Зв'язок алельного поліморфізму "генів ектопічної кальцифікації" з розвитком поширених серцево-судинних хвороб та їх ускладнень

Размещено на http://www.allbest.ru//

РЕФЕРАТ

Об'єкт дослідження - молекулярно-генетичні механізми розвитку патологічних процесів і хвороб людини.

Мета роботи - встановлення зв'язків між однонуклеотидними поліморфізмами "генів ектопічної кальцифікації" і розвитком поширених серцево-судинних хвороб та їх ускладнень.

Методи дослідження - полімеразна ланцюгова реакція з наступним аналізом довжиин рестрикційних фрагментів.

Уперше встановлено, що ризик розвитку ІАТІ у гомозиготних носіїв мінорного алеля С/С (Т2255С поліморфізм гена VKORС1) у 2,2 раза вищий, ніж у гомозигот за основним алелем. Показано, що ризик розвитку ГКС у гомозигот за мінорними алелями B/B (BsmI поліморфізм гена VDR) - у 2,1; Gln/Gln (Arg325Gln поліморфізм гена GGCX) і С/С (Т2255С поліморфізм гена VKORС1) у 2 рази вищий, ніж у гомозиготних носіїв основних алелів - b/b, Arg/Arg, T/T. Встановлення такого зв'язку дасть змогу в майбутньому прогнозувати ризик виникнення і розвитку склеротичних уражень судин та їх тяжких наслідків і на цій основі пропонувати та застосовувати сучасні методи профілактики та лікування в осіб, що мають спадково зумовлену схильність до судинної патології. Результати дослідження можуть бути використані при підготовці фахівців у галузі медичної і молекулярної генетики, при створенні методів виявлення спадкової схильності до найпоширеніших в Україні хвороб і розробці засобів їх попередження та лікування. Наукові результати будуть доповнювати банк даних про поширеність різних видів поліморфізму генів серед населення України та зв'язок цього явища з виникненням патологічних процесів та хвороб.

АЛЕЛЬНИЙ ПОЛІМОРФІЗМ, ГЕН, VDR, VKORС1, GGCX, CКЛЕРОТИЧНІ УРАЖЕННЯ, СЕРЦЕВО-СУДИННІ ЗАХВОРЮВАННЯ, ІШЕМІЧНИЙ АТЕРОТРОМБОТИЧНИЙ ІНСУЛЬТ.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ,

СКОРОЧЕНЬ І ТЕРМІНІВ

АГ - артеріальна гіпертензія

АТ - артеріальний тиск

АТФ - аденозинтрифосфорна кислота

ГІІ - гострий ішемічний інсульт

ГКК - гіперкоагуляція крові

ГКС - гострий коронарний синдром

ГМК - гладкі м'язові клітини

ДАТ - діастолічний артеріальний тиск

ДАХ - дисліпідемія атерогенного характеру

ІАТІ - ішемічний атеротромботичний інсульт

ІМТ - індекс маси тіла

ІХС - ішемічна хвороба серця

мРНК - матрична рибонуклеїнова кислота

ПАТ - пульсовий артеріальний тиск

РРі - неорганічний пірофосфат

САТ - систолічний артеріальний тиск

СрАТ - середній артеріальний тиск

ЦД - цукровий діабет

ПЕРЕДМОВА

Проблема походження і механізмів розвитку склеротичних уражень кровоносних судин - основної причини смертельно небезпечних ускладнень: гострого коронарного синдрому (ГКС) та ішемічного атеротромботичного інсульту (ІАТІ) - посідає одне з перших місць серед наукових проблем як клінічної, так і експериментальної медицини. Причиною цього є велика поширеність та смертність від серцево-судинних недуг у високорозвинених країнах світу загалом і в Україні зокрема.

Хоча за останні кілька десятиріч смертність від артеріосклерозу істотно зменшилася, його ускладнення все ще посідають перше місце серед причин летальності в економічно розвинених країнах світу. Не є винятком і Україна, де на серцево-судинні недуги, зумовлені артеріосклерозом, припадає понад 60 % усіх смертей.

Такий стан проблеми спонукає дослідників проникати все глибше і глибше в патогенетичні механізми склерозування судин, вивчати їх не лише на традиційних - тканинному й клітинному, а й на молекулярному та молекулярно-генетичному рівнях.

Дослідження в цьому напрямі проводяться і в Україні. Їхнім центром є Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України та Інститут кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України. Так, у цих наукових закладах досліджується роль поліморфізму генів, що кодують ряд ферментів (NO-синтазу, конвертазу, металопротеїнази та ін.) та важливих білків-регуляторів, у розвитку гострого коронарного синдрому, артеріальної гіпертензії та інших серцево-судинних хвороб. На відміну від цих досліджень у роботі, що проведена, вивчено поліморфізм гена, причетного до розвитку кальцифікації судинної стінки - важливого компоненту атеросклеротичних уражень і артеріосклерозу Менкеберга.

ВСТУП

На сьогодні однією особливо актуальною проблемою в Україні, як і у всьому світі є розповсюдженість серцево-судинних захворювань і один з найвищих показників смертності від них [1]. Зусилля багатьох учених спрямовані на розкриття механізмів, що лежать в основі ектопічної мінералізації взагалі і кальцифікації кровоносних судин зокрема. Великий прогрес у розумінні цих механізмів досягнуто завдяки відкриттю природних чинників, що запобігають відкладанню солей кальцію в м'які тканини у фізіологічних умовах і при патології.

Неспростовні докази того, що відкритий наприкінці 80-х років минулого сторіччя MGP є потужним антикальциногенним чинником, добуто за допомогою новітньої методики генетичного нокауту. Так, було встановлено, що у мишей, позбавлених гена MGP (MGP -/- миші), закономірно розвивається медіакальциноз, який, як правило, завершується аневризмою аорти, розрив якої призводить до смерті тварин [2].

У великій кількості праць удалося з'ясувати фактори, причетні до регуляції експресії гена MGP, і виявити можливі механізми, через які реалізують себе антикальциногенні властивості відповідного білка. Це дало підстави вести мову про функціональну систему MGP, до якої можуть бути зараховані, крім самого протеїну, такі чинники, як рецептор вітаміну D (VDR), ферменти, що беруть участь у біохімічних перетвореннях MGP, - вітамін К-оксидоредуктаза (VKOR) і г-глютамілкарбоксилаза (GGCХ).

Із впровадженням методів молекулярної генетики в медичну практику стало можливим вивчення генетичних маркерів, які обумовлюють виникнення тих чи інших мультифакторіальних хвороб, що має велике значення не тільки для визначення спадкової схильності до них, а й для вибору метода лікування, прогнозу розвитку ускладнень. Успіхами світової наукової спільноти сьогодні накопичена значна кількість даних про участь різних поліморфних генів у формування схильності до мультифакторної патології [1].

Ефективна діяльність цієї системи може залежати від багатьох факторів, серед яких поліморфізм генів, що кодують структуру відповідних білків. Останнім часом цей аспект проблеми привертає все більшу і більшу увагу, про що свідчить значна кількість праць, присвячених зв'язкам молекулярно-генетичних чинників із розвитком патологічних процесів та хвороб у людини. Проте комплексні дослідження, у яких би вивчалася роль генетичного поліморфізму MGP і пов'язаних із ним протеїнів у розвитку серцево-судинних недуг, до цього часу не проводилися. З огляду на це ми поставили за мету вивчити зв'язок цілого ряду однонуклеотидних поліморфізмів генів системи MGP з такими тяжкими ускладненнями артеріосклерозу, як гострий коронарний синдром та ішемічний атеротромботичний інсульт.

Крім того, важливим, на наш погляд, було з'ясувати, яким чином пригнічення функціонування MGP впливає на стан судинної стінки в умовах дії на неї патогенних факторів, що індукують кальцифікацію артерій і зумовлюють розвиток артеріосклерозу Менкеберга.

Дослідженнями ВООЗ показано, що традиційні підходи в терапії цих та ішших поширених мультифакторних хвороб малоефективні і ведуть до суттєвих економічних витрат. Проблема низької ефективності лікувально-профілактичних заходів пов'язана з відсутнісю їхньої етіологічної спрямованості внаслідок недостатнього розуміння провідних механізмів формування переважної більшості мультифакторних хвороб [1].

Виконання проекту може в перспективі мати важливе практичне значення, оскільки на підставі даних вивчення геному можна буде прогнозувати ризик розвитку серцево-судинних хвороб та їхніх ускладнень і на цій основі пропонувати засоби ефективної профілактики, а в разі виникнення недуг - адекватні методи їх лікування, що поліпшить якість життя і його тривалість у населення України. Здобутий у дослідженні науковий матеріал може скласти основу розділів підручників та навчальних посібників, у яких викладаються молекулярно-генетичні механізми розвитку патологічних процесів і хвороб.

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ З ПИТАННЯ РОЛІ АЛЕЛЬНОГО ПОЛІМОРФІЗМУ ГЕНІВ VDR, VKORC1, GGCX У РОЗВИТКУ серцево-судинних захворювань

1.1 Сучасні уявлення про плив «ектопічної кальцифікації» на розвиток серцево-судинних захворювань

У 90 % пацієнтів із серцево-судинними захворюваннями виявляють ознаки кальцифікації артеріальних судин [3]. Зростання вмісту кальцію у стінках вінцевих артерій людей віком понад 50 років має важливе прогностичне значення щодо розвитку тяжких серцево-судинних недуг та їх ускладнень [3, 4]. Відкладання солей кальцію в структурах артерій у хворих із кардіо- і цереброваскулярною патологією, на думку багатьох дослідників, є несприятливим фактором, що свідчить про високу ймовірність настання фатальних ускладнень [5]. За сучасними уявленнями інтенсивність кальцифікації судин визначається балансом між про- та антикальциногенними факторами [6]. Серед чинників, що захищають судинну стінку від кальцифікації, важливу роль відіграють неорганічний пірофосфат PPi, матриксний Gla-протеїн (MGP), остеопонтин, остеопротегерин, фетуїн, внутрішньоклітинні інгібітори (Smad6, Dkk1), остеокластоподібні клітини судинної стінки [6, 7].

Сьогодні відомо, що важливе значення в експресії гена MGP відіграє вітамін D. Показано, що вітамін D3 збільшує синтез мРНК MGP в остеокластах людини, а також у хондроцитах, остеобластах та клітинах остеосаркоми щурів [8]. Він не впливає на експресію гена MGP у фібробластах, хондроцитах та остеобластах людини. У фізіологічних концентраціях вітамін D3 посилює транскрипцію гена MGP у судинних ГМК [9].

Вплив вітаміну D на синтез MGP реалізується через рецептор вітаміну D (VDR), який є представником суперсімейства ядерних рецепторів (NR) - ліганд-активних транскрипційних регуляторів фізіологічних функцій, починаючи з розвитку та розмноження, і до гомеостазу і метаболізму у багатоклітинних організмів. Рецептори вітаміну D широко представлені в організмі людини і виявлені не лише в таких класичних органах-мішенях для вітаміну D, як кишечник, нирки і кістковий апарат, але й у мозку, серці, підшлунковій і паращитоподібних залозах, шкірі, статевій системі та ін. [10, 11].

Молекула VDR людини (мол. маса 48,3 кДа) складається з 427 амінокислотних залишків. У ній виділяють декілька функціональних доменів. Домен А/В несе мотив, що виконує функцію автономної активації транскрипції, так звану функцію активації-1 (AF-1). У молекулі VDR він укорочений, порівняно з іншими ядерними рецепторами, і складається з 20 амінокислотних залишків. Домен С, або ДНК-зв'язуючий домен (DBD), складається з 21-92 амінокислот і представлений висококонсервативною послідовністю, що містить два цинкових пальці типу С4 [12], які взаємодіють зі специфічною ділянкою ДНК, розміщеною перед геном-мішенню, і модулює швидкість ініціації транскрипції. Крім того, доведена роль С- домену у димеризації рецептора і накопиченні VDR в ядрі. Домен D є дуже варіабельним і являє собою гнучку лінкерну ділянку, що забезпечує пластичність структури рецептора і пов'язує ДНК-зв'язуючий і лігандзв'язуючий домени [13]. Домен E/F помірно варіабельний у послідовності, але висококонсервативний у третинній структурі. Він містить лігандзв'язуючий домен (LBD). Е-домен закінчується ділянкою, що виконує функцію транс активації-2 (AF-2) - є платформою для численних кофакторів, необхідних для прояву активності рецептора [14], а також бере участь у димеризації з рецептором цис-ретиноєвої кислоти (RXR). Унікальною особливістю молекули VDR, порівняно з іншими ядерними рецепторами, є велика вставка між доменами D і E/F, яка кодується окремим екзоном. Роль цієї ділянки у функціонуванні VDR не з'ясована [13, 14].

Таким чином, вітамін D та велика кількість інших факторів можуть впливати на експресію гена MGP, щоправда з різними ефектами на різні типи клітин. Необхідно, однак, зауважити, що збільшення експресії MGP найчастіше відбувається у місцях кальцифікації тканин [16]. У таких випадках посилення синтезу MGP може бути спробою клітин відповісти на кальцифікацію способом, що інгібує цей процес. Іншими словами, експресія MGP є залежною від подій, що розвиваються в тканинах [6].

Молекула MGP людини (мол. маса 10 кДа) складається з 84 амінокислотних залишків, 5 з яких представлено г-карбоксиглютаміновою кислотою (Gla) [17].

На відміну від усіх відомих сьогодні вітамін К-залежних білків MGP не має форми пропептиду [17]. Хоча MGP містить великий відсоток гідрофільних амінокислотних залишків, він майже не розчинний у воді (розчинність < 10 мкг/мл), а тому його транспорт плазмою крові може відбуватися лише в комплексі з іншими водорозчинними білками.

Щойно синтезована молекула MGP складається із 103 амінокислотних залишків (84 - це зрілий білок та 19 - трансмембранний сигнальний пептид) і містить, починаючи з N-кінця, три функціональні ділянки: 1) трансмембранний сигнальний пептид (transmembrane signal peptide); 2) імовірний сайт, що його розпізнає г-карбоксилаза (putative recognition site for г-carboxylase); 3) домен, що містить залишки Gla (Gla-containing domain) [17].

Утворений у клітинах MGP зазнає посттрансляційної модифікації, яка полягає в карбоксилюванні п'яти залишків глютамінової кислоти (Glu) з утворенням г-карбоксиглютамінової кислоти (Gla). Зазначена реакція каталізується ферментом г-глютамілкарбоксилазою (GGCX) і є спряженою з окисненням відновленої форми вітаміну К (гідрохінону) в 2,3-епоксид вітаміну К.

Вітамін К-залежна г-глютамілкарбоксилаза - інтегральний трансмембранний протеїн [18], що каталізує посттрансляційне карбоксилювання глютамінової кислоти до г-карбоксиглютамінової кислоти не лише в молекулі MGP, а й в інших вітамін К-залежних білках, які синтезуються в печінці (фактори згортання крові: II, VII, IX, X, протеїни S, С і Z), та в інших тканинах (остеокальцин, білок S, Gas6 та чотири трансмембранні білки: PRGP1, PRGP2, TmG3 і TmG4) [19].

Оскільки Glu значно слабший хелатор іонів кальцію, ніж Gla, то вітамін К-залежна реакція карбоксилювання значно підвищує кальцій-зв`язуючу спроможність білків і тому має вирішальне значення для біологічних функцій вітамін К-залежних білків, які беруть участь у згортанні крові, мінералізації кісток і м'яких тканин, сигналах трансдукції та проліферації клітин [20].

Вітамін К-залежна г-глютамілкарбоксилаза вперше була виділена із печінки щурів у лабораторії Esmon у 1975 році [21], а у 1976 році Suttie et al. екстрагували фермент із тканин інших тварин і людини [22]. GGCX утворюється в багатьох тканинах організму, зокрема у печінці, яєчках, шкірі, легенях, нирках [23].

г-Глютамілкарбоксилаза складається із 758 амінокислотних залишків (94 кДа). Білок здебільшого сконцентрований на люмінарній поверхні ендоплазматичного ретикулума та у структурах комплексу Гольджі. Гідрофобна N-кінцева частина молекули складається із декількох (від 3 до 7) трансмембранних доменів. C-термінальна частина відносно гідрофільна. Молекула г-глютамілкарбоксилази пронизує мембрану ендоплазматичного ретикулума щонайменше 5 разів [24].

GGCX людини є глікопротеїном. Вісім із дев`яти глікозильованих сайтів знаходяться на С-термінальній частині молекули. Крім активних сайтів, де відбувається карбоксилювання, наявні високоафінні до субстрату розпізнавальні сайти (пропептидзв`язуючі сайти), які взаємодіють з ділянками пропептидів, що знаходяться на NH2-кінці цих субстратів. Уперше теорія про зв`язок GGCX із відповідними пропептидними ділянками вітамін К-залежних білків була запропонована Pan and Price, які помітили схожі амінокислотні послідовності на N-кінцях різних протеїнів, що карбоксилюються г-глютамілкарбоксилазою [25]. Ця теорія була експериментально підтверджена в багатьох дослідженнях, у т. ч. і на культурі клітин ссавців. Крім того, було доведено, що точкові мутації, які призводять до змін у «консервативних» гідрофобних залишках у 16-, 10- та 6-му положеннях пропептиду, значно зменшують або взагалі усувають ефект карбоксилювання субстрату у культурі клітин [26]. Щодо вітамін К- залежних кісткових протеїнів, вони підлягають дещо іншому механізму карбоксилювання та процесингу. Так, матриксний Gla-протеїн, як уже зазначалося, синтезується як препротеїн, у якого немає пропротеїну. Декарбоксильований кістковий Gla-протеїн імовірно з`єднується із ферментом за допомогою внутрішньої розпізнавальної послідовності (putative recognition site for г-carboxylase) [141].

Як уже зазначалося, процес посттрансляційної модифікації MGP полягає в г-карбоксилюванні залишків глютамінової кислоти, одночасно з яким відновлена форма вітаміну K (KH2) окиснюється до 2,3-епоксид вітаміну К (KO), який через обмежену кількість вітаміну К in vivo повинен бути перетворений знову в KH2 для продовження реакції. Це циклічне перетворення вітаміну К становить окисно-відновний цикл, відомий сьогодні як цикл вітаміну К. Фермент, що відповідає за перетворення KO до його відновленої форми, називається вітамін К-епоксидоредуктазою (VKOR) [27].

Крім цілком зрозумілого стану гіповітамінозу К, зменшення необхідного пулу цього вітаміну в клітинах може бути зумовлено значним зростанням потреб у г-карбоксилюванні. Так, висунуто гіпотезу, відповідно до якої основні токсичні ефекти високих доз вітаміну D, у тому числі ектопічна кальцифікація паренхіматозних органів і артеріальних судин, зумовлені недостатністю вітаміну К, яка настає внаслідок значного посилення синтезу білків, що потребують г-карбоксилювання [28]. У цих умовах наявного вітаміну К недостатньо і значна кількість новоутворених білків, у тому числі MGP, не може перейти в Gla-форму, а отже, набути необхідної функціональної активності. Отже, будь-яке посилення експресії MGP вимагає збільшення доступності відновленої форми вітаміну K, що діє як кофактор г-карбоксилювання.

Таким чином, без окиснення вітаміну К не може відбуватися карбоксилювання Glu-залишків молекули MGP. У свою чергу, достатня кількість вітаміну К для реакції карбоксилювання MGP визначається балансом між його надходженням у клітини і використанням, з одного боку, та інтенсивністю відновлення окисненої форми вітаміну К (KO), з іншого, яка здійснюється за допомогою VKOR.

Із моменту відкриття ферментативної активності VKOR у 1970 році були описані численні невдалі спроби виділити цей мембранний фермент із печінкових мікросом щурів [29]. Виділення VKOR виявилося доволі складним завданням, оскільки ензим інактивувався будь-яким детергентом, що використовувався для розчинення [30].

Із часу відкриття каталітичної активності VKOR і до сьогодні деякі вчені висловлюють припущення, що відновлення епоксиду вітаміну К представлено мультиензимним комплексом - VKORC1 (комплексна субодиниця 1) [29] і ще однією субодиницею, яка досі не ідентифікована. Результати останніх досліджень із використанням очищеної рекомбінантної VKOR показують, що відновлення KO і вітаміну К може бути здійснене одним ферментом [30]. Однак це не виключає можливості того, що in vivo досі невідомий фізіологічний відновник може зв'язуватися з нею, утворюючи ферментний комплекс.

Вітамін К-епоксидоредуктаза має молекулярну масу 18,2 кДа, складається із 163 амінокислотних залишків і являє собою інтегральний трансмембранний протеїн, який каталізує відновлення 2,3-епоксиду вітаміну К (КО) і вітаміну К до вітаміну К-гідрохінону (КH2). Утворюється VKOR у багатьох тканинах, зокрема в печінці, серці, підшлунковій та слинних залозах, нирках, легенях, м'язовій тканині та кістках.

За останніми даними, в клітинах організму існує ендогенний інгібітор вітамін К-епоксидоредуктазного комплексу, названий калюменіном [31]. Калюменін є білком, здатним зв'язувати кальцій. Його вперше ідентифікували в тканинах серця мишей і виявили в ендоплазматичному ретикулумі та апараті Ґольджі клітин. Важливим є те, що калюменін зв'язується з VKOR і зменшує його активність, а отже, зумовлює менш ефективну діяльність вітамін К-залежної системи г-карбоксилювання [32]. Припускають, що калюменін перешкоджає зв'язуванню варфарину з VKOR. Показано, що у варфаринрезистентних щурів був збільшений рівень калюменіну в печінці, який захищав VKOR від пригнічення варфарином. Причому VKOR та GGCX, виділені з цих щурів, мали нормальну чутливість до варфарину [32]. У клітинах, які були нокаутовані за геном калюменіну, спостерігалася підвищена VKOR- і GGCX-активність та збільшена продукція IX та VII факторів згортання крові. Цікаво відзначити, що цей білок є продуктом секреції активованих тромбоцитів і його виявляють у місцях атеросклеротичних уражень у людини [31]. Калюменін, таким чином, може бути важливим фактором, що зумовлює накопичення недокарбоксильованого (тобто неактивного) MGP в атеросклеротичних бляшках. Останнє дає право припускати, що досліджуваний ензим може відігравати роль у розвитку серцево-судинних захворювань.

Після відкриття MGP було доведено, що у стінках кровоносних судин Gla-вмісні білки представлено саме цим протеїном. В артеріальній стінці MGP синтезується ГМК медії та інтими, а в місцях атеросклеротичних уражень - і макрофагами [15]. За допомогою моноклональних антитіл було показано, що в стінці нормальних артерій людини MGP асоційований із ГМК та еластичними мембранами в медії і з позаклітинним матриксом в адвентиції [28]. Було встановлено, що MGP має стосунок до різних видів кальцифікації артеріальних судин.

Сьогодні основним фізіологічним ефектом матриксного Gla-протеїну вважають його антикальциногенну дію. Докази того, що MGP є важливим природним інгібітором кальцифікації in vivo, було отримано в трьох групах досліджень, а саме: 1) при вивченні генетично нокаутованих мишей; 2) при експериментальному відтворенні варфаринової моделі уражень судин; 3) при виявленні причин синдрому Кейтеля у людей.

1.2 Ген VDR та його поліморфізми

Ген VDR у людини представлено однією копією, яка міститься в довгому плечі 12-ї хромосоми (12q13.11) [33]. Довжина гена становить 63495 пар нуклеотидів. Послідовність гена розміщена на мінус- або анти сенс-ланцюгу. На генетичній карті ген VDR знаходиться поряд із генами колагену ІІ типу альфа-1 (COL2A I), фосфофруктокінази (PFK), вакуольної АТФази (VATPase), сентрин/SUMO-специфічної протеази (SENP I).

Більшість дослідників вважають, що ген рецептора вітаміну D складається з 11 екзонів. Хоча стосовно кількості екзонів даного гена існують різні погляди. Деякі автори виділяють 9, інші - 13 або більшу кількість екзонів [34]. Усе це пов'язано з тим, що у гені VDR є послідовності, транскрипти яких можуть не вирізатися під час процесингу, але в той самий час вони не несуть інформацію про структуру білка. Також доведено, що початок транскрипції з одного із альтернативних промоторів є тканиноспецифічним. Альтернативний початок зумовлює утворення тканиноспецифічних мРНК, які кодують функціонально різні ізоформи рецепторів. У перший екзон об'єднують групу невеликих екзонів (IA, IB і т. д.), кількість яких і зумовлює варіабельність кількості екзонів гена VDR. Послідовність ДНК, розміщена перед 1А-екзоном, містить велику кількість GC-повторів і не має типового ТАТА-боксу [35]. Відсутність останнього і обумовлює існування декількох стартових кодонів. Другий та третій екзони кодують амінокислотну послідовність, що виконує функцію цинкових пальців у зрілому протеїні. Окремо необхідно назвати п'ятий екзон, який серед усіх ядерних рецепторів характерний лише для VDR. Структурна частина протеїну кодується екзонами 2 - 9.

На сьогодні описано 1518 однонуклеотидних поліморфізмів (SNP) гена VDR у людини. З них найкраще досліджено з огляду їхньої асоціації з різними хворобами такі поліморфізми: FokI (rs2228570) [36], BsmI (rs1544410) [37], ApaI (rs7975232) [38], TaqI (rs731236) [39], EcoRV (rs4516035) [39], Tru9I [40], Cdx2 (rs11568820) [41].

Суть однонуклеотидного поліморфізму FokI полягає в тому, що в результаті заміни в 2-му екзоні гена VDR у положенні 25920 тиміну на цитозин відбувається зміщення стартового кодону і вкорочення на три амінокислотні залишки зрілого білкового продукту. Таким чином, залежно від поліморфних варіантів FokI, а отже, двох можливих сайтів початку трансляції існують два різновиди (ізоформи) білка VDR: довгий і вкорочений. Перший (427 амінокислотних залишків) є продуктом T-алеля, його позначають як M1-форму (метіонін у першій позиції). Другий варіант (424 амінокислотні залишки) є вкороченим на 3 амінокислоти, він пов'язаний із C-алелем і позначається як M4-форма (метіонін у четвертому положенні).

Таким чином, необхідно зазначити, що, за даними літератури, FokI поліморфізм 2-го екзону гена VDR має своїм проявом існування двох ізоформ транскрипційного фактора з різною функціональною активністю, яку виявляють у дослідженнях in vitro в системах, що складаються з різних ділянок промотору різних генів, уведених у різні види культивованих клітин. Що стосується впливу FokI поліморфізму, а отже, і двох ізоформ VDR на рівні організму в цілому, то він може позначатися на показниках сироватки крові (наприклад, вміст остеокальцину), інтенсивності всмоктування кальцію у тонкій кишці, щільності кісткової тканини, ефектах кальцитріолу, що вводиться ззовні [42].

Поліморфізми гена VDR - BsmI і ApaI, локалізовані у 8-му інтроні, недалеко від ділянки, яку позначають як 3'-UTR (untranslated region) [39]. Самі по собі поліморфізми в інтронах не є функціонально значимими, оскільки не змінюють послідовності азотистих основ у змістовній частині гена, проте, будучи зчепленими з регуляторними ділянками гена, можуть бути маркерами функціональних зв'язків інших SNP із розвитком патологічних процесів і хвороб. TaqI поліморфізм локалізований у 9-му екзоні, недалеко від ділянки 3'-UTR і також не змінює кількості і якісного складу амінокислот білкового продукту.

Arai et al. повідомили про заміну гуаніну на аденін в 1А-екзоні промоторної ділянки серед жінок в японській популяції і довели, що А-алель характеризується більшою транскрипційною активністю [34].

Ряд досліджень підтверджує, що поліморфізм гена рецептора вітаміну D може бути одним із багатьох факторів ризику атеросклерозу. Filus et al. з'ясували, що існує зв'язок між FokI поліморфізмом і деякими показниками ліпідного спектра плазми крові. Більш уразливими до розвитку атеросклерозу і його ускладнень є носії основного алеля (F/F, F/f), які мають нижчий рівень антиатерогенного ХС-ЛПВГ, ніж гомозиготи за мінорним алелем (f/f) [36].

Swapna et al. виявили асоціацію між FokI поліморфізмом гена VDR та величиною артеріального тиску. Особи з F/F генотипом мають більший ризик розвитку есенціальної гіпертензії [37]. В іншому дослідженні доведений вплив BsmI поліморфізму гена рецептора вітаміну D на показники артеріального тиску у здорових осіб: чоловіки, які є носіями b/b генотипу, мають вищий рівень систолічного артеріального тиску порівняно з носіями b/B і B/B генотипів [38].

Група індійських учених виявила зв'язок FokI, BsmI і TaqI поліморфізмів гена VDR із цукровим діабетом 2-го типу, який є одним із факторів ризику серцево-судинних захворювань [39].

Ortlepp et al. довели зв'язок BsmI поліморфізму з розвитком кальцифікації аортального клапана і з'ясували, що В алель зустрічається достовірно частіше у пацієнтів із кальцифікованим клапаном порівняно з особами з групи контролю [43].

1.3 Ген VKORC1 та його поліморфізми

Ген VKORC1 у людини представлено однією копією, яка міститься в короткому плечі 16-ї хромосоми (16p11.2) на мінус-ланцюгу. У гені закодовано 163 амінокислотні залишки зрілого білка. Довжина гена - 5126 нуклеотидів, він складається з 3 екзонів, розділених двома інтронами.

На сьогодні описано понад 117 поліморфізмів поодиноких нуклеотидів

у гені вітамін К-епоксидоредуктазного комплексу, субодиниці 1. Найкраще вивченими з огляду на зв'язок із серцево-судинними захворюваннями є три: поліморфізм промотору G-1639A (rs9923231), поліморфізм першого інтрону C1173T (rs9934438) та поліморфізм другого інтрону С2255Т (rs2359612).

G-1639A поліморфізм розміщений у другому положенні Е-боксу, що має нуклеотидну послідовність CA/GNNTG [44]. Yuan et al. вивчали вплив даного SNP на активність промотору і довели, що A-алель пов'язаний з її значним зниженням і з більш низьким рівнем експресії мРНК VKORC1 [45]. Wang et al. підтвердили цей висновок. При визначенні рівня експресії мРНК у HepG2-клітинах печінки вони виявили, що -1639A-алель пов'язаний з 2-кратним зниженням експресії мРНК порівняно з -1639G-алелем. Але таке зниження активності промотору обмежується лише HepG2-клітинами і не виявлене в інших тканинах [46].

Більшість досліджень генетичного поліморфізму гена VKORC1 проводилася з метою вивчення його впливу на метаболізм кумаринових коагулянтів в організмі людини з подальшим застосуванням отриманих даних у корекції дози препаратів у пацієнтів із різними алельними варіантами названого гена.

Одними з перших почали вивчати інформативні SNP у гені VKORC1 Rieder et al. [47]. Найбільша їх увага була звернена на G6853C поліморфізм (rs17886369), який корелює з різним рівнем експресії гена VKOR і визначає 21-25 % варіабельності дози варфарину у пацієнтів. Авторами з'ясовано, що носії G-алеля мають вищий рівень ендогенної епоксидоредуктазної активності і повинні отримувати більшу дозу варфарину. Так, середня терапевтична доза варфарину на добу становить у гомозигот за основним алелем (G/G генотип) 6,0-6,2 мг, у гетерозигот (С/G) - 4,3-4,9 мг і у носіїв С/С генотипу - 2,7-3,4 мг.

В інших дослідженнях доведено, що варіабельність дози варфарину може бути пов'язана ще з двома поліморфізмами: промотору G-1639A (rs9923231) [48] і першого інтрону C1173T (rs9934438) [49]. Так, установлено, що варфариннечутливі пацієнти мали G-алель у -1639-му положенні гена VKORC1, тоді як варфаринчутливі - виключно А-алель. Дослідники підкреслили, що G-1639A та С1173T поліморфізми тісно пов'язані між собою і корелюють із втратою експресії гена VKORC1 при трансфекції його в лінію клітин.

На даний час названо 5 основних SNP у гені VKORC1, що визначають із метою коригування дози оральних антикоагулянтів: T-4931C (rs719616114), G-1639A (rs9923231), C1173T (rs9934438), G1542C (rs8050894), C7566T (rs2359612), які утворюють 2 основних гаплотипи. Гаплотип А містить у собі мінорні алелі і пов'язаний зі зниженням експресії мРНК і меншою підтримуючою дозою варфарину порівняно з гаплотипом В, який об'єднує основні алелі [46].

Ураховуючи наявність серед вітамін К-залежних протеїнів тих, які беруть участь у підтриманні кальцієвого гомеостазу в організмі, подальші дослідження з вивчення однонуклеотидних поліморфізмів гена VKORC1 були спрямовані на пошук зв'язку генетичної варіабельності останнього з розвитком уражень серцево-судинної та кісткової систем.

Так, Teitchert et al. установили, що представники білої раси, які є носіями Т-алеля за C1173T поліморфізмом 1 інтрону гена VKORC1 мають значно вищий ризик розвитку кальцифікації аорти, ніж носії основного алеля [50].

Wang et al. з?ясували, що наявність С-алеля в 2255-му положенні гена VKORC1 (С2255T поліморфізм) збільшує більше ніж у два рази ризик розвитку інсульту та ішемічної хвороби серця і більше ніж у три рази - ризик розвитку розшарування аорти. Також вчені виявили, що пацієнти з С/С та С/Т генотипами мали нижчий рівень карбоксильованого остеокальцину, ніж носії T/T генотипу [51]. Lemmens et al., на відміну від отриманих у японському дослідженні результатів, не виявили зв'язку С1173T поліморфізму з розвитком ішемічної хвороби серця та інсультом серед населення Західної Європи [52].

1.4 Ген GGCX та його поліморфізми

Ген GGCX має 1 копію і розміщений на короткому плечі 2-ї хромосоми (2p12). Довжина гена становить 13151 нуклеотид. Він складається з п'ятнадцяти екзонів, на які припадає 2277 нуклеотидів. У нуклеотидній послідовності інтронів Sheue-Mei Wu et al. виявили 10 Alu-повторів типів J і S (підтипи Sq, Sx, Sp), з якими пов?язують розвиток цілого ряду патологічних процесів та хвороб, передусім онкологічних захворювань. У другому інтроні розміщені MER 20 повтори з частотою 200-400 копій. Послідовність шостого інтрону збагачена САА- повторами [53].

Сайт ініціації транскрипції розміщений у 515-й позиції гена. У тканинах людини утворюється мРНК г-глутаміл карбоксилази двох типів (2.7 кб та 3.6 кб). Різниця між ними в тому, що довша має Alu Sx-повтори між першою і другою полі-А-послідовністю. Функціональна значимість зазначених повторів є незаперечною. Так, Vansant and Reynolds виявили, що Alu повтори можуть бути зв'язуючим сайтом для рецептора ретиноєвої кислоти та підвищувати рівень транскрипції у 35 разів [54].

На сьогодні описано понад 400 поліморфізмів поодиноких нуклеотидів у гені г-глютамілкарбоксилази людини. Основна кількість досліджень присвячена їх зв'язку з дозуванням непрямих оральних антикоагулянтів.

Одними з перших ген GGCX секвенували Rieder et al., які визначили в ньому 37 SNP: три - у промоторі; п'ять - у кодуючій частині гена, сім - у ділянці 3?-кінця і двадцять два - в інтронах. Для подальших досліджень авторами було обрано шість поліморфізмів (у позиціях 4046, 10067, 12970, 13333, 14101 і 14599). Зв'язок із дозою варфарину виявився тільки для поліморфізму 14-го інтрону C12970G, який мав хоч і незначний, але статистично значимий вплив на дозу препарату та пояснював 2 % її варіабельності (у носіїв генотипу G/G доза була 5,4 мг/добу, тоді як у носіїв основного алеля - 4,6 мг/добу) [55]. Асоціація з дозою оральних антикоагулянтів для поліморфізму G6317A (rs12714145) була доведена Shikata еt al. Авторами також показано, що доза варфарину зростає разом зі збільшенням кількості мікросателітних повторів у 6-му інтроні гена GGCX [56]. В одному з останніх досліджень King et al. у 2010 році показано, що на дозування варфарину впливає C12970G (rs11676382) поліморфізм. Для гомозигот за мінорним алелем і гетерозигот доза варфарину була достовірно нижчою (3,8 мг/добу), ніж для гомозигот за основним алелем (4,9 мг/добу). Поліморфізм rs12714145 не був визнаний значимим предиктором дози варфарину [57].

Серед незначної кількості робіт присвячених генетичним факторам розвитку ішемічного інсульту, дослідження Shyu et al., які виявили статистично значимий протективний ефект поліморфізмів Arg325Gln (ген GGCX), G-1639A (ген VKORC1) та Pro187Ser (ген NQO1) відносно ризику виникнення ішемічного інсульту. Синергізм досліджуваних локусів був більш вираженим у пацієнтів, які не вживали спиртних напоїв та не палили [58]. Vanakker et al. показали, що генетичний поліморфізм 8-го екзону Arg325Gln гена GGCX знижує карбоксилазну активність та індукує дефіцит вітамін К-залежних факторів згортання крові. Учені зробили висновок, що генетична мінливість GGCX є фактором ризику тяжких неонатальних кровотеч [59]. Kimura et al. досліджували вплив поліморфізмів генів GGCX, VKORC1 та CALU на активність C та S протеїнів у японській популяції. Жінки, які були гомозиготами за основним алелем (Arg325Gln поліморфізм гена GGCX), мали значимо вищий рівень активності протеїну С, ніж гетерозиготи та гомозиготи за мінорним алелем [60].

2. ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ ДОСЛІДЖЕННЯ

У дослідженні використано кров 118 хворих на ГКС, яких було госпіталізовано у кардіологічне відділення Сумської міської клінічної лікарні № 1, і 234 практично здорових осіб, у яких відсутність серцево-судинної патології підтверджували шляхом збору анамнестичних даних, запису електрокардіограм, вимірювання артеріального тиску та дослідження ряду біохімічних показників крові.

До дослідження не залучалися хворі із хронічною серцевою недостатністю IIБ - III ст., кардіогенним шоком, вираженою нирковою та печінковою недостатністю, бронхіальною астмою, травмою або великим хірургічним втручанням, гострими чи хронічними запальними процесами в стадії загострення, онкологічними та системними захворюваннями.

Діагноз гострого інфаркту міокарда та нестабільної стенокардії встановлювали на підставі даних клінічних, електрокардіографічних та біохімічних досліджень згідно з рекомендаціями експертів ВООЗ, а також відповідно до рекомендацій європейського та американського товариств кардіологів [61]. Критерієм залучення до дослідження була наявність типового ангінозного больового синдрому в спокої тривалістю від 10 до 30 хв упродовж останніх 24 годин до госпіталізації із змінами ЕКГ без навантаження (депресія сегмента «ST» 1 мм та більше або інверсія зубця «Т» 2 мм та більше щонайменше у двох суміжних відведеннях). Заключний діагноз нестабільної стенокардії поставлено 33.5% хворих, гострого інфаркту міокарда - 66,5 % хворих.

Контрольна група і група хворих із ГКС відрізнялися за співвідношенням осіб різної статі (P = 0,034 за ч2-критерієм), середній вік першої (66,0±0,95 років) був істотно вищим, ніж другої (P<0,001) (табл. 2.1). Остання обставина збільшувала надійність контролю, оскільки зменшувалася ймовірність розвитку ГКС у пацієнтів контрольної групи в майбутніх періодах їхнього життя.

Хворі з ГКС мали істотно вищі, якщо порівнювати з контрольною групою, показники ДАТ, концентрації глюкози крові натще, серед них було більше курців і представників стресових професій. Жінки з ГКС мали достовірно вищий показник ІМТ, ніж здорові представниці жіночої статі: 31,5±0,9 кг/м2 проти 28,6±0,13 (Р = 0,013).

У табл. 2.2 наведена клінічна характеристика хворих з ГКС жіночої і чоловічої статі. З неї випливає, що чоловіки хворіють на ГКС у більш ранньому віці, ніж жінки: середній вік хворих чоловічої статі становив 54,5±1,01 роки проти 61,0±1,47 - у жіночої (Р = 0,002). Чоловіки мають більший зріст, серед них більше курців і таких, які мають стресову професію. У жінок зареєстровані вищі, ніж у чоловіків, значення ІМТ, рівня глюкози натще, серед них більше таких, які мають артеріальну гіпертензію та ожиріння.

Відмінності між групами за масою тіла, наявністю ЦД, рівнем ліпідів та показниками згортання крові були статистично не достовірними (P>0,05).

Дані про наявність відомих сьогодні факторів ризику у групі хворих із ГКС відображено в табл. 2.3.

Привертає до себе увагу та обставина, що основним фактором ризику як у жінок, так і у чоловіків була дисліпопротеїнемія атерогенного характеру, яку відзначали відповідно у 84,6 і 82,6 % пацієнтів. Друге місце займала артеріальна гіпертензія: її виявляли у 96,2 % жінок і 51,1 % осіб чоловічої статі. Причому серед хворих із ГКС осіб жіночої статі вона реєструвалася достовірно частіше, ніж серед чоловіків. Значні статеві відмінності в частоті факторів ризику встановлено при порівнянні відповідних показників, що характеризують ожиріння, цукровий діабет і паління. Так, ожиріння та цукровий діабет у жінок виявляли частіше, ніж у чоловіків (у 50,0 і 43,2 % проти 29,3 і 20,7 % відповідно). Натомість серед чоловіків курців було набагато більше (55,4 %), ніж серед жінок (11,5 %). Особи чоловічої статі, які хворіли на ГКС, частіше мали стресові професії (47,8% проти 19,5 % у жінок).

Ішемічний атеротромботичний інсульт. У дослідженні використано кров 170 хворих на ІАТІ, які перебували на диспансерному обліку в поліклінічному відділенні Сумської клінічної лікарні № 5, і 124 практично здорових донорів. Ішемічний характер інсульту встановлювався за даними анамнезу і клінічної картини хвороби, результатами МРТ-дослідження головного мозку. Патогенетичний варіант інсульту визначали відповідно до критеріїв TOAST [62], на підставі анамнезу і особливостей клінічного перебігу хвороби, даних ультразвукової допплерографії магістральних артерій голови, ЕКГ. Контрольна група і група хворих з ІАТІ не відрізнялися за співвідношенням осіб різної статі (P=0,294), проте середній вік першої (76,7±0,93 роки) був істотно вищим, ніж другої (P < 0,001).

У табл. 2.4 наведено порівняльну клінічну характеристику обох груп пацієнтів.

Із неї випливає, що хворі з ІАТІ мали істотно вищі, якщо порівнювати з контрольною групою, показники зросту, маси тіла, систолічного і діастолічного артеріального тиску, концентрації глюкози крові натще.

Дані про наявність відомих на сьогодні факторів ризику у групі хворих з ІАТІ відображено в табл. 2.5.

Привертає до себе увагу та обставина, що основним фактором ризику як у жінок, так і у чоловіків була артеріальна гіпертензія, яку відзначали відповідно у 81,9 і 70,4 % пацієнтів. Друге місце посідали порушення складу ліпопротеїнів плазми крові атерогенного характеру: їх виявляли у 58,8 % жінок і 58,4 % осіб чоловічої статі. Значні статеві відмінності в частоті факторів ризику встановлено при порівнянні відповідних показників, що характеризують ожиріння, цукровий діабет і паління. Так, ожиріння та цукровий діабет у жінок виявляли частіше, ніж у чоловіків (у 43,1 і 25,0 % проти 28,6 і 12,2 % відповідно). Натомість серед чоловіків курців було набагато більше (42,9 %), ніж серед жінок (11,1 %).

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ З НАСТУПНИМ АНАЛІЗОМ ДОВЖИНИ РЕСТРИКЦІЙНИХ ФРАГМЕНТІВ

Венозну кров у хворих на ІАТІ та практично здорових осіб набирали в стерильних умовах у моновети об'ємом 2,7 мл з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти (11,7 мМ) як антикоагулянт (“Sarstedt”, Німеччина), заморожували та зберігали при температурі - 20 С. Забір крові для досліджень проводився кваліфікованими спеціалістами в клінічних умовах із дотриманням усіх правил медичної асептики та антисептики. Усі особи підписали згоду на використання своєї крові для генетичних досліджень.

Алельний поліморфізм вивчали методом полімеразної ланцюгової реакції (PCR) з подальшим аналізом довжини рестрикційних фрагментів (PCR-RFLP). Використовували праймери, синтезовані фірмою “Metabion” (Німеччина), і ферменти (Taq-полімераза і рестриктази) фірми “Fermentas” (Литва). PCR проводили в термоциклері GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США). Ампліфікати після рестрикції розділяли в 2,5 % агарозному гелі, що містив 10 мкг/мл бромистого етидію. Візуалізацію ДНК після електрофорезу здійснювали за допомогою трансілюмінатора ("Біоком", Росія).

1) Виділення ДНК із лейкоцитів цільної крові. ДНК виділяли з цільної крові з використанням наборів DIAtom DNA Prep 200 («Isogene», Росія). Цей метод базується на застосуванні лізуючого реагенту із гуанідинтіоціонатом, який призначений для лізису клітин, солюбілізації клітинного дебрису, а також для денатурації клітинних нуклеаз. За наявності лізуючого реагенту ДНК активно сорбується на NucleoS™-сорбенті, потім легко відмивається від білків та солей спиртовим розчином. Потім ДНК екстрагують із сорбента та переносять у стерильні, вільні від ДНК та РНК, мікропробірки. Виділення ДНК проводили згідно з протоколом, запропонованим у комерційному наборі.

2) Визначення алельного поліморфізму 2-го екзону гена VDR FokI (rs2228570). Використовували пару специфічних праймерів: прямий (sence) - 5`-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTG-3`, зворотний (antisense) - 5`-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3`. Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буфера, 1,5 мМ сульфату магнію, 250 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 15 pM кожного з праймерів і 0,75 ОД Taq-полімерази, об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Ампліфікація фрагмента, що містив стартову ділянку, складалася з 33 циклів: денатурація - 94 °С (50 c), гібридизація праймерів - 64,5 °С (45 с) та елонгація - 72 °С (1 хв). Для рестрикційного аналізу 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 55 °С упродовж 20 годин із 3 ОД рестриктази FokI у буфері Тango такого складу: 33 мМ трис-ацетату (рН 7,9), 10 мМ ацетату магнію, 66 мМ ацетату калiю, 0,1 мг/мл альбуміну. Наявність у 25920-й позиції гена VDR цитозину перешкоджає рестрикції, а при заміні цитозину на тимін рестриктаза FokI розщеплює ампліфіковану ділянку (довжина - 267 п.о) на два фрагменти: 204 і 63 пари основ (рис. 2.4). Горизонтальний електрофорез (0,13 А; 210 V) проводили впродовж 30 хв. (рис 3.1)

Рисунок 3.1 - Результати рестрикційного аналізу FokI поліморфізму гена VDR. M - маркер молекулярної маси (по - пари нуклеїнових основ); доріжки 2, 11 відповідають F/F-генотипу; доріжки 1, 3, 4, 6, 9, 10 - F/f-генотипу; 5, 7, 8 - f/f-генотипу

3) Визначення алельного поліморфізму 8-го екзону гена VDR BsmI (rs1544410). Ділянку гена ампліфікували за допомогою пари специфічних праймерів: прямого (sence) - 5`-AGGGAGACGTAGCAAAAGGAG-3` і зворотного (antisense) - 5`-TGTCCCCAAGGTCACAATAAC-3`. Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буфера, 1,5 мМ сульфату магнію, 250 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 20 pM кожного з праймерів і 0,75 ОД Taq-полімерази, об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Ампліфікація фрагмента промотору складалася з 33 циклів: денатурація - 94 °С (50 с), гібридизація праймерів - 60 °С (45 с) та елонгація - 72 °С (1 хв). Пізніше 6 мкл продукту ампліфікації фрагмента промотору інкубували при 37 °С упродовж 20 годин із 2 ОД рестриктази BsmI у буфері R такого складу: 10 мМ трис-HCl (pH 8,5), 10 мМ хлориду магнію, 100 мМ хлориду калiю та 0,1 мг/мл альбуміну. Якщо в 58980-й позиції гена VDR містився гуанін, ампліфікат, який складався з 425 пар основ, розщеплювався рестриктазою BsmI на два фрагменти: 232 і 193 пари основ. У разі заміни гуаніну на аденін сайт рестрикції для BsmI втрачався і утворювався один фрагмент розміром 425 пар основ (рис. 3.2). Горизонтальний електрофорез (0,13 А; 210 V) проводили впродовж 30 хв.

Рисунок 3.2 - Результати рестрикційного аналізу BsmI поліморфізму гена VDR. M - маркер молекулярної маси (по - пари нуклеїнових основ); доріжки 5, 11 відповідають B/B-генотипу; доріжки 1, 3, 4, 8, 9, 10 - B/b-генотипу; 2, 6, 7 - b/b-генотипу

4) Визначення алельного поліморфізму 8-го інтрону гена VDR ApaI (rs7975232). Використовували пару специфічних праймерів: прямий (sence) - 5`-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3` і зворотний (antisense) - 5`-CACTTCGAGCACAAGGGGCGTTAGC-3`. Для ампліфікації брали 50- 100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буфера, 1,5 мМ сульфату магнію, 250 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 15 pM кожного з праймерів і 0,75 ОД Taq-полімерази, об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Програма ампліфікації була такою: денатурація - 94 °С (50 с), гібридизація праймерів - 64,5 °С (45 с), елонгація - 72 °С (1 хв), разом 33 цикли. У подальшому 6 мкл про...