Исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений

Отрицательно заряженные субстраты, например, аспирин, БХЭ гидролизует вдвое медленнее, чем ацетилхолин [166].

Показано, что трехмерная структура БХЭ человека [159] и структуры АХЭ ската и дрозофилы очень близки. Основные цепи АХЭ и БХЭ практически совпадают, а различия в боковых цепях создают в канале БХЭ дополнительный объем по сравнению с АХЭ.

Биологическая роль БХЭ

Как мы уже отмечали, физиологическая функция БХЭ до сих пор не выяснена. Гидролизуя различные соединения и связываясь с ФОС, БХЭ выполняет в организме в первую очередь защитные функции, а также участвует в метаболизме лекарственных препаратов [163, 167].

Есть данные, что БХЭ играет также определенную роль в развитии сахарного диабета 2 типа [168, 169].

БХЭ является одной из эстераз, которая инактивирует аппетит-стимулирующий гормон октаноил-грелин, превращая его в неактивную форму (чистый пептид - грелин). Роль БХЭ в жировом обмене подтверждается в экспериментах на БХЭ (-/-) мышах, у которых развивалось ожирение при получении кормов с высоким содержанием жира в отличие от животных дикого типа [170, 171].

В работе [172] показано, что активность сывороточной БХЭ коррелирует со степенью ожирения пациентов, с липидным профилем сыворотки крови и степенью резистентности к инсулину.

Роль БХЭ в метаболизме лекарственных препаратов

В связи с отсутствием КЭ в плазме человека [173], гидролиз фармакологически важных соединений, содержащих сложноэфирную связь, в крови человека осуществляет именно БХЭ плазмы, играя таким образом важную роль в их фармакокинетике.

Так, БХЭ гидролизует целый ряд сложноэфирных предшественников лекарств (prodrugs), тем самым участвуя в процессе их метаболической активации. В частности, БХЭ превращает пролекарство бамбутерол в тербуталин - бронходилятатор длительного действия, препарат для лечения астмы [174]. Также БХЭ вместе с карбоксилэстеразой превращает пролекарство СРТ-11 (иринотекан) в активный противоопухолевый препарат SN-38 [175, 176]. Терапевтический эффект подобных лекарственных средств зависит от уровня активности БХЭ в организме.

БХЭ плазмы является также основным ферментом, гидролизующим миорелаксанты сукцинилхолин и мивакурий, обеспечивая таким образом кратковременность их действия [138, 177, 178]. Также БХЭ участвует в биотрансформации прокаина [179], ацетилсалициловой кислоты [180], героина.

Основным метаболическим путем детоксикации и выведения кокаина из организма человека является его гидролиз под действием БХЭ [182-186], продукты гидролиза - экгонин и бензойная кислота, биологически неактивны. [182, 184, 187]. Только 5% кокаина детоксицируется окислением микросомальным цитохромом P450 в печени. В связи с этим лечение передозировки кокаина при помощи препаратов на основе БХЭ является перспективным терапевтическим подходом [188, 189].

Взаимодействие с ФОС: БХЭ как биоскэвенджер и биомаркер воздействия ФОС

Сывороточная БХЭ способна осуществлять связывание многих токсичных ФОС и карбаматов, поступивших в организм извне, выступая в роли биоскэвенджера. ФОС токсиканты реагируют с БХЭ по тому же механизму, что с АХЭ, образуя ковалентный комплекс, не обладающий ферментативной активностью, с одной стороны, и инактивируя отравляющее вещество с другой. Инактивация БХЭ, которая не является первичной биомишенью ФОС, не вносит непосредственного вклада в токсический эффект. При этом БХЭ снижает токсичность ФОС, действуя как стехиометрический скэвенджер, то есть как место альтернативного фосфорилирования, снижая, тем самым, концентрацию ФОС, доступного для взаимодействия с АХЭ или другими биомишенями [1, 94]. Молекулярный полиморфизм БХЭ, определяющий ее активность и специфичность, влияет на чувствительность индивидуума к ФОС.

В работе [137] показано, что БХЭ связывает низкие дозы фосфорорганических и карбаматных пестицидов и таким образом защищает человека от токсического действия этих ингибиторов эстераз. Подтверждением этому является пониженная активность БХЭ без клинических признаков отравления у людей, работающих с пестицидами. Показана корреляция между связыванием ФОС с БХЭ и снижением острой токсичности данных соединений для мышей. [190]. В экспериментах на обезьянах и грызунах показано, что у животных с молчащей БХЭ резко возрастает риск антихолинэстеразного отравления при любом контакте с ингибиторами холинэстераз [137].

Профилактическое введение сывороточной БХЭ человека или рекомбинантной БХЭ человека грызунам, морским свинкам и нечеловекообразным приматам защищает их от смертельных доз зарина, зомана VХ-газов [167, 191-194]. В связи с этим перспективным является создание препаратов на основе БХЭ для защиты человека от токсического воздействия ФОС [163, 167, 195, 196]. Некоторые из таких препаратов (сывороточная БХЭ человека и рекомбинантная форма фермента, полученная из молока трансгенных коз) прошли I фазу клинических испытаний [196-198]. Однако, основным ограничением биоскэвенджеров первого поколения является стехиометрический механизм взаимодействия между ферментом и молекулой ФОС (1:1).

Определение активности БХЭ в цельной крови (или плазме) обычно используют в качестве чувствительного биомаркера воздействия ФОС [199]. Оценка активностей обеих холинэстераз, АХЭ и БХЭ, является необходимым условием правильного подбора антидота для людей, подвергшихся воздействию боевых отравляющих веществ. [200, 201]. Правильное и своевременное установление уровня активности холинэстераз позволяет выбрать оптимальный антидот и его количество, что предотвращает развитие тяжелых последствий отравления.

Ингибиторы БХЭ в терапии болезни Альцгеймера

Помимо плазмы, БХЭ широко представлена в нервной системе, что указывает на ее роль в нейрональных функциях. В человеческом мозге, как АХЭ, так и БХЭ находятся в нейронах и в клетках глии, а также в нейритных бляшках и нейрофибриллярных клубках у пациентов с БА [202, 203]. Есть свидетельства важной роли БХЭ в холинергической нейротрансмиссии и участия в развитии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера [56-58, 169].

В здоровом мозге человека, активность АХЭ выше, чем активность БХЭ. При развитии БА активность АХЭ постепенно снижается, в то время как активность БХЭ возрастает [204]. По мере прогрессирования болезни, баланс между ферментами смещается в пользу БХЭ, увеличивая ее функциональное значение в регулировании уровня ацетилхолина [47]. В связи с этим использование ингибиторов БХЭ на поздних стадиях БА имеет важное значение для поддержания когнитивных функций и качества жизни пациентов [55, 203]. В экспериментах на грызунах было показано, что селективные ингибиторы БХЭ, улучшают когнитивные функции у старых животных за счет увеличения уровня ацетилхолина в мозге и тем самым могут быть полезны в лечении БА [59, 204-206].

В настоящее время ведется активный поиск селективных обратимых ингибиторов БХЭ для терапии БА [207].

В последние годы предложено большое количество ингибиторов БХЭ как потенциальных терапевтических агентов для лечения БА как из природных источников, так и синтетического происхождения [208]. Многие из этих соединений были синтезированы на основе химических структур классических ингибиторов АХЭ - физостигмина, такрина, галантамина и донепезила.

Другие ингибиторы, действующие избирательно на БХЭ, включают бензофураны [211] и производные изосорбида [212-214], причем последняя группа включает в себя наиболее мощные и селективные ингибиторы БХЭ.

Производные фенотиазина - еще один химический класс ингибиторов БХЭ [215-218], которые, как известно, обладают также антипсихотическими и антигистаминными свойствами. В последнее время получены и охарактеризованы диарилимидазолы (diarylimidazoles) как гибридные ингибиторы гидролазной активности БХЭ и формирования фибрилл в-амилоида [208], а также тиенотиазины (thienothiazine), сходные по структуре с фенотиазинами [219].

В качестве эффективных селективных ингибиторов АХЭ и БХЭ представляют интерес также природные алкалоиды из растений рода Peganum - в-карболины и хинолины.

Таким образом, холинэстеразы (АХЭ и БХЭ) играют важнейшую роль в организме человека. На данный момент накоплен огромный объем информации относительно их структуры и свойств, вместе с тем множество вопросов остается открытым. Ведутся активные исследования функционирования холинэстераз, как в здоровом организме, так и при нарушениях различной этиологии, проводится активная разработка фармацевтических препаратов на основе холинэстераз и их селективных ингибиторов.

1.3 Нейротоксичная эстераза

Физиологическая роль и локализация НТЭ

Нейротоксичная этераза (НТЭ, КФ 3.1.1.5) - фермент нервной ткани теплокровных, который является мишенью нейропатичных ФОС, способных ее необратимо ингибировать c последующим быстрым старением фосфорилированного фермента, и инициировать тем самым развитие опасного синдрома «отставленной нейротоксичности, вызываемой ФОС» (ОНТФОС). Это практически необратимое поражение, обусловленное дистальной дегенерацией сенсорных и моторных аксонов в периферических нервах и спинном мозге [221-226]. Возможные механизмы развития ОНТФОС и роль НТЭ мы подробно обсуждаем ниже.

НТЭ экспрессируется в основном в нейронах, но также обнаружена в ненейрональных клетках, в том числе в лимфоцитах и клетках Лейдига.

Физиологическая роль НТЭ окончательно не выяснена. В настоящее время НТЭ классифицируется как лизофосфолипаза (EC 3.1.1.5) в связи с тем, что она гидролизует лизофосфосфолипиды (продукты гидролиза цитозольной фосфолипазы А2 - PLA2) до глицерофосфатов [229-233]. НТЭ также может действовать и как фосфолипаза, однако преимущественно гидролизует именно лизофосфатидилхолин до глицерофосфохолина [231]. Таким образом, НТЭ играет важную роль в липидном гомеостазе мембран.

Показано, что SWS протеин, обнаруженный в мозге Drosophila и имеющий высокую степень гомологии с НТЭ человека, является необходимым для процесса развития мозга у Drosophila [234, 235]. О возможной роли НТЭ в процессе нейронального развития теплокровных говорит наличие НТЭ в нейронах мыши на самых ранних стадиях их появления в нервной системе [236]. Подтверждением этой гипотезы являются исследования на нокаутных мышах НТЭ (-/-) [228]. Такие мыши погибали на 8-й день эмбрионального развития. Тотальная делеция НТЭ у таких мышей вызывает эмбриональную смерть в связи с нарушениями при формировании плаценты и недостаточностью васкуляризации [238, 237].

Нейрональные НТЭ нокаутные мыши (nestin-cre:NTEfl/fl mice), у которых удаление гена НТЭ происходит только в нервной ткани на 11-й день эмбрионального развития [239], доживают до взрослого возраста. Однако у таких мышей наблюдается вакуолизация и гибель нейронов, характерные для нейродегенеративных заболеваний [238].

Эксперименты на нокаутных по гену НТЭ мышах (НТЭ -/-) показали, что НТЭ необходима для развития и поддержания различных клеток и тканей, в том числе крупных нейронов в гиппокампе и мозжечке [239]. Кроме того, хотя НТЭ +/- мыши, имеющие примерно половину нормального уровня НТЭ, выживают и, вероятно, имеют нормальное морфологическое развитие нервной системы; они проявляют гиперактивность и повышенную чувствительность к воздействию нейропатичных соединений [239].

Ряд работ указывает на то, что НТЭ участвует в межклеточном сигнальном пути между нейронами и глиальными клетками [240, 231, 241]. В экспериментах на nestin-cre:NTEfl/fl мышах и культуре НТЭ-дефицитных нейронов показана роль НТЭ в гомеостазе фосфатидилхолина в нервной ткани и поддержании (сохранении) аксонов, а также в аксональном мембранном транспорте: присутствие НТЭ в мембране ЭПР нейронов облегчает транспортировку макромолекул к дистальным участкам длинных аксонов [242].

Matsuzaka Y. с соавторами [243] показали роль НТЭ в развитии синдрома больного здания (Sick Building Syndrome, SBS). Этот термин объединяет набор неспецифических симптомов, которые возникают без каких либо видимых причин: головные боли, усталость, вялость, тошнота, раздражения глаз и горла, головокружение, боли в спине и суставах и нарушения сна. Предполагается, что SBS может быть вызван воздействием целого ряда факторов, находяшихся внутри помещений [244, 245], причиной может являться неблагоприятная «внутренняя окружающая среда». При исследовании японской популяции показано, что в группе пациентов с SBS активность НТЭ значительно повышена по сравнению с контрольной группой.

Было также показано повышение транскрипционной активности НТЭ в периферических моноцитах у пациентов с синдромом хронической усталости chronic fatigue syndrome (CFS) [246]. Симптомы CFS имеют много сходства с симптомами SBS [247]. Предполагается, что SBS и CFS имеют перекрывающихся причины возникновения и сходные молекулярные механизмы. В целом, эти результаты показывают, что активность НТЭ может являться важным маркером при исследовании SBS. Тем не менее, дополнительные исследования различных популяций населения, генетических и экологических факторов необходимы для подтверждения роли НТЭ в патогенезе SBS.

Субстратная специфичность и методы оценки активности НТЭ

Специфический субстрат НТЭ неизвестен. НТЭ хорошо гидролизует некоторые гидрофобные искусственные субстраты: ароматические эфиры карбоновых кислот (но не объемные б - нафтиловые) и ароматические эфиры щ- фенилалкилкарбоновых кислот [248]. В качестве субстратов для определения активности НТЭ могут использоваться фенилфенилацетат, нитрофенилвалерат и фенилвалерат [221] из которых последний имеет наилучшее сочетание чувствительности и специфичности при соответствующих условиях анализа [249]. В нервной ткани содержится несколько эстераз, гидролизующих фенилвалерат, причем активность НТЭ составляет около 10% от общей фенилвалерат-гидролизующей активности. В связи с этим активность НТЭ может быть определена методом дифференциального ингибирования с использованием нейропатичного соединения - мипафокса (N,N'-диизопропиламидофторфосфат) и соединения, не вызывающего ОНТФОС - параоксона - О,О-диэтил-О-(4-нитрофенил) фосфата. Активность НТЭ определяется как часть нечувствительной к параоксону эстеразной активности, которая чувствительна к мипафоксу. Так, если А - общая фенилвалерат-гидролизующая активность, В - параоксон-резистентная активность, С - (параоксон+мипафокс) - резистентная эстеразная активность, то активность НТЭ определяется как (В - С) (Рис. 1.3.-1). Определение активности НТЭ в головном и спинном мозге обычно проводят в соответствии с дифференциальным метода Johnson, 1977 [250], в периферических нервах тем же методом с некоторыми модификациями [251].

Структура НТЭ

НТЭ - интегральный белок мембраны эндоплазматического ретиуклума, причем большая часть молекулы ориентирована на цитоплазматической поверхности мембраны [252].

НТЭ существует в двух формах. Распределение этих форм в тканях различно: в мозге 90% активности НТЭ наблюдается в микросомах и около 10% в цитозоле, в то время как в седалищном нерве около 45 % активности НТЭ наблюдается в микросомах и 55% в цитозоле. Эти две формы НТЭ демонстрируют разную чувствительность к мипафоксу: для микросомальной формы IC50 = 7 мкМ, для цитозольной около 43 мкМ [253].

Третичная структура НТЭ до сих пор не определена в связи со сложностью кристаллизации молекулы белка, отчасти из-за большого размера (1327 аминокислотных остатков) и крепления в мембране ЭПР [223, 252]. В связи с этим рассматриваются альтернативные стратегии структурного анализа, включая компьютерное моделирование дискретных доменов белка.

НТЭ человека представляет собой полипептид, состоящий из 1327 аминокислотных остатков с молекулярным весом 146 kDa, и имеющий два функциональных домена [234, 254]

1) N-концевой домен, выполняет, по-видимому, регуляторную функцию и состоит примерно из 700 аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки от 10 до 32 образуют трансмембранную спираль (TMD), аминокислотные остатки 163-262, 480-573 и 597-689, формируют 3 фрагмента, сходных с цАМФ-связывающими белками (CNP 1-3, соответственно);

2) С-концевой каталитический домен (остатки 933-1099), содержит активный серин (Ser-966), взаимодействующий с ФОС. Этот домен имеет 30 % гомологии

с растительным белком пататин-17 (фосфолипаза растений), в связи с чем называется пататин-гомологичным доменом НТЭ (PNTE) (Рис. 1.3. - 2).

Результаты молекулярного моделирования [254] и направленного мутагенеза [234, 240] показали, что каталитический центр НТЭ состоит из диады Ser-966 - Asp-1086 аналогично активному центру цитозольной фосфолипазы А2 (PLA2) и фосфолипазы растений - пататин-17 в отличие от классической триады сериновых гидролаз Ser-Asp/Glu-His. В связи с этим НТЭ относят к семейству фосфолипаз, содержащих пататин-подобный домен

(PNALA, patatin-like phospholipase domain-containing proteins), состоящему из 9 белков, где НТЭ классифицируется как PNALA6 [255].

Интересно, что НТЭ (PNPLA6) и PNPLA7 (NTE-related protein, NRE), которая, как было показано, регулируется инсулином и глюкозой [256], имеют идентичные на 61% аминокислотные последовательности и одинаковую доменную структуру, отличаясь тканевым распределением [255]. Cходство между НТЭ (PNPLA6) и PNPLA7 предполагает возможность регулирования белка НТЭ и/или кодирующего его гена инсулином и глюкозой, а также потенциальную роль НТЭ в патогенезе диабетической нейропатии: частое осложнение диабета, включающее дистальную симметричную дегенерацию аксонов.

Минимальный полипептид, содержащий эстеразный С-домен (аминокислотные остатки 727-1216) и обладающий чувствительной к ФОС фенилвалерат-эстеразной активностью, был экспрессирован в E.coli [240, 258]. Этот рекомбинантный полипептид, названный NEST, является чрезвычайно гидрофобным, и требует включения в фосфолипидные липосомы для проявления каталитической активности. Он активно используется для исследования механизма функционирования НТЭ in vitro [258, 259].

Синдром отставленной нейротокичности, вызываемой ФОС (ОНТФОС)

Характеристика и эпидемиология ОНТФОС

Как мы уже упоминали, развитие синдрома отставленной нейротоксичности связано со способностью некоторых ФОС необратимо ингибировать НТЭ с последующим быстрым старением фосфорилированного фермента [223, 262, 263]. Это привело к выделению ОНТФОС в качестве отдельной нозологической единицы - согласно классификатору ВОЗ это дистальные нейропатии, вызываемые фосфорорганическими соединениями.

В основе патологии ОНТФОС лежит билатеральная симметричная дегенерация сенсорных и моторных аксонов в дистальных областях периферических нервов и спинного мозга. При этом поражаются прежде всего наиболее длинные аксоны с максимальным диаметром [223, 225]. Наиболее выраженные дегенеративные изменения часто находят в dorsal columns грудного отдела спинного мозга. Считалось, что дегенерация начинается с миелиновой оболочки длинных аксонов. Это нашло отражение в термине «демиелинизирующие ФОС». Однако в дальнейшем было показано, что патологический процесс начинается с поражения ствола нерва, а демиелинизация вторична [264].

Характерным для ОНТФОС является наличие латентного (скрытого) периода перед началом клинических проявлений длительностью 1-3 недели [222, 223]. При этом клинических признаков острого отравления может не быть, особенно если токсикант обладает слабым антихолинэстеразным действием.

Первые клинические симптомы поражения аксонов (аксонопатии) проявляются не раньше, чем на 7-8 день после отравления нейропатичным ФОС (обычно через 7-14 дней после отравления) и заключаются в расстройстве чувствительности, слабости и онемении нижних, а затем и верхних конечностей. Параллельно с этим становится очевидным нарушение координации движения и к 20-21 дню после отравления может развиться частичный паралич конечностей. Специфические методы лечения ОНТФОС отсутствуют, выздоровление редко бывает полным [265]. Следует отметить, что это заболевание не связано с ингибированием АХЭ, и, следовательно, ОНТФОС могут вызывать те соединения, которые не обладают высокой острой токсичностью, и не вызывают сразу при отравлении настораживающих признаков острой токсичности, например триортокрезилфосфат, использование которого в промышленности практически не регламентировано. Кроме этого, ОНТФОС может потенцироваться или промотироваться другими соединениями, присутствующими в окружающей среде [264, 266 267].

Для ОНТФОС характерен ряд особенностей, отличающих это заболевание от периферических нейропатий (аксонопатий), вызываемых некоторыми лекарственными препаратами - сульфаниламидами, изониазидом, пиридоксином, а также тяжелыми металлами, сероуглеродом, акриламидом, гексаном и его производными [268]. Эти особенности включают: четко дифференцированные временные характеристики, характерные патоморфологические изменения; выраженную видовую специфичность - человек и куры являются наиболее чувствительными видами, наименьшую чувствительность проявляют грызуны [190, 264]; выраженную возрастную специфичность: молодые животные значительно менее чувствительны к ОНТФОС [264, 266, 269, 270]. Дети также менее чувствительны к действию нейротоксичных ФОС [271, 272].

Описано более 70000 случаев ОНТФОС за последние 70 лет, причем большинство из них вызвано триортокрезилфосфатом - соединением с низкой острой токсичностью, широко используемым в качестве пластификатора, любриканта и антифлогистика [190, 253, 273]. Зарегистрированы случаи полинейропатий, вызванных пестицидами: лептофосом, галоксоном, изофенфосом, метамидофосом, хлорпирифосом, мипафоксом [190, 222, 273].

Есть основания полагать, что ОНТФОС на самом деле явление более частое, чем это принято считать, в том числе и потому, что своевременный и правильный диагноз нередко упускают из-за размытости клинической картины и отсутствия четких диагностических критериев.

Видовая чувствительность к нейропатичным ФОС

Взрослые куры и кошки являются наиболее чувствительными животными: нейропатии вызываются у них при однократном воздействии ФОС с различным нейропатичным потенциалом. Человек, по-видимому, единственный из приматов, у которого ОНТФОС вызывается однократной дозой нейротоксиканта.

Грызуны считаются нечувствительными или малочувствительными к ОНТФОС из-за сложности получения клинической картины - атаксии. По мнению [262] меньшая чувствительность грызунов к воздействию нейропатичных ФОС является результатом «стабильности физиологии нейрона». Однако работы S.Padilla, B.Veronesi и M. Ehrich показали, что при отсутствии клинических симптомов поражения у крыс при введении стандартных нейротоксикантов - ТОКФ и мипафокса - наблюдаются характерные для ОНТФОС биохимические и патоморфологические изменения, и механизм инициирования ОНТФОС также одинаков для кур и грызунов.

Показано также, что клинические проявления ОНТФОС у крыс являются возраст-зависимыми, как и у кур [269, 281].

Таким образом, механизм ОНТФОС у грызунов и кур аналогичен: молекулярная мишень - НТЭ, присутствует в нервной ткани у обоих видов, ингибируется соответствующими нейропатичными дозами ФОС, ингибированный фермент «стареет» [262, 275, 280]. «Стабильность» нейронов у грызунов не является абсолютной и зависит от возраста животных.

Высокая чувствительность кур к действию отставленных нейротоксикантов наряду со схожестью гистопатологических изменений и одинаковой длительностью латентного периода у кур и человека, а также простотой клинической картины поражения привели к выбору кур в качестве стандартного тест-объекта для исследования ОНТФОС. Существенным фактором является и то, что банк данных по ОНТФОС накоплен в основном по результатам опытов на курах [262, 265, 282].

Роль НТЭ в механизме инициирования ОНТФОС

Ингибирование и «старение» НТЭ

Впервые M. Johnson в 1969 [283] году показал, что молекулой - мишенью в механизме инициирования ОНТФОС является один из белков нервной ткани, обладающий эстеразной активностью и относящийся к сериновым гидролазам - нейротоксичная эстераза (НТЭ) (neuropathy target esterasе, neurotoxic esterase, NTE) [262, 282, 283]. Полагают, что ОНТФОС инициируется путем фосфорилирования НТЭ и последующего старения фосфорилированного фермента [79, 190, 262-265]. При этом реактивация фосфорилированного фермента даже такими сильными нуклеофилами как KF и оксимы становится невозможной.

К веществам, способным индуцировать развитие ОНТФОС, относятся фосфаты, фосфонаты, амидофосфаты - группа А (Табл. 1.3.-2). Эти соединения образуют фосфорилированый фермент, способный стареть в результате расщепления связи R-OP или R-NHP [190, 284], причем порогом для последующего развития ОНТФОС у экспериментальных животных (куры) является 70-80% ингибирования НТЭ

Механизм старения НТЭ отличается от старения АХЭ: для НТЭ этот процесс происходит чрезвычайно быстро, в течение нескольких минут, причем быстрее всего стареют структуры с неразветвленными радикалами, в отличие от АХЭ, где старение в целом происходит медленнее, в течение нескольких часов, при этом быстрее стареют структуры с разветвленными алкильными радикалами.

В то же время соединения, в том числе ФОС, ингибирующие НТЭ, но после ингибирования которыми ацилированная НТЭ не способна стареть: фосфинаты, карбаматы, сульфонил фториды - группа Б (Табл. 1.3.- 2), не вызывают ОНТФОС (Рис. 1.3.- 4). Более того, как показано в экспериментах на животных, при введении подобных соединений перед воздействием нейропатичных ФОС, они служат протекторами против отставленной нейротоксичности [79, 190, 265, 287].

Какие именно процессы приводят к нейродегенерации, и чем обусловлено наличие 2-3 недельного скрытого периода между воздействием отставленного нейротоксиканта и проявлением клинической картины, на данный момент остается неясным. Одной из моделей развития ОНТФОС является так называемая «липидная модель» [226]. Эта модель предполагает, что НТЭ наряду с другими лизофосфолипазами, PLA2 и ацилтрансферазами участвует в регулировании уровня токсичных лизофосфолипидов в мембранах ЭПР.

В соответствии с данной моделью нейропатичные ФОС в основном ингибируют НТЭ (а также другие лизофосфолипазы) и ацилтрансферазу.

В результате чего возрастает уровень токсичных лизофосфолипидов в мембране эндоплазматического ретикулума, происходит образование мицелл лизофосфолипида, солюбилизирующих участки мембран, и в итоге - дестабилизация и разрушение мембран. Если подобное повреждение затрагивает достаточно протяженные области мембран ЭПР, можно ожидать развития аксонопатии. При этом нейропатичные ФОС наиболее активны в отношении НТЭ и ацилтрансфераз, а не вызывающие ОНТФОС соединения проявляют избирательность в отношении PLA2.

Из «липидной модели» следует, что определение относительной ингибиторной активности ФОС в отношении PLA2, НТЭ, других лизофосфолипаз и ацилтрансфераз позволяет определить, является соединение нейропатичным или нет. Развитие данной модели требует дополнительного экспериментального подтверждения.

Генетический полиморфмзм НТЭ

работах [288-291] показано, что три точечные мутации в каталитическом домене НТЭ человека приводят к снижению ферментативной активности НТЭ и связаны с развитием аутосомно-рецессивных расстройств двигательных нейронов (autosomal recessive motor neuron disorders, NTE-MND), которые являются подтипом наследственной спастической параплегии человека (human hereditary spastic paraplegia, HSP) [288, 289]. Клинические проявления данного заболевания имеют сходство с клиникой и патоморфологией ОНТФОС: медленно развивающаяся дегенерация аксонов в периферических нервах и спинном мозге, атрофия мышц и параличи [292].

Показано, что клиническая форма заболевания возникает у людей, имеющих мутации в обоих аллелях НТЭ. У людей, несущих один аллель дикого типа и второй мутантный аллель (вставка, приводящая к укорочению белка НТЭ), наблюдается низкая активность фермента, но при этом нет клинических признаков NTE-MND [290, 291].

Исследование данных мутаций NTE показало, что нейродегенерация может развиваться как в результате снижения активности NTE, так и при наличии аномальной формы белка.

Было также показано, что пост-трансляционные модификации НТЭ, в том числе фосфорилирование, приводят к усилению токсической функции в результате изменения связывания регуляторных белков с измененной частью молекулы НТЭ [293, 294]. Эта работа подтверждает предположение, что нейродегенерация развивается в результате комбинации двух событий: потери функции нормального белка и усиления токсической функции измененного белка.

Хотя проведенные молекулярно-генетические исследования не раскрывают полностью роль НТЭ в механизме развития ОНТФОС, они однозначно указывают на патологические эффекты, возникающие либо при потере функции белка, либо в результате токсичности мутированного белка. Эти две возможности не являются взаимоисключающими при развитии нейропатий [288, 295].

Оценка нейропатичного потенциала фосфорорганических соединений

Для ФОС, способных стареть, определение ингибиторной активности в отношении НТЭ в опытах in vitro, может быть использовано для оценки их способности вызывать ОНТФОС [264, 296].

Согласно Lotti M. и Johnson M. [296], относительная ингибиторная способность соединений в отношении двух ферментов-мишеней острой (АХЭ) является удобным параметром, характеризующим нейропатичный потенциал соединения. Для необратимых ингибиторов более корректным является кинетический подход к оценке их ингибиторной активности. В связи с этим для оценки нейропатичной опасности соединения предложено использовать отношение бимолекулярных констант ингибирования

Учитывая, что величина IС50 связана с ki, в соответствии с уравнением (3), где t - время предварительной инкубации ингибитора и фермента:

формула RIP с точки зрения IC50 (1) является вполне корректной.

В связи с тем, что ингибирование сериновых эстераз фосфорорганическими соединениями является время-зависимым процессом, временной интервал предварительной инкубации с ингибитором должен указываться для каждой полученной величины IС50. Многие из значений IС50, описанных в литературе были получены при стандартном 20-минутном интервале предварительной инкубации.

Показано, что относительная способность ФОС или его активного метаболита ингибировать НТЭ по сравнению с АХЭ коррелирует с отношением между величиной LD50 и минимальной нейропатичной дозой (доза, вызывающая атаксию). RIP > 1 указывает на то, что соединение может вызывать ОНТФОС в дозе, меньшей LD50; тогда как величины RIP < 1 свидетельствуют о том, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС, будет больше LD50 [262, 296]. Более того, согласно Johnson M. [262], соединения, для которых RIP ? 0.05, должны подвергаться тщательному токсикологическому исследованию, т.к. при интоксикации такими соединениями нейропатии могут развиваться после успешного лечения острых отравлений.

НТЭ как биомаркер воздействия нейропатичных ФОС

Наличие четкой зависимости между ингибированием / старением НТЭ и последующим развитием ОНТФОС делает возможным использование НТЭ как биомаркера этого заболевания [79, 262, 298]. Стандартным объектом для оценки нейропатичного потенциала ФОС являются взрослые куры [190, 262, 273]. Так, ингибирование НТЭ головного мозга взрослых кур в течение 24 часов после воздействия ФОС, способных стареть, т.е. фосфатов, фосфонатов, амидофосфатов, предсказывает развитие ОНТФОС через 1-3 недели. При этом пороговый уровень ингибирования НТЭ необходимый для проявления клинических признаков ОНТФОС составляет не менее 70%.

В опытах на курах показано, что для характеристики нейропатичной опасности ФОС in vivo применим показатель, основанный на отношении ингибиторной активности соединения в отношении НТЭ и АХЭ мозга и являющийся аналогом RIP [79, 299]: ED50(АХЭ)/ED50(NTE), где ED50 - средняя эффективная доза (мг/кг), при которой активность фермента снижена на 50%. Если величина данного отношения возрастает, то и нейропатичная опасность соединения увеличивается.

Как уже отмечалось, для человека характерна высокая чувствительность к действию нейропатичных ФОС [300, 301]. Кроме того, заболевание имеет скрытое начало, и отсутствуют антидоты и средства специфической терапии. Эти факты подчеркивают важность разработки биомаркеров, позволяющих определить сам факт воздействия нейропатичных ФОС на человека и степень этого воздействия для оценки риска возможного развития ОНТФОС.

Хорошо известно, что АХЭ эритроцитов и БХЭ плазмы крови могут быть использованы как биомаркеры воздействия антихолинэстеразных соединений, таких как фосфорорганические инсектициды [302, 303]. Но эритроциты как и плазма крови не содержат НТЭ. Однако было показано наличие активности НТЭ в лимфоцитах [304, 305]. Исследования на животных продемонстрировали хорошую корреляцию между ингибированием лимфоцитарной НТЭ и НТЭ мозга.

Было показано, что НТЭ периферических лимфоцитов человека может быть использована в качестве биомаркера воздействия на организм нейропатичных ФОС, в частности в образцах крови, взятых в течении 24 часов после воздействия. До настоящего времени определение активности НТЭ лимфоцитов было единственным методом мониторинга воздействия нейропатичных ФОС на человека.

Вместе с тем, использование лимфоцитарной НТЭ для рутинного мониторинга НТЭ у лиц, потенциально подвергнутых воздействию нейропатичных ФОС, весьма затруднено рядом объективных обстоятельств. Прежде всего, это значительный объем проб крови, который необходим для разделения форменных элементов крови; сама процедура разделения и дальнейший анализ трудоемки, требуют значительного времени, материальных ресурсов и квалифицированного персонала. Для мониторинга воздействия нейропатичных ФОС на человека, особенно в полевых условиях, было бы чрезвычайно удобно иметь возможность быстрого определения активности НТЭ в маленьких объемах цельной крови. Однако красный цвет крови, а также достаточно низкая активность НТЭ в крови, делали невозможным использование стандартного спектрофотометрического метода измерения. Для создания простого и быстрого метода мониторинга воздействия нейропатичных ФОС на человека нашей лабораторией совместно с кафедрой химической энзимологии МГУ был разработан принципиально новый подход к анализу активности НТЭ с использованием тирозиназных биосенсоров для определения фенола, выделяющегося как продукт ферментативного гидролиза фенилвалерата в присутствии НТЭ. Использование высоко-чувствительного амперометрического биосенсора на основе графитовой пасты, содержащей грибную тирозиназу, позволило проводить определение активности НТЭ с высокой чувствительностью и селективностью в цельной крови при многократном разбавлении исходного образца. Результаты последующих исследований продемонстрировали, что цельная кровь может быть использована в качестве надежного биомаркера воздействия нейропатичных ФОС.

В настоящее время разработан новый чувствительный планарный биосенсор на основе сочетания технологии трафаретной печати для создания графитовой подложки и технологии LBL (слой-за-слоем) нанесения полиэлектролитов (нанопленок полидиметилдиаллиламмоний хлорид - ПДДА) и грибной тирозиназы [318], который использовался для определения активности НТЭ в настоящей работе.

1.4 Карбоксилэстераза

Физиологическая функция и локализация КЭ

Карбоксилэстеразы млекопитающих (КЭ, CES, КФ 3.1.1.1.) представляют собой мультигенное семейство ферментов, относящихся к классу сериновых б/в-гидролаз, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и цитозоле клеток различных тканей [319-321].

Активность КЭ обнаружена в печени, почках, тонком кишечнике, сердце, мышцах, легких, мозге, половых железах в клетках эпителия носовой и дыхательной полостей, в лейкоцитах и моноцитах, плазме крови [320, 321].

Li B. с соавторами [173] показали, что плазма крови человека в отличие от мыши, крысы, кролика, лошади и кошки не содержит КЭ, незначительная активность КЭ в цельной крови (0.2-0.32 Ед/мл) связана с присутствием фермента в моноцитах [322, 323]. Гидролиз сложноэфирных соединений в крови человека осуществляют бутирилхолинэстераза и параоксоназа плазмы.

Максимальный уровень экспрессии КЭ обнаружен в микросомах печени млекопитающих. Уровень экспрессии и активность ферментов имеет существенные видовые и индивидуальные различия [324-326].

КЭ обладают широкой субстратной специфичностью, гидролизуют самые разные экзогенные и эндогенные соединения, содержащие сложноэфирные и амидные группы, в том числе лекарственные препараты и пролекарства. КЭ относятся к ферментам первой фазы метаболизма ксенобиотиков, участвуя в детоксикации и/или метаболической активации различных токсикантов и канцерогенов. Высокий уровень экспрессии КЭ в эпителиальных клетках большинства органов подтверждает защитную роль данных ферментов.

Изоформы КЭ млекопитающих

Охарактеризованы по крайней мере пять семейств КЭ млекопитающих согласно гомологии аминокислотной последовательности: КЭ-1 - КЭ-5 (CES1-CES5) [327]. Причем, разные изоформы различаются по субстратной специфичности.

Семейство КЭ1 (CES1) включает основные изоформы КЭ, разделенные на восемь подсемейств: CES1А - CES1H, которые экспрессируются и локализованы преимущественно в печени и ассоциированы с мембранами ЭПР.

CES1A подсемейство включает основные формы человеческой КЭ1 и основные изоформы КЭ крыс, собак, кроликов и мышей. CES 1H подсемейство включает гидролазы В и С, которые катализируют гидролиз ацетил-CoA. Члены CES 1G семейства являются секретируемыми белками [321, 330].

Семейство КЭ2 (CES2) включает кишечные изоформы КЭ человека (hCE2), крысы (rCES2), мыши (mCES2), кролика и хомяка, которые экспрессируются в основном в тонком кишечнике [330, 331] и также ассоциированы с мембраной ЭПР.

КЭ3 (CES3) экспрессируется в мозге, печени, трахее, наивысший уровень ее активности наблюдается в толстой кишке. У человека данная изоформа КЭ предположительно является секретируемой или цитоплазматической, не связанной с мембраной ЭПР. Аминокислотная последовательность КЭ3 человека (CES3A1) примерно на 40% идентична КЭ1 и КЭ2, уровень ее экспрессии в печени и желудочно-кишечном тракте крайне низкий по сравнению с КЭ1 и КЭ2.

Мышиный CES3-транскрипт локализован в мозжечке. Метаболическая роль КЭ3 еще не вполне исследована, хотя известно, что данная изоформа способна активировать противоопухолевый препарат иринотекан [332].

Miyazaki K. с коллегами выделили семейство КЭ4 (CES4). В результате исследования возможной причины протеинурии у здоровых кошек был обнаружен гликопротеин с молекулярной массой 70 кДа, имеющий КЭ - специфическую последовательность, который являлся основным белком в моче домашних кошек. Белок назван CAUXIN - carboxylesterase-like urinary excreted protein.

Семейство КЭ5 (CES5) включает изоферменты с молекулярной массой 46.5 кДа, которые имеют структуру, отличную от других семейств КЭ [337-339]. К этому семейству, вероятно, принадлежат некоторые эстеразы из печени мышей [337] и амидогидролазы из печени обезьяны.

КЭ6 (CES6) и у человека и у мышей в основном экспрессируется в периферических тканях, включая мозг, легкие, меланоциты, и является секретируемой формой фермента [340, 341]. В мозжечке показан наивысший уровень экспресии данного белка, хотя транскрипты обнаружены во многих отделах мозга, включая гиппокамп, миндалевидные ядра, обонятельную луковицу, кору, продолговатый мозг. CES6 является секретируемой формой КЭ нервной ткани. Распределение CES6 транскриптов в мозге и их наличие в цереброспинальной жидкости говорит о защитной роли этой изоформы КЭ в мозге, участвующей в детоксикации лекарств и ксенобиотиков. Еще в 1993 году Yamada T. с соавторами [342] показали присутствие КЭ в клетках капиллярного эндотелия мозга, что соответствует защитной роли КЭ для нервной системы от токсичных эфиров, возможно, как компонента гемато-энцефалического барьер.

Основные изоформы КЭ человека

КЭ человека представлена множественными изоформами. Наиболее распространены и хорошо изучены семейства КЭ1 и КЭ2. Аминокислотные последовательности этих изоформ гомологичны на 48%.

Большинство изоформ КЭ являются гликопротеинами и имеют сайты гликозилирования (КЭ1 имеет только один сайт - в положении Asn79, у КЭ2 имеется 2 сайта - в положении Asn103 и Asn267) [343]. Мономерные субъединицы КЭ1 и КЭ2 имеет молекулярную массу около 60 кДа.

КЭ-1 в основном экспрессируется в печени и минимально в тонком кишечнике [325]. Функциональный белок КЭ1 представлен тримером с молекулярной массой 180 кДа. КЭ1 находится в динамическом равновесии тример-гексамер, связывание различных лигандов на поверхности фермента смещает равновесие в сторону преобладания тримера. КЭ2 экспрессируется в основном в тонком кишечнике, а также в печени и в меньшей степени в почках. В отличие от КЭ1, КЭ2 является мономерным белком (60 кДа).

Субстратная специфичность КЭ

Изоферменты КЭ отличаются по субстратной специфичности: КЭ1 в основном гидролизует эфиры с короткой спиртовой и длинной ацильной группой, КЭ2 - напротив, более специфична к субстратам с длинной спиртовой группой и короткой ацильной частью [325, 343, 345]. КЭ1 в отличие от КЭ2 способна также катализировать реакцию переэтерификации. Так, КЭ1 гидролизует кокаин с образованием бензоилэкгонина и метанола, а КЭ2 - с образованием бензойной кислоты и метилового эфира экгонина [343].

Широкая субстратная специфичность КЭ определяет возможность клетки метаболизировать целый спектр разнообразных эфирных соединений.

Таблица Субстратная специфичность КЭ1 и КЭ2 [343].

Субстрат	Субстратная специфичность
Кокаин (метиловый эфир)	КЭ1
Меперидин	КЭ1
Метилфенидат	КЭ1
Темокаприл	КЭ1
Осельтамивир (тамифлю)	КЭ1
Кокаин (бензиловый эфир)	КЭ2>>КЭ1
CPT-11	КЭ2>>КЭ1
Героин	КЭ2>>КЭ1
Метилпреднизолон	КЭ2>>КЭ1

КЭ имеют много общих субстратов с БХЭ, включая 4-нитрофенилацетат, 1-нафтилацетат, иринотекан, кокаин и др. Они также имеют общие ингибиторы: диизопропилфторфосфат (ДФФ), iso-OMPA, параоксон, ФОС, крезил салигенин фосфат (CBDP) и др. Основное отличие между ними состоит в том, что БХЭ лучше взаимодействует с положительно заряженными соединениями (экотиофат, VX, бензоилхолин), тогда как КЭ предпочитает нейтральные [346].

Генетический полиморфизм КЭ человека

Генетический полиморфизм КЭ человека был обнаружен недавно в связи с аномальным ответом на применение некоторых лекарственных препаратов [347, 348]. Методом секвенирования ДНК выявлены две мутации в кДНК, по одной в каждом аллеле КЭ1 [348]. Первая мутация, G143E, расположена в оксианионном центре фермента и ведет к потере эстеразной активности. Вторая мутация, Asp260fs (frameshift), приводит к сдвигу рамки считывания, что уменьшает длину фермента и также ведет к потере ферментативной активности. Клиническим последствием потери активности КЭ1 может быть непереносимость (побочные эффекты со стороны сердечно-сосудистой системы) метилфенидата (Риталин), лекарственное средство из группы психостимуляторов, используемыое в ряде стран для лечения синдрома дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ).

Тамифлю (Tamiflu, Oseltamivir) - противовирусное средство, используемое для лечения и профилактики инфекций вируса гриппа А и В и птичьего гриппа, представляет собой пролекарство, которое активируется КЭ1 в печени [349], активный метаболит селективно ингибирует вирусную нейраминидазу. Форма КЭ1 с мутациями G143E и Asp260fs не способна активировать пролекарство Тамифлю, в связи с чем снижается терапевтическая эффективность и переносимость данного препарата.

Трандолаприл (Trandolapril) - ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, также является сложноэфирным пролекарством. Его деэтерификацию до активного препарата катализирует КЭ1 в печени. Неактивные мутантные формы КЭ1 (G143E и Asp260fs) не способны катализировать превращение пролекарства в активный метаболит, что приводит к неэффективности препарата и нежелательным побочным реакциям у пациентов.

Имидаприл - сложноэфирное пролекарство для лечения повышенного артериального давления, также активируется КЭ1 в печени. SNP в промоторной области гена КЭ1A2 (-816А/С) влияет на чувствительность пациентов к имидаприлу предложительно в результате увеличения транскрипции гена КЭ1 [351].

Обнаружены и другие единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNPs) гена КЭ1: -75G/T, -46A/G, -39A/G, -21C/G, -20G/A, -2G/C. Однако эти замены не оказывают заметного влияния на активность КЭ1.

Структура КЭ

Кристаллическая структура КЭ млекопитающих впервые была установлена для фермента сыворотки кролика в 2002 году [353]. В настоящее время установлена кристаллическая структура КЭ1 (Рис. 1.4.-1) человека, ведется активное исследование структуры фермента в комплексе с различными молекулами для более детального понимания роли КЭ в различных биологических процессах, ее субстратной специфичности [344, 354, 355]. Данная информация важна для направленного дизайна и разработки эффективных пролекарств.

Центральный каталитический домен КЭ окружен б/в-слоями и регуляторными областями [343]. Активный центр КЭ содержит высоко консервативную аминокислотную последовательность, характерную для всех сериновых гидролаз, которая включает активный остаток серина. Каталитическая триада КЭ (Ser203- Glu336 - His450) находится на дне канала на глубине около 15 ? от поверхности белка приблизительно в центре молекулы.

Канал активного центра КЭ1 выстлан остатками гидрофобных аминокислот, вход в каталитическую щель ограничен альфа-спиралью. Объем активного центра КЭ намного больше (~1300 ?), чем у АХЭ и БХЭ (300 ? и 500 ?, соответствено). Активный центр КЭ имеет два связывающих домена, расположенных по разные стороны от активного Ser-203: один, «маленький и жесткий», другой - «большой и гибкий». Наличие этих двух доменов облегчает распознавание и связывание химически различных субстратов [354]. Жесткий карман прилегает к оксианионному сайту (Gly124 и Gly125) и выстлан гидрофобными остатками. Короткие ацильные цепи могут легко размещаться внутри этого кармана (метильные и этильные, например). Более объемный гибкий карман выстлан неполярными остатками и может принимать крупные или полициклические молекулы, такие как холестерол. Этот сайт прилегает к «боковой двери» («side door»), которая предположительно пропускает небольшие молекулы субстратов и продуктов в активный центр и из него.

Еще один лиганд-связывающий сайт, называемый Z-сайт, находится также в каталитическом домене на расстоянии 15 ? от эстеразного сайта и участвует в аллостерической регуляции фермента [344, 355].

Таким образом, активный центр КЭ обладает рядом структурных особенностей в сравнении с АХЭ и БХЭ. Так, КЭ не имеет периферического анионного сайта (в-анионного сайта), который отвечает за первичное связывание лигандов, определяет попадание субстрата в каталитическую щель является сайтом субстратного ингибирования в случае АХЭ. В каталитической щели КЭ отсутствует ароматический кластер, который сильно ограничивает объем активного центра и структурные возможности субстратов особенно для АХЭ и в меньшей степени для БХЭ. Объемный активный центр КЭ, наличие гибких «участков» связывания субстрата и сайта аллостерической регуляции в каталитическом домене (Z-сайт) обеспечивает широкую субстратную специфичность этого фермента.

Общая схема гидролиза субстрата в активном центре КЭ и ключевая роль серина и гистидина являются общими для сериновых гидролаз. Рисунок 1.4.-2 демонстрирует участие основных аминокислотных остатков в процессе катализа (нумерация аминокислотных остатков согласно [319]. Ключевым моментом является перенос протона от активного Ser203 к His450. Протонированный гистидин His450 стабилизируется при взаимодействии с Glu336. Эти два аминокислотных остатка, His450-Glu336, составляют так называемую систему переноса заряда (charge-relay system), активирующую серин. Реакция идет в 2 стадии - ацилирование (с образованием ацил-фермента) деацилирование, причем на обеих стадиях образуется тетраэдрический интермедиат, подобно реакциям, катализируемым АХЭ и БХЭ. Изоформы КЭ, которые являются внутриклеточными ферментами, связанными с мембраной ЭПР, имеют высококонсервативную С-концевую последовательность HXEL-COOH (в соответствии буквенному коду аминокислот -His-Х-Glu-Leu-, где Х - любая аминокислота), отвечающую за удержание белка на внутренней стороне мембраны эндоплазматического ретикулума посредством связывания с мембранным рецептором KDEL - интегральный мембранный белок с KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) сигнальной последовательностью на С-конце [343]. На Рисунке 1.4.-2 схематично показана локализация молекулы КЭ на внутренней стороне мембраны ЭПР.

Секретируемые формы КЭ, например, КЭ плазмы крови мыши (ES1) и крысы (Ces1G2), которые экспрессируются в печени, имеют нарушенный вариант удерживающей сигнальной последовательности - HTEHK -COOH (His-Thr-Glu-His-Lys), которая не может связываться с KDEL-рецептором мембраны ЭПР, в связи с чем данные изоформы КЭ секретируются в кровь.

КЭ плазмы мышей ( ES1) - гликопротеин 70 кДа, продукт гена ES1, локализованного на хромосоме 8, один из 16 гомологичных генов КЭ. Фермент транскрибируется в основном в печени и секретируется в кровь. ES1 обнаруживается в крови и лимфе в основном в форме мономера. Обычно содержание ES1 в крови мышей составляет 80 мг на литр крови, примерно 1.2 мкМ [360].

ES1 взаимодействует с ФОС как биоскэвенджер, стехиометрически связывая и инактивируя ФОС вне зависимости от токсичности соединения. Таким образом ES1 эффективно понижает количество молекул ФОС, способных ингибировать биологически значимые мишени (АХЭ и НТЭ) и повышает устойчивость к токсичным ФОС [361]. Ранее на крысах было показано, что именно КЭ плазмы, а не печени, тонкого кишечника и других органов ингибируется токсичными дозами зомана [362-364]. В недавних исследованиях на модели нокаутных мышей по гену ES1 было подтверждено, что именно КЭ плазмы обеспечивает эффективную защиту от высокотоксичных ФОС [360].

У человека отсутствует подобная секретируемая форма фермента, что объясняет отсутствие КЭ в плазме крови человека [173].

Таким образом, активность КЭ в плазме грызунов следует учитывать при использовании их в качестве модельных животных в исследованиях по оценке токсичности соединений во избежание ложной интерпретации данных.

...