Зв'язок алельного поліморфізму "генів ектопічної кальцифікації" з розвитком поширених серцево-судинних хвороб та їх ускладнень

Рисунок 3.3 - Результати рестрикційного аналізу ApaI поліморфізму гена VDR. M - маркер молекулярної маси (по - пари нуклеїнових основ); доріжки 2, 5, 9 відповідають A/A-генотипу; доріжки 1, 6, 8, 10, 11 - A/a-генотипу; 3, 4, 7 - a/a-генотипу.

5) Визначення алельного поліморфізму 9-го екзону гена VDR TaqI (rs731236). Використовували пару специфічних праймерів: прямий (sence) - 5`-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3` і зворотний (antisense) - 5`-CACTTCGAGCACAAGGGGCGTTAGC-3`. Для ампліфікації брали 50- 100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буфера, 1,5 мМ сульфату магнію, 250 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 15 pM кожного з праймерів і 0,75 ОД Taq-полімерази, об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Програма ампліфікації була такою: денатурація - 94 °С (50 с), гібридизація праймерів - 64,5 °С (45 с), елонгація - 72 °С (1 хв), разом 33 цикли. У подальшому 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37 °С упродовж 20 годин із 5 ОД рестриктази TaqI у буфері TaqI такого складу: 10 мМ трис-HCl (pH 8,0), 5 мМ хлориду магнію, 100 mM NaCl та 0,1 мг/мл альбуміну. Наявність у 60058-й позиції гена VDR тиміну перешкоджає рестрикції, а при заміні тиміну на цитозин рестриктаза TaqI розщеплює ампліфіковану ділянку (довжина - 501 пара основ) на два фрагменти: 294 і 207 пар основ (рис. 2.7). Горизонтальний електрофорез (0,13 А; 210 V) проводили впродовж 30 хв.

Рисунок 3.4 - Результати рестрикційного аналізу TaqI поліморфізму гена VDR. M - маркер молекулярної маси (по - пари нуклеїнових основ); доріжки 5, 7 відповідають T/T-генотипу; доріжки 1, 2, 3, 4, 6, 8, 11 - T/t-генотипу; 9, 10 - t/t-генотипу

6) Визначення алельного поліморфізму 8-го екзону гена GGCX Arg325Gln (rs699664). Використовували пару специфічних праймерів: прямий (sence) - 5`-GGAGAAGTCTCCTAAGGGAACG-3` і зворотний (antisense) - 5`-AGTCCAGCCTTTGCTGTACACT -3`. Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буфера, 1,5 мМ сульфату магнію, 250 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 10 pM кожного з праймерів і 1,0 ОД Taq-полімерази, об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Програма ампліфікації була такою: денатурація - 94 °С (50 с), гібридизація праймерів - 65,0 °С (30 с), елонгація - 72 °С (1 хв), разом 30 циклів. У подальшому 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37 °С упродовж 20 годин із 2 ОД рестриктази XmnI у буфері Тango такого складу: 33 мМ трис-ацетату (рН 7,9), 10 мМ ацетату магнію, 66 мМ ацетату калiю, 0,1 мг/мл альбуміну. Якщо в 8762-й позиції гена GGCX містився гуанін, ампліфікат, який складався з 384 пар основ, розщеплювався рестриктазою XmnI на два фрагменти: 216 і 168 пар основ. У разі заміни гуаніну на аденін сайт рестрикції для XmnI втрачався і утворювався один фрагмент розміром 384 пар основ (рис. 2.8). Горизонтальний електрофорез (0,1 А; 200 V) проводили впродовж 40 хв.

Рисунок 3.5 - Результати рестрикційного аналізу Arg325Gln поліморфізму гена GGCX. M - маркер молекулярної маси (по - пари нуклеїнових основ); доріжки 2, 3, 8, 9, 10 відповідають Arg/Arg-генотипу; доріжки 1, 4, 7, 11 - Arg/Gln-генотипу; 5, 6 - Gln/Gln-генотипу

7) Визначення алельного поліморфізму 2-го інтрону гена VKORС1 T2255C (rs2359612). Використовували пару специфічних праймерів: прямий (sence) - 5'-GAACAGAGAGAGGAACCAAGGGAGTGGA-3' і зворотний (antisense) - 5'-TCTGAACCATGTGTCAGCCAGGACC-3'. Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буфера, 1,5 мМ сульфату магнію, 250 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 15 pM кожного з праймерів і 1,0 ОД Taq-полімерази, об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Програма ампліфікації була такою: денатурація - 94 °С (50 с), гібридизація праймерів - 62,5 °С (45 с), елонгація - 72 °С (1 хв), разом 30 циклів. Для рестрикційного аналізу 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37 °С упродовж 18 годин із 3 ОД рестриктази NcoI у буфері Тango такого складу: 33 мМ трис-ацетату (рН 7,9), 10 мМ ацетату магнію, 66 мМ ацетату калiю, 0,1 мг/мл альбуміну. Якщо в 2255-й позиції гена VKORС1 містився тимін, ампліфікат, який складався із 198 пар основ, розщеплювався рестриктазою NcoI на два фрагменти: 172 і 26 пар основ. У разі заміни тиміну на цитозин сайт рестрикції для NcoI втрачався і візуалізувався один фрагмент завдовжки 198 пар основ (рис. 2.9). Горизонтальний електрофорез (0,1 А; 140 V) проводили впродовж 20 хв.

Рисунок 3.6 - Результати рестрикційного аналізу Т2555С поліморфізму гена VKORC1. M - маркер молекулярної маси (по - пари нуклеїнових основ); доріжки 1, 7, 8 відповідають T/T-генотипу; доріжки 5, 9, 10, 11 - T/C-генотипу; 2, 3, 4, 6 - C/C-генотипу.

4. АЛЕЛЬНИЙ ПОЛІМОРФІЗМ ГЕНІВ VDR, GGCX, VKORC1

4.1 Поліморфізми гена VDR у хворих з ГКС і в контрольній групі

У проведеному дослідженні було вивчено чотири поліморфізми гена VDR: поліморфізм 2-го екзону FokI (rs2228570), поліморфізми 8-го інтрону BsmI (rs1544410) та ApaI (rs7975232), поліморфізм 9-го екзону TaqI (rs731236).

Суть однонуклеотидного поліморфізму FokI полягає в тому, що в 2-му екзоні гена VDR у позиції 25920 тимін (f) заміщається на цитозин (F). Цей поліморфізм спричиняє зміну стартового кодона, оскільки триплет ATG, що кодує амінокислоту метіонін, заміняється на ACG. Як наслідок, відбувається зміщення стартового кодона (до наступного ATG) і вкорочення на 3 амінокислотні залишки білкового продукту гена VDR. Таким чином, залежно від поліморфних варіантів FokI, а отже, двох можливих сайтів початку трансляції, існують два різновиди білка VDR: довгий і вкорочений. Перший (427 а.з.) є продуктом T ("f")-алеля, його позначають як M1-форму (метіонін у першій позиції). Другий варіант (424 а.з.) є вкороченим на 3 амінокислоти, він пов'язаний із C ("F")-алелем і позначається як M4-форма (метіонін у четвертому положенні).

BsmI і ApaI поліморфізми локалізовані у 8-му інтроні, недалеко від ділянки, яку позначають як 3'-UTR (untranslated region). Суть BsmI SNP полягає в тому, що у положенні 58980 гуанін заміщається на аденін. ApaI SNP пов'язаний із заміною у 59979-му положенні гуаніна на тимін. Самі по собі поліморфізми в інтронах не є функціонально значимим, оскільки не змінюють послідовність азотистих основ у змістовній частині гена, проте, будучи зчепленими з регуляторними ділянками гена, можуть виступати маркерами функціональних зв'язків інших SNP із розвитком патологічних процесів і хвороб.

TaqI поліморфізм локалізований у 9-му екзоні. Його суть полягає в тому, що у положенні 60058 тимін заміщається на цитозин. Встановлено, що TaqI SNP тісно пов'язаний із поліморфними варіантами двох інших SNP гена VDR - BsmI та ApaI. Завдяки такому зчепленню серед великої кількості прогнозованих гаплотипів виявляють три: baT, BAt і bAT. Близькість зазначених гаплотипів до 3'-UTR-ділянки гена може певним чином позначатися на регуляції його експресії, оскільки відомо, що від цієї ділянки залежить стабільність мРНК, а отже, й кількість синтезованого білкового продукту.

Частоту трьох можливих варіантів генотипу за вивченими поліморфізмами гена VDR, а також перевірку відповідності розподілу основного і мінорного алелів рівновазі Харді-Вайнберга подано в табл. 4.1.

Перевірка розподілу генотипів за вивченими SNP на відповідність закону Харді-Вайнберга показала, що і в контрольній, і в основній групах відхилення від встановленої рівноваги не є статистично значимими. З'ясовано, що співвідношення алелів в обох групах істотно не відрізняється від очікуваних (P>0,05).

Порівняння частоти алельних варіантів гена VDR за поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI, TaqI у хворих із ГКС і в контрольній групі свідчить про відсутність відмінностей у розподілі різних видів генотипу між хворими з гострим коронарним синдромом і здоровими пацієнтами (P>0,05 за ч2-критерієм) (рис. 4.1).

Рисунок 4.1 - Частота алельних варіантів гена VDR за поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI, TaqI у хворих із ГКС (чорні стовпчики) і в контрольній групі (сірі стовпчики). Р - статистична значимість відмінності показників за ч2-критерієм Пірсона

Проте аналіз із використанням методу логістичної регресії виявив достовірний зв'язок між розвитком гострого коронарного синдрому і BsmI поліморфізмом гена VDR. Так, ризик ГКС у носіїв B/B генотипу у 2,1 раза більший, ніж у гомозигот за основним алелем B/b (табл. 4.2)

Аналіз за статтю. Розподіл частот алельних варіантів за вивченими поліморфізмами в осіб різної статі у групах порівняння подано в табл. 4.3.

При аналізі частоти генотипів за FokI поліморфізмом гена VDR в основній і контрольній групах окремо у жінок і чоловіків достовірної різниці у їх співвідношенні не виявлено (Р = 0,534 для жінок і Р = 0,619 для чоловіків). Статистично значима різниця в розподілі відсутня і при порівнянні окремо в контрольній (Р = 0,149) і основній групах (Р = 0,886). Під час вивчення частоти осіб у групах, утворених за різними варіантами поліморфізму серед носіїв генотипу f/f у контрольній групі виявлено 42,3 % жінок і 57,7 % чоловіків, а у групі хворих із ГКС відповідно 20,0 % і 80,0 %. Серед гомозигот за мінорним алелем різниця в розподілі осіб різної статі в групах порівняння максимально наближалася до рівня статистичної значимості (Р = 0,055).

При вивченні частоти генотипів у основній і контрольній групах за поліморфізмом BsmI окремо у жінок та чоловіків одержані такі результати. Серед жінок контрольної групи генотип b/b мали 39,0 %, b/B - 49,3 %, B/B - 11,7 %, а серед хворих із ГКС - відповідно 42,3 %, 46,2 %, 11,5 %. Генотип b/b був виявлений у 47,8 % практично здорових чоловіків, b/B - у 42,0 %, B/B - у 10,2 %, а серед хворих із ГКС - у 35,8 %, 43,5 % і 20,7 % відповідно. Таким чином, виявлено статистично значиму асоціацію BsmI поліморфізму з ГКС в осіб чоловічої статі (P = 0,040) і відсутність такого зв'язку в жінок (P = 0,953).

Порівняння даних про частоту варіантів поліморфізму BsmI у жінок і чоловіків окремо в контрольній групі та у хворих із ГКС свідчить про відсутність статистично значимих відмінностей між особами жіночої і чоловічої статей як серед пацієнтів із ГКС (P = 0,560), так і в контролі (P = 0,444). У жодній із груп, утворених з урахуванням генотипу за BsmI поліморфізмом, різниця у розподілі осіб із різними поліморфними варіантами гена не була достовірною (табл. 4.3).

Методом логістичної регресії був підтверджений зв'язок між статтю пацієнтів і розвитком гострого коронарного синдрому в пацієнтів із різними генотипами за BsmI поліморфізмом гена VDR (табл. 4.4). Так, в осіб чоловічої статі, що є носіями B/B генотипу, ризик ГКС у 2,7 раза більший, ніж у гомозигот за основним алелем b/b.

Як випливає з наведених даних, частота різних алельних варіантів гена VDR за ApaI поліморфізмом істотно не відрізняється у хворих із ГКС та пацієнтів контрольної групи, якщо порівнювати окремо жінок і чоловіків (Р = 0,501 і Р = 0,655 відповідно). Порівняння даних про частоту варіантів поліморфізму ApaI у жінок і чоловіків окремо в контрольній групі та у хворих із ГКС свідчить про відсутність статистично значимих відмінностей між особами жіночої і чоловічої статей як серед пацієнтів із ГКС (Р = 0,455), так і в контролі (P = 0,791). В усіх групах, утворених із урахуванням генотипу за ApaI поліморфізмом, різниця у розподілі осіб із різними поліморфними варіантами гена була недостовірною (табл. 4.4).

Щодо TaqI поліморфізму, то частота різних алельних варіантів гена VDR істотно не відрізняється у хворих із ГКС та пацієнтів контрольної групи, якщо порівнювати окремо жінок (Р = 0,375) і чоловіків (Р = 0,384). Не виявлено достовірної різниці у розподілі генотипів у осіб різної статі при порівнянні у контрольній (Р = 0,232) і основній (Р = 0,967) групах. І лише у пацієнтів із генотипом T/t відмінності між співвідношенням статей у контролі й серед хворих були статистично значимими (P = 0,027). Серед осіб із таким генотипом частка жінок і чоловіків становила відповідно 38,0 % і 62,0 % у практично здорових осіб, і 21,1 % та 78,9 % - у хворих із ГКС. Отже, серед гетерозигот T/t за TaqI поліморфізмом гострий коронарний синдром у чоловіків виникає частіше, ніж у жінок.

Аналіз за антропометричними даними. При порівнянні показників зросту, маси тіла та ІМТ в основній і контрольній групах серед осіб жіночої та чоловічої статей залежно від генотипу пацієнтів за FokI, BsmI, ApaI, TaqI поліморфізмами гена VDR були виявлені різниця середніх значень вивчених показників та їх залежність від деяких вивчених варіантів генетичного поліморфізму (додатки 16, 17, 18, 19). Так, у чоловіків із ГКС, що мають генотип F/F, більші маса тіла (Р = 0,054) та ІМТ (Р = 0,049), ніж у носіїв F/f і f/f генотипів. Хворі на ГКС жінки-носії t/t генотипу мали достовірно більшу масу (Р = 0,040) та індекс маси тіла (Р = 0,006), ніж представниці T/T і T/t генотипів.

Що стосується порівняння між групами, то тут також виявлено певні істотні відмінності антропометричних даних. Хворі із ГКС жінки, які є носіями основного алеля за FokI поліморфізмом (генотипи F/F та F/f), мають достовірно вищі показники зросту і маси тіла, ніж жінки у групі контролю. У хворих жінок із генотипом F/f показник ІМТ достовірно вищий, ніж у практично здорових жінок (додаток 16). У чоловіків із ГКС, представників F/F та F/f генотипів, вищі показники ІМТ, ніж у хворих чоловіків, які є гомозиготами за мінорним алелем (f/f). Чоловіки з генотипами F/Fі F/f мають більший зріст, масу тіла та ІМТ, ніж у відповідному контролі. Що стосується гомозигот за мінорним алелем (f/f) чоловічої статі, то лише показник зросту в осіб із даним генотипом виявився достовірно вищим у хворих із ГКС, якщо порівняти з практично здоровими особами. Хворі жіночої статі, що є гомозиготами за основним алелем за BsmI поліморфізмом (b/b), мають достовірно вищий, ніж у контролі, показник маси тіла. У жінок-гетерозигот із ГКС більші зріст, маса тіла та ІМТ, ніж у відповідному контролі. У чоловіків із ГКС, представників b/b та b/B генотипів, достовірно вищі показники зросту та маси тіла, ніж в осіб чоловічої статі з групи контролю. Чоловіки-гомозиготи за мінорним алелем (B/B) мають вищий показник зросту, ніж гомозиготи з контрольної групи.

Що стосується ApaI поліморфізму, то у хворих із ГКС жінок із генотипами а/а, а/А та А/А показник маси тіла, а у жінок-гетерозигот (а/А) ще й показник зросту були значно більшими, ніж у жінок контрольної групи. Такі відмінності, однак, не впливали на ІМТ, що можна було пояснити пропорційністю відхилень показників зросту і маси тіла. У чоловіків, хворих на ГКС із варіантами генотипу а/а, а/А та А/А маса тіла, а для гомозигот а/а та А/А ще й зріст істотно відрізнялися від відповідних значень у чоловіків із контрольної групи. Що стосується ІМТ, то тут вплив генетичного чинника на зазначені показники виявлений не був.

При аналізі співвідношення алельних варіантів за TaqI поліморфізмом з'ясувалося, що хворі з ГКС жінки, які є гомозиготами за мінорним алелем (t/t), мають достовірно вищі показники зросту та ІМТ, ніж хворі жінки-власниці основного алеля (генотипи T/T, T/t). У представниць усіх варіантів генотипів за TaqI маркером виявився вищим показник маси тіла, ніж у жінок із контролю. У гетерозигот значима різниця виявилась між показниками зросту, а у жінок із генотипом t/t і між показником ІМТ - відносно основної групи.

У хворих чоловіків, незалежно від генотипу за досліджуваним SNP виявився достовірно вищим показник зросту, ніж у практично здорових осіб чоловічої статі. У носіїв гетерозиготного генотипу вищими також стали показники маси тіла та ІМТ, ніж у чоловіків із контрольної групи.

Поділ кожної із двох груп - дослідної та контрольної - на дві підгрупи залежно від величини ІМТ (<25 кг/м2 і ?25 кг/м2) дав можливість проаналізувати вплив поліморфних варіантів гена VDR на розвиток ГКС в осіб із нормальним і підвищеним рівнями цього показника (табл. 4.5).

При порівнянні частоти генотипів в основній і контрольній групах за поліморфізмами, що вивчались, окремо у пацієнтів з ІМТ<25 кг/м2 і ІМТ?25 кг/м2 виявлений вплив лише BsmI поліморфізму гена VDR на розвиток ГКС і лише у групі пацієнтів з ІМТ <25 кг/м2 (P = 0,027).

Порівняння даних про частоту генотипів поліморфізмів BsmI, ApaI, TaqI в осіб, що мають різне значення ІМТ окремо в контрольній групі та у хворих із ГКС, свідчить про відсутність статистично значимих відмінностей у розподілі алельних варіантів гена VDR. Зв'язок між генотипом та індексом маси тіла виявлений лише для FokI поліморфізму в групі хворих із гострим коронарним синдромом. Серед хворих із ГКС, що мають ІМТ<25 кг/м2, було 9,5 % із генотипом F/F, 52,4 % із генотипом F/f і 38,1 % із генотипом f/f, а серед осіб з ІМТ?25кг/м2 відповідно 30,9%, 51,6% і 17,5%. Одержані результати свідчать про наявність статистично значимої відмінності серед пацієнтів із ГКС, що мають різне значення ІМТ (P = 0,041). Таким чином, у хворих із ГКС FokI поліморфні варіанти гена VDR впливають на показник ІМТ.

Найбільш інформативним виявився аналіз у групах пацієнтів, утворених за генотипами різних поліморфізмів гена VDR. Це дає можливість стверджувати, що гомозиготи за основним алелем F/F і b/b та гетерозиготи T/t і а/А, які мають підвищений ІМТ, більшою мірою схильні до розвитку ГКС, ніж відповідні гомозиготи із нормальними показниками ІМТ.

Аналіз за показниками артеріального тиску. Одержані дані свідчать про те, що всі чотири різновиди АТ (САТ, ДАТ, ПАТ і СрАТ) у пацієнтів контрольної групи та у хворих із ГКС, що мають різні генотипи за поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI, TaqI. істотно не відрізняються у носіїв із різними варіантами генотипів за всіма поліморфізмами, що вивчалися, як усередині контрольної групи, так і у хворих із ГКС.

При порівнянні між групами з'ясовано, що за вивченими поліморфізмами у представників усіх генотипів, крім t/t, показник ДАТ був достовірно вищим у хворих із ГКС, ніж у контролі. У гомозигот за основним алелем F/F, T/T і гетерозигот b/B, а/А, T/t, що хворіють на ГКС, вищими виявилися значення середнього артеріального тиску, а у носіїв T/T і F/f генотипів - пульсового.

Описана закономірність майже повністю підтверджувалася, коли аналіз проводився серед осіб жіночої статі. За всіма вивченими поліморфізмами у жінок із ГКС значення ДАТ і СрАТ були вищими, ніж у практично здорових осіб. У носіїв F/F, а/А, T/t генотипів був більшим ще й систолічний артеріальний тиск. Щодо чоловіків, то вплив артеріального тиску на розвиток ГКС проявляв себе меншою мірою. Значення САТ у групах порівняння достовірно не відрізнялись у носіїв різних генотипів. ДАТ був вищим у гомозигот F/F, f /f, T/T і гетерозигот b/B, а/А, T/t, а ПАТ - у носіїв F/f, b/B, b/b, а/А, А/А, що хворіють на ГКС.

Дані про вплив поліморфізмів гена VDR на розвиток ГКС в осіб з нормальним і підвищеним артеріальним тиском подані у табл. 4.6. Як в осіб із нормальним, так і підвищеним АТ генотип пацієнтів за поліморфізмами гена VDR не впливав на їхню схильність до розвитку ГКС.

Використання ч2-критерію Пірсона показало, що і в контрольній групі, і серед хворих із ГКС розподіл алельних варіантів вивчених поліморфізмів не відрізнявся у пацієнтів з артеріальною гіпертензією та в осіб із нормальним АТ. Отже, як в основній, так і в контрольній групі генотипи за вивченими поліморфізмами гена VDR не впливали на розвиток артеріальної гіпертензії.

При аналізі частоти осіб із нормальним та підвищеним артеріальним тиском серед носіїв різних генотипів (гомозигот за основним алелем, гетерозигот і гомозигот за мінорним алелем) у контрольній групі та групі з ГКС з'ясовані деякі відмінності. У носіїв усіх генотипів, крім А/А і t/t, виявлено статистично значиму залежність між рівнем АТ і ймовірністю розвитку ГКС. Таким чином, артеріальна гіпертензія є важливим фактором ризику ГКС незалежно від поліморфізмів гена VDR.

Аналіз за фактом паління. У табл. 4.7 подано відомості про розподіл генотипів за поліморфізмами гена VDR залежно від факту паління. Розподіл генотипів за поліморфізмами FokI, ApaI, TaqI гена VDR у курців і тих, хто не палить, істотно не відрізняється в основній і контрольній групах. У ході вивчення BsmI поліморфізму з'ясовано, що співвідношення гомозигот за основним алелем, гетерозигот і гомозигот за мінорним алелем становило серед тих, хто не палить і хворіє на ГКС, 32, 8%, 43, 8%, 23, 4%, у той час як у контролі - 45,4 %, 43,7 %, 10,9 %. Відмінність у розподілі виявилася достовірною (P = 0,032). У групі курців подібна різниця виявлена не була (P = 0,881). Таким чином, встановлений зв'язок між BsmI поліморфізмом гена VDR і розвитком ГКС в осіб, які не палять: у гомозигот за мінорним алелем (B/B) ризик виникнення гострого коронарного синдрому більший.

У контрольній і основній групах за поліморфізмами гена VDR, що вивчалися, відмінностей у розподілі генотипів між курцями і тими, хто не палить, не виявлено.

Співвідношення між курцями і тими, хто не палить, у хворих із ГКС і в контролі статистично відрізнялося практично в усіх групах, виділених за ознакою генотипу пацієнтів.

Таким чином, носії усіх вивчених генотипів, за винятком F/F, t/t, А/А і B/B, що палять, мають більший ризик виникнення гострого коронарного синдрому. Паління, як і артеріальна гіпертензія, є доведеним фактором ризику ГКС і асоційоване з ГКС незалежно від генотипу пацієнтів за поліморфізмами гена VDR.

Аналіз за наявністю цукрового діабету. Визначення концентрації глюкози натще у хворих із ГКС показало, що рівень глюкози крові не залежав від поліморфізмів, що вивчались. У пацієнтів із гострим коронарним синдромом не виявлено зв'язку між поліморфними варіантами гена VDR і цукровим діабетом. На відсутність такої залежності не впливали стать, ІМТ, наявність артеріальної гіпертензії, дисліпопротеїнемії атерогенного характеру та ознак гіперкоагуляції крові.

Аналіз за наявністю ожиріння. Під час вивчення розподілу алельних варіантів гена VDR у пацієнтів із гострим коронарним синдромом зв'язку з розвитком ожиріння для поліморфізмів BsmI, ApaI і TaqI не виявлено. Співвідношення генотипів у групах порівняння не відрізнялось і при врахуванні основних факторів ризику ГКС (стать, ІМТ, паління, АГ, ДАХ, ожиріння, ЦД, ГКК).

Співвідношення частоти алельних варіантів гена VDR за поліморфізмом FokI у групі пацієнтів з ожирінням становило 30,0 %, 62,5 %, 7,5 %, а серед осіб без ожиріння - відповідно 25,6 %, 46,2 %, 28,2 % (рис. 4.2). Використання ч2-критерію Пірсона показало, що розподіл алельних варіантів FokI поліморфізму статистично достовірно відрізнявся у групах порівняння. Отже, серед пацієнтів із гострим коронарним синдромом, що є гомозиготами за мінорним алелем (f/f) за поліморфізмом FokI, ожиріння виникає рідше, ніж у носіїв інших генотипів.

Рисунок 4.2 - Частота алельних варіантів гена VDR за поліморфізмом FokI у хворих із ГКС з ожирінням (чорні стовпчики) і без ожиріння (сірі стовпчики). Р - статистична значимість відмінності показників за ч2-критерієм Пірсона

Вплив SNP на основні характеристики ГКС. Аналіз даних про зв'язок поліморфізмів гена VDR із різними клінічними варіантами гострого коронарного синдрому виявив відсутність асоціації досліджуваних SNP із різними проявами хвороби. Достовірності у розподілі не встановлено і при врахуванні таких факторів ризику, як стать, ІМТ, паління, артеріальна гіпертензія, порушення ліпідного складу й гіперкоагуляція крові, цукровий діабет, ожиріння.

Відмінності у співвідношенні алельних варіантів за поліморфізмами BsmI, ApaI і TaqI серед пацієнтів із різними формами ГКС не були статистично значимими. Проте для BsmI поліморфізму такий зв'язок існує, якщо хворих з ГКС розділити на підгрупи на підставі наявності чи відсутності артеріальної гіпертензії: у хворих без АГ виявляється різниця в розподілі алельних варіантів між підгрупами із нестабільною стенокардією, не-Q-інфарктом міокарда, Q- та QS-інфарктом міокарда (P = 0,030). Щодо ApaI поліморфізму, то залежність між алельними варіантами та формами ГКС виявляється, якщо хворих розділити на підгрупи на підставі наявності чи відсутності дисліпопротеїнемії атерогенного характеру.

Проведений аналіз виявив зв'язок між FokI поліморфізмом гена VDR і варіантами ГКС, установленими за його електрокардіографічними характеристиками (P = 0,042) (рис. 4.3).

Такий зв'язок підтвердився для хворих чоловіків (P = 0,025); пацієнтів з ДАХ (P = 0,047); пацієнтів без цукрового діабету (P = 0,034) хворих, що мають стресову професію (P = 0,032) та хворих із гіперкоагуляційним синдромом (P = 0,023).

Нарешті, нами був вивчений зв'язок між поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI, TaqI і розвитком ускладнень гострого коронарного синдрому.

Під час вивчення співвідношення генотипів у хворих, що мають і не мають ускладнення, була виявлена асоціація між FokI поліморфізмом гена VDR і розвитком ускладнень гострого коронарного синдрому. Розподіл алельних варіантів (F/F, F/f, f/f) серед пацієнтів без ускладнень становив 31,9 %, 51,1 %, 17,0 %, тоді як у пацієнтів з ускладненнями - відповідно 8,3 %, 54,2 %, 37,5 %. Різниця у розподілі виявилася достовірною (P=0,021). Таким чином, існує зв'язок між алельними варіантами гена VDR за поліморфізмом FokI і розвитком ускладнень: гомозиготи за мінорним алелем частіше мають ускладнення, ніж носії інших генотипів. Такий зв'язок із розвитком ускладнень ГКС підтвердився для пацієнтів чоловічої статі (P = 0,004); хворих з ІМТ ?25 кг/м2 (P = 0,018); пацієнтів без артеріальної гіпертензії (P = 0,025); цукрового діабету (P = 0,035) та ожиріння (P = 0,021).

Рисунок 4.3 - Частота алельних варіантів гена VDR за поліморфізмом FokI у хворих із нестабільною стенокардією (заштриховані стовпчики), не-Q-інфарктом міокарда (сірі стовпчики), Q- та QS-інфарктами міокарда (чорні стовпчики). Р - статистична значимість відмінності показників за ч2-критерієм Пірсона

BsmI поліморфні варіанти гена VDR не були пов'язані з розвитком ускладнень ГКС (Р = 0,220). Залежність між відповідними алельними варіантами та формами ГКС виявляється, якщо хворих розділити на підгрупи на підставі наявності чи відсутності АГ: у хворих із підвищеним артеріальним тиском, що є гомозиготами за мінорним алелем (B/B), ускладнення виникають частіше, ніж у носіїв інших генотипів (P = 0,013).

Впливу АраІ і TaqI поліморфізмів гена VDR на розвиток ускладнень гострого коронарного синдрому не виявлено. Аналіз, що проводився з урахуванням факторів ризику, не виявив жодних закономірностей між ними та розвитком ускладнень гострого коронарного синдрому за цими поліморфізмами.

4.2 Поліморфізми генів VDR у хворих з ІАТІ і в контрольній групі

Частоту трьох можливих варіантів генотипу за поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI і TaqI, а також перевірку відповідності розподілу основного і мінорного алелів рівновазі Харді-Вайнберга подано в табл. 4.8. Як випливає з наведених даних, розподіл алелів за всіма поліморфізмами у контрольній групі та у групі хворих з ІАТІ не має статистично достовірних відхилень від очікуваних за генетично-популяційним законом величин (P>0,05).

Показник P>0,05 свідчить про відсутність достовірної різниці у розподілі алельних варіантів гена у контрольній групі та у групі хворих. Таким чином, не виявлено зв'язку між різними генотипами за вивченими поліморфізмами гена VDR і ризиком розвитку ішемічного інсульту. Порівняння частоти алельних варіантів гена VDR за поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI, TaqI у хворих з ІАТІ і в контрольній групі свідчить про відсутність відмінностей у розподілі різних видів генотипу між хворими з інсультом і здоровими особами (P>0,05) (рис. 4.4).

Рисунок 5.4 - Частота алельних варіантів гена VDR за поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI, TaqI у хворих з ІАТІ (чорні стовпчики) і в контрольній групі (сірі стовпчики). Р - статистична значимість відмінностей показників за ч2-критерієм Пірсона

Аналіз за статтю. Частота різних варіантів вивчених поліморфізмів істотно не відрізняється у хворих з ІАТІ та пацієнтів контрольної групи, якщо порівнювати окремо жінок і чоловіків, осіб контрольної та основної груп та підгруп, виділених за ознакою генотипу пацієнтів.

Аналіз за антропометричними даними. Було досліджено показники зросту, маси тіла та ІМТ у жінок і чоловіків обох груп порівняння залежно від генотипів пацієнтів за поліморфізмами гена VDR. У кожній групі як у жінок, так і у чоловіків середні значення вивчених показників істотно не відрізняються між собою, а отже, не залежать від вивчених варіантів генетичного поліморфізму. Лише за АраІ поліморфізмом у жінок, хворих на ІАТІ, різниця за значеннями ІМТ у носіїв різних генотипів дуже близька до рівня статистичної значимості (Р = 0,052). У хворих на ішемічний інсульт величина ІМТ ймовірно залежить від даного варіанта генетичного поліморфізму.

Що стосується порівняння між групами, то тут виявлено певні відмінності антропометричних даних. Так, у хворих на ІАТІ жінок за всіма трьома генотипами поліморфізму FokI (F/F, F/f і f/f) зріст, а з генотипом F/f ще й маса тіла були значно більшими, ніж у жінок контрольної групи з відповідним генотипом. Такі відмінності, однак, не впливали на ІМТ, що можна було пояснити пропорційністю відхилень показників зросту і маси тіла. У чоловіків із варіантами генотипу F/f і f/f зріст був значно більшим у хворих з ІАТІ, ніж у групі контролю.

Хворі як жіночої, так чоловічої статі за всіма генотипами поліморфізму BsmI, крім чоловіків-гомозигот за В-алелем, мають достовірно вищі, ніж у контролі, показники зросту. За масою тіла достовірну значимість спостерігаємо у жінок-носіїв b-алеля (b/b i b/B) і гетерозиготних чоловіків, якщо порівнювати пацієнтів з інсультом і практично здорових осіб.

У жінок і чоловіків-гетерозигот за АраІ поліморфізмом зріст і маса, а у чоловіків-гомозигот за а-алелем тільки зріст, були істотно вищими у хворих на інсульт, ніж у відносно здорових осіб.

Щодо TaqI поліморфізму, то хворі як жіночої, так чоловічої статі, що є гетерозиготами, мають достовірно вищі, ніж у контролі, показники зросту і маси тіла. Таку саму картину спостерігаємо і в жінок-гомозигот за Т-алелем, а у гомозиготних чоловіків з ІАТІ за Т-алелем (Т/Т) лише показник зросту є вищим, ніж у відповідному контролі.

Аналіз за показниками артеріального тиску. Вивчено показники САТ, ДАТ, ПАТ і СрАТ у пацієнтів контрольної групи та у хворих з ІАТІ, що мають різні генотипи за поліморфізмами FokI, BsmI, ApaI, TaqI. Одержані дані свідчать про те, що всі чотири різновиди АТ істотно не відрізняються у носіїв з різними варіантами генотипів за всіма поліморфізмами, що вивчалися, як усередині контрольної групи, так і у хворих з ІАТІ.

При порівнянні між групами з'ясувалося, що у гомозигот за F-алелем поліморфізму FokI (F/F) усі чотири показники САТ, ДАТ, ПАТ і СрАТ виявилися набагато вищими у хворих з ІАТІ, ніж в осіб, що не мали інсульту. У носіїв F/f генотипу достовірно більшими були лише ДАТ і СрАТ, а у гомозигот f/f - САТ, ДАТ і СрАТ. Вивчення показників окремо у жінок і чоловіків дозволило виявити інші відмінності між хворими і контролем. Так, у групі жінок з ІАТІ, що є гетерозиготами (F/f), значно більшими були показники САТ, ДАТ і СрАТ, у гомозигот за f-алелем (f/f) тільки показник САТ, а гомозигот за F-алелем (F/F) - САТ, ДАТ, ПАТ і СрАТ. У чоловіків-гомозигот за f-алелем на відміну від жінок вплив FokI поліморфізму на показники АТ був дещо іншим і виявляв себе тільки при порівнянні ДАТ і СрАТ: ці два показники у хворих з ІАТІ були вищими, ніж в осіб контрольної групи. Що стосується гетерозигот (F/f), то жодних статистично значимих відмінностей між хворими з ІАТІ і контролем не було виявлено за жодним із чотирьох вивчених параметрів АТ.

При аналізі показників тиску для BsmI поліморфізму з'ясувалося, що у гомозигот за b-алелем і в гетерозигот показники САТ, ДАТ і СрАТ були достовірно вищими у хворих з ІАТІ, ніж у контролі (додаток 80). Проте тут виявлено істотні статеві відмінності. У хворих жінок, гомозиготних за b-алелем, були більшими величини САТ, ДАТ і СрАТ, а у ...