиков вакцин человека и животных, так как очищенные антигены, входящие в состав вакцин, обладают низким уровнем иммуногенности как таковой. Более того, часть лиц слабо реагирует на определенные виды вакцин, что справедливо для вакцин против гепатита В или вируса гриппа у пожилых людей [46,153].

Существует более мягкий подход, однако он применим только к живым микроорганизмам. Данная методика заключается в создании при помощи генной инженерии линий микроорганизмов, которые экспрессируют ген определенного цитокина, благодаря чему достигается усиление иммунного ответа. Также можно упомянуть работу Dempsey et al., которые показали, что вакцинация мышей рекомбинатным модельным антигеном (лизоцимом куриного яйца), связанным с компонентом C3 системы комплемента, вызывает 10000-кратное усиление гуморального и клеточного иммунных ответов по сравнению с одиночным введением антигена. Это позволяет считать С3, являющийся природным адьювантом системы врожденного иммунитета, способным влиять на развитие приобретенного иммунитета[35, 36]..

Строго говоря, гормоны тимуса, а также туфтизин (тетрапептид, полученный от части Fc молекулы иммуноглобулина) относятся к природным эндогенным иммуномодуляторам. Ряд подобных пептидов может быть создан при помощи химического синтеза или же экстрагироваться из тимуса крупного рогатого скота, а затем использоваться в различных областях в клинике. Природа и применение в терапии синтетических пептидов тимуса широко обсуждается в литературе [28, 31, 162-164].

Тимомодулин и тимостимулин представляют собой очищенные экстракты тимуса телят и получили довольно широкое применение в практике, в особенности в Италии. Тимомодулин содержит смесь низкомолекулярных белков (менее 10 ma). Считается, что эти препараты улучшают течение хронических инфекционных заболеваний, таких как хронический бронхит и рецидивирующие педиатрические инфекции (165).

Таким образом, одной из возможных сфер применения иммуностимулирующих препаратов является лечение инфекционных заболеваний, особенно в случае лиц, иммунная система которых не функционирует оптимально, в частности, у маленьких детей, пожилых людей и иммуноскомпрометированных пациентов. В этой сфере применяются разнообразные лизаты бактерий (некоторые из них могут выступать в качестве вакцин), химически очищенные бактериальные гликопротеины, экстракты растений и химически синтезированные препараты. Также в этом контексте используются пептиды тимуса тимомодулин и тимостимулин.

Тимозин б1 (Тб1) является природным пептидом тимуса. Авторы предположили, что Тб1 может влиять на баланс иммунитета и толерантности, находящийся под контролем ДК и тем самым влиять на формирование клеток Treg. Для этого оценивали влияние Тб1 на образование ДК из клеток костного мозга мышей или предшественников периферической крови человека Полученные ДК оценивались на проявление экспрессии IDO и способность управлять праймингом Th1/Treg in vitro и in vivo против A. fumigatus и аллоантигенов [28, 31- 33, 164 - 168].

Авторы исследовали относительную способность ДК, сформировавшихся в присутствии Тб1, индуцировать антигенспецифический прайминг Th1/Treg в CD4+-T-лимфоцитах селезенки в ответ на конидии Aspergillus. Показано, что Тб1 повышает уровень прайминга CD4+-T-клеток, синтезирующих IFN-г/IL-10 клетками костного мозга, а также количество IL-10 в присутствии FL-ДК. Блокада активности IDO или снижение количества B220+CD11c+ клеток из популяции костномозговых дендритных клеток, обработанных Тб1, полностью прекращали активацию Treg. Таким образом, можно заключить, что клетки фенотипа CD11c+B220+ являются ключевыми компонентами, обеспечивающими толерогенное влияние Тб1. Блокада IDO 1-метилтриптофаном предотвращала активацию IL-10-синтезирующих клеток, но не имела влияния на клетки, синтезирующие IFN-г, что указывает на наличие причинно-следственной связи между активностью IDO и праймингом IL-10-синтезирующих клеток [164, 166].

Гистопатологические исследования показали, что у мышей, которым вводили костномозговые ДК, обработанные предварительно Тб1, наблюдалось снижение рекрутинга провоспалительных клеток в легких и локальных воспалительных реакциях по сравнению с мышами, которым вводили обычные костномозговые ДК. Эти данные показывают, что введение дендритных клеток костномозгового происхождения извне связано с развитием тяжелой воспалительной токсичности, уровень которой снижается при обработке донорских клеток Тб1. Также стоит отметить, что при использовании ДК, обработанных Тб1 не только снижалась активность реакции «трансплантат против хозяина», но и увеличивалась сопротивляемость мышей-реципиентов к инфекции, в отличие от животных, которым вводили стволовые и дендритные клетки без дополнительной обработки [164 - 168].

Дипептид L-глутамил-L-триптофан, как и другие пептиды, состоящие из левовращающих изомеров аминокислот, относится к числу малотоксичных соединений, специфически фиксируясь на мембране тимоцита и усиливает трансмем-бранный обмена Са++. Под его влиянием происходит активация систем вторичных посредников. Представленные данные свидетельствуют том, что тимоген не только тимомимети-ческий иммуномодулятор, но в не меньшей степени полифункциональный биорегулятор, выполняющий, как и другие короткие пептиды, функцию стартового сигнала в пептидном регуляторном каскаде. Эти представления позволяют понять способность тимогена одно-временно индуцировать различные эффекты, направленность которых определяется ви-дом клеток-мишеней и характером имеющихся повреждений [33, 163 - 168].

Изучение патофизиологических механизмов течения инфекций на фоне радио-индуцированного иммунодефицита могут способствовать совершенствованию оценки состояния гомеостаза организма и эффективности терапевтического вмешательства [2,3,12, 13,29].

В Национальном Институте Аллергии и Инфекционных болезней (NIAID) и Национальном Онкологическом институте (NCI) было запущено ряд программ, которые проводятся на стандартизованных экспериментальных моделях животных для сравнения эффективности препаратов, разрабатываемых для профилактики и лечения радиационных поражений, согласно требованиям FDA [1, 5, 35, 36).4].

Вышеизложенное обуславливает актуальность проведения исследований комбинированного влияния небольших доз радиации и инфекции на организм. Определение оптимальных уровней продукции цитокинов для сопротивления бактериальной инфекции поможет в разработке потенциальных терапевтических стратегий для лечения инфекционных заболеваний на фоне радиационного повреждения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 162 крысах-самцах популяции Вистар массой 180-200 г., которые были разделены на следующие группы: І - облученные крысы (36 особей); II - инфицированные крысы (36); ІІІ - облученные и инфицированные крысы (36); ІV - интактные крысы (6); V - облученные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VI - инфицированные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VIІ - облученные и инфицированные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); VIІІ - интактные крысы, получавшие метилглюкамина акридонацетат (6); ІХ - облученные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6); Х - инфицированные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6); ХІ - облученные и инфицированные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6); ХІІ - интактные крысы, получавшие дипептид глутамил-триптофан (6).

Подопытных животных, которые были выращены в виварии ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины», содержали на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде по десять - двенадцать голов в стандартных металлических клетках. Для устранения влияния сезонных и суточных колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в осенний сезон, в утренние часы. Исследования осуществлялись согласно принципам Хельсинской декларации, принятой Генеральной ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (1964 - 2000 гг.), Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине (1997 г.), соответствующих положений ВОЗ, Международного совета медицинских научных обществ, Международного кодекса медицинской этики (1983 г.), Национальных «Общих этических принципов исследований на животных» (Украина, 2001 г.), которые согласованы с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 18.03.1986). Все болезненные и стрессовые процедуры выполняли под легким эфирным наркозом, умерщвление животных осуществляли путем декапитации с предварительным введением раствора тиопентала натрия.

Облучение животных

Фракционированное тотальное облучение животных осуществляли в течение трех суток с интервалом 24 ч на рентгеновской диагностической установке РУМ - 17 на протяжении 40 сек. Напряжение было 90 кВ, сила тока 40 мА, алюминиевый фильтр 0,5 мм, кожно - фокусное расстояние 48 см. Суммарная доза - 1,5 Gy (ежедневная - 0,5 Gy).

Инфицирование животных

Для моделирования инфекционного процесса применяли культуру штамма Candida albicans, который был получен от больного острым гастроэнтероколитом до проведения этиотропной терапии и хранился в музее живых микроорганизмов лаборатории специфической профилактики капельных инфекций ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины».

Приготовление микробной суспензии Candida albicans с определенной концентрацией микробных клеток проводили при помощи электронного прибора Densi - La - Meter (Pliva - lachema а.s., Чехия) по шкале Mcfarland согласно инструкции к прибору. С поверхности агаровой среды стерильным изотоническим раствором NaCl смывали суточную тест-культуру и доводили до необходимого для проведения опытов количества единиц оптического стандарта плотности по Mcfarland. Число живых микроорганизмов (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом на питательные среды. Синхронизация культур перед проведением опытов достигалась путем одноразового воздействия низкой температуры (40 С) в течение 30-ти минут.

Приготовление питательных сред осуществлялось согласно ДСТУ 10.444.1 - 84 (СТСЭВ 3833 - 82) «Приготовление растворов, реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе» и в соответствии с инструкциями фирм-производителей.

Выбор дозы заражения были определены экспериментальным путем, описанным в патенте Украины на полезную модель «Способ получения модели генерализованного кандидоза» [169] и является оптимальной для достижения минимального уровня летальности опытных крыс, что является необходимым для получения модели генерализованного кандидоза.

Инфицирование крыс проводили путем внутривенного введения в хвостовую вену 0,5 мл суспензии указанного штамма Candida albicans, с концентрацией микробных клеток 5х106 КОЕ/мл. Животным контрольной группы внутривенно вводили 0,5 мл стерильного изотонического раствора NaCl.

Постановка эксперимента

После завершения облучения (на 3-и сутки) группа облученных и группа необлученных животных были инфицированы путем внутривенного введения культуры Candida albicans в дозе 2,5х106 КОЕ. Животных декапитировали на 1-е, 2-е, 3-и сутки после инфицирования и на 10-е, 17-е и 28-е сутки после начала облучения. В качестве контроля были интактные крысы, животные с инфекционным процессом без предварительного облучения и облученные крысы без последующего инфицирования. Последним внутривенно вводили 0,5 мл стерильного изотонического раствора NaСl. Наблюдение в группе неинфицированных облученных животных осуществлялось на протяжении 28-ми суток. Наблюдение в группах инфицированных животных осуществлялось на протяжении двух недель после инфицирования.

Разработанная модель была использована для оценки возможностей коррекции полученного типа дефекта антиинфекционной реактивности и терапевтической эффективности иммунотропных препаратов с широким спектром возможных биологических эффектов.

Учитывая характерные признаки индуцированного нарушения структуры антиинфекционной резистентности (в частности, дисбаланс цитокинов и недостаточный уровень активации иммунокомпетентных клеток периферической крови и перитонеальных макрофагов в ответ на инфекцию), в качестве средств коррекции был выбран препарат, среди фармакологических эффектов которого указана способность влиять на эффективность процессов фагоцитоза, - индуктор интерферона метилглюкамина акридонацетат, и препарат, нормализующий функциональное состояние иммунной системы, - дипептид глутамил-триптофан. Препараты вводили внутримышечно, начиная со следующего дня после инфицирования, один раз в сутки, курсом 5 суток. Разовая доза составляла для метилглюкамина акридонацетат 10 мг/кг и для дипептид глутамил-триптофана 200 мг/кг массы тела в сутки соответственно.

Микробиологические методы исследования

С целью микробиологического исследования органов крыс (кровь, сердце, печень), последние в асептических условиях препарировали, взвешивали (вес каждой пробы для посева составлял 1 г), затем измельчали в стерильных условиях в биологическом гомогенизаторе, вносили в накопительные среды, инкубировали в течение 18-ти часов при температуре 370 С. Для определения количества микроорганизмов 1 г исследуемого материала переносили в асептических условиях в биологический гомогенизатор и растирали, добавляя 1 мл изотонического раствора NaCl, затем готовили ряд последовательных десятикратных разведений. 0,1 мл гомогената из каждого разведения высеивали на элективную агаризованную среду ВСА. Дальнейшее исследование и идентификация изъятых культур микроорганизмов, которая осуществлялась по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам, проводились общепринятыми методами [46-49].

Определение количества микроорганизмов. Концентрацию микроорганизмов в 1 г исследуемого материала определяли путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ/г), с учетом количества посевного материала и разведения, по формуле:

,

где Х - число КОЕ/г исследуемого материала;

10 - постоянный коэффициент при посеве 0,1 мл гомогената;

N - количество колоний;

m - разведение (в 10, 100, 1000 раз и т. п.).

Для удобства полученные результаты выражали в десятичных логарифмах числа микроорганизмов на 1 г исследуемого материала - lg КОЕ/г - и интерпретировали следующим образом [4, 5]:

I степень - до 0,5 lg КОЕ/г;

ІІ - 0,51-1,5 lg КОЕ/г;

ІІІ - 1,51-2,5 lg КОЕ/г;

ІV - больше 2,5 lg КОЕ/г.

Контроль качества питательных сред проводили согласно рекомендациям фирм-производителей, которые изложены в сертификатах к продукции, а также в соответствии с Информационным письмом МЗ Украины №05.4.1/1670 «Бактериологический контроль питательных сред», Киев, 2000.

Иммунологические методы исследования

Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови

Концентрацию TGF-в в сыворотке крови оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием диагностической иммуноферментной тест-системы R&D Systems, Inc.,

IL-17 - при помощи тест-системы производства Life Science Inc.,

IFN-г - используя тест систему производства PBL Biomedical Laboratories,

IL-10 и IL-4 - при помощи диагностических тест-систем производства фирмы Abcam.

Принцип метода на примере определения TGF-в заключается в следующем.

На первой стадии анализа исследовательские и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизованными антителами. TGF-в, который содержится в образцах, связывается с иммобилизованными антителами (с добавлением буферного раствора). Материал, который не связался, удаляется путем отмывки. TGF-в, который связался с антителами, взаимодействует при инкубации с коньюгатом (поликлональные антитела к TGF-в коньюгированные с пероксидазой хрена).

Несвязавшийся коньюгат удаляется путем отмывки. На третьей стадии связавшийся коньюгат №1 взаимодействует при инкубации с коньюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количество связавшегося коньюгата № 2 определяют в цветной реакции с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением раствора стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм на иммуноферментном анализаторе. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству присутствующего в образце TGF-в.

Диапазон измеряемых концентраций составляет 0-2000 пг/мл.

Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови

Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), проводилось стандартным методом преципитации 3,5 % раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) (м.м. 6000) (Applichem Gmb) с последующей спектрометрией, в единицах оптической плотности (е. о. п.) по методике, описанной в монографии [170].

Для этого сыворотку крови крыс разводили изотоническим раствором NaСl в соотношении 1:25. Разбавленную сыворотку смешивали с 3,5 % раствором ПЭГ в соотношении 1:1.

Для проведения реакции преципитации пробирки оставляли на 18 часов в холодильнике при температуре 4є С, потом центрифугировали на протяжении 15-ти минут при 1500 об./мин и сливали надосадочную жидкость. Далее осадок растворяли в 2,5 мл 0,1 % NaОН, ресуспендировали и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Пробы замеряли на спектрофотометре при длине волны 280 нм, в качестве контроля использовали 0,1 % раствор NaОН. Уровень ЦИК выражали в МЕ.

Определение уровня общего комплемента в сыворотке крови

Комплементарную активность сыворотки крови определяли по следующей методике [170].

Подготовка сыворотки для исследования. Забор крови проводили без антикоагулянтов, пробы выстаивались 1 час при комнатной температуре, центрифугировались (10 минут при 1000 g), во время чего отделялась сыворотка.

Титрование комплемента. Исследуемая сыворотка разводилась рабочим буфером в отношении 1:2. Разведенную сыворотку в количестве 0,5 мл смешивали с 2,55 мл рабочего буфера, что соответствует разведению 1:12,2. В остальных пробирках готовили ряд разведений в соответствии с таблицей 2.1.

Таблица 2.2 Схема титрования комплемента

В пробирку № 12, где должен быть 100 % гемолиз, добавляли следовые количества сапонина. Все пробы инкубировали на водяной бане в течение 45 минут при 37° С. Затем центрифугировали 10 минут при 800 g и измеряли оптическую плотность надосадочной фракции в 11-й пробирке (0% гемолиз).

Обработка результатов. Результаты определения оптической плотности корригируют по значению оптической плдотности контроля (пробирки 11 и 12). Рассчитывали процент гемолиза. Для построения графической зависимости использовали логарифмическую бумагу. Значение каждого разведения сыворотки (12,2, 15,2, 18,5 и т. д.) отмечали на оси абсцисс. На оси ординат откладывали соответствующий процент гемолиза. Получаемые точки соединяли и по графику тут же определяли разведение сыворотки, при котором наступает 50% гемолиз. Число гемолитических единиц в 1 мл сыворотки рассчитывали по формуле:

СН50/мл=a/x

а -- фактор первоначального разведения сыворотки (равен 12,2),

х--объем сыворотки, вызывающий 50% гемолиз.

Определение фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата

На протяжении 1-2 минут массировали животному живот. Затем отбирали жидкость из брюшной полости и вносили ее в пенициллиновые флаконы с покровными стеклышками и фосфатно-солевым буфером.

Флаконы с жидкостью ставили на один час в термостат при температуре 37є С. Отделение макрофагов от других клеток осуществляли за счет их прилипающей способности к стеклу. Жидкость отбирали, стеклышки промывали изотоническим раствором NaCl и добавляли суспензию латекса в концентрации 3 х 106 мл или культуры Candida albicans с определенной концентрацией микробных клеток по методике, описанной в монографии [170].

Снова выдерживали в термостате при температуре 37є С на протяжении 30-ти минут. Затем стеклышки доставали, промывали, высушивали, фиксировали клетки метанолом и окрашивали по методу Романовского-Гимзы.

Определение фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов проводили по подсчету фагоцитарного числа - индекса Райта (ИР) и фагоцитарного индекса - индекса Гамбургера (ИГ).

При микроскопическом исследовании окрашенных препаратов подсчитывали 200 макрофагов или нейтрофилов, регистрируя количество фагоцитирующих клеток (фагоцитарное число, ФЧ), а также количество поглощенных ими микробных тел или латексных частиц (фагоцитарный индекс, ФИ).

Определение антител к Candida albicans

Антитела к Candida albicans выявляли при помощи тест-системы CAND-TECTM. Принцип измерения состоит в том, что частицы латекса одинакового размера, покрытые специфическими антителами к Candida, будут агглютинировать в присутствии антигена Candida. В данном случае чувствительный латекс покрыт кроличьими антителами к Candida. В ходе измерения одновременно идет постановка позитивного и негативного контроля наравне с исследуемой сывороткой для проверки корректной работы системы. Образцы считаются позитивными при наличии агглютинации латекса.

Статистические методы

Статистическую обработку полученных количественных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Office 2010, а также программы Biostat 2003. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, согласно современным требованиям к проведению анализа медицинских данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Влияние фракционированного тотального низкодозового рентгеновского облучения на показатели иммунологической реактивности

В целом, облучение представляет собой сложный процесс организма, в котором задействованы межклеточные реакции в иммунной системе и передача сигналов в иммуннокомпетентных клетках [2, 3, 47, 48].

Содержание цитокинов, отвечающих за поляризацию Th1/Th2-специфического иммунного ответа, в сыворотке крови.

Нормальное функционирование иммунной системы возможно только за счет поддержания определенного баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Изменения в экспрессии и продукции цитокинов часто являются маркером воздействия неблагоприятных факторов на иммунологическую реактивность. Посредством цитокинов гомеостатическая система организма реализует свою реакцию на внешнее воздействие. Поэтому исследования экспрессии генов и продукции цитокинов могут дать информацию о состоянии иммунологической реактивности и о патологических процессах, происходящих в иммунной системе и в организме. Сегодня мы имеем возможность оценивать экспрессию генов интерлейкинов, которые, с одной стороны, продуцируются разными субпопуляциями Т-хелперов (Thl и Th2), а с другой - осуществляют регуляцию различных эффекторных популяций иммунокомпетентных клеток: интерлейкины Th1 - эффекторов ГЗТ, Th2 - антителопродуцентов [19, 46, 47, 51].