Исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений

Исследования фармакологически важных препаратов, в том числе доклинические испытания, также проводятся на грызунах. Препараты со сложноэфирными или амидными группировками быстро гидролизуются в плазме грызунов под действием КЭ плазмы, что снижает их эффективную концентрацию и создает определенные затруднения как при изучении фармакологических свойств новых соединений, так и при токсикологических исследованиях. Это также осложняет экстраполяцию результатов, полученных в экспериментах на грызунах, на человека [361, 365]. В связи с этим весьма актуальным является поиск соединений, которые могли бы селективно и длительно ингибировать КЭ плазмы грызунов in vitro и in vivo. Применение таких ингибиторов позволит создать адекватную модель на грызунах для доклинических исследований соединений, подвергающихся карбоксил-эстеразному гидролизу [365].

Биологическая роль КЭ

КЭ относятся к ферментам первой фазы метаболизма ксенобиотиков: гидролизуют разнообразные липофильные химические соединения, содержащие сложноэфирную и амидную связь, до соответствующих водорастворимых свободных кислот и спиртов или аминов, тем самым, способствуя их элиминированию [320, 366, 367].

Роль КЭ в метаболизме лекарственных препаратов

Поскольку сложноэфирные производные многих терапевтических агентов используются в качестве пролекарств, с медицинской точки зрения КЭ являются основными факторами, определяющими фармакокинетику и фармакодинамику большинства подобных соединений, превращая их в активные лекарственные формы [319, 368].

Генетический полиморфизм, различные заболевания, лекарственные взаимодействия и ксенобиотики могут быть причиной изменения активности КЭ у индивидуума, меняя, таким образом, терапевтическую эффективность лекарственных препаратов - субстратов КЭ [351, 368-370].

КЭ1 активируют такие пролекарства как ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (темокаприл, цилазаприл, квинаприла и имидаприла) [351, 371, 372]. Перспективные противоопухолевые препараты иринотекан (CPT-11, Irinotecan) и капецитабин активируются в организме в основном под дейстием КЭ2.

КЭ гидролизуют наркотики (кокаин, героин) [181, 378, 379] и препараты, действующие на ЦНС (метилфенидат, меперидин (петидин), флумазенил и др.) [380, 381], а также антиагреганты (клопидогрел, дабигатрана этексилат, аспирин и др), статины (симвастатин, ловастатин, клофибрат и др), противовирусные средства (осельтамивир - Тамифлю), тенофовир дизопроксил, валацикловир и др.), иммунодепрессанты (метилпреднизолон сукцинат) [368].

Таким образом, активность КЭ является важным параметром в фармакокинетике большинства терапевтических средств, содержащих сложноэфирную или амидную группировку, причем конструирование многих новых лекарств идет с учетом их метаболической активации или инактивации за счет карбоксилэстеразного гидролиза [382]. В связи с этим, ингибиторы КЭ, влияющие на скорость гидролиза подобных лекарственных препаратов, и таким образом определяющие скорость превращения пролекарства в действующее лекарство или, наоборот, увеличивающие полупериод жизни активного препарата, гидролизующегося КЭ, имеют важное терапевтическое значение.

Селективные ингибиторы КЭ востребованы также в качестве вспомогательного инструмента в доклинических исследованиях на грызунах новых фармакологических препаратов со сложноэфирными и амидными группировками, поскольку грызуны в отличие от человека имеют высокую активность КЭ плазмы [361, 365, 385, 386].

Роль КЭ в метаболизме липидов

Помимо основной роли КЭ в метаболизме ксенобиотиков недавние исследования выявили ее роль в метаболизме липидов [387-389]. Показано, что КЭ1 человека и ее мышиный ортолог Ces3 отвечают за мобилизацию цитозольного пула триглицеридов (ТГ) и их последующую сборку в липопротеины очень низкой плотности, которые впоследствии выходят из гепатоцитов в кровоток [390]. Кроме того, КЭ частично контролирует липолиз ТГ в жировой ткани мышей [391]. отсутствие такой регуляции приводит к высокому уровню жирных кислот в крови, липотоксичности и к клиническим проявлениям сахарного диабета. Гидролазная активность КЭ1 в отношении эфиров холестерина может предотвращать их накапливание в макрофагах человека и таким образом снижать риск развития атеросклероза и метаболического синдрома [392, 393].

Взаимодействие с ФОС: роль КЭ как биоскэвенджера и биомаркера воздействия ФОС

Одна из важнейших биологических функций КЭ - участие в детоксикации фосфорорганических соединений. Рассматривают два основных механизма защитного действия этих ферментов. Первый - это гидролиз карбоксиэфирной связи в тех ФОС, где она присутствует - это показано, например для малатиона [394], ацетиона и ряда других соединений [395]. Второй, более общий механизм, это ингибирование КЭ фосфорорганическими соединениями, приводящее к снижению концентрации антихолинэстеразного агента в циркулирующей крови и, соответственно, к меньшей степени ингибирования АХЭ и НТЭ в тканях-мишенях [396]. Таким образом, КЭ играет роль стехиометрической ловушки - скэвенджера, подобно БХЭ. Показано, что фосфорилированная КЭ плазмы в отличие от БХЭ подвергается быстрой спонтанной реактивации с образованием нетоксичных и неактивных метаболитов ФОС [365]. КЭ1 способна восстанавливать свою активность даже после ингибирования зарином [95]. Эти факты позволяют рассматривать КЭ1 в качестве эффективного биологического скэвенджера, который бы мог служить в качестве профилактического средства при отравлениях ФОС [95], а также для детоксикации оборудования и строений после воздействия ФОС [397].

Однако, в крови и плазме человека уровень активности КЭ чрезвычайно низок в противоположность стандартным лабораторным животным (мышам, крысам, кроликам), которые имеют высокий уровень КЭ в плазме. Это предполагает незначительную роль КЭ крови человека в качестве ФОС-скэвенждера, и соответственно низкую роль КЭ крови человека в качестве биомаркера, в противоположность КЭ крови грызунов и других животных. Данный факт необходимо учитывать при токсикологических исследованиях, проводимых на животных моделях.

КЭ гидролизуют и таким образом детоксицируют пиретроидные пестициды. Высокая активность КЭ насекомых - одна из причин их устойчивости к фосфорорганическим инсектицидам и снижения эффективности пиретроидов. Совместное применение ингибиторов КЭ позволяет преодолеть резистентность и усилить инсектицидное действие как фосфорорганических, так и пиретроидных инсектицидов [398].

Таким образом, токсичность и терапевтический эффект целого спектра соединений зависят от активности КЭ. В связи с этим оценка уровня активности КЭ очень важна при использовании лекарственных препаратов, содержащих сложноэфирные группировки, перспективной антираковой терапии, а также для защиты организма от токсического действия ФОС.

1.5 Параоксоназа

Другой важной группой эстераз являются параоксоназы (PON). PON широко распространены у млекопитающих, включая человека. PON-подобные белки обнаружены у различных классов организмов, включая бактерии и грибы, что говорит о филогенетической древности этой группы ферментов. PON не относятся к классу сериновых эстераз, каталитический центр PON содержит «гистидиновую диаду», в отличие от АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ, имеющих высококонсервативную каталитическую триаду, в состав которой входит активный остаток серина.

Параоксоназы относятся к классу А-эстераз: ФОС не ингибируют данные ферменты, а являются их субстратами, в отличие от B-эстераз (АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ), которые являются мишенями ФОС [69].

Локализация и субстратная специфичность PON

Параоксоназы человека разделены на три подсемейства (PON1, PON2 и PON3), гены которых картированы на длинном плече хромосомы 7 человека в локусе 7q21.3, рядом с геном АХЭ (7q22). Аминокислотные последовательности изоформ идентичны на 60-70% [399].

PON1 имеет два номера по классификации ферментов, поскольку гидролизует нитрофенилацетат (арилэстераза, КФ 3.1.1.2) и триэфир фосфорной кислоты - параоксон (арилдиалкилфосфатаза, фосфотриэстераза, органофосфатгидролаза, КФ 3.1.8.1).

У млекопитающих все три гена PON высоко консервативны и демонстрируют 79-95% идентичности на аминокислотном уровне и 81-95% на уровне нуклеотидов для различных генов [399, 400], что говорит об их важной физиологической роли.

PON1 изначально была идентифицирована как фермент, способный гидролизовать параоксон, первый и один из наиболее изученных субстратов. Впоследствии это название закрепилось за всем семейством ферментов. Однако только PON1 обладает значительной параоксоназной активностью, PON3 имеет очень низкую параоксоназную активность, а PON2 не обладает ею вообще [401], при этом все три изоформы обладают в той или иной степени арилэстеразной и лактоназной активностью. Название фермента дает ошибочное представление, будто параоксон является лучшим субстратом для фермента, на самом деле PON1 гидролизует фенилацетат (наилучший известный субстрат PON1) в 1000 раз быстрее, чем параоксон [402].

Все три изофермента PON1 обладают лактоназной активностью и участвуют в гидролизе некоторых общих субстратов - ароматических лактонов, но также обладают и собственной субстратной специфичностью. Все три параоксоназы очень эффективно взаимодействуют с производными арахидоновой и докосагексаеновой кислот, являющимися эндогенными субстратами ферментов семейства PON [403].

работе активность PON1 была исследована с использованием более 50 субстратов, принадлежащих к трем различным классам: сложные эфиры, фосфотриэфиры и лактоны. Полученные результаты подтверждают, что PON1 является скорее лактоназой, чем эстеразой или фосфотриэстеразой. Являясь ферментом с широкой субстратной специфичностью [404, 405], PON1 выполняет разнообразные биологические функции, что более подробно обсуждается ниже.

PON1 главным образом экспрессируется в печени и секретируется в кровь, в плазме крови она прочно связана с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП). Показано, что ферментативная активность и стабильность молекулы PON1 зависят от связи фермента с частицами ЛПВП.

Концентрация белка PON1 в плазме человека составляет примерно 60 мг/л

Очень высокий уровень активности параоксоназы присутствует в печени и плазме крови грызунов, причем в плазме содержится более 50% всей параоксоназы.

Структура PON1

PON1 имеет молекулярную массу 43 кДа и состоит из 353 аминокислотных остатков. Остатки Cys42 и Cys353 образуют дисульфидный мостик, который связывает N- и C-концевые области молекулы, свободный Cys284 необходим для проявления лактоназной активности фермента, но не участвует в арилэстеразном и параоксоназном гидролизе [412], [413].

Кристаллическая структура PON1 представлена шестью в-слоями, организованными в виде пропеллера (Рис. 1.5.-1). В центральной части молекулы имеется канал, внутри которого располагается активный центр. Помимо в-складок, в молекуле имеется три б-спиральных домена, два из которых ограничивают вход в центральный канал и играют роль своеобразного якоря для закрепления молекулы фермента на поверхности частиц ЛПВП PON1 является Ca2+- зависимой гидролазой: внутри центрального канала фермента располагаются два иона Ca2+, один из которых участвует в стабилизации структуры белка, другой необходим для каталитической функции PON1. ЭДТА полностью ингибирует активность фермента [410]. Ион кальция необходим как для гидролиза лактонов, так и для параоксоназной и арилэстеразной активностей PON1 [414]. Необходимость именно Ca2+ доказывалась его заменой на ионы цинка или магния: ферментативная активность со всеми субстратами сильно снижалась в присутствии Zn2+ и Mg2+ (приблизительно в 10-100 раз.

В активном центре фермента располагается «гистидиновая диада» - сопряженный комплекс остатков His115 и His134, участвующих в эстеразном и лактоназном гидролизе, но не в фосфотриэстеразной активности [415]. Структура активного центра указывает на общеосновный механизм катализа: His115 депротонирует молекулу воды, образующийся гидроксильный радикал атакует молекулу субстрата и вызывает ее гидролиз. His134 является донором протона, повышая основность His115. «Каталитический» ион Ca2+ стабилизирует образующийся отрицательно заряженный интермедиат. Ацил-ферментный комплекс в процессе гидролиза, по всей видимости, не образуется [416]. Аминокислотные остатки, обусловливающие фосфотриэстеразную активность и эстеразную/лактоназную активность PON1 находятся в разных областях активного центра [415, 416].

Физиологическая функция PON1

Физиологической функцией PON1 предположительно является гидролиз гомоцистеин-тиолактонов, что предотвращает гомоцистеинилирование белков и предупреждает развитие атеросклероза [417, 418]. PON1 гидролизует и другие эндогенные лактоны, например, лактон гомогентизиновой кислоты, промежуточный продукт распада циклических аминокислот - фенилаланина и тирозина [413].

Как уже отмечалось, PON1 синтезируется главным образом в печени и секретируется в кровь, где она связывается с ЛПВП. Одной из естественных физиологических функций PON1 является метаболизм токсичных окисленных липидов и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), а также ЛПВП, что снижает риск развития атеросклероза [419-424].

Активность PON1 понижена при ряде патологий, ассоциированных с атеросклерозом. Наблюдается обратная зависимость между уровнем активности PON1 и риском развития сердечно-сосудистых заболеваний [413, 425, 426], что свидетельствует о важном клиническом значении этого фермента

[421, 427].

PON1 способна также гидролизовать фактор активации тромбоцитов (PAF), что значительно снижает тромбообразование и хемотаксис лейкоцитов.

Роль PON1 в метаболизме лекарственных средств

PON1 играет важную роль в гидролитическом метаболизме некоторых лекарственных препаратов, содержащих сложноэфирную и лактоновую группировку [403]. Так, PON1 гидролизует ловастатин, используемый для контроля уровня холестерина. [413].

Ингаляционная терапия кортикостероидами для лечении астмы предполагает устойчивость данных препаратов в легких, но при этом их быструю инактивацию при попадании в кровь во избежание побочных эффектов. Было показано, что именно лактоны, но не эфиры кортикостероидов обладают должным эффектом [429]. Их инактивация в крови обеспечивается PON1, тогда как в легких PON1 отсутствует.

PON1 и детоксикация ФОС

PON1 играет ключевую роль в детоксикации ряда ФОС, гидролизуя их активные метаболиты (оксоны), что показано в исследованиях на животных моделях [430, 431]. PON1 гидролизует оксоны ряда фосфорорганических инсектицидов (например, параоксон, хлорпирифос-оксон, диазинон-оксон, пиримифос-метилоксон), а также нервно-паралитические боевые отравляющие вещества, такие как зарин, зоман, табун и в меньшей степени VX [410]. Данные, полученные на животных моделях [432, 433], убедительно показали основную роль параоксоназ в детоксикации тионфосфорильных ФОС, метаболизм которых идет по пути Р450 / PON1.

Живые организмы с низким уровнем параоксоназы (например, птицы) более восприимчивы к специфическим фосфорорганическим соединениям, чем животные с высоким уровнем активности этого фермента (например, крысы, мыши и в особенности кролики) [400, 433, 434]. Гидролизуя ФОС, PON1 тем самым нейтрализует их токсическое действие на организм. Однако параоксоназная активность фермента в крови человека относительно невысока имеет значительные индивидуальные различия [435]. Исследуется возможность применения препаратов рекомбинантной PON1 человека (rHuPON1) в качестве каталитического биоскэвенджера при отравлениях ФОС.

Возраст является существенным фактором, определяющим активность PON1. Исследования на грызунах показали, что в печени и сыворотке крови у новорожденных животных наблюдается очень низкий уровень активности PON1, который увеличивается до нормального уровня к 21 дню жизни [437, 438]. Низкий уровень активности параоксоназы у молодых животных частично объясняет наблюдаемую у них более высокую чувствительность к ФОС.

Низкая активность PON1 в процессе вынашивания плода может представлять собой фактор риска повышения восприимчивости к токсическому действию некоторых фосфорорганических инсектицидов. У детей до двух лет наблюдается минимальная активность PON1, и только к 9 годам ее активность достигает уровня активности у взрослых людей сохраняется примерно на постоянном уровне после достижения взрослого состояния [437]. С возрастом наблюдается прогрессирующее снижение активности PON1. Это может быть связано с развитием окислительного стресса при старении, и имеет влияние на повышение риска заболеваемости атеросклерозом у пожилых людей [443]. В связи с пониженным уровнем активности PON1 в детском и пожилом возрасте эти категории людей более восприимчивы к токсическому воздействию ФОС [441].

Генетический полиморфмзм PON1

Определяющее значение имеют два наиболее распространенных полиморфизма в кодирующей области гена: L55M (Leu/Met) и Q192R (Gln/Arg) [444], которые оказывают влияние на каталитическую активность параоксоназы [444-447]. Частота встречаемости Leu55 и Met55 составляет, соответственно, 0.65 и 0.35 в Соединенных Штатах и Европе, тогда как в Японии 0.94 и 0.06, соответственно [448, 449]. Вариант Leu55 имеет более высокую активность в отношении гидролиза фенилацетата, чем Met55 [450]. Замена Gln192Arg (Q192R), определяет различную каталитическую активность PON1 в отношении некоторых фосфорорганических субстратов и повышенную склонность к ишемической болезни сердца и смертности среди женщин во второй половине жизни [451]. Встречаемость Q192 варьирует в диапазоне от для кавказской популяции до 0.3 для некоторых азиатских популяций [452]. Примерно в 98% случаев вариант аллеля R192 связан с вариантом L55. Было показано, что R192-форма белка быстрее гидролизует параоксон, чем Q192-форма, тогда как для зарина, зомана, диазоксона наблюдается обратная катртина.

T-108C представляет собой полиморфизм тимидин/цитозин в промоторной области гена PON1, следствием которого является значительная вариабельность концентрации РON1 [433, 449, 450]. C-108T полиморфизм оказывает наибольший эффект на уровень PON1 в плазме, причем для -108C аллеля уровень активности PON1 в плазме вдвое превышает таковой для -108T аллеля. Эти генетические факторы в значительной мере определяют индивидуальную чувствительность к ФОС, понижая как активность фермента, так и его содержание в крови.

Важность статуса PON1 для оценки восприимчивости организма к токсичным веществам или риска развития сердечно-сосудистых заболеваний указывает и на значимость факторов, влияющих на активность PON1. Хотя генетические факторы, такие как полиморфизм, о котором было сказано ранее, играют главную роль в определении PON1-статуса человека, вклад других факторов в регуляцию деятельности фермента также имеет значение. Так, показана модуляция экспрессии гена PON1 у человека широким спектром соединений: статины, желчные кислоты, этанол [453], полифенолы, флавоноиды, антиоксиданты, ацетилсалициловая кислота. Также оказывают влияние факторы окружающей среды (активные формы кислорода и азота, табачный дым [454], тяжелые металлы). Атерогенная диета и воспалительные процессы также способны влиять на уровень экспресии гена PON1.

Таким образом, в организме PON1 выполняет

защитную функцию при действии антихолинэстеразных соединений, в первую очередь ФОС, гидролизуя потенциальные нейротоксиканты, и является биомаркером чувствительности к ФОС;

обладает антиатерогенной активностью, в составе ЛПВП проявляет антиоксидантные свойства, снижая риск заболеваний сердечно-сосудистой системы;

модулирует метаболизм лекарств, гидролизуя фармакологически значимые соединения, а также детоксицирует широкий спектр ксенобиотиков.

В связи с этим уровень активности PON1 в крови является важным показателем как для предсказания индивидуальной чувствительности к действию ФОС, так и для оценки риска кардиоваскулярных заболеваний, а также при проведении экспериментальных исследований в токсикологии и фармакологии.

Обзор литературных источников показал, что АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и PON1 играют важнейшую роль в организме человека и могут служить индикаторами различных патологических состояний, в том числе и вызванных контактами с токсичными ФОС и карбаматами. Показана важная роль ингибиторов АХЭ, БХЭ и КЭ как фармакологических препаратов. Отмечена значимость анализа активности указанных эстераз для своевременной диагностики и подбора индивидуальной лекарственной терапии в клинической практике и токсикологии.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

(ЭДТА), протеин стандарт (бычий сывороточный альбумин (BSA), хлорид кальция (CaCl2); диметилсульфоксид (DMSO), этопропазин (ЭПр), 1-нафтилацетат (1-NA), 4-нитрофенилацетат (4-NPA), фенилацетат (PhA), эзерин, диэтил-4-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты (параоксон, РО), тетра(моноизопропил)пирофосфотетрамид (iso-OMPA), бис-пара-нитро-фенилфосфат (BNPP) фирмы Sigma-Aldrich (США); 4-аминоантипирин (4-ААП) (Acros organics, Бельгия); фенилвалерат (PhV) и мипафокс (МХ) (Oryza Laboratory Inc., США), цитрат натрия (Merck, Германия).

О-фосфорилированные гексафторизопропанолы (PFP): O,O-диэтил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)фосфат (diEt-PFP) и O,O-дибутил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)фосфат (diBu-PFP); серия O,O-диалкил-O-(1-этоксикарбонил-2,2,2-трифторэтил) фосфатов (O-фосфорилированных этилтрифторлактатов, TFL) и O,O-ди-1-пропил-О-2,2-дихлорвинилфосфат (diPr-DClVP) синтезированы и предоставлены зав. лаб. синтеза физиологически активных веществ ИФАВ РАН к.х.н. Соколовым В.Б. и в.н.с., к.х.н. Аксиненко А.Ю. Синтез diEt-PFP и diBu-PFP проводился по методу, описанному в работах [64, 455, 456], TFL синтезированы по методу, описанному в работе [64, 456].

Все остальные реактивы были марки не ниже Х.Ч. и использовались без предварительнойочистки.Всеводныерастворыготовилисьв бидистиллированной воде.

2.2 Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ фосфорорганическими соединениями

Определение бимолекулярных констант ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми ФОС (ki, М-1мин-1) проводили с использованием коммерческих препаратов ферментов фирмы Sigma-Aldrich (США) - ацетилхолинэстеразы (АХЭ, Е.С. 3.1.1.7) эритроцитов человека (500 Ед/мг, C0663), бутирилхолинэстеразы (БХЭ, Е.С. 3.1.18) сыворотки крови лошади (500 Ед/мг, (C4290)), карбоксилэстеразы (КЭ, E.C. 3.1.1.1.) печени свиньи (150 Ед/мг, (E2884)); и стабильного лиофилизованного препарата НТЭ мозга кур (ЛиоНТЭ), полученного по методике, разработанной в нашей лаборатории и детально описанной в работах [457, 458]. ЛиоНТЭ - это мембранная (Р2 + Р3) фракция гомогената головного мозга кур, предварительно обработанная параоксоном (40 мкМ, 40 мин), которая представляет собой параоксон-резистентную эстеразную активность мозга.

Для кинетических исследований использовали 3-4 концентрации ингибитора (~ 0.5Ч IC50, М; 1ЧIC50, М и 2ЧIC50, М) и для каждой концентрации 4-5 различных интервалов времени инкубации. Ферменты инкубировали с исследуемыми соединениями в соответствующем рабочем буфере в условиях [I]0>>[E]0 при 25°C для АХЭ, БХЭ, КЭ и при 37°C для НТЭ. Конечная концентрация растворителя (ацетон) составляла не более 1% об/об. В отдельных экспериментах нами было показано, что в данной концентрации ацетон не оказывает значимого влияния на активность ферментов. Запасные растворы ингибиторов готовили непосредственно перед проведением экспериментов. Контрольные пробы содержали соответствующий объем растворителя без ингибитора.

Остаточную активность АХЭ и БХЭ определяли методом Эллмана [459] с 1 мM ацетилтиохолином (АТХ) и 1 мM бутирилтиохолином (БТХ) в качестве субстратов, соответственно, в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 7.5 при 25oC, л=412 нм, (?412 = 14150 M-1 cm-1) в присутствии 0.33 мМ ДТНБ.

Активность КЭ определяли с использованием 1 мM 4-NPA в качестве субстрата в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 8.0 при 25o, л=405 нм (?405 = 13300 M-1cm-1).

Активность НТЭ определяли как разность между параоксон-резистентной (ЛиоНТЭ) и (параоксон+мипафокс)-резистентной (ЛиоНТЭ + мипафокс 250 мкМ, 20 мин) эстеразной активностью в соответствии с дифференциальным методом Johnson M.K. (1977) [250]. Реакцию проводили в 50 мМ трис-HCl буфере рН 8.0 с 0.2 мМ ЭДТА при 37°C, субстрат - 1.4 мМ фенилвалерат. Выделяющийся в результате реакции фенол определяли при л = 510 нм (?510 = 13900 M-1 min-1). Измерения проводили на микропланшетном спектрофотометре

Bio-Rad Benchmark Plus (France) в 96-и луночных планшетах.

Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ и КЭ

Контрольная проба без ингибитора содержала 10 мкл 5% раствора ацетона в соответствующем рабочем буфере и 40 мкл раствора фермента в буфере.

Опытная проба содержала 10 мкл раствора ингибитора определенной концентрации и 40 мкл раствора соответствующего фермента. Реакцию ингибирования начинали внесением фермента. Реакционную смесь инкубировали при 25°C в течение 1, 2, 4, 6 мин для максимальной концентрации ингибитора; в течение 2, 4, 6, 8 мин для средней концентрации и в течение 3, 6, 9, 12 мин для минимальной концентрации ингибитора. Реакцию ингибирования АХЭ и БХЭ останавливали внесением 1.25 мМ раствора субстрата (АТХ и БТХ соответственно) в рабочем буфере, содержащем 0.33 мМ ДТНБ (общий объем вносимого раствора 200 мкл). Реакцию ингибирования КЭ останавливали внесением 1.25 мМ раствора субстрата (4-NPA) в 200 мкл рабочего буфера. Суммарный объем реакционной смеси составлял 250 мкл.

Исследование кинетики ингибирования НТЭ