Исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений

- атаксию и параличи конечностей. Тем не менее, было показано, что у крыс и мышей линии CD-1 после однократного введения стандартного нейротоксиканта триортокрезилфосфата (ТОКФ) при отсутствии клинических симптомов наблюдаются характерные для ОНТФОС патоморфологические изменения ряда длинных аксонов и дозозависимое ингибирование НТЭ головного и спинного мозга [275, 279, 509, 510]. При этом пороговая для инициирования ОНТФОС степень ингибирования НТЭ у крыс составляла, как и у кур, 70-80%.

Ранее в экспериментах in vitro в нашей лаборатории была показана близкая чувствительность НТЭ из мозга крыс и кур к ингибированию О-фосфорилированными оксимами и рядом дихлорвиниловых эфиров фосфорной и фосфоновой кислот [484, 511]. В экспериментах на целом животном на примере нейропатичного соединения diPr-DClVP в работе [ 484] продемонстрирована принципиальная возможность использования крыс для биохимической оценки способности ФОС вызывать отставленную нейротоксичность.

Эксперименты по исследованию поведения соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма планировалось проводить на мышах линии CD1. В связи с этим следовало выяснить, насколько НТЭ мозга и крови мышей могут служить биохимическими маркерами воздействия нейропатичных ФОС, и оценить возможность использования мышей в качестве модели для биохимической оценки нейропатичной опасности соединений.

Для решения данной задачи в опытах in vitro на препаратах мозга и крови на целом животном было проведено сравнительное исследование чувствительности НТЭ и АХЭ мозга мышей и мозга кур к действию нескольких ФОС. Исследовали два известных нейропатичных соединения: мипафокс (MX) diPr-DClVP. diPr-DClVP детально изучен в наших предыдущих работах in vivo и in vitro на курах и крысах [306, 484], в связи с этим мы использовали его в качестве маркерного соединения в настоящем эксперименте на мышах. Оба соединения - MX и diPr-DClVP, обладают как антихолинэстеразными свойствами, так и способностью вызывать отставленную нейротоксичность [297, 306, 484, 485]. Также мы исследовали два экспериментальных соединения diEt-PFP и diBu-PFP, обладающие, по результатам анализа их эстеразного профиля, различным нейропатичным потенциалом RIP = 0.07 и 6.6, соответственно.

Для оценки возможности использования НТЭ крови мышей в качестве биомаркера воздействия нейропатичных ФОС было проведено сравнительное исследование ингибирования НТЭ мозга и крови мышей in vivo двумя нейропатичными соединениями, diPr-DClVP и diBu-PFP.

Сравнительное исследование чувствительности НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур к действию ФОС с различным эстеразным профилем в экспериментах in vitro

В опытах in vitro на препаратах мозга были определены бимолекулярные константы ингибирования АХЭ и НТЭ мозга мышей и мозга кур несколькими фосфорорганическими соединениями: diPr-DClVP, МХ, diEt-PFP и diBu-PFP. В качестве источника АХЭ и НТЭ мозга мышей использовали 9S фракцию гомогената головного мозга мышей. Источником АХЭ мозга кур являлась 9S фракция гомогената головного мозга кур. В качестве источника НТЭ мозга кур использовали стабильный лиофилизованный препарат НТЭ, полученный по методике, разработанной в нашей лаборатории.

Таблица 3.3. - 1. Ингибиторная активность (k i, M-1 min-1) и ингибиторная селективность (RIP) соединений в отношении АХЭ и НТЭ мозга мышей и кур in vitro.

		ki, M-1мин-1		RIP
Соединение					ki(НТЭ)/ki(АХЭ)
	мыши	куры
	АХЭ	НТЭ	АХЭ	НТЭ	мыши	куры
diEt-PFP	7.22±0.36	1.22±0.05	1.11±0.06	2.50±0.14	0.17±0.01	0.23±0.02
	Ч102	Ч102	Ч103	Ч102
diBu-PFP	7.12±0.33	5.11±0.23	1.80±0.14	1.27±0.09	7.20±0.46	7.10±0.74
	Ч104	Ч105	Ч105	Ч106
diPr-DClVP	3.67±0.22	1.44±0.06	3.60±0.12	1.25±0.11	3.90±0.28	3.47±0.33
	Ч105	Ч106	Ч105	Ч106
МХ	4.41±0.28	1.65±0.08	1.2± 0.07	5.31±0.5	3.74±0.29	4.43±0.49
	Ч102	Ч103	Ч103	Ч103

Приведенные величины являются средними из трех экспериментов, (mean ± SEM, N=3)

Литературные данные по ингибиторной активности известных ФОС - мипафокса (MХ) и diPr-DClVP - в отношении АХЭ и НТЭ представлены в основном величинами IC50. Для сравнения этих данных с нашими результатами из полученных констант ингибирования (Табл. 3.3.-1) были рассчитаны величины IC50 для фиксированного времени инкубации ферментов с MХ и diPr-DClVP (20 мин.) в соответствии с уравнением IC50=(ln2)/(kiЧt)

Для всех исследуемых соединений получены хорошие корреляции между величинами констант ингибирования АХЭ мозга кур и мозга мышей и между величинами констант ингибирования НТЭ мозга кур и мозга мышей. Результаты показывают, что НТЭ и АХЭ мозга мышей имеют сходную с ферментами кур чувствительность к исследуемым соединениям.

Для оценки нейропатичного потенциала соединений в опытах in vitro определяют их относительную ингибиторную способность (RIP) в отношении НТЭ в сравнении с АХЭ: RIP = ki(НТЭ)/ki(АХЭ) = IC50(АХЭ)/ IC50(НТЭ) [296, 297]. Относительная способность ФОС ингибировать НТЭ по сравнению с АХЭ коррелирует с отношением между LD50 и минимальной нейропатичной дозой [226, 262]. RIP > 1 указывает на то, что соединение может вызывать ОНТФОС в дозе, меньшей LD50, тогда как величины RIP < 1 свидетельствуют о том, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС, будет больше LD50.

Величины RIP для исследуемых ФОС, рассчитанные из отношений kiНТЭ/kiАХЭ, представлены в Таблице 3.3.-1. Как видно из таблицы, величины RIP, полученные на препаратах мозга кур и мозга мышей очень близки и отражают одинаковый ряд нейропатичной опасности соединений для обоих видов животных: diEt-PFP << МХ ? diPr-DClVP < diBu-PFP. Это подтверждают хорошие корреляции между величинами RIP, полученными на препаратах мозга кур и мозга мышей для всех соединений: r = 0.997, p = 0.003, N = 4

Таким образом, НТЭ и АХЭ мозга мышей имеют сходную с ферментами кур чувствительность к нейропатичным соединениям, а видовые различия в чувствительности к отставленному нейротоксическому действию ФОС у мышей по сравнению с курами не связаны с различиями в чувствительности фермента-мишени - НТЭ.

Принимая во внимание строгие корреляции между величинами констант ингибирования (ki) АХЭ и НТЭ, а также величинами RIP, полученными на ферментах мозга кур и мозга мышей, т.е. одинаковый ряд и степень нейропатичной опасности исследуемых соединений для обоих видов, можно сделать вывод о возможности использования НТЭ и АХЭ мозга мышей для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС в экспериментах in vitro.

Сравнительное исследование ингибирования НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур фосфорорганическими соединениями в экспериментах на целом животном

Для выяснения характера и степени ингибирования ферментов мозга мышей в сравнении с ферментами мозга кур как стандартного объекта для изучения ОНТФОС, мы исследовали ингибирование НТЭ и АХЭ в мозге мышей через 1 час после однократного в/бр введения возрастающих доз маркерного соединения - diPr-DClVP и двух экспериментальных ФОС diEt-PFP и diBu-PFP, обладающих согласно данным in vitro разным нейропатичным потенциалом. Временной интервал в 1 час был выбран по аналогии с исследованием diPr-DClVP в оытах на крысах [484].

На-3А показана зависимость степени торможения активности АХЭ и НТЭ в головно м мозге мышей от введенной дозы diPr-DClVP. Ингибирование обоих ферментов имеет дозозависимый характер. В результате анализа полученных кривых доза-ответ были определены средние эффективные дозы для ингибирования АХЭ и НТЭ в головном мозге мышей (ED50, мг/кг - доза, при введении которой активность фермента снижается на 50%): ED50(АХЭ) = 4.3 ± 0.6 и ED50(НТЭ) = 2.2 ± 0.4 мг/кг. Высокая ингибиторная активность diPr-DClVP в отношении АХЭ мозга мышей in vivo, согласуется с его высокой острой токсичностью для мышей (LD50 = 15 мг/кг).

Таблица 3.3. - 4. Ингибиторная эффективность (ED50, мг/кг) diPr-DClVP в отношении АХЭ и НТЭ мозга мышей и кур и ингибиторная селективность diPr-DClVP в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ в опытах на целом животном: ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ).

cоединение	Мозг мышей	Мозг кур	ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ)
	ED50, мг/кг	ED50, мг/кг
	АХЭ	НТЭ	АХЭ	НТЭ	мыши	куры
diPr-DClVP	4.3 ± 0.6	2.2 ± 0.4	0.79 ± 0.07	0.44 ± 0.01	2	1.8

Полученные результаты показывают, что НТЭ головного мозга мышей является достоверным биомаркером воздействия нейропатичных ФОС. Определение активности НТЭ и АХЭ в мозге мышей может быть использовано для биохимической оценки нейропатичной опасности соединения.

Для подтверждения возможности использования мышей в качестве модели для биохимической оценки нейропатичной опасности ФОС мы провели исследование изменения активности АХЭ и НТЭ в головном мозге мышей через 1 час после в/бр введения возрастающих доз двух экспериментальных соединений - diEt-PFP и diBu-PFP, обладающих различным нейропатичным потенциалом: diEt-PFP - не является нейропатичным соединением (RIP = 0.07), отличие от более гидрофобного diBu-PFP, который представляет опасность как отставленный нейротоксикант (RIP = 6.6).

На Рисунке 3.3.-4 показана зависимость степени торможения активности АХЭ и НТЭ в головном мозге мышей от введенных доз diEt-PFP и diBu-PFP.

Как видно из Рисунка 3.3.-4А, diEt-PFP слабо ингибирует НТЭ и АХЭ мозга: в дозе, соответствующей LD50 (200 мг/кг), активность НТЭ снижена лишь на 10%, активность АХЭ - на 26%. Это означает, что дозы, при которых данное соединение может инициировать ОНТФОС (>70% ингибирования НТЭ), будут существенно выше LD50, и соединение не представляет опасности как отставленный нейротоксикант, что согласуется с его эстеразным профилем (RIP=0.07).

diBu-PFP ингибирует НТЭ и АХЭ в мозге мышей дозозависимым образом (Рис. 3.3.-4Б). В отличие от diEt-PFP, критичное для инициирования ОНТФОС 70-80%-ное снижение активности НТЭ при в/бр введении diBu-PFP достигается дозе 200 мг/кг, что существенно ниже LD50, которая для данного соединения превышает 2000 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют о том, что diBu-PFP, имеющий очень низкую острую токсичность, представляет опасность как отставленный нейротоксикант, способный вызывать ОНТФОС в дозах, не вызывающих признаков острого холинергического отравления. В результате анализа кривых доза-ответ для diBu-PFP были определены величины ED50:

ED50(АХЭ) = 516±83.9 мг/кг, ED50(НТЭ) = 127±7.5 мг/кг.

Отношение ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) = 4.1, что подтверждает высокую нейро-патичную опасность данного соединения и согласуется с его эстеразным профилем (RIP = 6.6).

Таким образом, эксперименты на целом животном подтверждают прогнозы экспериментов in vitro: diEt-PFP не представляет опасности как отставленный нейротоксикант, тогда как diPr-DClVP и diBu-PFP являются нейропатичными соединениями. При этом наблюдается тот же ряд нейропатичной опасности соединений, который был получен в опытах in vitro:

diEt-PFP << diPr-DClVP < diBu-PFP.

В результате проведенных экспериментов мы можем заключить:

- НТЭ мозга мышей имеет сходную с ферментом кур чувствительность к нейропатичным соединениям in vitro;

- видовые различия в чувствительности к отставленному нейротоксическому действию ФОС у мышей по сравнению с курами не связаны различиями в чувствительности фермента-мишени - НТЭ; можно полагать, что меньшая чувствительность грызунов к действию нейропатичных ФОС обусловлена как отличиями в метаболизме и фармакокинетике ФОС у грызунов [279], так и большей физиологической стабильностью нейрона [262, 265];

- несмотря на более низкую по сравнению с курами эффективность торможения АХЭ и НТЭ в головном мозге мышей in vivo, отношения ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ), полученные в опытах на мышах и курах и характеризующие нейропатичную опасность соединения, близки;

- относительное ингибирование НТЭ и АХЭ в мозге мышей через 1 час после в/бр введении diEt-PFP, diPr-DClVP и diBu-PFP соответствует нейропатичному потенциалу соединений (величинам RIP) и демонстрирует одинаковый ряд нейропатичной опасности соединений: diEt-PFP << diPr-DClVP < diBu-PFP.

Полученные результаты позволяют рассматривать НТЭ мозга мышей как достоверный биомаркер отравления нейропатичными ФОС. Несмотря на отсутствие у мышей клинической картины ОНТФОС, относительное ингибирование НТЭ и АХЭ в мозге мышей, определяемое через 1 час после в/бр введения ФОС, может быть использовано для биохимической оценки нейропатичной опасности соединения.

Использование НТЭ крови мышей в качестве биохимического маркера отравления нейропатичными ФОС

Ранее было показано, что НТЭ цельной крови кур, измеряемая с помощью тирозиназного электрохимического биосенсора, может быть использована в качестве биомаркера отравления нейропатичными соединенями.

В настоящем эксперименте мы провели сравнительное исследование ингибирования НТЭ и АХЭ в крови и мозге мышей при однократном в/бр введении возрастающих доз нейропатичных соединений diPr-DClVP и diBu-PFP. Как видно и, ингибирование НТЭ и АХЭ обоими соединениями в крови, как и в мозге, носит дозозависимый характер, причем

ферменты крови проявляют несколько более высокую чувствительность к действию исследуемых ФОС по сравнению с ферментами мозга. Эти различия более выражены в случае менее активного и более гидрофобного diBu-PFP.

При в/бр введении вещество поступает в кровоток, минуя печеночный барьер и не контактируя с ферментами и средой желудочно-кишечного тракта. В этом случае кровь обеспечивает первый уровень защиты: ферменты и другие белки крови связывают ФОС, снижая тем самым количество молекул токсиканта, достигающих мишеней в мозге. В связи с этим активность АХЭ и НТЭ крови снижается быстрее и в большей степени, чем активность ферментов мозга.

Для того чтобы оценить, насколько ингибирование эстераз крови соответствует изменению активности эстераз-мишеней в мозге, мы построили корреляционные зависимости между степенью ингибирования НТЭ и АХЭ в мозге и крови, наблюдаемой через 1 час после в/бр введения diPr-DClVP и diBu-PFP.

Для diBu-PFP коэффициенты корреляции между степенью ингибирования НТЭ в мозге и крови мышей составляли: r = 0.967, p = 0.00035, n = 7 и степенью ингибирования АХЭ в мозге и крови: r = 0.966, p = 0.0074, n =5.

Полученные результаты показывают, что ингибирование НТЭ и АХЭ в крови мышей в целом отражает изменение активности ферментов в мозге при в/бр введении соединений, при этом для гидрофобного и менее активного diBu-PFP в значительной степени выражен защитный эффект ферментов и других белков крови.

Из полученных дозозависимостей для ингибирования АХЭ и НТЭ в крови мышей были определены соответствующие величины ED50 (мг/кг), а также рассчитаны величины ингибиторной селективности для diPr-DClVP и diBu-PFP в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ: ED50 (АХЭ)/ED50(НТЭ). Как уже упоминалось ранее, данное отношение для ферментов мозга характеризует опасность соединения как отставленного нейротоксиканта на уровне целого организма, аналогично величине RIP в экспериментах in vitro.

Как видно из высокоактивный diPr-DClVP ингибирует ферменты мозга и крови примерно в одинаковой степени и значительно эффективнее, чем diBu-PFP, что полностью соответствует эстеразным профилям соединений. При этом величины отношения ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ), характеризующие нейропатичную опасность исследуемых соединений, совпадают в мозге и крови.

diBu-PFP ингибирует НТЭ и АХЭ крови в большей степени, чем ферменты мозга при в/бр введении (более низкие величины ED50, мг/кг, Табл. 3.3.-5). Эти различия могут быть связаны с особенностями токсикокинетики менее активного и более гидрофобного diBu-PFP. Тем не менее, величины отношения ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) в крови и мозге очень близки: 4.3 и 4.1, соответственно.

Таким образом, для обоих соединений величины отношения ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) в крови совпадают с величинами данного отношения в мозге, т.е. соотношение между ингибированием НТЭ и АХЭ в крови характеризует вероятность развития ОНТФОС по сравнению с острой токсичностью.

Полученные данные позволяют рассматривать НТЭ крови мышей как достоверный биохимический маркер воздействия нейропатичных ФОС. Одновременное определение активности АХЭ и НТЭ в крови позволяет дифференцировать воздействие острых и отставленных нейротоксикантов.

Проведенные эксперименты демонстрируют возможность использования мышей в качестве адекватной модели для биохимической оценки нейропатичной опасности ФОС in vitro и в эксперименте на целом животном.

3.4 Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на препаратах мозга и крови мышей in vitro

Для выяснения вопроса о том, насколько эстеразный профиль антихолинэстеразного соединения определяет его поведение на уровне тканей, мы исследовали ингибирование АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в 9S фракции гомогената мозга (далее препараты мозга) и в препаратах крови мышей in vitro двумя экспериментальными фосфорорганическими соединениями diEt-PFP -

(С2H5O)2P(O)OCH(CF3)2 и diBu-PFP - (С4H9O)2P(O)OCH(CF3)2, и известным нейропатичным соединением diPr-DClVP - (C3H7O)2P(O)OCH=CCl2, выбор которых обоснован выше.

Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз мозга мышей in vitro

Проведено титрование активностей АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в 9S фракции гомогената мозга мышей (препараты мозга) исследуемыми соединениями. На представлены кривые титрования активности ферментов мозга мышей diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP при 20 минутной инкубации.

В результате анализа приведенных кривых получены величины IC50, (М), отражающие ингибиторную активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах мозга мышей (Табл. 3.4.-1), и рассчитана селективность исследуемых соединений в отношении эстераз мозга в соответствии с уравнением: S(Ex/Ey) = IC50(Ey) / IC50(Ex) (Табл. 3.4.-2).

Таблица 3.4. - 1. Ингибиторная активность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах мозга мышей (IC50, M, t = 20 мин).

соединение		IC50, M
	АХЭ	НТЭ	БХЭ	КЭ
diEt-PFP	(4.83±0.20)Ч10-5	(2.82±0.15)Ч10-4	(1.26±0.07)Ч10-5	(1.81±0.13)Ч10-5
diBu-PFP	(4.93±0.20)Ч10-7	(6.75±0.41)Ч10-8	(2.33±0.11)Ч10-8	(1.52±0.16)Ч10-7
diPr-DClVP	(9.36±0.56)Ч10-8	(2.41±0.10)Ч10-8	(5.30±0.26)Ч10-9	(3.2 ±0.29)Ч10-8

Сравнение эстеразных профилей соединений (Табл. 3.1.-6) и их ингибиторной активности в отношении эстераз мозга (Табл. 3.4.-1) показывает, что ингибиторная активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, БХЭ, НТЭ мозга мышей, за исключением КЭ, соответствуют эстеразному профилю соединений. Наибольшую селективность в препаратах мозга все три исследуемых соединения проявляют по отношению к БХЭ. Величины их ингибиторной селективности в отношении БХЭ по сравнению с АХЭ и НТЭ мозга (Табл. 3.4.-2) близки соответствующим величинам селективности, рассчитанным из эстеразного профиля соединений (Табл. 3.1.-7). Селективность соединений в отношении НТЭ мозга по сравнению с АХЭ также соответствует величинам RIP, полученным при анализе эстеразных профилей соединений (Табл. 3.1.-7) и, соответственно, наблюдается тот же ряд нейропатичной опасности соединений: diEt-PFP <? diPr-DClVP ? diBu-PFP .

Все исследуемые соединения ингибируют КЭ мозга мышей заметно слабее (в 10-50 раз), чем фермент КЭ микросом печени свиньи, используемый в кинетических исследованиях для оценки эстеразного профиля соединений.

Сравнительное исследование ингибиторной активности diBu-PFP в отношении КЭ печени и КЭ мозга мышей (20 мин инкубация) показало меньшую чувствительность фермента мозга по сравнению с ферментом печени у одного вида животных: IC50= (1.5±0.16)Ч10-7 М (КЭ мозга) и (4.6±0.4)Ч10-8 М (КЭ печени).

Мы полагаем, что различная чувствительность КЭ мозга и печени к ФОС, может быть связана с присутствием разных изоформ фермента в данных тканях, отличающихся как по уровню экспрессии, так и по специфичности. Из литературных источников известно, что в мозге экспрессируется CES6 изоформа КЭ, которая является продуктом гена CES6, локализованного на хромосоме 16. CES6 является индивидуальной секретируемой формой КЭ нервной ткани млекопитающих [341] и отличается от CES1 (КЭ печени), CES2 (КЭ тонкого кишечника), являющихся продуктами соответствующих генов, локализованных на 8-й хромосоме, и экспрессирующих белки, связанные с мембранами эндоплазматического ретикулума [341].

- исследована ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ в препаратах мозга мышей;

- показано, что ингибиторная активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей близка к их активностям, полученным на индивидуальных ферментах, т.е., соответствует их эстеразному профилю;

- показано соответствие ингибиторной селективности diEt-PFP, diBu-PFP diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей величинам селективностей, полученным из анализа эстеразного профиля данных соединений;

- для КЭ мозга мышей показана меньшая ингибиторная активность исследуемых ФОС по сравнению с коммерческим препаратом КЭ микросом печени свиньи, используемым для кинетических исследований, а также по сравнению с КЭ печени мыши, что может быть связано с присутствием различных изоформ КЭ в мозге и печени.

Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышей in vitro

Для исследования ингибиторной активности и селективности diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP на препаратах крови мышей in vitro в сравнении с их эстеразным профилем проведено титрование активности АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах крови мышей выбранными соединениями.

На Рисунке 3.4.-2 представлены кривые титрования активности ферментов крови мышей исследуемыми соединениями при 20 минутной инкубации с ингибиторами. Из Рисунка 3.4.-2 видно, что наиболее чувствительными к действию исследуемых соединений являются неспецифические эстеразы («вторичные» мишени-скэвенджеры) - БХЭ и особенно КЭ, в меньшей степени чувствительны АХЭ и НТЭ.

В результате анализа кривых титрования определены величины IC50, отражающие ингибиторную активность исследуемых ФОС в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ в препаратах крови мышей (Табл. 3.4.-3), и рассчитаны селективности исследуемых соединений в отношении указанных эстераз крови:

S(Ex/Ey ) = IC50(Ey)/IC50(Ex) (Табл. 3.4.-4).

Таблица 3.4. - 3. Ингибиторная активность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в препаратах крови мышей.

соединение		IC50, М (t = 20 мин)
	АХЭ	НТЭ	БХЭ	КЭ
diEt-PFP	(8.98±0.68)Ч10-5	(7.93±0.45)Ч10-4	(2.83±0.18)Ч10-5	(1.89±0.11)Ч10-6
diBu-PFP	(1.56±0.12)Ч10-6	(2.28±0.17)Ч10-7	(1.67±0.08)Ч10-7	(2.41±0.13)Ч10-8
diPr-DClVP	(1.23±0.04)Ч10-7	(2.54±0.25)Ч10-8	(1.42±0.19)Ч10-8	(2.31±0.13)Ч10-9

Из Таблицы 3.4.-3 видно, что ингибиторная активность соединений в препаратах крови мышей в целом ниже показателей их эстеразного профиля (Табл. 3.1.-6). Это, вероятно, можно объяснить присутствием в крови ферментов и других белков, способных изменять количество свободных молекул ингибитора путем связывания или гидролиза (например, сывороточный альбумин). При этом порядок чувствительности эстераз крови к каждому соединению соответствует его эстеразному профилю: для diEt-PFP НТЭ < АХЭ < БХЭ < КЭ, для diBu-PFP и diPr-DClVP АХЭ < НТЭ < БХЭ < КЭ.

Таблица 3.4. - 4. Ингибиторная селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ в препаратах крови мышей: S(Ex/Ey) = IC50(Ey)/IC50(Ex).

			Селективность (S)
соединение	БХЭ /АХЭ	КЭ /АХЭ	БХЭ/НТЭ	КЭ/НТЭ	КЭ/БХЭ	НТЭ/АХЭ
diEt-PFP	3.2	47.5	28	420	15	0.11
diBu-PFP	9.34	65	1.4	9.5	7	6.8
diPr-DClVP	8.7	53.2	1.8	11	6	4.8

Величины ингибиторной селективности ФОС в отношении эстераз крови (Табл. 3.4.-4) хорошо соответствуют значениям, рассчитанным из эстеразных профилей данных соединений (Табл. 3.1.-7), что подтверждают высокие показатели корреляции между этими параметрами: для diEt-PFP r = 0.999, p <

0.0001; для diBu-PFP r = 0.938, p = 0.0184; для diPr-DClVP r = 0.918, p = 0.0279 (Рис. 3.4.-3).

Селективность в отношении НТЭ крови по сравнению с АХЭ для всех соединений (Табл. 3.4.-4) близки к величинам RIP, рассчитанным из их эстеразных профилей (Табл. 3.1.-7): для diEt-PFP - 0.11 и 0.07, для diBu-PFP - 6.8 и 6.6, для diPr-DClVP - 4.8 и 3.5.

Таким образом, на препаратах крови, как и на препаратах мозга мышей, ряд нейропатичной опасности соединений соответствует прогнозам эстеразного профиля: diEt-PFP << diPr-DClVP < diBu-PFP.

В результате экспериментов на препаратах крови мышей

- исследована ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ крови;

- установлено, что активности исследуемых соединений в отношении эстераз крови в целом ниже, чем в отношении индивидуальных ферментов; при этом порядок чувствительности эстераз крови к каждому соединению соответствует его эстеразному профилю;

- показано, что величины ингибиторной селективности в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ крови полностью соответствуют эстеразному профилю соединений;

Таким образом, на препаратах крови мышей diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP проявляют эффекты, соответствующие их эстеразными профилями, как точки зрения ингибиторной активности в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ, так и с точки зрения ингибиторной селективности.

3.5 Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма

В настоящем эксперименте нам предстояло оценить, насколько прогнозы относительно биологических эффектов ФОС, сделанные на основании анализа их эстеразных профилей, соответствуют эффектам соединений на уровне целого организма, т.е. исследовать связь между эстеразным профилем соединения и степенью ингибирования эстераз головного мозга и крови мышей при в/бр введении соединений.

С этой целью было исследовано изменение активности АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ мозга и крови мышей через 1 час после однократного в/бр введения возрастающих доз трех соединений: diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP, обладающих разным эстеразным профилем, разной острой токсичностью и разным нейропатичным потенциалом. Вводимые животным дозы diEt-PFP и diBu-PFP не превышали величины LD50: для diEt-PFP интервал вводимых доз составлял 15 ч 200 мг/кг (LD50 = 200 мг/кг), для diBu-PFP - 0.5 ч 2000 мг/кг (LD50 > 2000 мг/кг), интервал вводимых доз diPr-DClVP составлял 0.2 ч 24 мг/кг. Дозы diPr-DClVP, превышающие LD50 (15 мг/кг), вводили мышам на фоне предварительного введения атропина-сульфата (20 мг/кг за 20 мин. до введения diPr-DClVP).

Ингибирование эстераз мозга мышей при внутрибрюшинном введении ФОС

Результаты ингибирования эстераз мозга мышей in vivo соединениями diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP представлены на Рисунке 3.5.-1. diEt-PFP в исследуемом интервале доз, практически не ингибирует НТЭ, слабо ингибирует АХЭ (26 %-ное ингибирование) и тормозит активность БХЭ на 50% (Рис 3.5.-1А). diBu-PFP (Рис. 3.5.-1Б) и diPr-DClVP (Рис. 3.5.-1В) в указанных выше интервалах доз ингибируют АХЭ, БХЭ и НТЭ в мозге мышей дозо зависимым образом.

Из полученных дозозависимостей определены величины ED50, мг/кг, для diBu-PFP и diPr-DClVP, для diEt-PFP указан % ингибирования каждой эстеразы при введении максимальной дозы. Ингибиторная селективность соединений in vivo рассчитана в соответствии с уравнением: S(EX/EY) = ED50(EY)/EC50(EX).

Величины ингибиторной селективности для diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей при в/бр введении соединений, и величины ингибиторной селективности, рассчитанные из эстеразного профиля

Таблица 3.5. - 2. Ингибиторная селективность diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей в экспериментах на целом животном в сравнении с данными эстеразного профиля соединений.

соединение	НТЭ/АХЭ	НТЭ/БХЭ	БХЭ /АХЭ
	эстеразный	in vivo	эстеразный	in vivo	эстеразный	in vivo
	профиль		профиль		профиль
diBu-PFP	6.6	4.1	4.4	3.2	29.3	13
diPr-DClVP	3.5	2.1	4.9	1.7	17.25	3.5

Наблюдаются хорошие корреляции между величинами ингибиторной селективности diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз мозга мышей, полученными в эксперименте in vivo, и соответствующими величинами, полученными из анализа эстеразного профиля соединений: для diBu-PFP r = 0.998, p = 0.00425, n = 3; для diPr-DClVP r = 0.882, p = 0.03126, n = 3.

Это касается как потенциальных фармакологических эффектов соединения таких как селективность в отношении БХЭ по сравнению с АХЭ, так и негативных эффектов, в частности, отставленной нейротоксичности (селективность в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ). Так, diBu-PFP, в соответствии с его эстеразным профилем, преимущественно ингибирует БХЭ в мозге мышей по сравнению с АХЭ ( ED50 = 38.45 ± 5.61 и 498.3 ± 41.2 мг/кг, соответственно (Рис. 3.5.-1Б, Табл. 3.5.-1), причем это происходит в дозах, значительно меньших LD50 (>2000 мг/кг). Т.е., соединение могло бы представлять интерес как селективный ингибитор БХЭ мозга in vivo. Однако, в соответствии с величиной отношения ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) = 4.1, diBu-PFP представляет опасность как отставленный нейротоксикант, как предсказывает анализ его эстеразного профиля. Это исключает фармакологическое применение данного соединения.

Для diPr-DClVP эффекты в мозге in vivo также соответствуют его эстеразному профилю: соединение эффективно ингибирует АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга, обладает высоким нейропатичным потенциалом, о чем свидетельствует отношение ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) = 2.1 (Табл. 3.5.-1). Эффективное ингибирование АХЭ мозга (ED50АХЭ = 3.9 ± 0.5 мг/кг) согласуется с его высокой острой токсичностью (LD50 = 15 мг/кг).

Проведенный эксперимент демонстрирует хорошее соответствие ингибиторной активности и селективности diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ мозга мышей при однократном в/бр введении соединений их биологическим эффектам, предсказанным в результате анализа эстеразного профиля соединений.

Ингибирование эстераз крови мышей при внутрибрюшинном введении ФОС

Кровь является наиболее подходящей для исследований тканью организма в плане ее доступности и информативности (в силу наличия активности всех исследуемых эстераз).

На данном этапе мы исследовали изменение активности АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в крови мышей через 1 час после однократного в/бр введения возрастающих доз соединений diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP, которые, как упоминалость выше, имеют различный эстеразный профиль, разную острую токсичность и разный нейропатичный потенциал.

Соединение diBu-PFP (Рис. 3.5.-2Б) ингибирует АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в крови дозозависимым образом, при этом проявляет более высокую ингибиторную активность в отношении всех четырех эстераз крови по сравнению с diEt-PFP, что согласуется с различиями в эстеразных профилях данных соединений. Наблюдается более сильное ингибирование БХЭ и особенно КЭ по сравнению с АХЭ и НТЭ.

diPr-DClVP (Рис. 3.5.-2В) демонстрирует дозозависимое ингибирование всех исследуемых эстераз крови при в/бр введении и наибольшую ингибиторную эффективность в отношении всех эстераз по сравнению с diBu-PFP и diEt-PFP. Соединение наиболее эффективно ингибирует КЭ крови.

Из полученных дозозависимостей определены величины ED50, мг/кг, для ингибирования эстераз крови всеми соединениями.

Таблица 3.5. - 3. Эффективность ингибирования (ED50, мг/кг) эстераз крови мышей через 1 час после в/бр введения соединений diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP.

соединение		ED50, мг/кг
	АХЭ	НТЭ	БХЭ	КЭ
diEt-PFP	>200	-	46.8 ± 1.5	25.0 ± 1.0
diBu-PFP	154 ± 5	36.3 ± 3.6	25.1 ± 3.6	3.1 ± 0.3
diPr-DClVP	4.0 ± 0.2	2.0 ± 0.1	1.58 ± 0.11	< 0.3

Из Таблицы 3.5.-3 видно, что эффективность ингибирования эстераз крови мышей исследуемыми соединениями на уровне целого организма (величины ED50) располагается в ряду: diEt-PFP < diBu-PFP << diPr-DClVP, что соответствует эстеразным профилям соединений. В соответствии с эстеразным профилем находится и ряд чувствительности эстераз крови к каждому соединению: для diEt-PFP: НТЭ << АХЭ < БХЭ < КЭ; для diBu -PFP и diPr-DClVP: АХЭ < НТЭ ? БХЭ < КЭ (Рис. 3.5.-2).

Ингибиторная селективность соединений in vivo рассчитана в соответствии с уравнением S(EX/EY) = ED50(EY)/EC50(EX)., для сравнения приведены также величины ингибиторной селективности соединений, полученные при анализе их эстеразного профиля.

Результаты показывают, что в эксперименте на целом животном diBu-PFP и diPr-DClVP проявляют наибольшую селективность в отношении КЭ по сравнению с АХЭ, селективность БХЭ/АХЭ ниже, что хорошо согласуется с результатами анализа эстеразного профиля данных соединений. Также наблюдается выраженная селективность соединений в отношении КЭ по сравнению с НТЭ, соответствующая результатам in vitro.

Ингибиторная селективность diPr-DClVP и diBu-PFP в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ в крови, ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ), подтверждает нейропатичную опасность соединений, предсказанную при анализе их эстеразного профиля, и соответствует величинам RIP (Табл. 3.5.-4).

diEt-PFP при в/бр введении проявляет слабую ингибиторную активность по отношению к АХЭ и особенно НТЭ в крови (Табл. 3.5.-3), что подтверждает его безопасность в плане развития отставленной нейропатии и соответствует низким величинам RIP = 0.07.

Наблюдаются хорошие корреляции между величинами ингибиторной селективности diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышей, полученными в эксперименте in vivo, и величинами ингибиторной селективности, полученными из анализа эстеразного профиля соединений.

Вклад эстераз-скэвенджеров в формирование токсических эффектов ФОС

На основании результатов, полученных в предыдущем эксперименте, мы оценили вклад эстераз-скэвенджеров, БХЭ и КЭ, в формирование острой и отставленной нейротоксичности при в/бр введении мышам diBu-PFP и diEt-PFP, которые отличаются степенью гидрофобности алкильных радикалов.

Для гидрофобного diBu-PFP наблюдаются высокие величины селективности в отношении эстераз-скэвенджеров по сравнению с АХЭ in vivo: ED50(КЭ)/ED50(АХЭ) = 49.7 и ED50(БХЭ)/ED50(АХЭ) = 6.1, что свидетельствует о высоком защитном эффекте эстераз-скэвенджеров в отношении формирования острой токсичности и хорошо согласуется с низкой острой токсичностью соединения (LD50 > 2000 мг/кг).

При этом ингибиторная селективность diBu-PFP в отношении КЭ и БХЭ по сравнению с НТЭ, т .е. защитный эффект от ОНТФОС, существенно ниже: ED50(КЭ)/ED50(НТЭ) = 11.7 и ED50(БХЭ)/ED50(НТЭ) = 1.44. Учитывая высокий нейропатичный потенциал diBu-PFP, можно ожидать высокой вероятности развития ОНТФОС при отравлении этим соединением.

Для менее гидрофобного diEt-PFP величины селективности in vivo в отношении эстераз-скэвенджеров по сравнению с АХЭ ниже, чем для diBu-PFP: ED50(КЭ)/ED50(АХЭ) > 8 и ED 50(БХЭ)/ED50(АХЭ) > 4. Это свидетельствует о более низком защитном эффекте эстераз-скэвенджеров в отношении формирования острой токсичности в случае diEt-PFP, что отражается на величине LD50 (200 мг/кг). Острая токсичность diEt-PFP значительно выше, чем у diBu-PFP (LD50 > 2000 мг/кг), несмотря на его существенно более низкую анти-АХЭ активность в сравнении с diBu-PFP: ki=(1.80±0.11)Ч103 и (8.44±0.34)Ч104 M-1мин-1 соответственно (по данным эстеразного профиля,

Отсутствие ингибирования НТЭ in vivo, характеризующее diEt-PFP как безопасное соединение с точки зрения ОНТФОС, может быть связано как с довольно низкой собственной анти-НТЭ активностью diEt-PFP in vitro: ki = (1.31 ± 0.08)Ч102 M-1мин-1 (Табл. 3.1.-7.), так и с высоким защитным эффектом эстераз-скэвенджеров, обусловленным высокой ингибиторной селективностью соединения в отношении БХЭ и особенно КЭ и in vitro: ki (БХЭ)/ki (НТЭ)=34.6, ki(КЭ)/ki(НТЭ)=779 (Табл. 3.1.-7), а также довольно высокой ингибиторной активностью соединения в отношении БХЭ и КЭ in vivo: ED50(БХЭ) = 46.8 ± 1.5; ED50(КЭ)= 25.0 ± 1.0 (Табл. 3.5.-3).

Таким образом, результаты эксперимента на целом животном полностью подтверждают высказанную нами гипотезу о различном вкладе эстераз-скэвенджеров - КЭ и БХЭ, в формирование острой и отставленной нейротоксичности ФОС при увеличении гидрофобности соединения, сделанныена основании анализа эстеразного профиля. А именно: для более гидрофобного diBu-PFP наблюдается выраженный защитный эффект КЭ и БХЭ в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении развития ОНТФОС; в то время как для менее гидрофобного diEt-PFP наоборот: защитный эффект эстераз-скэвенджеров выше в отношении ОНТФОС по сравнению с острой токсичностью.

Селективные ингибиторы КЭ плазмы крови мышей

Известно, что карбоксилэстеразы являются детерминантой в фармакокинетике большинства терапевтических средств, содержащих сложноэфирную или амидную группировку.

Литературные данные и полученные нами результаты, показывают, что для грызунов свойственна высокая активность КЭ плазмы (ES1), в то время как у человека активность КЭ в плазме практически отсутствует [173], что осложняет экстраполяцию результатов с животных на человека при доклинических, в том числе фармакокинетических исследованиях потенциальных лекарственных средств, содержащих сложноэфирные или амидные группы, а также при токсикологических исследованиях. Это обусловливает потребность в селективных ингибиторах КЭ для проведения исследований на плазме мышей и на целом животном. В последнем случае ингибиторы КЭ плазмы мышей должны также обладать низкой острой токсичностью.

Основываясь на результатах экспериментов, проведенных в настоящей работе, мы оценили возможность использования diBu-PFP и diEt-PFP в качестве селективных ингибиторов КЭ плазмы мышей в исследованиях на препаратах крови in vitro и на уровне целого организма.

Использование diEt-PFP в концентрации 1Ч10-5 М и diBu-PFP в концентрации 1Ч10-7 М позволяет селективно ингибировать КЭ в крови мышей, не затрагивая существенно активности АХЭ и БХЭ.

Мы также исследовали длительность ингибирования КЭ в препаратах крови мышей после инкубации с более эффективным ингибитором КЭ - diBu-PFP, в концентрации 1Ч10-7 М.

Таким образом, diBu-PFP эффективно избирательно и длительно ингибирует КЭ плазмы мышей in vitro, что позволяет рассматривать его как инструмент для стабилизации потенциальных лекарственных соединений, содержащих сложноэфирные группы, в фармакокинетических исследованиях на грызунах in vitro.

Полученные результаты позволяют рассматривать diBu-PFP и в меньшей степени diEt-PFP как эффективные и селективные ингибиторы КЭ в препаратах крови мышей in vitro.

Результаты экспериментов на целом животном (анализ дозозависимостей ингибирования эстераз крови мышей через 1 час после однократного в/бр введения возрастающих доз diEt-PFP и diBu-PFP, Глава 3.5.2) показывает, что diEt-PFP (Рис. 3.5.-2А) в дозе 45 мг/кг (0.22 LD50) эффективно (на 80%) ингибирует КЭ, не затрагивает активность АХЭ, при этом он также снижает активность БХЭ на 50%.

В случае diBu-PFP (Рис. 3.5.-2Б) полное ингибирование КЭ достигается при дозе 10 мг/кг (< 0.004 LD50), в то время как активность БХЭ снижается незначительно, изменений активности АХЭ при этой дозе не наблюдается.

Следует отметить, что отношение LD50/ED50(КЭ) - терапевтический индекс соединения, для diBu-PFP составляет 800 Т.е. эффект ингибирования КЭ проявляется в дозах, значительно меньших LD 50. Для diEt-PFP этот показател равен 8.

Наряду с высокой ингибиторной активностью и селективностью в отношении КЭ и низкой острой токсичностью, diBu-PFP, как было нами показано ранее (Глава 3.5.1.) является нейропатичным соединением (ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) = 4.1). Однако полное ингибирование КЭ плазмы достигается при низких дозах diBu-PFP (10 мг/кг), не влияющих на активность НТЭ мозга (ED50(НТЭ) = 127.3 мг/кг), что позволяет рассматривать diBu-PFP в качестве эффективного селективного малотоксичного ингибитора КЭ плазмы крови мышей in vivo в указанных дозах. Анализ полученных результатов показал, что diBu-PFP является более эффективным и селективным ингибитором КЭ плазмы мышей, чем diEt-PFP. Использование diBu-PFP позволяет уже в малых дозах необратимо ингибировать КЭ плазмы крови мышей, не затрагивая активности остальных эстераз, при этом данное соединение обладает низкой острой токсичностью (LD50 >2000 мг/кг) и высоким терапевтическим индексом, что позволяет рассматривать его в качестве нового эффективного ингибитора КЭ плазмы крови мышей in vitro и in vivo при исследовании на грызунах фармакологически активных веществ, содержащих гидролитически нестабильные сложноэфирные или амидные группы.

Таким образом, ингибиторная активность и селективность diEt-PFP и diBu-PFP в отношении КЭ, предсказанная при анализе эстеразного профиля данных соединений, проявляется на уровне целого организма. На примере данных соединений, показано, что анализ эстеразного профиля позволяет прогнозировать биологические эффекты соединений и их потенциальную применимость в качестве фармакологических агентов, а также их потенциальные нежелательные (побочные) эффекты.

Проведенные эксперименты показали, что анализ эстеразного профиля фосфорорганических соединений, т.е. их ингибиторная активность и селективность в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ, определяемые в экспериментах in vitro (на ферментных препаратах), позволяет прогнозировать эффекты данных соединений на уровне тканей и целого организма (ингибиторную активность и селективность соединений в отношении эстераз мозга и крови) и дает информацию о механизмах формирования токсичности ФОС, включая защитную роль эстераз-скэвенджеров.

ВЫВОДЫ

Получен и проанализирован эстеразный профиль O- фосфорилированных этилтрифторлактатов (TFL). Показано линейное возрастание нейропатичного потенциала соединений с увеличением гидрофобности молекулы и различная роль эстераз-скэвенджеров БХЭ и КЭ в формировании острой и отставленной нейротоксичности соединений.

2. Выдвинуто предположение о том, что эстеразный профиль антихолинэстеразного соединения в значительной степени определяет его эффекты в мозге и крови in vitro и на уровне целого организма. Проверку гипотезы проводили с использованием этильного и бутильного аналогов О-фосфорилированных гексафторизопропанолов (PFP), которые имеют сходные с TFL закономерности структура-ингибиторная активность/селективность при более выраженных биологических эффектах.

Разработаны методы определения активности АХЭ, БХЭ, НТЭ, КЭ и PON1 в цельной крови и охарактеризован «эстеразный статус» человека и лабораторных животных (мышей и крыс). Установлено, что в крови человека значимыми являются активности холинэстераз (АХЭ и БХЭ), активность КЭ незначительна, тогда как грызуны имеют высокую активность КЭ. Для всех видов показана высокая активность параоксоназы и низкая активность НТЭ.

Показано, что НТЭ мозга мышей является достоверным биохимическим маркером воздействия ФОС, вызывающих отставленную нейротоксичность. Разработана модель для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС, основанная на сравнительной оценке ингибирования НТЭ и АХЭ в мозге мышей, как в экспериментах in vitro, так и in vivo при внутрибрюшинном введении.

Установлено, что НТЭ крови мышей является биомаркером отравления нейропатичными ФОС. Впервые показано, что одновременное определение активности АХЭ и НТЭ в крови позволяет дифференцировать воздействие острых и отставленных нейротоксичных агентов.

В экспериментах in vitro на тканях (препаратах мозга и крови мышей) показано, что ингибиторная активность и селективность О-фосфорилированных гексафторизопропанолов в отношении АХЭ, БХЭ, НТЭ и КЭ мозга и крови соответствуют эстеразному профилю соединений, за исключением КЭ мозга - тканеспецифичной изоформы фермента.

В экспериментах in vivo при внутрибрюшинном введении исследуемых ФОС показано, что ингибиторная активность и селективность соединений в отношении эстераз мозга и крови соответствуют их эстеразному профилю. Продемонстрирована различная роль эстераз-скэвенджеров в формировании острой и отставленной нейротоксичности ФОС.

Найден новый эффективный и селективный ингибитор карбоксилэстеразы плазмы крови мышей, обладающий низкой острой токсичностью.

Результаты работы показывают, что концепция эстеразного профиля антихолинэстеразных соединений позволяет прогнозировать их терапевтические и токсические эффекты и может быть использована в скрининговых исследованиях для поиска эффективных и безопасных лекарственных средств.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Casida J.E., Quistad G.B. Organophosphate toxicology: safety aspects of nonacetylcholinesterase secondary targets // Chem. Res. Toxicol. 2004. V. 17. P. 983-998.

Peeples E.S., Schopfer L.M., Duysen E.G., Spaulding R., Voelker T., Thompson C.M., Lockridge O. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry // Toxicol. Sci. 2005. V. 83. P. 303-312.

Tarhoni M.H., Lister T., Ray D.E., Carter W.G. Albumin binding as a potential biomarker of exposure to moderately low levels of organophosphorus pesticides // Biomarkers. 2008. V. 13. P. 343-363.

Massoulie J. Pezzementi L., Bon S., Krejci E., Vallette F.M. Molecular and cellular biology of cholinesterases // Prog. Neurobiol. 1993. V. 41 (1). P. 31- 91.

Matthews G. Neurotransmitter release // Annu. Rev. Neurosci. 1996. V. 19. P. 219-233.

Wiesner J., Kшнћ Z., Kuиa K., Jun D., Koиa J. Acetylcholinesterases - the structural similarities and differences // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2007. V. 22 (4). P. 417-424.

Дудель Й. Физиология человека. / Под ред. Р. Шмидт, Г. Тевс. Москва: Мир, 1996. Т. 1. 323 с.

Lindstrom J. Mutation Causing Muscle Weakness // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95. P. 9070-9071.

Quinn D.M. Acetylcholinesterase: enzyme structure, reaction dynamics, and virtual transition states // Chem. Rev. 1987. V. 87. P. 955-979.

Nair H.K., Seravalli J., Arbuckle T., Quinn D.M. Molecular recognition in acetylcholinesterase catalysis: Free-energy correlations for substrate turnover and inhibition by trifluoro ketone transition-state analogs // Biochemistry.Rosenberry T.L. Acetylcholinesterase // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1975. V. 43. P. 103-218.

Plageman L.R., Pauletti G.M., Skau K.A. Characterization of acetylcholinesterase in Caco-2 cells. // Exp. Biol. Med. 2002. V. 227 (7). P. 480-486.

Wessler I., Kirkpatrick C.J. Acetylcholine beyond neurons: the non-neuronal cholinergic system in humans // Br. J. Pharmacol. 2008. V. 154. P. 1558-1571.

Momonoki Y.S. Occurrence of acetylcholine-hydrolyzing activity at the stele-cortex interface // Plant Physiol. 1992. V. 99 (1). P. 130-133.

Sagane Y., Nakagawa T., Yamamoto K., Michikawa S., Oguri S., Momonoki Y.S. Molecular characterization of maize acetylcholinesterase. A novel enzyme family in the plant kingdom // Plant Physiol. 2005. V. 138 (3). P. 1359-1371.

Shapira M., Tur-Kaspa I., Bosgraaf L., Livni N., Grant A.D., Grisaru D., Korner M., Ebstein R.P., Soreq H. A transcription-activating polymorphism in the ACHE promoter associated with acute sensitivity to anti-acetylcholinesterases // Hum. Mol. Genet. 2000. V. 9 (9). P. 1273-1281.

Brenner T., Harma-Amitay Y., Evron T., Boneva N., Seidman S., Soreq H. The role of readthrough acetylcholinesterase in the pathophysiology of myasthenia gravis // The FASEB J. 2003. V. 17. P. 214-222.

Hasin Y., Avidan N., Bercovich D., Korczyn A., Silman I., Beckmann J. S., Sussman J. L. A paradigm for single nucleotide polymorphism analysis: the case of the acetylcholinesterase gene // Hum. Mutat. 2004. V. 24 (5). P. 408- 416.

Bartels C.F., Zelinski T., Lockridge O. Mutation at codon 322 in the human acetylcholinesterase (ACHE) gene accounts for YT blood group polymorphism // Am. J. Hum. Genet. 1993. V. 52. P. 928-936.

Wurzel H.A., Haesler W.E. The Yt blood groups in American negroes // Vox Sang. 1968. V. 15 (4). P. 304-305.

Masson P., Froment M.-T., Sorenson R.C., Bartels C.F., Lockridge O. Mutation His322Asn in human acetylcholinesterase does not alter electrophoretic and catalytic properties of the erythrocyte enzyme // Blood. 1994. V. 83(10). P. 3003-3005.

Giles C.M., Metaxas-Buhler M., Romanski Y., Metaxas M.N. Studies on the Yt blood group system // Vox Sanguinis. 1967. V. 13. P. 171-180.

Duysen E.G., Stribley J.A., Fry D.L., Hinrichs S.H., Lockridge O. Rescue of the acetylcholinesterase knockout mouse by feeding a liquid diet; phenotype of the adult acetylcholinesterase deficient mouse // Brain Res. Dev. Brain Res. 2002. V. 137 (1). P. 43-54.

Duysen E.G., Li B., Xie W., Schopfer L.M., Anderson R.S., Broomfield C.A., Lockridge O. Evidence for nonacetylcholinesterase targets of organophosphorus nerve agents: supersensitivity of acetylcholinesterase knockout mouse to VX lethality // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. V. 299. P. 528-535.

Lockridge O., Duysen E.G., Voelker T., Thompson C.M., Schopfer L.M. Life without acetylcholinesterase: the implications of cholinesterase inhibition toxicity in AChE-knockout mice // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2005. V. 19. P. 463-469.

Getman D.K., Eubanks J.H., Camp S., Evans G.A., Taylor P. The human gene encoding acetylcholinesterase is located on the long arm of chromosome 7 // Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. P. 170-177.

Hasin Y., Avidan N., Bercovich D., Korczyn A.D., Silman I., Beckmann J.S., Sussman J.L. Analysis of genetic polymorphisms in acetylcholinesterase as reflected in different populations // Curr. Alzheimer Res. 2005. V. 2. P. 207-218.

Rachinsky T.L., Camp S., Li Y., Ekstrom T. J., Newton M., Taylor P. Molecular cloning of mouse acetylcholinesterase: tissue distribution of alternatively spliced mRNA species // Neuron. 1990. V. 5 (3). P. 317-327.

Sussman J.L., Harel M., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., Silman I. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein // Science. 1991. V. 253. P. 872-879.

Bourne Y., Taylor P., Marchot P. Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin: crystal structure of the complex // Cell. 1995. V. 83 (3). P. 503-512.

Saxena A., Redman A.M., Jiang X., Lockridge O., Doctor B.P. Differences in active site gorge dimensions of cholinesterases revealed by binding of inhibitors to human butyrylcholinesterase // Biochemistry. 1997. V. 36 (48). P. 14642-14651.

...