В работе Yamakura and Harris (2000) методом двухэлектродной техники вольтаж-клямпа тестировалось влияние Хе на широкий спектр рекомбинантных рецепторов мозга, экспрессированных на ооцитах Xenopus: глициновые, ГАМК-рецепторы типа А и С, NMDA (N-methyl-D-aspartate) - рецепторы, АМРА (alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) - рецепторы, рецепторы каината, 5-гидрокситриптаминовые (серотониновые) и N-ацетилхолиновые рецепторы (N-АХР). Авторы отмечали, что наиболее вероятные мишени ингибирующего действия Xe - N-АХР (бета2-субъединица) и NMDA-рецепторы. Основной точкой приложения действия ксенона является постсинаптическая мембрана [87].

Наибольшее количество работ посвящено влиянию Хе на NMDA - рецепторы. Установлено, что он является антагонистом NMDA - рецепторов [90]. В минимальной альвеолярной концентрации (МАК) Хе селективно подавляет (на 60 %) возбуждающие постсинаптические токи, вызванные активацией NMDA-рецепторов, но обладает незначительным влиянием на альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) / каинат рецептор-опосредованный компонент [87].

Постсинаптические NMDA - рецепторы реализуют эффекты глутамата, N-метил-D-аспартата, L-аспартата. Располагаются на мембране нейронов, микроглиальных клеток, нейтрофилов и моноцитов/макрофагов [101], что опосредует эффекты ксенона не только через состояние нервных клеток, но и через клетки микроокружения, обладающие широким спектром регулирующего влияния на клетки-мишени.

NMDA-рецепторы выполняют ноцицептивную функцию [87], они участвуют в образовании нейрональных сетей; синаптической передаче импульсов, необходимых для обучения и формирования памяти. При патологии они вовлекаются в острые и хронические неврологические расстройства; участвуют в формировании психических нарушений, и что, особенно важно для нас в реализации патологического болевого синдрома. Активация NMDA-рецепторов кетамином вызывает психотомиметический эффект, маркером которого является экспрессия гена c-fos. Хе значительно подавляет обусловленную кетамином экспрессию c-fos [114].

Гиперактивация NMDA-рецепторов высокими уровнями внеклеточных лигандов сопровождается повышением уровня внутриклеточного кальция, стимулирующего синтез внутриклеточного мессенджера, оксида азота (NO). Физиологическая роль NO связана с активацией гуанилатциклазы и повышением внутриклеточного уровня цГМФ [101]. В печени биосинтез NO активируется при местном или системном воспалении, он связывается с гемом, активируя либо ингибируя такие ферменты, как гуанилатциклаза, циклооксигеназа, цитохром P450. В иммунной системе активированные макрофаги высвобождают NO как цитотоксический и цитостатический агент, ингибирующий дыхательную цепь митохондрий, синтез ДНК и активность ферментов [101]. Реализация эффектов NO на клетку происходит через высокие уровни цГМФ, снижение концентрации АТФ через АДФ-рибозу, образование активных метаболитов, таких как пероксинитрит (ONOO^-), гидроксильный радикал (ОН^-), супероксиданион [101,132]. В свою очередь, они индуцируют перекисное окисление липидов мембран с образованием пероксидов, которые в 100 раз более токсичны, чем сам NO и его активные радикалы, что приводит к повреждению мембран нервных и других типов клеток [28,101].

Выявленные механизмы действия Хе позволяют полагать, что в нормальных и экстремальных условиях жизнедеятельности эффекты ксенона могут быть противоположными, поскольку будут зависеть от активности NMDA-рецепторов [29,139] и состояния клеток-мишеней. С одной стороны, Xe может блокировать физиологическую функцию нейронов, иммунокомпетентных (Т - и В-лимфоциты) и гладкомышечных клеток, с другой - предупреждать свободнорадикальные механизмы их гибели при патологических состояниях.

В оценке влияния Хе на тормозные аминокислоты центральной нервной системы (глицин, ГАМК) [1] наиболее понятным является действие Хе на глицинергическую систему. Хе потенцировал на 50 % ингибиторный постсинаптический ток, возникающий в постсинаптической мембране после воздействия глицина (50 микроМ) на альфа1-глициновые рецепторы.

Менее определенными являются результаты исследований по влиянию Хе на ГАМК-ергическую систему. Так, согласно Hapfelmeier e. a. (2000) Хе повышает эффективность ГАМК в рецепторном комплексе и усиливает ГАМК-ергическую синаптическую передачу посредством активации ионных каналов. Методом patch-clamp (электрофизиологическая методика, при которой фрагмент клеточной мембраны изолируется с помощью специальной микропипетки) на клетках эмбриональной почки человека (НЕК 293), инфицированных кДНК для субъединиц ГАМК-А рецепторов, авторы показали, что Хе обратимо усиливал ГАМК-индуцированные токи через каналы рецептора, подавляющего важнейшие функции головного мозга, например, поддержание сознания.

Некоторые авторы считают потенцирующее действие Хе на ГАМК-А рецепторы слабым [139]. С другой стороны, Хе в МАК=60 % в культуре нейронов гиппокампа крыс (препараты, предотвращающие смешанные эффекты нейрональной сети) не обладал измеримым эффектом на ГАМК-ергические ингибиторные постсинаптические токи (каналы) и не модулировал действие экзогенной ГАМК, однако заметно подавлял распространение потенциала действия по постсинаптической мембране [87]. Согласно Goto (2000), Хе вообще не является агонистом рецепторов, чувствительных к гамма-аминомасляной кислоте.

По мнению ряда авторов, противоболевое действие Хе не реализуется через опиатергическую систему, поскольку его эффекты не отменяются назначением налоксона [137].

Среди рецепторов к моноаминам наиболее чувствительны к ксенону N-ацетилхолиновые бета2-субъединицы для которых характерно выражена ингибиция газовым анестетиком Хе. Серотониновые рецепторы подавляются Хе слабо [139].

Согласно данным Yoshida e. a. (2001) Хе в концентрации 30 % и 60 % значительно стимулировал норадренергические нейроны гипоталамуса крыс, увеличивая тем самым концентрацию норадреналина, оцененную методом высокоскоростной жидкостной хроматографии, в перфузируемой искусственной цереброспинальной жидкости. По мнению авторов это может иметь значение в гипнотических и симпатотонических эффектах характерных для Хе. В то же время Ohara e. a. (1997) считают, что противоболевое действие Хе, в отличие от закиси азота, не реализуется через альфа2-адренорецепторы клеток центральной и периферической нервной систем, поскольку его эффект не блокируется иохимбином и L659-066, избирательно тропным к ним. В условиях индукции анестезии ксенон в смеси с кислородом 75 % на 25 % обладал некоторым стимулирующим действием на сердечно-сосудистую (тахикардия) и дыхательную системы (увеличение минутной вентиляции) [14,104].

С другой стороны, исследование состояния сердечно-сосудистой системы при анестезии пациентов Хе в 0,8 МАК (56 %) показало, что он подавляет как парасимпатическую, так в большей степени симпатическую периферическую нейротрансмиссию, что позволяет считать Хе относительным ваготоником [97]. По-видимому, мишенью блокирующего действия Хе может быть аденилатциклазный механизм действия медиаторов и гормонов на активность клетки.

Ваготонический эффект Хе, связанный с уменьшением частоты сердечных сокращений до 55-60 ударов в минуту, отмечается в работе [27].

Еще одним из механизмов биологического действия Хе может быть его влияние на такой мультифакторный процесс, как высвобождение метаболитов из нервных терминалей и секреторных клеток нейроэндокринной системы [140].

В цикле работ Marx T. и соавторов представлены данные о влиянии Хе на высвобождение катехоламинов и их предшественника дофамина из клеток гипоталамуса. Установлено, что ксенон в концентрациях 30-50-70 % не изменяет концентрацию в плазме крови дофамина и норадреналина (НА), однако уровень адреналина (А) падает во всех группах. Концентрация же дофамина при этом не меняется [109,110]. При этом существенной редукцией уровня А при 30 % и 50 % концентрациях Хе (ниже МАК) авторы объясняли его анальгетический эффект.

С другой стороны, Boomsma e. a. (1990) показали ранее на 16 пациентах, что как ксеноновая анестезия, так и анестезия закисью азота сопровождалась повышением в плазме крови содержания НА и пролактина при неизменном количестве дофамина. В период действия Хе уровни А и кортизола не менялись, а концентрация гормона роста даже уменьшалась. В послеоперационный период (после отмены Хе) концентрации катехоламинов, кортизола и пролактина оказались повышены с медленным возвращением к контрольным показателям. Исходя из полученных данных, авторы сделали предположение, что одним из органов-мишеней Хе являются надпочечники, в которых благородный газ накапливается в большей степени, чем в мозге [115]. Более определенными оказались данные о корелляции Хе с другими гормонами стресса. В субнаркотических концентрациях Хе снижал в плазме крови человека уровень гидрокортизона и повышал содержание инсулина [134]. Анестезия при оперативных вмешательствах в соотношении Хе/О_{2 (}70/30) повышала по сравнению с аналогичной концентрацией закиси азота уровень в крови соматотропного гормона (СТГ) и соотношение СТГ/кортизол [15].

По данным А.В. Година и соавт. (1999) Хе повышает индекс СТГ/кортизол и снижает АКТГ/СТГ, что свидетельствует о преобладании анаболического эффекта ксенона на организм. Не влияет на уровни тиреотропного гормона (ТТГ), гормонов щитовидной железы (Т₃, Т₄) [27]. Подобное действие Хе позволило [134] сделать заключение об его антистрессорном эффекте в отношении систем жизнеобеспечения человека с преобладанием в структуре клеточных эффектов инертного газа толерантной стратегии адаптации, представленной в работе [48]. В связи с тем, что Xe обладает высокой растворимостью в липидах и взаимодействует с белками, он должен аккумулироваться в клеточных мембранах [122]. Применение Хе как биосенсорной молекулы при проведении ядерно-магнитных резонансных исследований (ЯМР) [111,128] позволило получить сведения о некоторых механизмах его взаимодействия с макромолекулами. При исследовании ¹²⁹Хе - ЯМР спектров растворов миоглобина, суспензий различных липидных бислоев, мембран эритроцитов и мембран Torpedo californica, обогащенных рецептором к ацетилхолину, был установлен быстрый обмен Хе между жидкостями и органическими молекулами [111], что говорит о возможности интегрального механизма влияния газа на клетки через их гидрофильные и гидрофобные компартменты.

Хе может выступать и формировать протон-связывающие кластеры с образованием комплексов с катионами HCO+, HN2+ и HNCH+ [79]. Кроме того, ионы водорода и хлора могут взаимодействовать с атомом Хе в оппозитных участках (т.к. его молекула может быть диполем), что приводит к перемещению заряда и образованию ионизированного комплекса HХeCl [82].

Описанные выше процессы могут лежать в основе разнонаправленного влияния Хе на возбуждающие и тормозящие ионные каналы с лиганд-зависимыми и потенциал-зависимыми “воротами“, определяющими, в свою очередь, функциональное состояние соматических клеток. Тем не менее, несмотря на активное обсуждение в литературе механизмов взаимодействия Хе с биологическими молекулами и структурами, сведений непосредственном его влиянии на соматические клетки немного.

Известно, что Хе действует на мембраны клеток мозга, в том числе на их биохимический состав и соответственно на электрофизиологические свойства клеток [115]. Хе снижает соматосенсорные потенциалы мозга [105], уменьшает, как и другие анестетики, корковые потенциалы, электрическую активность мозга в целом [30,105].

Miyazaki Y. e. a. (1999) изучали влияние Хе в 70 % -ной концентрации на нейроны задних рогов спинного мозга кошек. Перерезка спинного мозга (устранение эффекта нисходящих ингибиторных систем) не влияла на способность инертного газа подавлять реакцию клеток на раздражители, что позволило авторам сделать заключение о возможности реализации его антиноцецептивного эффекта через прямое воздействие на нервные клетки спинного мозга.

Смесь Хе/О_{2 (}70/30) приводит к появлению отдельных пикнотических ядер в клетках коры и мозгового вещества надпочечников крыс. Однако в случае ингаляции смеси закись азота/кислород ₍70/30) подобные изменения более выражены, что авторы связывают с постстрессорными явлениями [115].

Xe способен блокировать деление эндотелиальных клеток через механизмы, связанные с внутриклеточными ионами двухвалентного кальция [27]. В то же время в культуре кардиомиоцитов человека, перфузируемой растворами, содержащими ксенон в концентрациях, соответствующих МАК, Хе не влиял на L-тип кальциевых каналов. Кроме того, благородный газ лишь слабо супрессировал быстрые выходящие калиевые токи, оцененные техникой patch clamp. Поскольку Са²⁺ - и К⁺-токи важны для продолжительности потенциалов действия и реполяризации [95], сделали вывод, что действие Хе согласуется с отсутствием у благородного газа побочных клинических, негативных влияний на сердце.

По мнению de Rossi e. a., (2001), 65 % Хе не влияет на функцию тромбоцитов и их мембран в системе in vitro (обычную и стимулированную агонистом экспрессию гликопротеинов, постактивационные конформации рецепторов, экспрессию селектина).

Применение изотопов Хе в компьютерной томографии при патологических состояниях [129] и мониторинге действия лекарственных препаратов [76] выявило его способность самостоятельно влиять на мозговой кровоток [94]. Микроциркуляторное русло (артериола, капилляры, венула) является одним из компонентов клеточного микроокружения, регулирующего питание, пролиферацию и дифференцировку, функционирование клеток различных тканей [63,130]. В связи с этим клеточные, синаптические, тканевые и органные эффекты Хе в некоторой степени могут быть опосредованы его гемодинамической активностью.

По мнению Schmidt M. e. a. (2001) до сих пор мало известно о влиянии инертного газа на перфузию органов. Тем не менее, с помощью микросфер авторы изучали действие 79 % Хе на кровоснабжение коры головного мозга, продолговатого мозга, ствола мозга, мозжечка, печени, почек, тонкого кишечника, прямой кишки, мышц, кожи и сердца. Результаты показали, что газ увеличивал объем кровотока в мозге: в стволе мозга на 63 %, коре мозга на 38 %, продолговатом мозге на 35 % и в мозжечке на 34 %. Было сделано заключение об осторожном применении Хе в ситуациях, сопровождающихся повышением внутричерепного давления [124]. Централизация кровотока при действии Хе в субнаркотических концентрациях отмечена так же [134].

У больных инсультом, в первые 76 секунд воздействия Хе, наблюдалось увеличение регионального мозгового кровотока в пределах 3-7 %, через 190 сек - 12 % и в дальнейшем этот показатель не менялся. Обусловленная Хе активация мозгового кровотока показывала значительную меж - и внутрииндивидуальную вариабельность [94]. Эти результаты согласуются с экспериментами на крысах. Ингаляция Хе в течение 45 мин в концентрации 30-70 % не приводила к изменениям локального и общего мозгового кровотока. Однако короткое (2 и 5 мин) назначение 70 % инертного газа сопровождалось увеличением на 48 % и 37 % соответственно кровообращения в коре мозга. Вывод - эффекты ксенона на кровоток в мозге определяются временем его воздействия [89], что объясняет, по-видимому, отсутствие влияния Хе на показатели сердечно-сосудистой и гемодинамической систем в других исследованиях [99].

Согласно данным [105], в наркотической концентрации Хе также вызывал увеличение мозгового кровотока. Так, при содержании инертного газа более 60 % кровоток в мозге повышается на 18 % [108].

Ингаляционная смесь 70 % ксенона - 30 % кислорода в первые 15 мин реперфузии после региональной ишемии у крыс снижает размеры инфаркта миокарда по сравнению с чистым кислородом. Помимо инфаркта и инсульта дефицит кровотока, связанный с недостаточностью допаминергической регуляции [129], описан при болезни Паркинсона [100] и его усиление при приеме L-допы сопровождается симптоматическим улучшением состояния пациентов [76], что делает Хе потенциальным средством коррекции, по крайней мере, при данных заболеваниях.

Ксенон хорошо зарекомендовал себя при различных оперативных вмешательствах у пациентов с проблемами в кардиовазальной сфере [16]. Он является методом выбора при операциях у пациентов с компрометированной сердечно-сосудистой системой [65]. Кроме того, одним из основных предпосылок к развитию неотложных состояний в клинике кардиоцеребральных расстройств имеет эмоциональный стресс [67]. В то же время известно, что ксенон обладает положительным влиянием на эмоциональную сферу и обладает антидепрессивным эффектом [41].

Ксенон-кислородные ингаляции применяются в настоящее время в качестве дополнительного аналгетического воздействия при болевых синдромах, а также обладают активным антистрессовым эффектом [52].

Исследования, проведенные при операциях на сердце по поводу тампонады и аортокоронарного шунтирования, показали, что анестезия ксеноном не оказала значительного влияния на артериальное давление, частоту сердечных сокращений, сердечный выброс, периферическое сосудистое сопротивление и сопротивление в системе легочной артерии. Было отмечено, что хотя ксенон имеет тенденцию снижать частоту сердечных сокращений, сердечный выброс поддерживается на стабильном уровне за счет ударного объема и преднагрузки. Данный эффект можно расценить как доказательство того, что ксенон поддерживает гемодинамическую стабильность и симпатический тонус у больных со сниженным сердечно-сосудистым резервом.

В опытах на животных, как здоровых, так и с сердечной патологией, было также показано, что практически никаких изменений данных продольной оси сердца не было выявлено при всех концентрациях ксенона. Это позволяет сделать вывод, что ксенон не влияет на изменения, вызванные в системной гемодинамике и сократимости миокарда применением других ингаляционных анестетиков.

Подведя итог, можно сделать вывод: несмотря на то, что влияние ксенона на сердечно-сосудистую систему еще не вполне изучено, влияние его на общую гемодинамику является минимальным, не изменяет стандартные показатели ЭКГ, не влияет на фазовую структуру сердечного цикла. После ксеноновой анестезии не отмечено поздних желудочковых потенциалов, следовательно, у ксенона нет аритмогенного свойства. Ксеноновая терапия вызывает благоприятные изменения ряда функциональных параметров у больных острым коронарным синдромом: увеличивает сердечный выброс, снижает сосудистое сопротивление, уменьшает гиперкоагуляцию, легочную гипертензию.

Несмотря на множество проведенных исследований, до сих пор остаются неизвестными возможности и целесообразность применения ксенона для лечения патологии почек и печени. Значительное количество работ по анестезиологии и наркологии имеет ряд ссылок на улучшение показателей функционального состояния этих органов, однако углубленных исследований по действию Хе на печень и почки не проводилось. На сегодняшний день достоверно известно, что ксенон обладает гепатопротекторным и нефропротекторным действием, но физиология данного процесса остается не изученной.

Еще меньше данных о влиянии ксенона на процессы острого воспаления и развития эндогенной интоксикации.

Исходя из имеющихся на сегодняшний день данных, в целом можно говорить о том, что Хе меняя управляемость, снижает повреждающее действие факторов за счет нереакции систем. Так же имеются сведенья о возможном восстановительном действии Хе на многие органы и системы, что делает актуальным продолжение исследований действия на организм этого благородного газа.

Глава II. Материалы и методы исследования

2.1 Характеристика экспериментальных моделей, использованных в работе

Материалом настоящего исследования послужили данные, полученные при комплексном исследовании 290 крыс массой 180 - 220г. Крысы в соответствии с задачами исследования были разделены на 4 группы. Ранжирование животных по группам и перечень исследований, проводимых у них, приведен в таблице 1.

Исследования проводили в соответствии с рекомендациями Европейской конвенции о защите прав животных, используемых в научных исследованиях (Страсбург 18.03.86).

Таблица 1. Распределение животных по группам и методы исследований применяемые к ним

Группа	Количество животных	Перечень методик
I Контроль (промывание брюшной полости физ. раствором)	20	Лабораторная (ОАК, биохимический анализ крови, определение МСМ) Гистологическая (макро - и микроскопия органов)
II Каловый перитонит	Самостоятельный	90
	Леченый ксеноном	30
III Алкогольный гепатоз	Самостоятельный	30
	Леченый ксеноном	30
IV Травматический перитонит	Самостоятельный	60
	Леченый ксеноном	30

Первую группу составляли 20 интактных крыс, которым в стандартных условиях вивария промывали брюшную полость обыкновенным физиологическим раствором и не подвергали никаким внешним воздействиям. Данные полученные при их исследовании служили контролем.

Вторую группу составляли 120 крыс, у которых у которых вызывали экспериментальный каловый перитонит. При этом животных этой группы делили на две подгруппы. Воспроизведение калового перитонита осуществляли следующим образом: в асептических условиях, под тиопенталовым наркозом (48мг на 1кг массы тела), выполняли срединную лапаротомию по белой линии живота, стандартизованное ранение толстой кишки проводили глазными ножницами, рассекая поперек кишечную стенку на 0,5 её диаметра. Длина разреза составляла 3мм. После ранения толстой кишки, на лапаротомную рану накладывалось 5 швов (шелк).

Крысы первой подгруппы не получали ни какого лечения. Ежедневно оценивалось их состояние по внешнему виду, состоянию аппетита и физиологических отправлений.

Крысам второй подгруппы, начиная с первых суток после воспроизведения перитонита, с однодневным перерывом, в асептических условиях 1 раз в день промывали брюшную полость физиологическим раствором обогащенным ксеноном (пунктировалась брюшная полость, вводилось 20мл раствора, в течении 2-х минут получали обратный ток (5-10мл)). Ежедневно оценивалось их состояние по внешнему виду, состоянию аппетита и физиологических отправлений. Продолжительность эксперимента составляла 7 суток. На 1, 3, 7 сутки животные из обеих подгрупп выводились из опыта декапитацией под легким эфирным наркозом. У животных забирали 5мл крови для последующих биохимических исследований. Затем животных вскрывали для проведения макроскопического изучения состояния печени, органов брюшной полости и органов грудной клетки. На вскрытии забирали кусочки печени, сердца, почек, поврежденной кишки для последующих гистологических исследований.

Третью группу составляли 60 животных, у которых моделировали состояние токсического гепатоза. Токсический гепатоз вызывали ежедневным, на протяжении 30 суток, внутрижелудочным введением 25% раствора этанола при помощи внутрижелудочного зонда. Животные данной группы так же подразделялись на две подгруппы. Первую подгруппу крыс составляли животные, у которых не применялись средства коррекции токсического гепатоза. Во второй подгруппе начиная с 15 суток опыта, с однодневным перерывом, в асептических условиях 1 раз в день проводилось промывание брюшной полости физиологическим раствором обогащенным ксеноном (пунктировалась брюшная полость, вводилось 20мл раствора, в течении 2-х минут получали обратный ток 5-10мл). Продолжительность эксперимента 30 суток. На 15, 30 сутки опыта животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. Забирали 5мл крови для последующих биохимических исследований; одновременно осуществляли вскрытие для оценки (макроскопически) состояния органов брюшной и грудной полостей, почек, печени, и забора материала для гистологических исследований.

Четвертую группу составляли 90 животных, у которых вызывали посттравматический перитонит. Животным в асептических условиях под тиопенталовым наркозом (48мг на 1кг массы тела), при помощи пневматического пистолета стреляющего стальными пулями калибра 4,5мм, проводилось моделирование огнестрельного ранения брюшной полости, вследствие которого развивался перитонит. Огнестрельные раны не ушивались, поверхность обрабатывалась антисептиком. В первой подгруппе крысы не получали ни какого лечения, ежедневно оценивалось их состояние по внешнему виду, аппетиту, стулу и диурезу. Во второй подгруппе крысам, начиная с 1 суток, с однодневным перерывом, в асептических условиях 1 раз в день проводилось промывание брюшной полости физиологическим раствором обогащенным ксеноном (пунктировалась брюшная полость, вводилось 20 мл раствора, в течении 2-х минут получали обратный ток (5-10 мл)). Ежедневно оценивалось их состояние по изменениям внешнего вида, аппетита, физиологических отправлений. Продолжительность эксперимента составляла 7 суток. На 1, 3, 7 сутки опыта животных обеих подгрупп выводили из опыта декапитацией под легким эфирным наркозом, забирали 5 мл крови для биохимического исследования и проводили вскрытие для оценки изменений внутренних органов и забора материала на гистологические исследования. Забирались участки тех же органов, что указаны в предыдущих группах. Во всех группах в крови, полученной при заборе материала, определяли, помимо стандартных параметров, состояние форменных элементов крови, содержание креатинина, мочевины, билирубина, активность АлТ и АсТ, содержание молекул средней массы (МСМ₂₅₄ - белковый обмен, МСМ₂₈₀ - нуклеиновый обмен).

2.2 Методы исследования функционального состояния организма экспериментальных животных

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ)

Метод позволяет визуально оценить скорость оседания эритроцитов и оценить белковый спектр сыворотки.

Принцип метода заключается в способности распределения смеси крови с цитратом натрия (С₆Н₅О₇Na₃ 5Н₂О) при стоянии на две прослойки (нижний - эритроциты, верхний - плазма). При этом СОЭ, то есть размер столбику плазмы, бывают разными в зависимости от физико-химических свойств крови. Перед использованием химически чистый капилляр промывают цитратом натрия 5%, заполняют к отметке р и переносят в пробирку. Набирают 2 полных капилляра крови (к отметке 0) и переносят в пробирку с цитратом. При этом получают соотношение крови и цитрата 4:

1. Содержимое пробирки добирают к отметке 0 (смесь крови с цитратом). При помощи пальца закрывают верхний конец капилляра осторожно, чтобы кровь из капилляра не вылилась, вставляют капилляр в штатив обязательно вертикально, опирая нижний его конец на резиновую подкладку и притискивая верхний конец подкладкой или пробкой. Через час отмечают величину СОЭ по высоте отстоянного слоя плазмы в сантиметрах.

Метод определения эритроцитов периферической крови

Метод позволяет визуально с помощью светового микроскопа и камеры Горяева определить количество эритроцитов периферической крови и определить её транспортную функцию.

Принцип метода заключается в учете эритроцитов в 1 мкл крови при постоянном ее растворе и объеме учетной камеры.

В пробирку из 4 см³ физиологического раствора добавляют 0,02 см³ капиллярной крови. Хорошо перемешивают. Шлифуемое покровное стекло притирают к камере Горяева, оставляют на 1 минуту. Учет проводят с помощью светового микроскопа (ОК х 10; ОБ х 8), подсчитывая в 5 больших квадратах (расчеркнутых на 16 малых), расположенных по диагонали.

Количество эритроцитов в 1 мкл крови определяет по формуле:

Х =	а Ч 4000 Ч 200	, где
	80

Х - количество эритроцитов в 1 мкл; а - количество эритроцитов, пересчитаных в 80 малых квадратах; 80 - количество малых квадратов, в которых проводили подсчет (5 х 16 = 80); 200 - разведение крови; 4000 - приводит результат к объему 1 мкл крови, который выходит из объема малого квадрата (1/4000мкл).

На практике количество эритроцитов, которые подсчитаны в 80 малых квадратах, умножают на 10000, а для перевода в единицы СИ (Г в 1 л) полученную цифру нужно умножить еще на 10⁶.

Определение концентрации гемоглобина гемоглобинцианидным методом

Метод позволяет с помощью набора реактивов и фотоэлектроколориметра определить концентрацию гемоглобина в крови и оценить состояние транспорта кислорода в организме. Принцип метода заключается в том, что под воздействием железосинеродистого калия гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемоглобин), который в свою очередь образовывает с ацетонциангидритом окрашенный продукт, - гемоглобинцианид HbiCN, яркость окраски которого пропорциональна содержимому гемоглобина. К 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,2 мл крови. Растворение крови при этом осуществляется в 251 раз. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем проводят измерение на фотоколориметре при длине волны 500-560 нм в кювете с толщиной слоя 10мм относительно „холостой" пробы трансформирующего раствора. Стандартный раствор измеряют при тех же условиях.

Концентрацию гемоглобина определяют по формуле:

Hb (г/л) =	Еоп	Ч С Ч К Ч 0,01, где
	Ест

Е_оп - экстинкция опытной пробы; Е_ст - экстинкция стандартного раствора; С - концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг %; К - коэффициент разведения крови; 0,01 - коэффициент перерасчета мг % в г/л.

Метод определения цветового показателя

Для определения цветового показателя используют только два показателя - количество эритроцитов и уровень гемоглобина.

Формула расчета цветового показателя (ЦП):

ЦП = (гемоглобин (г/л) * 3) / первые 3 цифры количества эритроцитов в крови.

Метод определения лейкоцитов периферической крови

Метод позволяет визуально с помощью светового микроскопа и камеры Горяева определить количество лейкоцитов периферийной крови и оценить наличие патологического процесса в организме.

Принцип метода заключается в учете лейкоцитов в 1 мкл крови при постоянном ее растворе и объеме учетной камеры. В пробирку из 0,4 мл 3 % раствора уксусной кислоты добавляют 0,02 мл капиллярной крови. Хорошо перемешивают. Покровное стекло притирают к камере Горяева. Каплю раствора капиллярной крови помещают в камеру под покровное стекло и оставляют на 1 минуту. Учет проводят с помощью светового микроскопа (ОК Ч 10; ОБ Ч 8), подсчитывая лейкоциты в 100 больших квадратах.

Результаты учета в больших квадратах суммируют и определяют количество лейкоцитов в 1 мкл крови по формуле:

Х =	а Ч 4000 Ч 20	, где
	1600

Х - количество лейкоцитов в 1 мкл; а - количество лейкоцитов, пересчитанных в 100 больших квадратах; 1600 - количество малых квадратов; 20 - разведение крови; 4000 - приводит результат к объему 1 мкл крови, который выходит из объема малого квадрата (1/4000 мкл).

На практике количество лейкоцитов, которые подсчитаны в 1600 малых квадратах, умножает на 50, а для перевода в единицы СИ (г в 1 дм³) полученную цифру нужно умножить еще на 10⁶.

Исследование форменных элементов крови морфологическим методом с дифференцированным подсчетом лейкоцитарной формулы

Метод позволяет дифференцировать разные формы лейкоцитов. Принцип метода заключается в микроскопии фиксированных и окрашенных мазков крови с дифференцированием разных форм лейкоцитов.

На предметное стекло, предварительно обезжиренное смесью Никифорова, и вытерто досуха, с помощью шлифуемого стекла наносят мазок крови. Мазки подсушивают на воздухе и маркируют. Мазок должен быть равномерно тонким и заканчиваться „метелкой”. Высушенные на воздухе мазки располагают в контейнере, который опускают в кювету с фиксатором на 10 мин. Фиксация проводится раствором эозинметиленового синего по Май-Грюнвальду. Дальше стекла вынимают, промывают в проточной воде и переносят в кювету с рабочим раствором краски Романовского-Гимза на четко определенное время, подобранное для каждой партии красителя.

После этого вынимают контейнер со стеклами из контейнера с красителем, промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе. Для микроскопии используют иммерсионный объектив (90х). Каплю иммерсионного масла наносят на край мазка крови. Объектив окунают в каплю масла. Подбирают с помощью микровинта соответствующее фокусное расстояние, такое, что позволило бы четко рассматривать клетки.

В мазках крови проводят дифференцированный подсчет количества клеток крови с помощью 11-клавишного счетчика; необходимо подсчитать не менее как 100 лейкоцитов. Подсчет лейкоцитов проводят, выполняя такое правило: отступив 2-3 поля зрения от края мазка, 3-5 полей зрения на протяжении края мазка; 3-5 полей зрения под прямым углом в направлении к середине мазка, опять 3-5 полей зрения параллельно краю; дальше - под прямым углом к краю и так далее.

Посчитав около половины клеток с одной стороны мазка, изменяют, положение стекла и вторую половину клеток считают на противоположном боку. Результат выражают в процентах.

Метод определения креатинина в сыворотке (плазме) крови

В качестве унифицированного метода при определении концентрации креатинина в крови предложен метод Поппера, основанный на реакции Яффе. Отечественные и импортные наборы для определения уровня креатинина содержат все необходимые реагенты для выполнения исследования данным методом. Определяя содержание креатинина в сыворотке крови, мы можем оценить направленность макроэргических процессов, а также состояние почечной функции и степень её недостаточности.

Принцип метода - в щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски (реакция Яффе - образование таутомера пикрата креатинина), которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке крови проводят после депротеинизирования. Определение не совсем специфично, интерферируют вещества с активной метиленовой группой и некоторые восстанавливающие вещества, например глюкоза, ацетон, ацетоуксусная и пировиноградная кислоты. Ход определения креатинина в сыворотке крови: 2 мл сыворотки смешивают с 6мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помещают на 15-20сек. в кипящую водяную баню, затем центрифугируют. К 4 мл центрифугата добавляют 0,2мл 2,5моль/л раствора едкого натра и тщательно смешивают. Иногда после подщелачивания раствор мутнеет вследствие выпадения фосфатов. В этом случае раствор еще раз центрифугируют. Затем раствор доводят до объема 10 мл водой. Через 10 мин (не позже 20 мин) измеряют в кювете с толщиной слоя в 2см при длине волны 500-560нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба: 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2мл 2,5моль/л раствора едкого натра доводят до объема 10мл водой. Расчет производится по калибровочному графику. Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора креатинина готовят разведения, через 10 мин производят измерения при тех же условиях, что и опытные пробы. Калибровочная кривая линейна до 260мкмоль/л креатинина.

Метод определения мочевины в сыворотке крови при помощи набора “Биотест-Лахема" и спектрофотометра

Принцип метода основан на взаимодействии мочевины с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов тривалентного железа с образованием окрашенных веществ. Определение содержания мочевины позволяет оценивать интенсивность аминового обмена (нуклеопротеиды) в организме. Подготовка к измерениям: Раствор 1 получают в мерной колбе 50см3 путем растворения таблетки реактива (каждая содержит диацетилмонооксима 0,5ммоль, тиосемикарбазида 0,08ммоль и соль тривалентного железа 2,5ммоль) в дистиллированной воде 30см3 при температуре 800 с последующим добавлением дистиллированной воды до метки. Раствор 2 получают путем смешивания раствора 1 с раствором серной кислоты (концентрация 1,8моль/дм3) 1:

1. Выполнение измерений: в трех тонкостенных пробирках смешивают раствор 2 в соотношении 200: 1 с сывороткой, стандартным раствором мочевины и дистиллированной водой, перемешивают. Пробирки закрывают алюминиевой фольгой и строго на 10 минут помещают на кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в проточной воде и измеряют оптическую плотность пробы (А1) и стандарта (А2) против контрольного раствора при длине волны 490-540 нм и толщине слоя в кювете 10мм. Измерения проводятся до 15 минут после охлаждения. Содержание мочевины рассчитывают по формуле:

Мочевина (ммоль/дм³) = 16,65 * (А¹: А²), где

А1 - оптическая плотность пробы

А2 - оптическая плотность стандартного раствора

16,65 ммоль/дм³ - стандартный раствор мочевины

Определения билирубина в сыворотке крови по методу Йендрашека, Клеггорна и Грофа

Определение содержания билирубина и его эфиров позволяет оценить детоксикационную функцию печени. Принцип метода основан на взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием. Образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая со связанным (прямым) билирубином сыворотки крови дает розово-фиолетовую окраску. По интенсивности окраски определяется концентрация билирубина дающего прямую реакцию. При добавлении в сыворотку крови кофеинового реактива несвязанный (непрямой) билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние и с раствором диазореактивов дает розово-фиолетовую окраску. По интенсивности окраски определяется концентрация общего билирубина. По разнице между общим и связанным билирубином определяют концентрацию несвязанного билирубина. После приготовления рабочего раствора билирубина, по методу Шелонг и Винде (1960) из ряда разведений с разным содержанием билирубина строят градуировочный график. В три пробирки, соответственно схемы вводятся реактивы

Ингредиенты, см3	Проба, см3	Холостая проба
	Общий билирубин	Прямой билирубин
Сыворотка	0,50	0,50	0,50
Кофеиновый реактив	1,75	-	1,75
9% NaCl	-	1,75	0,25
Диазосмесь	0,25	0,25	-

Для определения прямого билирубина колориметрирование проводится в течении 5-10 минут после введения диазосмеси, для общего билирубина - спустя 20 минут. Измеряют оптическую плотность при длине волны 500-560нм (зеленый светофильтр) и толщине слоя в кювете 5мм, используя как раствор сравнения дистиллированную воду. Из показателей, полученных при колориметрировании, прямого и общего билирубина вычитают показатель холостой пробы. Содержание прямого и общего билирубина рассчитывают по градуировочному графику, непрямого билирубина - путем вычитания показателя прямого из показателя общего билирубина.

Метод определения активности аспартат - и аланин - аминотрасфераз в сыворотке крови по Райтману-Френкелю

Ферменты, активность которых определяется в сыворотке крови, позволяют с одной стороны судить о сохранности клеточных мембран гепатоцитов, а с другой об активности процессов переаминирования - важного звена детоксикации. Принцип метода основан на реакции аминирования 2-оксоглутаровой кислоты L-аспарагиновой кислотой (L-аланином), что происходит под действием аспартатаминотрансферазы (аланинаминотрансферазы). Образуются L-глутаминовая и щавелевоуксусная кислоты, последняя декарбоксилируется с образованием пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности 2,4-нитрофенилгидрозонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде.

Отмеряется в кювету	Макроанализ	Микроанализ
	Исследуемая проба	Холостая проба	Исследуемая проба	Холостая проба
Субстратно-буферный реактив	0,4см3	0,4см3	0,1см3	0,1см3
3 минуты при 370С
Р-р 2,4-динитрофенилгидразина	--	0,4см3	--	0,1см3
Сыворотка крови	0,08см3	0,08см3	0,02см3	0,02см3
60 минут при 370С
Р-р 2,4-динитрофенилгидразина	0,4см3	--	0,1см3	--
20 минут при комнатной температуре
Р-р гидроксида натрия 0,4М	4см3	4см3	1см3	1см3
10 минут при комнатной температуре

Измеряются оптическая плотность исследуемой пробы относительно холостой (для каждой сыворотки) при длине волны 530нм и толщине слоя 10мм. Расчет активности фермента в сыворотке крови делают по градуировочному графику.

Определение молекул средней массы спектрофотометрическим методом

Молекулы средней массы - полипептиды разной длины, образующиеся в разных органах и системах при детоксикационных реакциях. Спектрофотометрически измеряется уровень средних молекул, измеряя экстинкцию сыворотки крови, после осаждения большемолекулярных белков и липидов ТХО. Измеряются две фракции СМ: фракция, содержащая ароматические аминокислоты (280нм) и не содержащая ароматических аминокислот (254нм).

К 1 см3 свежей сыворотки добавляется 0,5см3 раствора ТХО, перемешивается и центрифугируется при 3000 об/мин в течении 30мин. К 0,5см3 центрифугата добавляется 4,5см3 дистиллированной воды, перемешивают, измеряют оптическую плотность при длине волны 280нм (254нм) и толщине слоя в кювете 10мм, сравнивая с холостой пробой (0,25см3 ТХО, 4,75см3 дистиллированной воды). Уровень СМ выражают в условных единицах, которые количественно соответствуют показателям экстиции.

Гистологические исследования

Животные для проведения гистологических исследований выводились из опыта декапитацией под легким эфирным наркозом. Производилась аутопсия и извлекались участки печени, кишечника (вблизи от места его повреждения), сердца, почек, в некоторых случаях брали кусочки селезенки (когда внешний вид и размеры селезенки отличались от нормы). Извлеченные кусочки размером до 0,5см³ фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течении 72 часов. Затем материал проводили через спирты возрастающей концентрации и заливали в целлоидин по общепринятой методике. Из полученных таким образом блоков изготовляли микротомные срезы толщиной 7-9 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином с докраской фукселином по Ван-Гизон.

Полученные препараты исследовали под световым микроскопом с выявлением проявлений дистрофии в исследуемых органах, сохранности структурно-функциональной организации органов, состояния сосудистого русла исследуемых органов. Полученные данные систематизировали и излагали в виде разделов соответствующих глав.

Глава III. Особенности состояния внутренних органов крыс с каловым перитонитом при промывании брюшной полости раствором обогащенным ксеноном

3.1 Комплексная оценка состояния органов брюшной полости крыс через 1 сутки калового перитонита

Наблюдение за подопытными животными выявило, что в течении первых суток после формирования калового перитонита выжило 49,9% животных взятых в опыт. Для выживших животных характерно малоподвижное, вялое поведение, они адинамичны, шерсть всклокочена, глаза мутные, носы теплые. Животные не принимают пищу, потребление воды очень ограничено (2-3 мл на животное, против 13,2±0,19 мл в норме). Внешне обращала на себя внимание поддутость живота, болюсы практически не образуются.

При аутопсии в брюшной полости определяется небольшое количество жидкости. Брюшина и париетальная и висцеральная тусклая. На поверхности кишечника пласты фибрина. Кишечник вздут, также определяется вздутость желудка. При этом если печень бледная и капсула её тускловатая, то селезенка сочной багрово-коричневой окраски, хотя капсула её также тусклая. Кишечник темно-багрового цвета, у выживших животных петли его, в области нанесенной раны слипшиеся, разъединяются они с небольшим усилием. У погибших крыс петли кишечника располагаются обособлено.

При микроскопическом исследовании печени обращало на себя внимание спазмирование центральной вены и сосудов триад. При этом дольчатая структурно-функциональная организация печени сохранена. Внутри дольки гепатоциты собраны в балки только в центральной части дольки, в остальной же её части они располагаются неупорядоченно. В той части дольки, где гепатоциты собраны в балки, межбалочные пространства расширены. Клетки Купфера в них набухшие с округлыми ядрами. Сами гепатоциты в основном средних размеров, границы их нечеткие, цитоплазма комковатая, мутная, базофильная. Ядра гепатоцитов средних размеров умеренной окраски, хроматин собран под кариолеммой. Определяются группы гепатоцитов с темными маленькими (пикнотичными) ядрами. Цитоплазма их также комковатая, но окрашена бледнее, чем в основной массе клеток. Кроме того в цитоплазме этих гепатоцитов определяются вакуоли разных размеров. Следует отметить, что количество таких гепатоцитов, визуально выше у погибших животных и соответственно группы, в которые они собраны, визуально, крупнее (рис. 3.1).

Рисунок 3.1 Печень крысы с каловым перитонитом, смазаность белочной организации гепатоцитов. Пикноз ядер некоторых гепатоцитов. Вакуолизация цитоплазмы гепатоцитов.

Окр.: гематоксилином и эозином Ув.: * 400

При микроскопическом исследовании кишечника обращало на себя внимание отечное разрыхление наружной соединительнотканной оболочки кишки и умеренная инфильтрация её лимфоидными элементами. Мышечный слой стенки кишки обычного вида, фиброзные волокна в нем отечно-набухшие. Ворсинки слизистой оболочки кишки разной высоты. В строме ворсинок клетки и волокна располагаются в беспорядке. Эпителиоциты покровного эпителия располагаются неупорядоченно, ядра их расположены на разной высоте, цитоплазма эпителиоцитов мутная, ядра увеличенные в размерах бледно окрашенные. У некоторых из них граница нечеткая. Отдельные эпителиоциты слущены (рис.3.2).

Рисунок 3.2 Ворсинка кишечника крысы с каловым перитонитом. Эпителиоциты с нечеткими разнорасположенными ядрами. Отек-инфильтрация стромы.

Окр.: гематоксилином и эозином Ув.: * 400

В желудке, при микроскопическом исследовании в подслизистой соединительно-тканной пластине определяется набухание волокон и разрыхление в их расположении. В слизистой, железы обычные - трубчатые, эпителий, их выстилающий со слабой базофилией цитоплазмы и светлыми ядрами средних размеров.

В миокарде определяются признаки токсической дистрофии. Пальпаторно миокард дрябловатый. При микроскопии послойная и пучковая организация миокарда сохранена. Межпучковые перегородки слегка набухшие. Кардиомиоциты набухшие, граница тела нечеткая. Ядра кардиомиоцитов увеличены, светло окрашены, овальной формы. В цитоплазме поперечная исчерченность смазана, в части клеток она не определяется. Сосуды застойно полнокровные (рис.3.3).

Рисунок 3.3 Миокард крысы с каловым перитонитом. Застойное полнокровие кардиальных сосудов. Поперечная исчерченность кардиомиоцитов смазана. Ядра частью увеличены, светлые, нечеткие.

Окр.: гематоксилином и эозином Ув.: * 400

В корковом веществе почек при микроскопии определяются округлые почечные тельца, расположенные довольно равномерно. В них капиллярные клубочки округлые. Эндотелиоциты набухшие, в цитоплазме определяются капли яркоэозинофильных включений или вакуоли. Боуменово пространство щелевидное. Наружная мембрана утолщена за счет набухания. Интерстициальные прослойки между извитыми канальцами тонкие, но волокна в них набухшие. Часть извитых канальцев коркового вещества обычного вида. Часть канальцев с резко увеличенными эпителиоцитами, цитоплазма их содержит эозинофильные массы. Просвет канальца за счет набухания эпителиоцитов закрыт.

Селезенка пальпаторно дрябловатая. При микроскопии определяется сохранность сегментной организации её ткани. Перегородки длинные, слегка набухшие. Селезеночные фолликулы двух типов. Часть фолликулов обычных размеров, герминативный центр в них средних размеров с сильно разреженным расположением клеточных элементов. Визуально в них много ретикулоцитов. Лакуны немногочисленны, частью запустевшие. Периферическая зона средних размеров с умеренной плотностью расположения сочных лимфоидных элементов. Часть фолликулов маленькие, центр их небольшой, распределение клеточных элементов в них плотное. Периферическая зона визуально узкая за счет резко сниженной плотности распределения лимфоцитов. Вышеописанные структурные изменения внутренних органов при каловом перитоните у крыс сопровождался изменениями показателей гомеостаза. Выявленные изменения приведены в таблицах 3.1 и 3.2.

Таблица 3.1. Показатели состояния периферической крови крыс с каловым перитонитом без коррекции

Сроки Показатель	Контроль	1 сутки эксперимента	3 сутки эксперимента	7 сутки эксперимента
		Перитонит	Перитонит	Перитонит
Эритроциты 1012/л	3,88±0,11	4,5±0,21 p<0,05	4,0±0,5 p<0,5	4,13±0,34 p<0,5
Гемоглобин г/л	136,0±3,2	168,0±9,1 p<0,05	141,4±9,0 p<0,5	142,0±11,4 p<0,5
Цветной показатель	1,10±0,03	1,12±0,1 p<0,1	1,0±0,11 p<0,5	1,0±0,1 p<0,1
СОЭ мм/час	1,54±0,08	4,0±0,3 p<0,1	1,0±0,07 p<0,02	3,0±0,21 p<0,5
Лейкоциты 109/л	5,5±0,2	7,9±0,6 p<0,05	6,0±0,7 p<0,5	12,1±2,3 p<0,01
Формула крови	Нейтрофилы	12,79±0,64	41,0±5,6 p<0,1	32,0±6,1 p<0,1	19,0±1,6 p<0,5
	Ацидофилы	2,25±0,23	-	2,67±0,2 p<0,05	2,0±0,3 p<0,5
	Моноциты	3,73±0,21	4,0±0,41 p<0,05	4,67±0,31 p<0,02	3,0±0,4 p<0,5
	Лимфоциты	81,2±0,80	55,0±4,9 p<0,01	60,7±5,9 p<0,05	76,0±8,1 p<0,1

Как следует из данных таблицы 3.1, в первые сутки калового перитонита количество эритроцитов несколько снижается, что очевидно связано с кровопотерей в ходе оперативного вмешательства. Количество гемоглобина и цветной показатель остаются близкими к норме, что свидетельствует о сохранности функции крови по транспортировке кислорода и субстратов. Со стороны белой крови определяется изменение соотношения клеток разных типов: снижается содержание лимфоцитов и ацидофилов, повышается - нейтрофилов, т.е. ухудшается распознавание чужеродных элементов, но усиливается уничтожение попавших в кровь ксенобиотиков, усиливаются механизмы неспецифической защиты.

...