Оптимізація антибіотикотерапії хворих на хронічний пієлонефрит, що поєднується із цукровим діабетом 2 типу, шляхом оцінки плазмідіндукованої резистентності

Оскільки антибактеріальна ефективність в-лактамних антибіотиків залежить від часу, протягом якого їх концентрація перевищує МІК, одним з можливих шляхів подолання резистентності ESBL-продукуючих штамів може бути зміна режиму дозування препаратів. Використання раціональної фармакокінетики існуючих препаратів дозволяє підвищити клінічну ефективність і поліпшити фармако-економічні показники антибіотико-терапії. Даний підхід підтримується всіма новими клінічними рекомендаціями [78]. Особливу складність представляє терапія інфекцій, спричинених штамами, що продукують NDM. При серйозних інфекціях рекомендована комбінована антибактеріальна терапія з використанням поліміксину, хоча до поліміксину спостерігається швидке наростання резистентності [129].

У ряді досліджень фторхінолони поступалися в клінічній ефективності карбапенемам, при цьому спостерігалося також зниження чутливості виділених штамів до фторхінолонів [37].

Очевидним вирішенням проблеми резистентності штамів, що продукують ESBL, може бути використання антибіотиків, захищених інгібіторами в-лактамаз, такими як клавуланова кислота, сульбактам і тазобактам. Найбільшу ефективність in vitro демонстрував тазобактам, внаслідок чого став широко застосовуватися піперациллін-тазобактам для лікування інфекцій, спричинених бактеріями, що продукують ESBL [91], у тому числі при бактеріємії, незважаючи на існуючі спочатку рекомендації уникати в даній ситуації його застосування. Значне збільшення використання піперациллін-тазобактама за останні 10 років, не привело до істотного зростання частоти виявлення резистентних до піперациллін-тазобактаму штамів, проте відзначається підвищення МІК у відношенні ESBL-продукуючих штамів. У той же час амоксициллін-клавуланат демонструє стабільність МІК у відношенні ESBL-продукуючих штамів. Автори досліджень пов'язують зростання МІК піперациллін-тазобактаму з механізмами резистентності не залежними від виробітки в-лактамаз [71, 76]. Невеликі дослідження підтверджують, що клінічна ефективність амоксициліну з клавулановою кислотою в лікуванні хворих з циститом, викликаним ESBL-продукуючими штамами, становить до 93% при високій чутливості in vitro і 56% серед штамів з помірною чутливістю і резистентних in vitro, що дозволяє успішно використовувати амоксицилін з клавулановою кислотою для емпіричної терапії циститів викликаних ESBL-продукуючими штамами [101].

Дослідження in vitro показали високу активність фосфоміцину щодо ESBL-продукуючих штамів Escherichia coli і Klebsiella pneumoniae, що викликало нову хвилю інтересу до фосфоміцину у клініцистів при ІСС, викликаних мульти-резистентними штамами [46]. Була показана висока in vitro активність фосфоміцину щодо KPC-продукуючих штамів Klebsiella pneumoniae, що досягала 93% в цілому і 87% у групі штамммів, що були не чутливі до тігецікліну та/або колістину. За даними багатоцентрового обсерваційного дослідження, фосфоміцин був ефективний у лікуванні тяжких інфекцій, спричинених мульти-резистентними і панрезистентними карбапенемаз-продукуючими штамами Pseudomonas aeruginosa і Klebsiella pneumoniae [95].

Також високу чутливість in vitro карбапенемаз-продукуючі штами демонстрували до тігецикліну, у зв'язку з чим, прогнозувалася його висока клінічна ефективність. Однак, клінічні дослідження показали швидке наростання резистентності до тігецикліну в ході терапії, що поставило під сумнів можливість його використання при інфекціях викликаних карбапенемаз-продукуючими штамами і викликало необхідність ретельного моніторування чутливості збудника до тігецикліну в ході терапії [34].

У 2008 році, Європейською Об'єднаною Референтною Лабораторією по вивченню антибактеріальної Резистентності (EURL-AR) ініційовано дослідження в усіх Національних референтних лабораторіях по з метою збору ретроспективної інформації про наявність плазмід-індукованої резистентності штамів Salmonella і Escherichia coli і виявлення генів відповідальних за неї [124].

Отже, терапевтичні можливості лікування інфекцій, спричинених бактеріями з плазмідними механізмами резистентності, дуже лімітовані. Крім того, наявність перехресної резистентності, обмежує використання навіть антибіотиків резерву. Тому, суворе дотримання рекомендацій по призначенню та дозуванню антибактеріальних препаратів, ідентифікація та ретельний моніторинг резистентних бактерій і генів, що відповідають за неї, є необхідними для вивчення механізмів формування резистентності та пошуку можливих шляхів її подолання.

ГЛАВА 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1 Клінічна характеристика хворих

В процесі виконання роботи нами було обстежено 105 хворих. Хворі знаходились на обстеженні та лікуванні у 1 терапевтичному відділенні з нефрологічними ліжками (20) Харківської міської клінічної лікарні швидкої та невідкладної медичної допомоги №4 ім. проф. О.І. Мещанінова. Критерії залучення пацієнтів у дослідження: наявність у хворих ХП, цукрового діабету 2 типу. Критерії вилучення пацієнтів із дослідження: цукровий діабет 1 типу, хворі з термінальною нирковою недостатністю (ШКФ ? 15 мл/хв/1,73 м²), тяжкі захворювання печінки, онкологічні захворювання, захворювання системи крові, вагітність.

У діагностичному процесі використовувалися стандартні методи опитування і обстеження хворих, з урахуванням скарг, анамнезу захворювання, даних об'єктивного обстеження, лабораторних і інструментальних методів дослідження. Визначення стадії, варіанту та клінічного перебігу ХП проводилося згідно рекомендацій адаптованої клінічної настанови з кращої діагностики, лікування та профілактики інфекцій сечової системи Української асоціації нефрологів (2012р.). Визначення типу, ступеня тяжкості, стану компенсації, наявності хронічних ускладнень цукрового діабету проводилося згідно рекомендацій Асоціації ендокринологів України (2012 р.). Визначення наявності плазмід-індукованих механізмів резистентності проводилось методом полімеразної ланцюжкової реакції. Стадію ХХН визначали по рівню швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ) за формулою CKD-EPI (KDIGO 2012) [5].

У всіх 105 (100%) хворих було діагностовано хронічну хворобу нирок (ХХН), хронічний пієлонефрит (ХП), у 73 (69,5 %) - із супутнім цукровим діабетом (ЦД) 2 типу, з різними стадіями ХХН.

Серед обстежених було 91 (86,7 %) жінка і 14 (13,3 %) чоловіків. Вік обстежених коливався від 21 до 86 років, в середньому склав 56,9±1,7 років. Всіх хворих, окремо чоловіків і жінок, було розподілено на дві вікові групи: до 55 років (n=39) та старше 55 років (n=66), таблиця 2.1.

Згідно рекомендацій KDIGO 2012, хворі були розподілені за рівнем ШКФ: > 90 мл/мін/1,73м² - 21 (20%) осіб; 60-89 мл/мін/1,73м² - 28 (26,7%) особи; 30-59 мл/мін/1,73м² - 27 (25,7%) осіб та 15-29 мл/мін/1,73м² - 29 (27,6%) осіб (таблиця 2.1).

При лабораторному обстеженні, показники азотемії були підвищеними у 41 (39%) осіб, середній рівень креатиніну становив - 148,4±12,1 мкмоль/мл, сечовини - 9,32±0,56 ммоль/мл; в клінічному аналізі сечі відносна щільність в середньому склала 1013,5±0,6; при дослідженні сечового осаду лейкоцитурія мала місце у 85 (80,9%) пацієнтів, гематурія була виявлена у 35 (33,3%), альбумінурія зустрічалася у 32 (30,5%), протеїнурія у 23 (21,9%).

По стадії активності ХП, хворі були розподілені наступним чином: І ст. активності мали 20 (19%) пацієнта, ІІ ст. активності - 43 (40,9%), ІІІ ст. мала місце у 42 (40%) осіб.

За наявністю супутніх коморбідних станів, хворі були розподілені наступним чином: із супутньою АГ - 71 (67,6%) хворих; наявністю обструкції сечовивідних шляхів - 22 (20,9%) осіб; наявністю епізодів перенесеної ІСС в анамнезі - 11 (10,5%); ІХС - 56 (53,3%); ДН - 18 (17,1%).

Клінічна характеристика пацієнтів представлена у таблиці 2.1

Таблиця 2.1

Ознаки		Кількість, n (%)
Групи хворих	І група (ХП+ЦД 2 типу)	73 (69,5%)
	ІІ група (ХП)	32 (30,5%)
Стать	Чоловіки	14 (13,3%)
	Жінки	91 (86,7%)
Вік	Чоловіки	59,6±3,6
	Жінки	56,6±1,9
Активність ХП	І ст. активності	20 (19%)
	ІІ ст. активності	43 (40,9%)
	ІІІ ст. активності	42 (40%)
Стадії ХХН	І ст. ХХН	21 (20%)
	ІІ ст. ХХН	28 (26,7%)
	ІІІ ст. ХХН	27 (25,7%)
	ІV ст. ХХН	29 (27,6%)
Втрата білку з сечею	Альбумінурія	38 (36,2%)
	Протеїнурія	27 (26,7%)
Коморбідна патологія	ДН	18 (24,7%)
	АГ	83 (79%)
	ІХС	75 (71,4%)

Лікування хворих на ХП проводилось згідно рекомендацій адаптованої клінічної настанови з кращої діагностики, лікування та профілактики інфекцій сечової системи Української асоціації нефрологів (2012р). В залежності від виду емпіричного АБП, хворі були розподілені на 3 групи: лікування 1 (40 осіб) - отримали фторхінолони (левофлоксацин) 500 мг у вигляді внутрішньовенно-крапельних інфузій; лікування 2 (42 осіб) - цефалоспорини (цефтріаксон, цефіпім) 2 грами на добу у вигляді внутрішньовенних ін'єкцій та лікування 3 (23 пацієнтів) - комбінацію зазначених препаратів.

Дизайн лікування хворих основної групи і групи порівняння зображено на малюнку 2.1.

Мал. 2.1 Дизайн емпіричної АБТ у хворих на ХП.

В першу групу увійшло 73 хворих на ХП і супутній ЦД 2 типу. Серед обстежених було 64 (87,7%) жінки та 9 (12,3%) чоловіків. Вік обстежених коливався у межах від 21 до 86 років, в середньому становив: для жінок 52,45±2,4, для чоловіків - 58,78±5,1 років. Всіх хворих, окремо чоловіків і жінок, було розподілено на дві вікові групи: до 55 років (n=34) та старше 55 років (n=39), таблиця 2.1.

При надходженні до стаціонару хворі пред'являли скарги на: підвищення температури тіла - 41 (56,2%) особа, середня температура тіла по групі - 37,4±0,8; інтоксикаційний синдром спостерігався у 100 % хворих, больовий синдром - мала 71 (97,3%) особа, дизурія спостерігалася у 37 (50,7%) пацієнтів, зміна кольору сечі - мала місце у 11 (15,1%) обстежених хворих.

З анамнезу захворювання відомо, що тривалість хронічного пієлонефриту у даній групі склала: до 5 років - 37 (50,7%) осіб, до 10 років - 12 (22,6%) осіб і більше 10 років - 24 (32,9%) пацієнта. Лікування у стаціонарі у поточному році проводили 11 (15,1%) пацієнтів, прийом антибіотиків мав місце у 30 пацієнтів, з них в-лактамні АБП приймали 28 чоловік, фторхінолони - 27 осіб.

При об'єктивному дослідженні виявлено: блідість шкірних покровів - 47 (64,4%) чоловік, набряки обличчя та кінцівок - 16 (21,9%) осіб, біль при пальпації у косто-вертебральному куті - 43 (58,9%) особи. Середній артеріальний тиск становив - САТ 139,45±3,2 мм рт.ст., ДАТ - 87,12±1,5 мм рт.ст.. Середній рівень пульсу склав 81,79±1,3 ударів у хвилину.

При вивченні клінічного аналізу крові, лейкоцитоз мав місце у 23 (31,5%) осіб, підвищення ШОЕ - у 54 (73,9%), анемія зустрічалася у 18 (24,7%) пацієнтів.

В загальному клінічному аналізі сечі відносна щільність у середньому складала 1014±6,1, альбумінурія була виявлена у 21 особи, протеїнурія - у 15 (50,7%) пацієнтів, з них у 4 (10,8%) складала вище 1 г/л. При дослідженні сечового осаду лейкоцитурія мала місце у 61 (83,6%) пацієнта, з них у 28 (45,9%) - на все поле зору, гематурія була виявлена у 26 (35,6%) пацієнтів, з них у 4 (15,4%) - на все поле зору (макрогематурія). У 16 (21,9%) хворих були виявлені циліндри - гіалінові, зернисті і еритроцитарні.

При дослідженні функції нирок шляхом розрахунку швидкості клубочкової фільтрації за формулою CKD-EPI, у 7 (9,6%) хворих вона була дещо підвищена (від 122 до 158 мл/хв/1,73м²), у 54 (73,9%) - знижена (від 16 до 88 мл/хв/1,73м²), у 12 (16,4%) - не перевищувала фізіологічну норму. У середньому рівень клубочкової фільтрації становив 42,33±4,4 мл/хв/1,73м². Показники азотемії були підвищені у 23 (31,5%) пацієнтів. Рівень креатиніну становив в середньому 187,3±22,8 мкмоль/л, рівень сечовини - 12,6±1,2 ммоль/л (таблиця 2.2).

Таблиця 2.2 Дані лабораторних обстежень у пацієнтів на ХП з і без супутнього ЦД 2 типу

Показники	І група (n=73)	ІІ група (n=32)
ШКФ, мл/хв/1,73м2	42,3±4,8	69,4±4,4*
Креатинін крові, мкмоль/л	187,3±22,8	131,4±13,9*#
Сечовина крові, ммоль/л	12,6±1,2	7,8±0,54*
Загальний білок крові (г/л)	72±2,2	73,1±1,1
Альбумінурія (г/л)	0,07±0,01	0,04±0,01*
Протеїнурія (г/л)	0,98±0,3	0,94±0,3

Примітка: * р?0,05 при порівнянні І та ІІ груп.

Показники вуглеводного обміну натще складали 8,39±0,7; рівень глікозильованого гемоглобіну становив у середньому 7,1±0,2.

Вміст загального білка по групі в середньому складав 72±2,2.

При проведенні ехосоноскопії дифузні зміни паренхіми нирок у вигляді підвищення ехощільності, стоншення кортикального шару нирки, розширення мисок та мікроліти спостерігались у 100% хворих.

Друга група (порівняння) складалась із 32 хворих: 27 (84,4%) жінок та 5 (15,6%) чоловіків. Вік обстежених коливався у межах від 45 до 86 років, в середньому становив: для жінок 66,29±1,9, для чоловіків - 61,2±4,5 років. Всіх хворих, окремо чоловіків і жінок, було розподілено на дві вікові групи: до 55 років (n=5) та старше 55 років (n=27), таблиця 2.1.

При надходженні до стаціонару хворі пред'являли скарги на: підвищення температури тіла - 15 (46,9%) осіб, середня температура тіла по групі - 37,2±0,7; астенічні явища (слабкість, підвищена втомлюваність) спостерігалися у 100 % хворих, больовий синдром - мали 26 (81,3%) осіб, дизурія спостерігалася у 15 (46,9%) пацієнтів, зміна кольору сечі - мала місце у 4 (12,5%) обстежених хворих.

Тривалість ХП становила: до 5 років - 17 осіб, 6-10 років - 9 осіб та більше 10 років - 6 пацієнтів. Лікування у стаціонарі у поточному році проводили 11 (18%) пацієнтів, прийом антибіотиків мав місце у 30 пацієнтів, з них в-лактамні АБП приймали 28 чоловік, фторхінолони - 27 осіб.

При об'єктивному дослідженні мали місце: блідість шкірних покривів - 20 (62,5%) чоловік, набряки обличчя та/або кінцівок мали 14 (43,8%) пацієнтів, біль при пальпації у косто-вертебральному куті зустрічалася у 13 (40,6%) хворих. Середній артеріальний тиск становив - САТ 142,18±4,1 мм рт.ст., ДАТ - 85,78±2,1 мм рт.ст. Середній рівень пульсу склав 85±2,3 ударів у хвилину.

При вивченні клінічного аналізу крові, лейкоцитоз мав місце у 11 (34,4%) осіб, підвищення ШОЕ - у 28 (87,5%), анемія зустрічалася у 12 (37,5%) пацієнтів.

В загальному клінічному аналізі сечі відносна щільність у середньому складала 1014±6,1, альбумінурія була виявлена у 17 осіб, протеїнурія - у 6 (18,7%) пацієнтів, з них у 2 (18,2%) складала вище 1 г/л. При дослідженні сечового осаду лейкоцитурія мала місце у 27 (84,4%) пацієнта, з них у 15 (55,6%) - на все поле зору, гематурія була виявлена у 11 (34,4%) пацієнтів, з них у 4 (13,6%) - на все поле зору (макрогематурія). У 7 (21,9%) хворих були виявлені циліндри - гіалінові, зернисті і еритроцитарні.

При дослідженні функції нирок шляхом розрахунку швидкості клубочкової фільтрації за формулою CKD-EPI, у 3 (9,4%) хворих вона була дещо підвищена (від 122 до 158 мл/хв/1,73м²), у 24 (75%) - знижена (від 16 до 88 мл/хв/1,73м²), у 5 (15,6%) - не перевищувала фізіологічну норму. У середньому рівень клубочкової фільтрації становив 69,4±4,4 мл/хв/1,73м². Показники азотемії були підвищені у 10 (31,3%) пацієнтів. Рівень креатиніну становив в середньому 131,41±13,9 мкмоль/л, рівень сечовини - 7,87±0,5 ммоль/л (таблиця 2.2).

Вміст загального білку крові складав у середньому 73,12±1,1 г/л.

При проведенні ультразвукового дослідження нирок у 30 (93,8%) хворих спостерігалася нечіткість зовнішнього контуру нирок (втягнення, нерівномірне стоншення кортикального шару нирки до 8-12 мм), утиск контурів чашково-мискової системи (ЧМС), порушення кортико-медулярную диференціації, що свідчить про наявність хронічного запального процесу.

2.2 Методи дослідження

В процесі виконання роботи обстежено 105 хворих на хронічний пієлонефрит, з них 73 пацієнти - із супутнім цукровим діабетом 2-го типу. Хворі знаходились на обстеженні та лікуванні у 1 терапевтичному відділенні з нефрологічними ліжками (20) Харківської міської клінічної лікарні швидкої та невідкладної медичної допомоги №4 ім. проф. О.І. Мещанінова. Лабораторні дослідження були виконані в умовах клінічної лабораторії, інструментальні дослідження виконувалися в відділенні функціональної діагностики та в рентгенологічному відділенні лікарні швидкої та невідкладної медичної допомоги №4.

Діагноз ХП верифікували на підставі наступних методів:

1. Методи оцінки стану хворого і верифікації діагнозу: сбір анамнезу, загальний огляд, лабораторні дослідження включали клінічний аналіз крові та сечі, біохімічне дослідження крові - забір крові проводився всім пацієнтам із ліктьової вени у кількості 10 мл вранці натще (через 12 годин після останнього прийому їжі); і інструментальні методи - ультразвукове дослідження нирок проводилося на апараті …;

2. Методи оцінки ефективності антибіотико-терапії вивчалися в динаміці клінічних симптомів і лабораторних показників (клінічного аналізу крові та сечі, біохімічного аналізу крові з визначенням концентрацій креатиніну, сечовини, загального білку);

3. Методи оцінки резистентності in vitro - бактеріологічне дослідження сечі з визначенням чутливості виділених збудників. Матеріалом для мікробіологічного дослідження було 3-5 мл середньої порції вільно випущеної у стерильний посуд сечі. Сечу збирали до початку антибіотикотерапії після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Доставку матеріалу для бактеріологічного дослідження здійснювали не пізніше 2-х годин від моменту збирання. Мікробіологічні дослідження проводили у відповідності до діючих нормативних документів класичними бактеріологічними методами [Приказ № 535 ”Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений” МЗ СССР от 22.04.1985 г. - 123 с.]. Кількісне визначення бактерій у 1 мл сечі (ступінь бактеріурії) проводили шляхом висіву матеріалу на 5 % кров'яний агар за методом Gould (1965). Також для висіву використовували хромогенний агар ChromID CPS (bioMerieux, Франція) для вилучення та прямої ідентифікації Escerichia coli, Enterococcus spp, бактерій групи KESC (Klebsiella spp, Enterobacter spp, Serratia spp, Citrobacter spp) та Proteus spp. Ідентифікацію інших видів бактерій здійснювали за морфологічними, культуральними, біохімічними ознаками згідно з „Визначником бактерій Берджі”, 1997. Для оцінки молекулярно-генетичних характеристик вилучених із сечі штамів використовували добові агарові культури. Для цього чисту бактеріальну культуру, вирощену 18-20 годин на поживному агарі, суспендували у буферному розчині рН 7,0-7,2 до оптичної щільності 3 одиниці за шкалою McFarland. Визначення оптичної щільності бактеріальних суспензій проводили за допомогою денситометру (DENSIMAT, bioMerieux, Франція).

Визначення чутливості вилучених із сечі культур мікроорганізмів до протимікробних препаратів проводили диско-дифузійним методом Bauer-Kirbi на середовищі Хінтон-Мюллера з використанням готових комерційних дисків відповідно до діючих нормативних документів. Облік результатів проводили шляхом виміру зон затримки росту мікроорганізмів навколо дисків, включаючи діаметр самого диска. Результати дослідження антибіотикочутливості мікроорганізмів інтерпретували у відповідності з Наказом МОЗ України №167 [Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів : Наказ. - [Чинний від 2007-04-05]. - К. : МОЗ України, 2007. - 78 с. - (Нормативний документ МОЗ України. Вказівки, Наказ).]. Оцінку результатів проводили за таблицями, що містять граничні значення діаметрів зон затримки росту для стійких, помірно-стійких і чутливих штамів. Отримані значення діаметрів зон затримки росту порівнювали з граничними значеннями таблиць і відносили досліджувані штами до однієї з трьох категорій чутливості.

Крім загальноприйнятих методів обстеження в процесі виконання роботи ми проводили діагностику плазмід-індукованих генних механізмів резистентності методом полімеразної ланцюжкової реакції в лабораторії Вірола.

Визначення та ідентифікація плазмід-індукованих генних механізмів резистентності.

Для отримання ДНК використовували наступний метод виділення ДНК (MolecularCloning: A Laboratory Manual, (1989) Second Edition, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., eds., ColdSpringHarborLaboratoryPress, ColdSpringHarbor, NY.):

1. Зразки інкубували при 95 ° С в 0,2 М NaOH 15

2. Додавали протеїназу К до концентрації 50 мкг / мл і SDS до 0,5%. Інкубували 12 годин при 37оС.

3. Доводили об'єм зразка до 5 мл розчином 10 мМтріс-ЕДТА, рН 8,0 і послідовно проводили екстракцію ДНК рівними обсягами фенолу, суміші фенол-хлороформ і хлороформом.

4. До зразку додавали 1/10 обсягу 5М ацетату натрію, рН 5,3, перемішували і облягали ДНК 2,5 обсягами холодного 96% етанолу, витримуючи зразок 30 хв. при температурі - 70^оС.

5. Пробу центрифугірували 15 хв з прискоренням 12000g. Висушували осад ДНК на повітрі і розчиняли в 200 мкл10 мМтріс-ЕДТА, рН 8.0.

6. Якість виділеної ДНК перевіряли електрофорезом в 1,5% агарозному гелі з візуалізацією етидієм бромідом. Виділену ДНК зберігали при -20 ° С

ПЛР проводили за стандартною схемою за допомогою програмованого термоциклер «Терцик-2» фірми ДНК-технологія.

Використані праймери:

blaTEM 5'-ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG

5'-CCA ATG CTT AAT CAG TGA GG;

blaSHV 5'-ATG CGT TAT ATT CGC CTG TG

5'-AGC GTT GCC AGT GCT CGA TC;

blaCTX-M 5'-SCS ATG TGC AGY ACC AGT AA

5'-ACC AGA AYV AGC GGB GC;

Qnr A qnrAF ATTTCTCACGCCAGGATTTG

qnrAR GATCGGCAAAGGTTAGGTCA;

aac(6')Ib aacIbF TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA

aacIbR CTCGAATGCCTGGCGTGTTT;

gepA qepAF AACTGCTTGAGCCCGTAGAT

qepAR GTCTACGCCATGGACCTCAC

Розміри ампліфікованих фрагментів: - 858, 862, 585, 516, 482, 596 п.н. відповідно.

В реакційну суміш, яка містить 50мм KCl, 10мм трис-HCl pH 8,4, по 5 пМ праймерів, 2,5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTP, 10% DMSO, 5мм меркаптоетанол та 2 одиниці термофільної ДНК-полімерази. Потім додавали краплю вазелінової олії, прогрівали суміш при 95^оС протягом 10 хв. і проводили 33 циклу з параметрами:

Денатурація: 95 ОС - 30 сек.

Відпал і елонгація: 50^ОС - для праймерів blaTEM,

58 ° С - для праймерів blaSHV і blaSHV,

55 ° С - для праймерів qnrA, aac (6 ') Ib і gepA, 30 сек.

Фінальну інкубацію проводили при 72^оС протягом 10 хв.

Результати ПЛР оцінювали після проведення електрофорезу в 2% агарозному гелі з подальшим фарбуванням в розчині етидію бромиду з концентрацією 1 мг/мл, в якості маркера молекулярної ваги використовували ДНК плазміди puc19 гідролізовану ферментом HpaII.

Визначення ІЛ-6 в плазмі крові.

Для визначення рівня ІЛ-6 використовували імуноферментні тест-системи «ProCon» (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Росія).

Принцип методу: для вимірювання рівня ІЛ-6 використовується твердофазний імуноферментний метод з застосуванням пероксидази хрону у якості індикаторного ферменту. Один тип антитіл імобілізується на внутрішніх поверхнях лунок планшетів для мікротитрування. Другий тип моноклональних антитіл для незалежного епітопу молекули ІЛ-1в знаходиться в наборі у вигляді кон'югата з біотином. Індикаторним компонентом є кон'югат пероксидази хрону зі стрептовідином, що має дуже високу спорідненість до біотину. Після інкубацій і промивань в лунки вносять кон'югат пероксидази зі стрептовідином, знову інкубують, промивають, вносять субстрат і вимірюють активність зв'язаної пероксидази з використанням автоматичного фотометра.

Об'єкт дослідження - плазма крові. Набір матеріалу для дослідження вмісту ІЛ-6 у крові проводився в такий спосіб: в обстежуваних хворих ранком натще в пробірку, що містить стабілізатор (ЕДТА), забирали 5 мл венозної крові, що відразу центрифугували, відбирали зразки плазми й заморожували. Зразки плазми зберігалися при температурі мінус 20° С.

Постановка імуноферментного аналізу:

В усі лунки планшета набору для імуноферментного аналізу «ProCon» додавали 300мкл буфера для промивання й витримували протягом 5 хвилин, потім проводили повну аспірацію рідини. Готували набір стандартів ІЛ-1в, змішуючи стандартний зразок (1нг/мл) з буфером за наступною схемою:

Концентрація ІЛ-6	Об'єм стандарту (1нг/мл)	Об'єм буфера
500 пг/мл	100 мкл	100 мкл
250 пг/мл	50 мкл	150 мкл
100 пг/мл	20 мкл	180 мкл
50 пг/мл	10 мкл	190 мкл

В усі лунки мікропланшета вносили по 100 мкл біотінільованих моноклональних антитіл, потім по 100 мкл досліджуваної плазми, инкубували протягом 1 години при температурі 37° С, після чого промивали їх буфером, вносили в лунки по 200 мкл розчину стрептовідину з пероксидазой хрону та інкубували 30 хвилин. Потім лунки тричі промивали буфером і вносили по 200 мкл розчину субстрату з барвником в усі лунки. Після інкубації протягом 15-25 хвилин додавали 50 мкл розчину сірчаної кислоти в кожну лунку для зупинки реакції.

Підрахунок результатів проводили з використанням фотометра-аналізатора імуноферментного Humareader, 2003 р., № 2106-1709, при довжині хвилі 492 нм.

2.3 Статистичні методи дослідження

Статистичну обробку даних проводили за допомогою пакету статистичних програм Statistica 6.0. На першому етапі проводили візуальний аналіз даних, визначали характер кривих розподілів і вибирали відповідні методи аналізу. Для параметричного аналізу використовували блок базових статистик. Оцінку значимостей відмінностей середніх проводили за допомогою ANOVA. Для аналізу непараметричних даних використовував блок непараметричних статистик, методи обиралися у відповідності з характером аналізованих даних. При аналізі за допомогою чотирипольних таблиць результати оцінювали в залежності від вихідних даних за критерієм Хі квадрат (при необхідності з поправкою Йеті) або по точному критерію Фішера. При проведенні факторного аналізу на першому етапі оцінювалася кількість значущих чинників, а потім проводився сам аналіз, за ??стандартною процедурою. Використовувався тип обертання - варімакс нормалізованності, як найбільш адекватний для характеру наявних даних.

ГЛАВА 3. ВЛАСНІ СПОСТЕРЕЖЕННЯ

3.1 Поширеність плазмід-індукованих механізмів резистентності серед хворих на хронічний пієлонефрит і супутній цукровий діабет 2 типу

Поширеність плазмід-індукованих механізмів резистентності серед хворих з ІСС варіює між країнами. Так, згідно опублікованих даних дослідження SENTRY, поширеність плазмідних механізмів стійкості до в-лактамів серед таких хворих складає 6,4% [29]. Щодо плазмід-індукованої резистентності до фторхінолонів, Longhi C та соавт. в своєму дослідженні демонструють такі рівні: 11% для амбулаторних пацієнтів з ІСС та 21% - для госпіталізованих [75]. Поширеність плазмід-індукованих механізмів резистентності серед збудників ІСС згідно даних дослідження SMART складає 11,6% для E. coli і 17,9% для K.pneumoniae [56]. А річний звіт європейської громади з епіднагляду за антимікробною резистентністю (EARS-Net) за 2012 рік, наголошує о 85-100% наявності плазмідних вЛРС серед уропатогенних штамів E. coli і K.pneumoniae, резистентних до 3-ї генерації цефалоспоринів [38]. Однак, в Україні, даних щодо розповсюдженості плазмід-індукованих механізмів резистентності серед пацієнтів з інфекціями сечової системи, зокрема ХП, нема.

Тому, завданням нашого дослідження було вивчити поширеність плазмід-індукованих механізмів резистентності серед хворих на хронічний пієлонефрит з і без супутнього ЦД 2 типу, та визначити основні види бактерій з наявністю плазмідних генів резистентності.

3.1.1 Виявлення плазмід-індукованих механізмів антибіотико-резистентності у хворих на хронічний пієлонефрит

Серед обстежених 105 хворих на ХП, у 31 (29,5%) були виявлені плазмід-індуковані механізми резистентності, серед яких у 20 (19%) хворих виявлені вЛРС, у 9 (9%) - гени резистентності до фторхінолонів та у 2 (2%) хворих - комбінація вЛРС і генів резистентності до фторхінолонів (малюнок 3.1).

Мал. 3.1 Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП.

Всього було виявлено 44 плазмідних генів резистентності: 30 (68,2%) вЛРС та 14 (31,8%) - генів стійкості до фторхінолонів. Серед 30 виявлених вЛРС було 11 (25%) генів blaTEM, 11 (25%) - blaCTX-M та 8 (18,2%) - blaSHV. Серед генів резистентності до фторхінолонів було виявлено 4 (9,1%) протеїна QnrА, 3 (6,8%) - аміноглікозид-ацетилтрансферази AAC(6')-Ib-cr, та 7 (15,9%) генів QepA (малюнок 3.2).

Мал. 3.2 Виявлення різних типів плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП.

Отже, виявляємість плазмід-індукованих механізмів резистентності серед хворих на ХП складає 29,5%. Найпоширенішими генами визначені вЛРС (19%), розповсюдження генів резистентності до фторхінолонів складає 9%, у 2% хворих - виявилася комбінація вЛРС і генів стійкості до фторхінолонів. Серед вЛРС, по виявляємості, домінували гени blaTEM і blaCTX-M; серед генів резистентності до фторхінолонів - efflux pump QepA.

3.1.2 Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності в залежності від наявності супутнього цукрового діабету 2 типу

В залежності від наявності супутньої патології - ЦД 2 типу, хворі були розподілені на 2 групи: І група - хворі на ХП із ЦД 2 типу, ІІ група - пацієнти із ХП без ЦД 2 типу. У пацієнтів на ХП і ЦД 2 типу, виявляємість плазмід-індукованих механізмів резистентності дещо вища і становить 31,5% (23/73), тоді як у пацієнтів із ХП без діабету - 25% (8/32), проте достовірних відмінностей між групами не виявлено.

В першій групі (n=73), всього було виявлено 28 (38,4%) плазмідних генів резистентності: 20 генів вЛРС та 8 генів стійкості до фторхінолонів. В другій групі (n=32), було виявлено 16 (50%) плазмідних генів резистентності: 10 генів вЛРС та 6 - генів стійкості до фторхінолонів (малюнок 3.3).

Мал. 3.3 Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП з і без супутнього ЦД 2 типу.

По типам виявлених генів, в І групі серед вЛРС переважали типи blaTEM і blaCTX-M, серед генів стійкості до фторхінолонів - протеїн QnrА. В ІІ групі - серед вЛРС також переважали типи blaTEM і blaCTX-M, серед генів стійкості до фторхінолонів - efflux pump QepA (малюнок 3.4).

Мал. 3.4 Виявлення різних типів плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП з і без супутнього ЦД 2 типу.

Отже, виявляємість плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП і супутнім ЦД 2 типу вище ніж у пацієнтів без діабету (31,5% vs. 25%), однак достовірних відмінностей між групами не виявлено. Серед генів стійкості до в-лактамів переважають в-лактамази типів blaTEM і blaCTX-M в обох групах, серед генів резистентності до фторхінолонів в І групі - протеїн QnrА, в ІІ групі - efflux pump QepA.

3.1.3 Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності серед збудників хронічного пієлонефриту

За результатами бактеріологічного дослідження сечі було виділено 120 патогенних збудників: 81 штам (67,5%) Грам-негативної флори, 34 (28,3%) - Грам-позитивні бактерії та 5 (4,2%) бактерій грибкової флори. Серед Г- бактерій домінуючим збудником виявилася E.coli (44%), серед Г+ флори - сімейство Enterococcus spp (14%). Типи виявлених збудників представлені на малюнку 3.5



Мал. 3.5 Виявлені збудники у хворих на ХП і ЦД 2 типу.

Серед 115 виділених штамів, 30 (26,1%) були продуцентами вЛРС. Максимум генів в-лактамаз було виділено у P.mirabilis - 4 (50%), виявлення вЛРС в штамах E.сoli склала 37,7%, K.pneumoniae - 22,2%. Серед Грам-позитивної флори, гени антибіотико-резистентності виявлені у 13,3% виділених бактерій. Найпоширенішими вЛРС були гени blaTEM і blaCTX-M з частотою виявлення 33.3% та 36.6% відповідно (таблиця 3.1).

Таблиця 3.1Виявляємість плазмідних вЛРС у збудників ХП

Збудники	Загальна кількість n (%)	ESBLs гени n (%)
		blaCTX-M	blaTEM	blaSHV
E. coli	20 (37.7)	6 (30)	10 (50)	4 (20)
K.pneumoniae	2 (22.2)	2 (100)	0 (0.0)	0 (0.0)
P.mirabilis	4 (50)	1 (25)	1 (25)	2 (50)
Staphylococcus spp.	1 (8.3)	1 (100)	0 (0.0)	0 (0.0)
Enterococcus spp.	2 (11.8)	1 (50)	0 (0.0)	1 (50)
Corynebacterium	1 (25)	0 (0.0)	0 (0.0)	1 (100)

Виявляємість плазмідних генів резистентності до фторхінолонів серед збудників ХП склала 12,2% (14/115). Найбільше генів резистентності було виявлено в штамах P.aeruginosa (50%), E.coli (15,1%) та P.mirabilis (12,5%). Серед Грам-позитивної флори, питома вага генів стійкості склала 11,8%. Найпоширенішими генами були виявлені efflux pump QepA та протеїн QnrА з частотою виявлення 42,8% та 35,7% відповідно (таблиця 3.2).

Таблиця 3.2 Виявляємість плазмідних генів резистентності до фторхінолонів у збудників ХП

Збудники	Загальна кількість n (%)	гени резистентності до фторхінолонів n (%)
		QnrА	AAC(6')-Ib-cr	QepA
E. coli	8 (15.1)	2 (25)	2 (25)	4 (50)
K.pneumoniae	1 (11.1)	0 (0.0)	0 (0.0)	1 (100)
P.mirabilis	1 (12.5)	0 (0.0)	1 (100)	0 (0.0)
P.aeruginosa	2 (50)	2 (100)	0 (0.0)	0 (0.0)
Enterococcus spp.	2 (11.8)	1 (50)	0 (0.0)	1 (50)

Із 30 вЛРС-продукуючих мікроорганізмів, у 6 (20%) виявлені різні комбінації генів. Патогенні бактерії E.coli мали: 2 штами - комбінацію QepA, blaTEM і blaCTX-M, 2 - blaTEM і blaCTX-M, і один штам мав комбінацію blaSHV і QnrА. В штамі P.mirabilis була виявлена комбінація 2 вЛРС: blaTEM і blaCTX-M (малюнок 3.6).

Мал. 3.6 Виявлені комбінації плазмід-індукованих механізмів резистентності серед збудників ХП.

Таким чином, виявлення плазмід-індукованих генних механізмів резистентності серед основних збудників ХП складає 38,3%. Виявляємість вЛРС складає 26,1%, генів резистентності до фторхінолонів - 12,2%. Максимум генів в-лактамаз було виділено в штамах P.mirabilis (50%), генів резистентності до фторхінолонів - в штамах P.aeruginosa (50%). В патогенних ізолятах E.coli було виявлено найбільшу кількість комбінацій генів стійкості.

Найпоширенішими вЛРС були виявлені типи blaTEM і blaCTX-M з частотою виявлення 33.3% та 36.6% відповідно. Серед генів резистентності до фторхінолонів домінували efflux pump QepA (42,8%) та протеїн QnrА (35,7%).

Поширеність плазмід-індукованих механізмів резистентності серед хворих на ХП складає 29,1%. Розповсюдження плазмідних вЛРС становило 19%, генів резистентності до фторхінолонів - 9%, у 2% хворих виявилася комбінація вЛРС і генів резистентності до фторхінолонів. Отже, спостерігається висока розповсюдженість плазмідних генів стійкості серед хворих на ХП, що, можливо, є однією із причин зниження ефективності лікування пієлонефриту, оскільки за даними офіційного реєстру хворих з ХХН в Україні за 2012 рік саме ХП в структурі причин ХХН V ст. займає провідну позицію [8]. Щодо даних світової статистики, ІСС є найбільш розповсюдженими інфекціями серед всіх бактеріальних інфекцій [40], і поширеність плазмідних механізмів стійкості серед таких хворих варіює від 6,4% згідно дослідження SENTRY [29] до 52% згідно даних Sharma M та співавт. [108]. Longhi C та співавт. в своєму дослідженні демонструють такі рівні плазмід-індукованої резистентності до фторхінолонів: 11% для амбулаторних пацієнтів з ІСС та 21% - для госпіталізованих [74]. Крім того, поширеність генів резистентності також щорічно зростає завдяки високій активності мобільних генетичних елементів - плазмід [38].

У хворих на ХП із супутнім ЦД 2 типу вивляємість плазмід-індукованих механізмів резистентності дещо вища і становить 31,5%, тоді як у пацієнтів без діабету - 25%, проте достовірних відмінностей не виявлено. Лікування ХП, особливо на тлі ЦД 2 типу, є досить складними завданням для клініцистів, і, можливо, однією із причин, є саме вплив плазмід-індукованих механізмів резистентності. По виявляємості домінували вЛРС як у пацієнтів із ХП і супутнім ЦД 2 типу, так і без останнього, хоча розповсюдженість плазмідних генів стійкості до фторхінолонів теж була доволі висока (11% для І групи, 19% - для ІІ групи). По даним різних авторів, ЦД є незалежним фактором ризику, що сприяє колонізації сечової системи бактеріями з плазмідними механізмами резистентності [45, 65]. Проте, в нашому дослідженні, достовірних відмінностей по виявляємості плазмідних генів резистентності серед хворих на ХП в залежності від наявності супутнього ЦД 2 типу, виявлено не було. Тому, у зв'язку з суперечливими даними, цей факт потребує подальших досліджень з метою підвищення ефективності АБТ.

Щодо розповсюдженості плазмід-індукованих механізмів резистентності серед основних збудників ХП, в нашому дослідженні вона складала 38,3%: 26,1% генів, що кодують вЛРС та 12,3% генів - що опосередковують резистентність до фторхінолонів. Максимум генів в-лактамаз було виділено у P.mirabilis - 4 (50%), виявлення вЛРС в штамах E.сoli склала 37,7%, K.pneumoniae - 22,2%. Найбільш поширеними визнані типи blaTEM і blaCTX-M. Найбільше генів резистентності до фторхінолонів було виявлено в штамах P.aeruginosa (50%), E.coli (15,1%) та P.mirabilis (12,5%). Домінуючими генами були efflux pump QepA та протеїн QnrА. В Європейських країнах, згідно даних річного звіту європейської громади з епіднагляду за антимікробною резистентністю (EARS-Net) за 2013 рік, поширеність вЛРС серед клінічних штамів E. coli і K.pneumoniae, резистентних до 3-ї генерації цефалоспоринів, варіює від 85-100% [38]. Поширеність плазмід-індукованих генів резистентності до фторхінолонів серед клінічних штамів Escherichia coli і K.pneumoniae в Таїланді становить 22,3% і 65,3% відповідно. За виявленням гени розташувалися в наступному порядку: aac (6 ') - Ib-cr, qnrS, qnrB і qnrA [87].

При інфекціях, викликаних вЛРС-продукуючими бактеріями, визначається висока частота перехресної резистентності, що обмежує застосування як фторхінолонів, так і аміноглікозидів [32]. Згідно даних Ferjani S та соавт., виявляємість плазмід-індукованих механізмів резистентності серед вЛРС-продукуючих бактерій склало 60% [39]. Дослідження GEIH-ESBL 2006 project демонструє виявлення протеїнів Qnr серед вЛРС-продукуючих мікроорганізмів, що склало 3,7%, а виявлення аміноглікозид-ацетилтрансферази (aac (6 ') - Ib-cr) - 16,2% [25]. В нашому дослідженні, виявлення плазмідних генів резистентності до фторхінолонів серед вЛРС-продукуючих мікроорганізмів становило 10%.

Висновки.

1. Поширеність плазмід-індукованих механізмів резистентності серед хворих на ХП становить 29,5%: 19% за рахунок вЛРС, 9% - складають гени резистентності до фторхінолонів та 2% хворих мають комбінацію вЛРС та генів стійкості до фторхінолонів. У пацієнтів на ХП і ЦД 2 типу, виявляємість плазмід-індукованих механізмів резистентності дещо вища - 31,5% (23/73), у пацієнтів із ХП без діабету - виявляємість становить 25% (8/32), проте достовірних відмінностей між групами не виявлено.

2. Виявляємість плазмід-індукованих механізмів резистентності серед збудників ХП становить 38,3%: 26,1% складають вЛРС, 12,2% - гени стійкості до фторхінолонів. Найбільш поширеними серед вЛРС були визначені типи blaTEM і blaCTX-M, серед генів стійкості до фторхінолонів - efflux pump QepA та протеїн QnrА.

3.2 Основні фактори, пов'язані з наявністю плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на хронічний пієлонефрит і супутній цукровий діабет 2 типу

Фактори, що можуть бути пов'язані з наявністю у хворого на ХП і супутній ЦД 2 типу плазмід-індукованих механізмів резистентності, вивчені недостатньо. Так, згідно досліджень, достовірними факторами ризику інфекції, спричиненої мікроорганізмами з плазмідними генами резистентності, є: чоловіча стать; вік 65 років і вище; випадок не давньої госпіталізації; лікування в попередні 3 місяці цефалоспоринами, пеніцилінами та фторхінолонами; захворювання простати; деменція; діабет [18, 126]. Проте, можливі взаємозв'язки між тривалістю ХП, наявністю ХХН різних стадій, супутньої обструкції сечовивідних шляхів, артеріальної гіпертензії у таких хворих, залишаються нез'ясованими. Крім того, невизначеними є вплив плазмід-індукованих механізмів резистентності на клінічну картину захворювання, ступінь активності ХП, а також можливі взаємозв'язки між вираженістю лейкоцитурії, протеїнурії, тощо, тобто основних клінічних характеристик пієлонефриту.

Встановлення факторів, що можуть бути пов'язані з колонізацією сечової системи бактеріями з плазмідними генами стійкості, дозволить відокремити основні категорії хворих на ХП і ЦД 2 типу, яким доцільно в план обстеження включати дослідження експресії плазмід-індукованих механізмів резистентності.

3.2.1 Вплив плазмід-індукованих механізмів резистентності на клінічні характеристики ХП

Для аналізу взаємозв'язків плазмідних генів резистентності з вираженістю клінічних симптомів, хворі з ХП були розподілені на 2 групи: група А - пацієнти з наявністю плазмідних генів резистентності; група В - пацієнти без генів стійкості. У хворих, що не мають генів резистентності, скарги на підвищення температури тіла вище 37,2?, дизурію, больовий та інтоксикаційний синдроми, пред'являло 55%, 47%, 95% та 100% хворих відповідно. Щодо пацієнтів з виявленими генами резистентності, у більшої половини (52,9%) спостерігається відсутність лихоманки, у 47% та 15% - відсутність сечового та больового синдромів відповідно (малюнок 3.7).

Малюнок 3.7 Виразність клінічних симптомів ХП в залежності від наявності плазмідних генів резистентності.

При об'єктивному обстеженні: середня температура тіла склала 37,3±0,07; підвищення АТ було виявлено у 71 (67,6%) хворих з ХП, середні показники: САТ - 140,3±2,4 мм.рт.ст.; ДАТ - 86,7±1,2 мм.рт.ст.; середній рівень частоти серцевих скорочень та пульсу склав 83,3±1,1 та 82,8±1,1 ударів за хвилину відповідно. Дані об'єктивного обстеження по групах представлено у таблиці 3.3.

Таблиця 3.3Показники об'єктивного обстеження пацієнтів з ХП в залежності від наявності плазмідних генів стійкості

	t? тіла	САТ (мм.рт.ст.)	ДАД (мм.рт.ст.)	ЧСС (уд/хв.)	PS (уд/хв.)
Група А	37,2±0,1	143,2±4,7	87,8±2,2	82,8±2,1	82,5±2,1
Група В	37,3±0,2	139,3±2,9	86,4±1,4	83,6±1,4	83±1,3

При лабораторному обстеженні, показники азотемії були підвищеними у 41 (39%) осіб, середній рівень креатиніну становив - 148,4±12,1 мкмоль/мл, сечовини - 9,32±0,56 ммоль/мл; в клінічному аналізі сечі відносна щільність в середньому склала 1013,5±0,6; при дослідженні сечового осаду лейкоцитурія мала місце у 85 (80,9%) пацієнтів, гематурія була виявлена у 35 (33,3%), альбумінурія зустрічалася у 32 (30,5%), протеїнурія у 23 (21,9%). При подальшому аналізі встановлено, що у пацієнтів, які мають гени резистентності, виявлено достовірно більші показники азотемії, альбумінурії та протеїнурії і достовірно нижчу ШКФ (таблиця 3.4).

Таблиця 3.4Дані лабораторних обстежень пацієнтів з ХП в залежності від наявності плазмідних генів стійкості

	ШКФ, мл/хв/1,73м2	Креатинін крові, мкмоль/л	Сечовина крові, ммоль/л	Загальний білок крові (г/л)	Альбумінурія (г/л)	Протеїнурія (г/л)
Група А	54,3±6,03	168,5±25,02	11,1±1,1	70,8±1,5	0,07±0,01	1,45±0,61
Група В	74,7±4,4	139,8±13,2	8,6±0,6	73,7±1,2	0,06±0,01	0,75±0,17

При проведенні аналізу між наявністю генів резистентності і виразністю лейкоцитурії, виявлено, що у пацієнтів без генів резистентності, питома вага цього лабораторного показника дещо вище ніж у хворих з виявленими генами стійкості (85% vs. 71%, p?0,05), малюнок 4.2.

Мал. 3.8 Виразність лейкоцитурії у хворих на ХП і ЦД 2 типу в залежності від наявності плазмідних генів резистентності.

При розподілі хворих за ступенем активності ХП, виявлено: І ст. активності мали 20 (19%) пацієнтів, ІІ ст. активності - 43 (40,9%), ІІІ ст. мала місце у 42 (40%) осіб. При наступному аналізі взаємозв'язків між наявністю генів стійкості і ступенем активності ХП встановлено, що у пацієнтів з І ст. активності ХП питома вага плазмідних генів достовірно вище (85%) порівняно з пацієнтами з ІІ ст. (18,6%, р<0,05) та ІІІ ст. (45,2%, р<0,05) активності. Виявлення різних типів плазмідних генів резистентності в залежності від ступеня активності пієлонефриту показано на малюнку 3.9.



Мал. 3.9 Виявлення плазмідних генів резистентності в залежності від ступеня активності ХП.

Примітка: ^* - при порівнянні І та ІІ ст. активності; ^** - при порівнянні ІІ та ІІІ ст. активності; ^*** - при порівнянні І та ІІІ ст. активності.

Отже, у пацієнтів з плазмідними генами резистентності, у більшої половини (52,9%) спостерігається відсутність лихоманки, у 47% та 15% - відсутність сечового та больового синдромів відповідно. Щодо лабораторних даних, показники азотемії були достовірно вище у пацієнтів з виділеними генами резистентності; питома вага лейкоцитурії була вище у пацієнтів без генів резистентності, проте достовірних відмінностей не виявлено; середні показники загального білку крові достовірно не відрізнялися поміж груп; середні значення альбумінурії та протеїнурії були достовірно вище у хворих з виділеними плазмідними генами резистентності. Проте, по критеріям активності ХП, пацієнти, що не мають плазмідних генів стійкості, були віднесені до ІІ та ІІІ ступеня (80% та 55% пацієнтів відповідно), тоді як 85% хворих з виявленими генами резистентності, були віднесені до І ступеня активності ХП.

3.2.3 Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП і ЦД 2 типу в залежності від стадії ХХН

При аналізі розповсюдженості плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих з різними стадіями ХХН, встановлено тенденцію до збільшення колонізації сечового тракту бактеріями с генами стійкості при прогресуванні ХХН. Так у хворих з ХХН І ст., частота виявлення генів резистентності склала 23,8%, з ХХН ІІ ст. - 28,6%, ХХН ІІІ ст. - 55,6% (р<0,05), а у пацієнтів з вираженою нирковою недостатністю ХХН ІV ст. - 55,2% (р<0,05). Виявлення різних типів плазмідних генів резистентності в залежності від стадії ХХН представлено на малюнку 3.10.

Мал. 3.10 Виявлення плазмідних генів резистентності у хворих на ХП в залежності від стадії ХХН.

Примітка: ^* - р?0,05 при порівнянні ХХН І та ІІІ ст. активності; ^** - р?0,05 при порівнянні І та ІV ст. ХХН.

При аналізі розповсюдженості плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП з і без супутнього ЦД 2 типу в залежності від стадії ХХН, встановлено, що при ХХН І ст., виявлення генів стійкості переважає у пацієнтів І групи (26% vs 0%), при ХХН ІІ ст. - у пацієнтів ІІ групи (40% vs 26%), проте найвища питома вага плазмідних генів резистентності спостерігається при ХХН ІІІ ст. та ХХН ІV ст. в обох групах (малюнок 3.11).



Мал. 3.11 Виявлення плазмідних генів резистентності у хворих на ХП з і без супутнього ЦД 2 типу в залежності від стадії ХХН.

При аналізі типів виявлених генів, встановлено, що серед хворих з ХХН І ст. переважають вЛРС типу blaSHV, та ефлюкс насос QepA; серед пацієнтів з ХХН ІІ ст. - гени blaTEM та blaCTX-M; з ХХН ІІІ ст. - вЛРС blaTEM та ефлюкс насос QepA; з ХХН ІVст. - вЛРС blaCTX-M та протеїн QnrА (таблиця 3.5).

Таблиця 3.5 Типи виявлених генів у хворих з різними стадіями ХХН

Гени	Стадії ХХН
	ХХН І ст..	ХХН ІІ ст..	ХХН ІІІ ст..	ХХН ІV ст..
blaCTX-M	0 (0,0%)	2 (7,1%)	4 (14,8%)	5 (17,2%)
blaTEM	0 (0,0%)	2 (7,1%)	5 (18,5%)	4 (13,8%)
blaSHV	2 (9,5%)	1 (3,6%)	3 (11,1%)	2 (6,9%)
QnrА	1 (4,8%)	1 (3,6%)	0 (0,0%)	2 (6,9%)
QepA	2 (9,5%)	1 (3,6%)	2 (7,4%)	2 (6,9%)
AAC(6 ')-Ib-cr	0 (0,0%)	1 (3,6%)	1 (3,7%)	1 (3,4%)

Отже, колонізація уропатогенів з плазмідними генами найвища у пацієнтів з начальною та вираженою нирковою недостатністю (ХХН ІІІ та ІV ст.), що простежується в усіх групах обстежених хворих. в-лактамази розширеного спектру дії були визначені як найбільш поширені плазмід-індуковані механізми резистентності.

3.2.4 Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП в залежності від наявності обструкції сечовивідних шляхів

Серед обстежених пацієнтів із ХП, обструкція сечовивідних шляхів була виявлена у 22 осіб. При аналізі розповсюдженості плазмід-індукованих механізмів резистентності в залежності від наявності обструкції, встановлено, що у пацієнтів з обструктивним пієлонефритом питома вага генів резистентності була дещо вище (45,5% vs 40,9%), проте достовірних відмінностей між групами не виявлено (малюнок 3.12).

Мал. 3.12 Виявлення плазмідних генів резистентності в залежності від наявності обструкції сечових шляхів.

У хворих на ХП з із без супутнього ЦД 2 типу, обструкція сечових шляхів була виявлена у 3 та 19 осіб відповідно. У пацієнтів із ХП без супутнього ЦД 2 типу, виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності склало 52,6%, проте, у хворих, що страждають ХП на тлі ЦД 2 типу, плазмідних генів стійкості виявлено не було. У пацієнтів з необструктивним пієлонефритом, виявлення генів стійкості в І групі склало 33,3%, в ІІ групі - 55,2% (малюнок 3.13)



Мал. 3.13 Виявлення плазмідних генів резистентності у хворих на ХП з і без супутнього ЦД 2 типу в залежності від наявності обструкції сечових шляхів.

При аналізі типів виявлених генів, встановлено, що серед хворих з обструктивним пієлонефритом переважають вЛРС типів blaTEM і blaCTX-M, серед генів резистентності до фторхінолонів - протеїн QnrА. У пацієнтів з необструктивним пієлонефритом, виявляємість 3-х типів вЛРС була однаковою, серед механізмів резистентності до фторхінолонів переважав ефлюкс насос QepA (таблиця 3.6).

Таблиця 3.6 Типи виявлених генів в залежності від наявності обструкції сечових шляхів

Гени	Обструктивний ПН	Необструктивний ПН
blaCTX-M	3 (13,6%)	8 (9,6%)
blaTEM	3 (13,6%)	8 (9,6%)
blaSHV	0 (0,0%)	8 (9,6%)
QnrА	2 (9,1%)	2 (2,4%)
QepA	1 (4,5%)	6 (7,2%)
AAC(6 ')-Ib-cr	1 (4,5%)	2 (2,4%)

Таким чином, у пацієнтів із ХП без супутнього ЦД 2 типу, проте з наявністю обструкції сечових шляхів, колонізація бактеріями з плазмідними генами резистентності вище ніж у пацієнтів з необструктивним пієлонефритом. Однак, у хворих, що страждають ХП на тлі ЦД 2 типу, виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності вище у пацієнтів з необструктивним пієлонефритом.

3.2.5 Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності у хворих на ХП і ЦД 2 типу в залежності від наявності епізодів перенесеної інфекції сечової системи (ІСС)

Серед обстежених пацієнтів, наявність епізоду перенесеної ІСС було відмічено у 11 осіб. Виявлення плазмід-індукованих механізмів резистентності серед цих хворих склало (63,6%). Серед чоловіків, наявність простатиту була відмічена у 4 осіб, серед яких у 3 (75%) були виявлені плазмідні гени стійкості. Серед жінок, епізод перенесеного циститу мав місце у 7 осіб, серед яких гени антибіотикорезистентності були виявлені у 4 (57,1%), малюнок 3.14.

...