Оваріальний резерв та його гормональна корекція при використанні програм допоміжних репродуктивних технологій

Таблиця 3.1. Середні показники об'єму яєчника та ЧАФ у обстежених пацієнток

Показник	Основна група	Контрольна група (n=30)
	I підгрупа (n=33)	II підгрупа (n=33)
Об'єм ПЯ (см3)	4,47±1,95	4,18±1,49	5,74±1,22
Об'єм ЛЯ (см3)	5,22±2,94	5,13±2,61	6,39±1,56
Середній об'єм (см3)	5,01±2,10	4,76±1,72	6,06±1,13
ЧАФ	6,88±2,06*	7,36±2,64*	19,97±7,26

Примітка.* - р<0,05 значима достовірність відмінностейпоказниківзконтролем.

Середні показники об'єму яєчника значно не відрізнялися в I та IIгрупі і складали 5,01±2,10 см³ та 4,76±1,72 см³ відповідно. Звертають на себе увагу дещо нижчий об'єм яєчників у пацієнток основної групи, порівняно з контрольною групою, що може пояснюватися перенесеними оперативними втручаннями за типом резекції яєчників та видалення кістозних утворень в анамнезі пацієнток з безпліддям.

Оцінка функціонування репродуктивної системи (табл. 3.3) проводилась за рахунок визначення таких гормональних показників як пролактин (ПРЛ), тестостерон (Т), кортизон (К) естрадіол (Е2), лютеїнізуючий гормон (ЛГ), фолікулостимулюючий гормон (ФСГ), та антимюллерів гормон (АМГ) у ранню фолікулярну фазу, окрім прогестерону (П), який визначався в лютеїновій фазі.

Рівні АМГ в основній групі коливались від 0,1 до 1,2 нг/мл, в контрольній групі від 1,2 до 2,5 нг/мл. Середній рівень АМГ у безплідних жінок з НОР 0,53±0,04 нг/мл був в 3 рази нижче, порівняно зі здоровими жінками-донорами 1,85±0,07 нг/мл (р<0,01). Середній рівень АМГ в I групі складав 0,48±0,05 нг/мл, вірогідно не відрізнялися від середнього показника АМГ в II групі, який складав 0,59±0,06 нг/мл, що свідчить на користь однорідності поділу основної групи за даним показником.

Рівень ФСГ в основній групі мав широкі коливання від 3,5 до 21 мМО/мл, середній показник складав 10,66±3,73 мМО/мл, що мало вірогідну різницю з контрольною групою, в якій рівень ФСГ мав меншу амплітуду коливання від 2,4 до 9,6 мМО/мл і в середньому складав 5,95±1,58 мМО/мл, що було в 2 рази нижче, ніж у жінок з безпліддям (р<0,05). Середній показник ФСГ не мав статистично значущої різниці між пацієнтами з безпліддям I та II групи.



Таблиця 3.2. Оцінка гормональних показників функціонування репродуктивної системи у обстежених груп

Показник	Основна група	Контрольна група (n= 30)
	I підгрупа (n= 33)	II підгрупа (n= 33)
Пролактин, мМО/мл	339,23±15,94*	283,82±19,27*	246,07±11,80
Прогестерон,нмоль/л	18,36±6,65*	24,15±8,41*	34,89±9,65
Тестостерон,нмоль/л	1,74±0,59*	1,69±0,62*	1,39±0,45
Естрадіол, пг/мл	39,98±16,59*	38,49±17,85*	23,50±7,15
Кортизол, нмоль/л	366,88±97,59*	289,39±22,48	278,50±66,73
ЛГ,мМО/мл	6,48±2,20	6,02±2,92	6,53±1,34
ФСГ, мМО/мл	11,29±3,55*	10,04±3,84*	5,95±1,58
АМГ, нг/мл	0,48±0,05*	0,59±0,06*	1,85±0,07

Примітка.* - р<0,05 значима достовірність відмінностейпоказниківзконтролем.

Рівні ЛГ у жінок з безпліддям коливались у межах нормативних значень від 2,3 до 11,9 мМО/мл, середній показник у I групі складав 6,48±2,20 мМО/мл, у II групі 6,02±2,92 мМО/мл. В контрольній групі рівень ЛГ коливався від 2,8 до 7,8 мМО/мл, середне значення складало 6,53±1,34 мМО/мл. Не знайдено статистично значущих відмінностей між середніми показниками ЛГ в основній та контрольній групах.

Стандарне відношення ЛГ / ФСГ= 1-1,5 у ранню фолікулярну фазу, спостерігалось лише у 24,2% (n=16) жінок основної групи та у 83,3% (n=25) жінок контрольної групи. Порушення відношення ЛГ / ФСГ у пацієнток основної групи відбувалося за рахунок високих концентрацій ФСГ у жінок пізнього репродуктивного віку, та характеризувало порушення з боку оваріального резерву (табл. 3.5).

Базальні рівні естрадіолу в основній групі коливались від 16,29 до 87,30 пг/мл, у середньому складали 39,98±16,59 пг/мл в I групі та 38,49±17,85 пг/мл в II групі, і вірогідно відрізнялись від середніх показників Е2 у контрольній групі 23,50±7,15 пг/мл (р<0,01). Високі рівні Е2 мали позитивні кореляційні зв'язки з віком, які представлені у табл.3.5.

Рівень ПРЛ у хворих на безпліддя жінок коливався від 145 до 507 мМО/мл. Високі рівні ПРЛ були зафіксовані в I групі 339,23±15,94 мМО/мл, порівняно зі здоровими жінками в контольній групі 246,07±11,80 мМО/мл, де рівні ПРЛ коливались від 132 до 360 мМО/мл (р<0,05).

Рівні тестостерону у жінок з безпліддям основної групи коливались від 0,3 до 3,9 нмоль/л та в 15 (22,7%) випадках перевищували нормативні значення (0,2-1,8 нмоль/л), проте середній показник складав 1,71±0,6 нмоль/л і вірогідно не відрізнявся від середнього показника контрольної групи 1,39±0,45 нмоль/л. Рівні тестостерону у здорових жінок контольної групи коливались від 0,4 до 2,3 нмоль/л і також спостерігалась тенденція до помірного підвищення рівню тестостерону в 5 (16,6%) випадках.

Середні рівні кортизолу були вищими у пацієнток з безпліддям в I групі 366,88±97,59 нмоль/л, порівняно з контрольною групою 278,50±66,73 нмоль/л (р<0,05), проте не перевищували нормативні значення в популяції.

Таблиця 3.3. Кореляційні залежності між рівнями гормонів репродуктивної системи у жінок з безпліддям

Показники	ПРЛ	П	Т	Е2	К	ЛГ	ФСГ	АМГ
ПРЛ	-	±±	±	-	-	±±	±±	±
П	±±	-	±	±	-	±±	±±	-
Т	-	-	-	-	±	±	±	-
Е2	±	±	-	-	-	±	±±	-
К	±	-	±	-	-	±	-	-
ЛГ	±	±	-	±	-	-	±	±
ФСГ	±±	±	-	±±	-	±±	-	±±
АМГ	±	±	±	±	±	±	±±	-

Примітки. ±± - значуща кореляція на рівні р<0,01; ± - значуща кореляція на рівні р<0,05; «-»- кореляція не значима або відсутня.

Аналіз гормональних показників функціонування репродуктивної системи, який подано в табл. 3.2, виявив статистично значущі відмінності між середніми показниками ФСГ, АМГ, ЛГ, ПРЛ, прогестерону та естрадіолу у жінок основної та контрольної групи, що пояснюється, в першу чергу, наявністю порушень з боку репродуктивної системи у пацієнток основної групи, що є характерним для клінічного перебігу безпліддя. Варто зауважити, що простежувались певні кореляційні зв'язки не тільки між гормональними показниками (табл.3.3), але й між гормональними показниками та віком жінки (Рис. 3.1). Сильну кореляційну залежність було виявлено з показниками ФСГ, АМГ, ЛГ, Е2 у жінок старше 33 років.

Рис. 3.1. Рівень гормональних показників функціонування репродуктивної системи залежно від вікових діапазонів у пацієнток з безпліддям.

Помітне підвищення рівня ФСГ починається у пацієнток після 33 років, зокрема, у жінок з безпліддям у вікових діапазонахз 34-37 років, 38-41 рік та 42-45 років. Вийняток з правила становили 6% жінок з безпліддям, у яких незважаючи на пізній репродуктивний вік ? 33 років спостерігались низькі рівні ФСГ < 8 мМО/мл, високі базальні рівні Е2 ? 35 пг/мл, низькі рівні АМГ < 1,0 нг/мл, які свідчили на користь зниженого оварільного резерву. Можливе пояснення базується на тому, що підвищена концентрація естрадіолу при нормальному рівні ФСГ є показником раннього дозрівання фолікула, яке може відбуватися в результаті передчасного підвищення рівня ФСГ в лютеїнову фазу. Естрогени, що виділилися у великій кількості, за принципом негативного зворотного зв'язку пригнічують секрецію ФСГ, таким чином маскуючи ФСГ-статус пацієнтки. Чітко простежується тенденція до зростання естрадіолу у пацієнток віком 38-41 років.

Рівні ЛГ мають слабкий кореляційний зв'язок відносно до вікових змін. Наглядно спостерігається втрата фізіологічного відношення ЛГ/ФСГ на рубежі 33 та 37 років, коли коефіцієнт співвідношення прагне до нульового значення.

Рівні АМГ мають чітку тенденцію до зниження у старших вікових групах. Мінімальні значення АМГ спостерігались у жінок після 40 років, проте існувало 7,5 % (n=5) виключень, коли у жінок з безпліддям старшої вікової групи 38-41 років (n=3) та 42-45 років (n=2), спостерігались відносно високі рівні АМГ від 0,9 до 1,1 нг/мл, що свідчило на користь збереженого оваріального резерву та позитивно корелювало з високим ЧАФ у цих пацієнток.

Для доповнення уявлення про гормональну ланку функціонування репродуктивної системи та виключення супутньої ендокринної патології детально досліджувалась функція щитоподібної залози за допомогою наступних показників: тиреотропного гормону (ТТГ), загального та вільного тироксину (Т4), загального та вільного трийодтироніну (Т3), та антитіл до тиреопероксидази (ТПО). Гормональні показники, що характеризували стан щитоподібної залози представлені у таблиці 3.4.

Таблиця 3.4. Показники функції щитоподібної залози у обстежених жінок

Показник	Основна група	Контрольна група (n= 30)
	I підгрупа (n= 33)	II підгрупа (n= 33)
ТТГ, мкМО/мл	2,11±0,56* (n= 22)	1,93±0,78 (n= 23)	1,63±0,98 (n= 23)
Т4 загальний, нмоль/л	98,13±13,98* (n= 20)	108,31±20,82* (n= 20)	120,88±19,65 (n= 20)
Т4 вільний, пмоль/л	15,15±2,75 (n= 23)	14,02±2,68 (n= 23)	15,89±3,11 (n= 21)
Т3 загальний, нмоль/л	1,53±0,23* (n= 23)	1,56±0,37* (n= 23)	2,11±0,88 (n= 23)
Т3 вільний, пг/мл	1,25±0,77* (n= 23)	1,76±0,49* (n= 21)	2,08±0,67 (n= 23)
Антитіла до ТПО мО/мл	10,71±2,67 (n= 23)	11,98±3,88* (n= 21)	9,89±3,11 (n= 23)

Примітка. * - р<0,05 достовірність відмінностей показників з контролем

Оцінка функції щитоподібної залози за допомогою вищезгаданих маркерів не виявила вірогідних відмінностей між групами дослідження та контролю. Середній вміст тиреоїдних гормонів не відрізнявся від нормативного інтервалу значень у загальній популяції.

Таким чином, оцінка стану ОР за допомогою ОРТ полягає у визначенні вікових, анамнестичних, клінічних, інструментальних та гормональних особливостей. Показниками, що свідчать на користь зниження ОР є пізній репродуктивній вік жінки, вкорочення менструального циклу, операції на яєчниках. Однак загально-клінічні методи оцінки характеризуються низькою специфічністю, тому на підставі їх аналізу практично неможливо створити патогенетично обумовлений прогностичний алгоритм оваріальної відповіді в програмах ДРТ. Більш інформативними є лабораторні методи діагностики.

На цей час запропоновано багато лабораторних методів оцінки стану ОР, однак рівень їх інформативності та доступності у жінок з НОР не завжди достатній. Рівень доказовості традиційних методів дослідження, зокрема гормональних показників, які найбільш широко розповсюджені, недостатній. Найбільшою інформативністю характеризується метод визначення ЧАФ.

Вищевикладене свідчить про перспективність розробки нового методу патогенетичної оцінки стану ОР та прогнозування НВЯ.



Розділ 4. Оцінка маркерів оксидативного стресу у жінок з безпліддям в програмах дрт

Відомо, що в патогенезі НВЯ мають місце загальні окисні реакції організму різного ступеня вираженості у відповідь на безпосередню дію ОС під час стимуляції ГТ. Патофізіологічні процеси, що при цьому виникають, у тому числі в фолікулярній рідині, можуть виступати в якості основної патогенетичної ланки зниження оваріальної відповіді на КОС в програмах ДРТ. Вивчення цієї проблеми дозволить не тільки розкрити невідомі раніше сторони патогенезу НВЯ окисної етіології, але й визначити нові однотипні підходи до ведення цієї категорії хворих та розширити можливості лікувального впливу на патологічний процес у цих пацієнтів.

Поряд із дослідженням гормональних показників функціонування репродуктивної системи в сироватці крові були визначені діагностичні властивості показників, що маркують рівень ОС під час дозрівання ооциту - вміст мелатоніну та 8-ізопростану, що є одним із ключових ферментів ефекторного ланцюга окисних процесів в фолікулярній рідині.

4.1 Діагностичні властивості маркерів ОС мелатоніну та 8-ізопростану в сироватці крові в програмах ДРТ

Досліджувану основну групу склали 66 хворих на безпліддя жінок з НОР, очікуваних «поганих відповідачів» відповідно до Болонських критерів. Трубно-перитонеальний генез безпліддя був підтверджений за допомогою МСГ. Контрольну групу склали 30 здорових жінок репродуктивного віку, донорів яйцеклітин.

Перед початком протоколу КОС поряд зі стандартним обстеженням на рівні гормонів, були визначені показники МЛТ та 8-ізопростану в сироватці крові за вищеописаними методиками (табл. 4.1).



Таблиця 4.1. Середні показники вмісту мелатоніну та 8-ізопростану у сироватці крові у обстежених жінок на старті КОС

Показник	Основна група (n=66)	Контрольна група (n=30)
Мелатонін, пг/мл	21,60±4,77*	37,55±6,65
8-ізопростан, пг/мл	66,87±10,51*	44,61±13,96

Примітка.* - р<0,001 значима достовірність відмінностейпоказниківзконтролем.

Рівні мелатоніну в сироватці крові пацієнток з безпліддям коливались від 14,80 до 35,04 пг/мл, середне значення складало 21,60±4,77 пг/мл, медіана і мода складали 19,44 і 19,08, відповідно, що свідчить про відносно симетричний розподіл даних. У контрольній групі рівні мелатоніну коливались від 18,10 до 47,36 пг/мл, середній показник складав 37,55±6,65, що в 1,73 рази перевищувало показники основної групи (р<0,001).

Індивідуальний інтервал вмісту 8-ізопростану в сироватці крові обстежених жінок в основній групі коливався від 32,27 до 81,34 пг/мл, середній показник і медіана складали 66,87±10,51 пг/мл та 67,47 пг/мл відповідно і в 1,5 рази перевищували показники контрольної групи (р<0,001).

На рис. 4.1.1 подані результати розподілу значень МЛТ у жінок з безпліддям та в контрольній групі. Як видно, обидва розподіли є нормальними. В контрольній групі мода відповідає інтервалу значень показника 30-40 пг/мл, а у хворих на безпліддя жінок - 15-25 пг/мл. При цьому у хворих на безпліддя жінок мода розподілу зміщена ліворуч, тобто в ділянку нижчих значень показників.

Крім цього, розподіли значень в обох групах є нормальними, а ділянка перехрещення розподілів стосується інтервалу значень МЛТ від 20 до 35 пг/мл. У цьому зв'язку для визначення діагностичної чутливості та специфічності вмісту МЛТ у сироватці крові були проаналізовані його інтервальні значення у хворих на безпліддя жінок та в контрольній групі.

Діапазон показників МЛТ у сироватці крові від 30 до 40 пг/мл був специфічнимдля контролю, тому що значення 30-40 пг/мл буливиявленіу 50%осіб контрольноїгрупи. При цьому, цей спектр показників не визначався середхворих на безпліддя жінок (р <0,001) (табл. 4.2).

Рис. 4.1. Характеристика розподілів значень МЛТ у сироватці крові у обстежених груп.

Інтервал значень МЛТ від 30 пг/мл до 40 пг/мл виявився відносно специфічним для контролю, тому що в 5 разів частіше визначався серед осіб контрольної групи (відповідно в 70% і 13%; р<0,001). Значення МЛТ в сироватці крові <25 пг/мл були специфічними для хворих на безпліддя жінок з НОР. Вони визначалися у 87% хворих і майже не виявлялися в контрольній групі (7%; р<0,001).

Таблиця 4.2. Характеристика рівнів МЛТ у сироватці крові у обстежених пацієнток

Значення показника, нг/мл	Основна група (n=66)	Контрольна група (n=30)	Р
	абс.	%	абс.	%
14-19	11	17	0	0	<0,001
20-24	33	50	2	7	<0,001
25-29	13	20	5	16	<0,001
30-34	8	11	11	40	<0,001
35-39	1	2	10	30	<0,001
40-47	0	0	2	7	<0,001



Примітка. р<0,001 - значима достовірність відмінностей показників з контролем.

На підставі даних табл. 4.1.1 була визначена діагностична чутливість і специфічність МЛТ в сироватці крові жінок, хворих на безпліддя з НОР. Діагностична чутливість мала значення 87%, а специфічність 73%.

Рис. 4.2. Характеристика розподілів значень 8-ІЗП в сироватці крові у обстежених груп

На Рис. 4.2 відображені результати розподілу значень 8-ІЗП у жінок основної та контрольної груп. Як видно, обидва розподіли є нормальними. В контрольній групі мода відповідає інтервалу значень показника 40-50 пг/мл, а у хворих на безпліддя жінок - 60-70 пг/мл. При цьому у хворих на безпліддя жінок мода розподілу зміщена праворуч, тобто в область більш високих значень. Крім цього, розподіли значень в обох групах є нормальними, а область перехрещення розподілів стосується інтервалу значень 8-ІЗП від 50 до 65 пг/мл. У цьому зв'язку для визначення діагностичної чутливості та специфічності вмісту 8-ІЗП в сироватці крові були проаналізовані його інтервальні значення у хворих на безпліддя жінок та в контрольній групі.

Діапазон показників 8-ІЗП в сироватці крові від 30 до 49 пг/мл був специфічним для контролю, тому що значення 40-49 пг/мл були виявлені у 50% осіб контрольної групи. При цьому, цей спектр показників майже не визначався серед хворих на безпліддя жінок (9%; р <0,001) (табл. 4.3).

На підставі даних табл. 4.1.1 була визначена діагностична чутливість і специфічність 8-ІЗП в сироватці крові жінок з НОР. Діагностична чутливість складала 90%, а специфічність 81%.

Таблиця 4.3. Харкатеристика рівнів 8-ІЗП у сироватці крові у обстежених груп

Значення показника, нг/мл	Основна группа (n=66)	Контрольна група (n=30)	P
	абс.	%	абс.	%	<0,001
30-39	2	3	5	17	<0,001
40-49	4	6	15	50	<0,001
50-59	9	14	7	21	<0,001
60-69	26	39	1	3	<0,001
70-79	21	32	1	3	<0,001
80-85	4	6	1	3	<0,001

Примітка. р<0,001 - значима достовірність відмінностей показників з контролем.

Аналізуючі показники МЛТ та 8-ІЗП в сироватці крові у жінок з безпліддям і здорових жінок-донорів, визначено, що більш високі показники МЛТ (37,55±6,65), які відповідають за антиоксидантий захист, частіше зустрічаються в контрольній групі, порівняно з основною групою (21,60±4,77), р<0,001, а більш високі значення 8-ІЗП (66,87±10,51), які свідчать про рівень ОС, спостерігаються у жінок з безпліддям, порівняно зі здоровими жінками контрольної групи(44,61±13,96), р<0,001. Це може бути пов'язано не тільки з особливістю перебігу основного захворювання у жінок з безпліддям, але і з різницею в віковій структурі між цими групами.

Віковий склад основної групи коливався від 24 до 45 років, середній вік складав 36,00±4,86 років, медіана знаходилась на рівні 36 років, в контрольній групі коливався від 23 до 35, середній вік складав 28,67±2,61 років, медіана знаходилась на рівні 28 років (табл.4.1.3). Вікова структура пацієнток основної групи відрізнялась від вікової структури пацієнток контрольної групи, за рахунок домінантного вікового інтервалу на рівні 30-40 років, в якому знаходилось більше 80% пацієнток з безпліддям.

Рис. 4.3. Характеристика розподілів вікових значень у обстежених груп

Крім цього, розподіли значень в обох групах є нормальними, а область перехрещення розподілів стосується інтервалу вікових зачень від 26 до 37 років, у якому знаходяться 50% пацієнток основної групи і 38% пацієнток контрольної групи (рис. 4.3). Цей інтервал дозволяє порівнювати кількісні показники між досліджуваними групами.

Звертає на себе увагу тенденція розподілу маркерів ОС всередині досліджуваних груп згідно до вікових діапазонів (рис.4.4). Аналізуючи вміст МЛТ в сироватці крові у пацієнток з безпліддям була визначена тенденція до зниження цього показника з віком. Так у пацієнток вікового діапазону 20-25 років середні рівні МЛТ складали 27,51±3,8 пг/мл, тоді як у пацієнток 42-45 років середній показник складав 22,87±2,28 пг/мл (р<0,05).

Середні рівні 8-ІЗП мали тенденції до підвищення показників у більш старших вікових групах. Так у пацієнток 20-25 років середні рівні 8-ІЗП були вірогідно вищими і складали 43,47±6,4 пг/мл порівняно жінками 42-45 років 61,43±8,4 пг/мл, де рівні 8-ІЗП були максимальними (р<0,05). Аналіз залежностей у системі МЛТ - 8-ІЗП визначив зворотній кореляційний зв'язок між показниками.

Рис. 4.4. Розподіл маркерів ОС відповідно до вікових діапазонів у пацієнток з безпліддям основної групи

Враховуючи різницю вікової структури пацієнток основної та контрольної групи, було проаналізовано залежність маркерів ОС відносно вікових діапазонів у здорових жінок.

Зниження вмісту МЛТ спостерігається після 30-33 років, порівняно з більш молодшими групами (рис. 4.4). Проте середні рівні МЛТ залишаються вірогідно вищими 33,77±4,5 пг/мл, порівняно з пацієнтками з безпліддям - 19,86±3,8 нг/мл (р<0,01) (рис. 4.5). Дослідження не виявило вірогідного зниження 8-ІЗП з віком, це пояснюється більш молодою структурою пацієнток контрольної групи, що не дозволяє відстежити дану тенденцію у жінок-донорів.



Рис. 4.5. Розподіл маркерів ОС згідно до вікових діапазонів у пацієнток контрольної групи.

На основі отриманих даних були розроблені нормативні показники 8-ІЗП та МЛТ в сироватці крові для жінок репродуктивного віку, які приведені у таблиці 4.4.

Таблиця 4.4. Нормативні значення МЛТ та 8-ІЗП у сироватці крові здорових жінок репродуктивного віку

МЛТ	30,9 - 44,1	пг/мл
8-ІЗП	30,65 - 58,57	пг/мл

Рекомендовані нормативні значення МЛТ (30,9 - 44,1 пг/мл) у сироватці крові можуть використовуватися для оцінки роботи АОС, зокрема мелатонін-антиоксидантного захисту в організмі жінки репродуктивного віку у дослідженому віковому діапазоні 25-35 років, за умови додержання практичних рекомендацій щодо застосування методу. Потребують подальшого вивчення вікові зміни рівнів МЛТ у сироватці крові у розширених вікових діапазонах, у тому числі в періоді встановлення репродуктивної функції та перименопаузальному періоді. Використання маркеру МЛТ може бути корисним для контролю ефективності патогенетичної терапії, направленої на боротьбу з ОС в організмі.

Запропоновані нормативні значення 8-ІЗП (30,65 - 58,57 пг/мл) у жінок репродуктивного віку можуть використовуватися для оцінки рівня ОС в організмі, проте 8-ІЗП є високочутливим маркером оксидативних реакцій при багатьох дегенеративних та запальних захворюваннях. Його роль в діагностиці патогенетичних порушень при захворюваннях репродуктивної системи, зокрема безплідді, потребує подальшого вивчення безпосередньо у патогенному локусі. Для формування повноцінного уявлення щодо активності оксидативного стресу доцільно поєднання визначення маркеру ОС 8-ІЗП з маркером роботи АОС, наприклад МЛТ.

4.2 Динаміка показників оксидативного стресу в сироватці крові та фолікулярній рідині під впливом КОС

Наступним етапом в оцінці діагностичної значимості маркерів ОС було визначення показників МЛТ та 8-ІЗП в фолікулярній рідині (табл.4.5). Під час дозрівання ооциту в фолікулі накопичуються АФК, які призводять до ОС. В умовах оваріальної стимуляції ГТ множинне зростання фолікулів призводить до активізації процесів перекисного окислення ліпідів мембранних структур всередині фолікула, що безперечно впливає на якість ооцитів.

Таблиця 4.5. Показники рівнів оксидативного стресу в фолікулярній рідині у обстежених жінок

Назва	Основна група	Контрольна група (n = 30)
	I група (n = 30/33)	II група (n = 33)
МЛТ, пг/мл	33,86±5,76**	58,41±4,96	62,08±11,99
8-ІЗП, пг/мл	346,05±65,13**	256,53±53,76*	209,73±33,83

Примітка. 1. **- р<0,001 достовірність відмінностей показників з контролем.

2.* - р<0,01достовірність відмінностей показників з контролем.

Підвищений вміст 8-ІЗП та знижений рівень МЛТ у фолікулярній рідині у пацієнток I групи свідчить про високий рівень ОС та зниження антиоксидантної активності під час КОС. Це може бути обумовлене більш високими дозами ГТ у зв'язку з низькою оваріальною відповіддю під час стандартних протоколів КОС у пацієнток I групи. Середні показники МЛТ в фолікулярній рідині у пацієнток I групи складали 33,86±5,76 пг/мл, які були у 1,5 рази нижче за середні показники в II групі 58,41±4,96 пг/мл (р<0,05), і в 1,8 рази нижче середніх показників контрольної групи 62,08±11,99 пг/мл (р<0,001). Тоді як рівні 8-ІЗП в цій групі були найвищими, і складали 346,05±65,13 пг/мл, що свідчіть на користь високої активності ОС в фолікулярній рідині.

Заслуговують увагу рівні МЛТ та 8-ІЗП в фолікулярній рідині II групи, яка отримувала протокол КОС з мелатоніном. На користь антиоксидантного впливу цього препарату свідчать нижчі рівні 8-ІЗП 256,53±53,76 пг/мл, порівняно з I групою 346,05±65,13 пг/мл (р<0,001), яка знаходилась в таких же умовах, проте не отримувала АМГТ. Для оцінки оксидативного впливу ГТ під час КОС проведено динамічну оцінку показників ОС (табл. 4.6).

Таблиця 4.6. Динаміка показників оксидативного стресу у сироватці крові обстежених груп

Назва	Основна група	Контрольна група (n = 30)
	I група (n = 33)	II група (n = 33)
	На старті	Після КОС	На старті	Після КОС	На старті	Після КОС
МЛТ, пг/мл	23,32 ± 5,11**	8,25 ± 1,24	25,04 ± 4,93*	7,97 ± 1,38	37,55±6,55	8,87±1,89
8-ІЗП, пг/мл	56,87 ± 10,51*	1061,70 ± 173,26**	54,89 ± 11,60*	313,89 ± 41,22*	44,41±13,96	352,82 ± 68,60



Примітка. 1. **- р <0,001 достовірність відмінностей показників з контролем.

2.* - р <0,01достовірність відмінностей показників з контролем.

Оцінювались рівні МЛТ та 8-ІЗП у сироватці крові до початку стимуляції (на старті протоколу) у пацієнток з безпліддям, яким застосовано стандартний протокол КОС (I група), у пацієнток з безпліддям, яким застосовано модифікований протокол КОС з АМГТ (II група), пацієнткам контрольної групи, яким застосовано стандартний протокол КОС, та після завершення стимуляції мультифолікулярного зростання ГТ перед призначенням тригерної дози ХГ. Динаміка показників ОС в сироватці крові до і після протоколів КОС, свідчить про виражений оксидативний вплив ГТ на організм. Під впливом ГТ рівні 8-ІЗП збільшуються в десятки разів, що відображають показники I групи: на старті протоколу середні рівні 8-ІЗП складали 56,87 ± 10,51 пг/мл, що в 20 разів менше порівняно з 1061,70±173,26 пг/мл (р<0,001) після стандартного протоколу КОС. Рівні МЛТ також мають тенденцію до зниження в ході КОС. У пацієнток I групи на старті протоколу КОС середні значення МЛТ складали 23,32±5,11 пг/мл, порівняно з 8,25±1,24 після протоколу стимуляції (р<0,001). Така ж тенденція відмічається і у пацієнтів II групи, які додатково отримували препарати мелатоніну, початкові рівні МЛТ в сироватці крові скаладали 25,04 ± 4,93 пг/мл і вірогідно не відрізнялися від I групи. Після КОС спостерігалось вірогідне зниження в 3,5 разів рівнів МЛТ, порівняно зі стартом протоколу 7,97±1,38 пг/мл (р<0,001). Хоча АМГТ не підвищує рівні МЛТ в сироватці крові хворих на безпліддя пацієнток в програмах ДРТ, проте вона вірогідно зменшує рівень ОС, про що свідчить в 3 рази нижчій вміст 8-ІЗП - 313,89±41,22 пг/мл, порівняно з I групою- 1061,70±173,26 пг/мл (р<0,001), і в 1,2 рази порівняно з КГ - 352,82±68,60 пг/мл (р<0,01) у фолікулярній рідині II групи, яка отримувала модифікований протокол КОС.

Підсумовуючі результати досліджень маркерів оксидативного стресу, перш за все, слід відмітити, що рівні МЛТ та 8-ІЗП повязані між собою зворотнім кореляційним зв'язком. Більш високим рівням 8-ІЗП відповідають низькі рівні МЛТ і, навпаки, при збільшенні вмісту МЛТ в біологічних зразках рівень 8-ІЗП зменшується. Розроблені нормативні значення МЛТ та 8-ІЗП в сироватці крові у жінок репродуктивного віку доповнюють уявлення про активність ОС та ступінь природного антиоксидантного захисту в організмі. Використання маркерів ОС дозволяє сформувати патогенетичний підхід у використання антиоксидантної терапії та оцінити ії ефективність.

КОС з використанням ГТ викликає підвищення активності ОС в організмі, про що свідчать вірогідні збільшення рівнів 8-ІЗП в сироватці крові.Збільшена концентрація МЛТ в фолікулярній рідині, порівняно з сироваткою крові, у здорових жінок свідчить про запуск природних механізмів захисту зріючої яйцеклітини від руйнівної дії ОС за рахунок потужних антиоксидантів, зокрема мелатоніну.Модифіковані схеми КОС з АМГТ вірогідно зменшують рівні 8-ІЗП в сироватці крові та фолікулярній рідині пацієнток з безпліддям, порівняно зі стандартними протоколами КОС, однак, повної нормалізації показників не спостерігалося. Вивчення чутливості та специфічності окремих маркерів ОС дозволило розробити алгоритм диференційної діагностики окисних порушень під час КОС з високим ступенем інформативності та надійності.



Розділ 5. Проведення контрольованої стимуляції яєчниківу жінок з низьким оваріальним резервом

Результати дослідження, наведені у попередніх розділах, дозволили визначити напрямки підвищення ефективності лікування безпліддя методиками ДРТ. Головним з них є швидка патогенетична оцінка стану оваріального резерву та покращення оваріальної відповіді у жінок з НОР, за рахунок своєчасного лікування порушень оваріального резерву.

Основним напрямком поліпшення результатів лікування безпліддя методиками ДРТ є раціональний вибір схем контрольованої оваріальної стимуляції у жінок з НОР та ад'ювантної терапії, направленої на корекцію патогенетичних порушень під час стимуляції ГТ. Необхідність додаткових методів впливу обумовлена підвищенням активності ОС, руйнуючою дією АФК на клітинні структури під час КОС в програмах ДРТ. Важливими напрямками є корекція активності ОС в фолікулярній рідині під час дозрівання яйцеклітин, підвищення рівнів антиоксидантного захисту організму за рахунок модифікації протоколів КОС призначенням ад'ювантної мелатонін-гормонотерапії (АМГТ).

Проблема НВЯ займає від 20-44% у структурі ДРТ і набуває поширення за рахунок щорічної тенденції до збільшення кількості жінок пізнього репродуктивного віку в програмах ДРТ. Загальновідомим є той факт, що репродуктивний потенціал, зокрема ОР, зазнає генетично-детермінованих вікових змін, направлених на інволюцію фолікулярного апарата яєчників, що призводить до розвитку НВЯ. Високі рівні ОС від час стимуляції ГТ завдають додаткового руйнівного впливу на зріючі фолікули і зменшують як кількість, так і якість отриманих яйцеклітин.

На теперішній час є достатньо великий арсенал лікарських засобів для проведення КОС в програмах ДРТ. Існуючі протоколи стимуляції направлені, насамперед, на індукцію суперовуляції. Основними етапами більшості стандартних протоколів ДРТ у жінок з трубно-перитонеальним безпліддям є комплексне обстеження подружньої пари, з оцінкою можливих інфекційних захворювань та їх етіотропним лікуванням; оцінка гормональних показників функціонування репродуктивної системи (ФСГ, П, Е2, ПРЛ, ЛГ, Т) та стану ОР (АМГ), за умови відсутності глибоких порушень - визначення типу КОС та дати старту протоколу; проведення безпосередньо КОС з гормонально-іструментальної оцінки її ефективності (рівні естрадіолу, УЗД-моніторинг зростаючих фолікулів), після досягнення лідуючого фолікула розміром 18 мм в діаметрі призначення тригеру остаточного дозрівання фолікулів - ХГЧ і визначення часу пункції; підготовка ендометрію матки; проведення аспірації вмісту фолікулів за допомогою трансвагінальної пункції, відокремлення та оцінка отриманих яйцеклітин, запліднення in vitro, або ІКСІ за необхідністю; подальше культивування отриманих ембріонів в умовах ембріологічної лабораторії та перенесення 1-2 морфологічно найкращіх ембріонів в порожнину матки; експрес тест на в-ХГЧ на 14 добу та УЗД підтвердження клінічної вагітності; підтримка лютеїнової фази на ранніх термінах вагітності. До стандартного протоколу ЕКЗ не входить оцінка ступеня ризику НВЯ, або «відміни цикла» за допомогою УЗД підрахунку ЧАФ та визначення показників активності ОС (8-ІЗП) та роботи АОС (МЛТ), які значно доповнють уявлення про ступінь гормонально-метаболічних порушень у пацієнток з НОР і жінок після 33 років, і дозволяють своєчасно їх коригувати.

До теперішнього часу «золотим стандартом» у лікуванні безпліддя у пацієнтів з НОР була зміна протоколу КОС або збільшення дози ГТ, але у зв'язку з низкою недоліків та відсутністю доведеної ефективності цих заходів триває пошук альтернативних методик.

Ефективність застосування антиоксидантної терапії в програмах ДРТ на сьогоднішній момент є достатньо доведеною методами доказової медицини [123,126,128,178], особливо у пацієнтів з НОР. Однак оцінка фармакологічної дії існуючих засобів свідчить про відсутність патогенетичного обґрунтування їх застосування. Доцільність використання АМГТ, на відміну від інших засобів гормональної корекції оваріального резерву та роботи АОС, є патогенетично обґрунтованою нашими дослідженнями. Високі рівні показників ОС у сироватці крові та фолікулярній рідині, низькі рівні ендогенних антиоксидантів при стимуляції ГТ у пацієнток з НОР, спонукали до створення нового напрямку гормональної корекції оксидативних порушень з метою покращення оваріальної відповіді і якості отриманих яйцеклітин. В зв'язку з цим призначення МЛТ для покращення оваріальної відповіді під час КОС відповідає сучасним уявленням терапії окисних порушень, яка ґрунтується на клініко-лабораторній діагностиці. Проблему вибору ефективного протоколу стимуляції у жінок з НОР у даний час вирішують за допомогою використання двох протоколів КОС: «довгого протоколу» з а-ГнРГ та «короткого протоколу» с ант-ГнРГ.

Насамперед, була вивчена ефективність своєчасного призначення АМГТ у хворих на безпліддя жінок з НОР в програмах ДРТ. Загалом у цей фрагмент дослідження увійшли 60 жінок з безпліддям, тривалістю більше 5 років та встановленою трубно-перитонеальною етіологією захворювання, які були розподілені на дві групи. Для проведення порівняльної оцінки ефективності використовуваних схем I група (n=33, стандартий протокол КОС без АМГТ) та II група (n=33, стандартий протокол КОС з АМГТ) методом простої рандомізації були розділені на чотири підгрупи залежно від лікувальної схеми:

- Iа підгрупа «довгий протокол» з а-ГнРГ+лМГ, n=16

- Ib підгрупа «короткий протокол» з ант-ГнРГ+лМГ, n=17

- IIа підгрупа «довгий протокол» з а-ГнРГ+лМГ+АМГТ, n=16

- IIb підгрупа «короткий протокол» з ант-ГнРГ+лМГ+АМГТ, n=17.

Застосування патогенетичної терапії, направленої на зменшення рівнів оксидативного стресу в залежності від стану оваріального резерву представлена на Рис 5.1



Рис. 5. 1. Схема застосування КОС з АМГТ залежно від стану ОР і рівнів оксидативного стресу у пацієнток з безпліддям.

У пацієнток Iа підгрупи застосовували «довгий протокол» за стандартною методикою з використанням а-ГнРГ для щоденного підшкірного введення по 0,05-0,1 мг з середини лютеїнової фази попереднього менструального циклу до дня введення «овуляторної» дози ХГ.

При зниженні рівня сироваткового Е2 на 20-30% (3-5й день циклу) на 21 день починали стимуляцію суперовуляції препаратом людським менопаузальним гормоном по 3-5 ампул індивідуально. Стимуляція проводилася до дня досягнення лідируючими фолікулами діаметра 18-20 мм, що визначалось під час трансвагінальної ехографії та відповідній активності стероїдогенезу, після чого призначали ін'єкцію «овуляторної» дози ХГ.

У пацієнток IIа підгрупи застосовували «довгий протокол» за вищеописаною методикою з завчасним додаванням 3 мг мелатоніну 1 раз на добу перед сном незалежно від прийому їжі, протягом 2 тиж. до початку стимуляції та на протязі всього часу КОС, відміна мелатоніну виконувалась в день ін'єкції «овуляторної» дози ХГ.

У пацієнток Ib групи був використаний «короткий протокол» з ант-ГнРГ - стимуляція суперовуляції починалася з 2-3го дня менструального циклу так само за допомогою препарату лМГ, щоденна доза якого становила 3-5 ампули індивідуально залежно від даних ультразвукового та гормонального моніторингу. Для запобігання овуляторному піку ЛГ підшкірно вводився антагоніст ГнРГ у дозі 0,25 мг з 5-6го дня стимуляції суперовуляції, включаючи день введення овуляторної дози ХГ. Тривалість стимуляції суперовуляції, кратність і доза препаратів визначалися на підставі даних гормонального УЗ - моніторингу до дня введення овуляторной дози одного з препаратів ХГ.

Пацієнтки IIb групи отримували вищеописаний «короткий протокол» з ант-ГнРГ з завчасним додаванням 3 мг мелатоніну перед сном на протязі 2х тижнів до початку стимуляції протягом КОС, відміна мелатоніну виконувалась в день ін'єкції «овуляторної» дози ХГ.

Початкова доза стимуляції гонадотропінами визначалась з урахуванням базового числа антральних фолікулів (ЧАФ):

ЧАФ ?15: 150 МО на день;

ЧАФ 6-14: 300 МО протягом перших двох днів, а потім 150 МО на день;

ЧАФ < 5: 450 МО протягом перших двох днів з подальшим 225 МО щодня.

Цикл був скасований, якщо не спостерігалось зростання фолікулів після 14 днів від максимальної стимуляції.

Призначення «овуляторної» дози ХГ проводилось за наступних умов: максимальний діаметр лідируючого фолікула за даними УЗД - не менше 18 мм; товщина ендометрія за даними УЗД не менше 9 мм; концетрация Е2 в сироватці крові пацієнтки не менше 1000 пмоль/л (300-400 пг/мл) з розрахунку на кожен лідируючий фолікул; концентрація прогестерону в сироватці крові не більше 2,0 нмоль/л, у випадку високого вмісту прогестерону ПЕ не відбувався. Ембріони зазнавали кріоконсервації та подальшого переносення в природному циклі (табл. 5.1)

Таблиця 5.1. Оцінка гормональних показників на етапі аспірації фолікулів у обстежених жінок

Показник	Основна група	Контрольна група (n= 30)
	I група (n= 33)	II група (n= 33)
Прогестерон, нмоль/л	1,68±0,12*	2,04±0,27*	2,3±0,17
Естрадіол, пг/мл	620±90,23*	1195,22±120,27*	1560,43±98,91

Примітка:* - р<0,05 значима достовірність відмінностейпоказниківзконтролем.

Рівні прогестерону в основній групі коливались від 0,8 до 3,5 нмоль/л, середні показники в I групі складали 1,68±0,12 нмоль/л, в II групі - 2,04±0,27 нмоль/л, і вірогідно не відрізнялись від контрольної групи 2,3±0,17 нмоль/л.

Рівні Е2 в основній групі коливались від 350,87 до 1950,99 пг/мл, середній показник в I групі, яка отримувала стандартну схему КОС, складав 620±90,23 пг/мл і вірогідно відрізнявся від контрольної групи 1560,43±98,91 пг/мл (р<0,05). Середній показник в II групі, яка отримувала модифікований протокол КОС з АМГТ, складав 1195,22±120,27 пг/мл і вірогідно не відрізнявся від контрольної групи (р>0,05). Низькі рівні Е2 корелювали з найнижчими показниками ЧАФ в досліджуваних групах.

«Овуляторна» доза препаратів ХГ становила 5-10 тисяч міжнародних одиниць (МО), визначалася індивідуально і залежала від кількості зростаючих фолікулів і ступеня ризику розвитку синдрому гіперстимуляції яєчників у даної пацієнтки.

Трансвагінальну пункцію яєчників виконували через 35-36 годин після введення овуляторної дози хоріонічного гонадотропіну в умовах малої операційної під короткочасним внутрішньовенним наркозом і ультразвуковим контролем. Використовували трансвагінальний датчик, на який щільно фіксували адаптер для прикріплення спеціальної голки. Застосовували голку довжиною 25 см, з зовнішнім діаметром 1,6 мм, на кінчику якої була ехо-контрастна насічка, видима при проведенні трансвагінального ультразвукового дослідження. На екрані монітора ультразвукового апарату напрямок голки визначався пунктирною лінією. Зіставляючи напрямок цієї лінії з центром фолікула, виконували пункцію фолікула. За допомогою вакуум - аспірації (під тиском 150-160 мм рт.ст.) Фолікулярна рідина надходила в стерильні пробірки, в яких знаходилося 0,5 мл гепарину. Отриману фолікулярну рідину передавали ембріологу для ідентифікації ооцитів і подальшого їх запліднення.

Аспірована фолікулярна рідина негайно проглядалася ембріологом. Вміст пробірок переливався в чашки Петрі і досліджувався під стереомікроскопом або інвертованим мікроскопом при невеликому збільшенні. Знайдені ооцити переносили в спеціальне середовище для відмивання, яке містило HEPES-буфер, що дозволяло маніпулювати з ооцитами на повітрі без ризику зміни РН у лужну сторону, потім відмивали в культуральному середовищі, після чого оцінювали кількість, якість і ступінь зрілості ооцитів.

Ступінь зрілості ооцита оцінювали за станом комплексів ооцит- cumulus. Яйценосний бугорок (Cumulus oophorus) являє собою частину фолікулярного епітелію, яка безпосередньо контактує з ооцитом у процесі фолікулогенезу. За морфологічними ознаками ооцити поділяли на зрілі, незрілі і дегенеративні. Наявність пухкого Cumulus oophorus і дисперсної corona radiata свідчило про зрілість ооцита, ооцит знаходився на стадії метафази другого поділу мейозу (М2), полярне тільце було вже сформовано.

У незрілому ооциті клітини corona radiata щільно прилягають до ооциту, «кумулюс» незначно збільшений. Такий ооцит знаходився, як правило, в метафазі першого поділу мейозу (Ml), проте формування полярного тільця ще не відбулося.

Для дегенеративних ооцитів були характерні деформація контурів ооцита, груба зернистість і / або потемніння цитоплазми.

У процесі культивування остаточно уточнювалися морфологічні характеристики ооцитів за шкалою, яка запропонована Erenus (1991).

Отримані преовуляторні ооцити культивувалися ембріологами в спеціальних термостатах при температурі 37 градусів Цельсія при 5% СО2 в повітрі, в стерильному живильному середовищі Менеза В2.

Сперму, отриману шляхом мастурбації, після розрідження, що триває в нормі від 15 до 50 хв, двічі центрифугували в живильному середовищі по 7 хвилин при швидкості 1800 обертів на 1 хв. Надосадову рідину зливали, і на осад нашаровували культуральне середовище (0,5-1,0 мл). Потім пробірки розміщували на 30 хв у термостат при температурі 37 градусів Цельсія для проведення флотації - спливання активно рухливих спермотазоїдів.

Для запліднення отриманих ооцитів, в лунки з останніми по краплях додавали надосадову рідину зі спливаючими сперматозоїдами до досягнення концетрации не менше 100 тисяч активно рухливих сперматозоїдів на один ооцит.

На наступну добу після запліднення ооцити, звільнені від cumulus oophorus переносили в лунки зі свіжим середовищем, запліднення оцінювали за наявністю 2-х пронуклеусів. Пронуклеуси з'являлися, як правило, через 10-19 годин після додавання сперматозоїдів в середовище з ооцитами і зникали через 6-8 годин після появи. Якщо були присутні обидва пронуклеуси, запліднення вважалося нормальним. Якщо було видно один або більше 2-х пронуклеусів, запліднення вважали аномальним.

Оцінка якості ембріонів здійснювалася на підставі сукупності наступних параметрів: швидкості дроблення ембріонів, симетричності бластомерів, ступеня цитоплазматичної фрагментації (<10%, 10-30%,> 30%), мультинуклеарності бластомерів. Використовували наступну класифікацію якості ембріонів:

- Ембріони класу А - з найбільшою швидкістю дроблення, бластомери яких мають регулярну форму, а без'ядерні фрагменти відсутні. Вважається, що максимальну здатність до імплантації мають саме такі ембріони.

- Ембріони класу В - з нерівними бластомерами та / або фрагментами цитоплазми, які займають не більше 10% обсягу.

- Ембріони класу С - з фрагментацією від 10 до 50%.

- Ембріони класу D - з фрагментацією більше 50%.

Ембріонами «хорошої якості» вважали ембріони, на 2-у добу розвитку, які досягли стадії 4-х і більше бластомерів (48 годин після ТВП), на 3-ю - більше 6 бластомерів, на 5-у добу на стадії бластоцисти. Бластоциста, що має приблизно 150-200 клітин, компактну внутрішню клітинну масу і добре структурований трофектодерм, розцінювалася як «хороша». Ембріони гарної якості, які підлягали дробленню, повинні мати не більше 10% фрагментації.

Ембріони, які досягли стадії бластоцисти поділялись за наступними критеріями:

Стадії розвитку і величина бластоцисти: 0 - ембріон не досяг стадії бластоцисти; рання бластоциста, порожнина <50%; рання бластоциста, порожнина 50-80%; повна бластоциста, велика порожнина; розширена (expanded) бластоциста; hatching бластоциста; hatched бластоциста.

Внутрішня клітинна маса (ICM): А - багато клітин, розташовані компактно; В - кілька клітин, розосереджені; С - дуже мало клітин або не визначаються.

Трофектодерма (Trophectoderm): А - велика кількість клітин. В - мала кількість клітин.

Перенесення ембріонів в порожнину матки здійснювали на 2-3 та / або 5 добу (48-72-120 годин) після початку культивування in vitro за допомогою спеціального одноразового катетера. Ембріони під мікроскопом розміщували в спеціальний одноразовий катетер і через цервікальний канал вводили в порожнину матки пацієнтки. Перенесення виконували в амбулаторних умовах на гінекологічному кріслі. Число ембріонів для перенесення обирали індивідуально, стосовно кожної конкретної ситуації, проте воно не перевищувало 2. Після перенесення пацієнтка протягом 2-3-х годин перебувала під наглядом лікарів в умовах денного стаціонару. При показаннях проводилася госпіталізація до стаціонару.

Підтримку періоду раннього ембріогенезу проводили з використанням препаратів синтетичного прогестерону через 24 години після проведення транвагінальной пункції фолікулів в зростаючій дозі 200-600 мг / добу інвагінально.

Підтримка періоду раннього ембріогенезу проводилася до моменту проведення експрес-тесту на рівень Р-субодиниці ХГ (14-15-й день після перенесення ембріонів). При двох позитивних тестах на вагітність визначався стан як «біохімічна вагітність». Ультразвукова діагностика клінічної вагітності проводилася через 21 день після перенесення ембріонів, після чого визначали подальшу тактику ведення пацієнток.

За необхідністю виконували процедуру інтрацитоплазматичної ін'єкціїї сперматозоїда (ІКСІ). Безпосередньо перед проведенням ембріологічної процедури ІКСІ ооцити очищали від клітин кумулюса за допомогою ферменту гіалуронідази. Після ферментної обробки ооцити відмивали в буферному середовищі, що попереджувало зміну рН при роботі на повітрі.

Приготування сперми для ІКСІ не відрізняється від такого при стандартній процедурі ЕКЗ. Процедура ІКСІ проводилась в чашці Петрі діаметром 30-60 мм з низькими бортиками. Дно чашки зрошували краплями з середовищем, призначеним для роботи з ооцитами і ембріонами в умовах поза інкубатором. Сама процедура ІКСІ включала кілька етапів:

Іммобілізація сперматозоїда за допомогою мікроголки: засмоктування сперматозоїда в голку за допомогою створення негативного тиску; орієнтація і закріплення ооцита на присоску таким чином, щоб полярне тіло перебувало в положенні 6 або 12 годин; прокол ооцита і відсмоктування невеликої кількості ооплазми, що виконувалася для констатації проникнення голки в ооцит і цілісності мембрани.

Після закінчення ІКСІ ооцити негайно переносили в культуральне середовище і культивували надалі так само, як після стандартної методики запліднення in vitro.

За наявності показань проводився лазерний допоміжний хетчінг: вік жінки старше 38 років; 2 попередні невдалі спроби ЕКЗ в анамнезі; ембріони з незадовільними морфологічними показниками;

Залежно від параметрів сперми та якості ооциту проводили ЕКЗ або IКСІ (Рис. 5.2). У 47% (n=31) випадків застосовувався метод інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїда в ооцит (ІКСІ).

Рис. 5.2. Схема розподілу пацієнток залежно від застосованого методу запліднення

Найбільша кількість ІКСІ спостерігалась в I групі жінок з НОР, які отримували стандартні протоколи КОС - більше 60% (n=21), порівняно з 30% (n=10) в II групі жінок, які отримували АМГТ. Високий відсоток ІКСІ у пацієнток I групи обумовлений чоловічими факторами лише в половині випадків (n=11), іншими факторами, які спонукали до проведення ІКСІ були вкрай низькі показники оваріальної відповіді у пацієнток I групи.

Для оцінки ефективності проведеної АМГТ використовували клінічні дані щодо оваріальної відповіді на КОС, якості та кількості отриманих яйцеклітин і рівня клінічних вагітностей, динаміка зниження показників ОС (8-ІЗП) та рівней МЛТ в сироватці крові.

З об'єктивних причин не проводилась оцінка динаміки рівнів МЛТ та 8-ІЗП в фолікулярній рідині у одного ж і того пацієнта до і після АМГТ, порівнювались показники фолікулярної рідини між групами.

Через відсутність оваріальної відповіді на застосовані протоколи КОС - «відміна циклу», не проводилось визначення рівнів МЛТ та 8-ІЗП в фолікулярній рідині у 3 пацієнток I групи.

Аналіз протоколів КОС показав, що тривалість періоду десенситизаціі в середньому становить 13,5 ± 0,05 днів. У IIb підгрупі, де застосовувався ант-ГнРГ з АМГТ, тривалість введення препарату в 3,85 рази коротше: 3,0 ± 0,05 днів, оскільки антагоніст завдяки своїй здатності негайно блокувати рецептори ГнРГ в гіпофізі вводився вже на тлі проведеної стимуляції суперовуляції саме в ті дні, коли був можливий передчасний підйом ЛГ. Тривалість введення лМГ в Ib підгрупі та IIb підгрупі із застосуванням ант-ГнРГ була найкоротшою і склала 11 ± 0,5 днів. У підгрупах з а-ГнРГ лМГ вводився довше -14 ± 0,2 днів. Доза лМГ з розрахунку на цикл стимуляції суперовуляції в IIb підгрупіант-ГнРГ+ АМГТсклала 1800 ± 150 МО, що на 500-600 МЕ менше, ніж у Iа пігрупі із застосуванням а- ГнРГ (2200 ± 150 МО). Важливою характеристикою пацієнтів з НОР є підвищена резистентність яєчників до стимуляції, що диктує необхідність використання більш високих доз гонадотропінів протягом тривалого часу стимуляції.

Особливої уваги заслуговує оцінка якісті оваріальної відповіді взалежності від застосованої схеми КОС (табл.5.2)



Таблиця 5.2. Оцінка показників ефективності ДРТ залежно від схеми КОС

Основна група
Показник	I група (n=30) стандартна схема КОС без АМГТ	II група (n=33) модифікована схема КОС з АМГТ
	Iа підгрупа (n=15) а-ГнРГ+лМГ	Ib підгрупа (n=15) ант-ГнРГ+ лМГ	IIа підгрупа (n=16) аГнРГ+ лМГ+Млт	IIb підгрупа (n=17) ант-ГнРГ+ лМГ + Млт
Кількість фолікулів	3,83 ±0,39*	3,92±0,29*	8,01±0,92*	7,85 ± 0,69*
Кількість ооцитів	3,04±0,43*	2,95±0,42*	5,98±0,96*	5,03 ± 0,87*
Кількість ПЕ	2,61 ± 0,33	1,98±0,32*	4,22 ± 0,77*	3,91 ± 0,55
Зрілі ооцити	2,98±0,37*	2,34±0,34*	4,01 ± 0,68*	3,78 ± 0,56*
Запліднені ооцити	2,76 ± 0,43*	2,04 ± 0,23*	3,89 ± 0,56*	3,67 ±0,45*
Незрілі ооцити	1,19±0,31*	1,21±0,32*	0,78 ± 0,09*	0,86 ±0,05*

Примітка.* - р <0,05 значима достовірність відмінностейпоказників з групами, які отримували АМГТ.

Згідно даним табл. 5.2 не виявлено достовірних відмінностей у якості оваріальної відповіді залежно від використовуваної схеми КОС з а-...