Исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений

3.1 Исследование эстеразного профиля новых фосфорорганических соединений для оценки их биологической активности как потенциальных ингибиторов сериновых эстераз

Целью данного эксперимента являлось получение и анализ эстеразного профиля серии O,O-диалкил-O-(1-этоксикарбонил-2,2,2-трифторэтил) фосфатов (О-фосфорилированных этилтрифторлактатов, TFL) общей формулы

где R= CH3, C2H5, i-C3H7, n-C3H7, i-C4H9, n-C4H9, n-C5H11.

Предполагалось, что по аналогии с ранее изученными O,O-диалкил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил) фосфатами (О-фосфорилированными гексафторизопропанолами, PFP) [64, 455], трифторлактатный фрагмент в данных соединениях будет выполнять роль уходящей группы, и TFL, как ингибиторы АХЭ и БХЭ, могут представлять интерес в качестве потенциальных терапевтических средств для улучшения когнитивных функций при ряде нейродегенеративных расстройств.

Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ О-фосфорилированными этилтрифторлактатами

Для получения эстеразного профиля TFL была исследована кинетика ингибирования данными соединениями четырех сериновых эстераз - АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ. Кинетические исследования проводились с использованием коммерческих препаратов ферментов: АХЭ эритроцитов человека, БХЭ сыворотки крови лошади, КЭ печени свиньи (Sigma-Aldrich, США), и стабильного лиофилизованного препарата НТЭ мозга кур (ЛиоНТЭ), полученного по методике, разработанной в нашей лаборатории [458] (далее ферментные препараты).

Проведенные исследования показали, что TFL необратимо ингибируют АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ с типичной для ФОС кинетикой ингибирования: зависимость степени ингибирования эстеразной активности от времени имеет псевдо-первый порядок, а наклоны прямых в полулогарифмических координатах lg(V0/Vt) = f (t) в случае АХЭ, БХЭ , КЭ пропорциональны кон-центрации ингибитора. При ингибировании НТЭ наблюдалось кинетическое проявление образования комплекса Михаэлиса, что позволило определить индивидуальные кинетические константы процесса ингибирования фермента - константы Михаэлиса (Ka, M) и константы фосфорилирования (k+2, мин-1).

E - фермент, I - ингибитор, ki - бимолекулярная константа ингибирования (М-1мин-1). Типичные графики зависимости степени ингибирования активности АХЭ, БХЭ и КЭ от времени на примере diPr-TFL представлены.

Данные зависимости позволяют оценить константу скорости псевдопервого порядка при данной концентрации ингибитора: k? = 2.303 Ч tgб, а затем бимолекулярную константу ингибирования: ki = 2.303 Ч tgв (М-1мин-1).

Типичные графики зависимости lg(V0 /Vt) от времени инкубации для трех возрастающих концентраций ингибитора на примере diPr-TFL представлены на Рисунке 3.1.-2А. При ингибировании НТЭ не наблюдается пропорциональности в зависимости константы скорости псевдопервого порядка (k? = 2.303 Ч tgб) от концентрации ингибитора (Рис. 3.1.-2Б). Построение зависимостей в координатах [I]/2.3 tgб от [I] дает возможность получить линейную зависимость (Рис. 3.1.-2В) в соответствии с уравнением

[I] / k? = Ka / k+2 + [I] / k+2 ,

из которого определяются индивидуальные кинетические параметры процесса

- константа Михаэлиса (Ka, M) и константа фосфорилирования (k+2, мин-1). Таким образом данные параметры были определены для ингибирования НТЭ O-фосфорилированными этилтрифторлактатами. Полученные результаты приведены.

Таблица 3.1. - 1. Кинетические параметры ингибирования НТЭ O-фосфорилированными этилтрифторлактатами.

Как видно из Таблицы 3.1.- 1, константа фосфорилирования НТЭ k+2 (мин-1) практически не зависит от структуры алкильных радикалов, тогда как связывание TFL в активном центре НТЭ, которое характеризуется константой Михаэлиса (Ka), улучшается с увеличением гидрофобности соединений. Рисунок 3.1.-3А демонстрирует зависимость константы Михаэлиса от гидрофобности алкильных радикалов (рCH2=0.5 по Хэнчу [460]). Эта зависимость описывается линейным уравнением:

-lg Ka(НТЭ) = (1.70 ± 0.49) + (0.97 ± 0.15)?р

(n = 7, r = 0.944, s = 0.490, F = 41.15, P = 0.00137)

Тангенс угла наклона близкий к 1 в зависимости lgKa(НТЭ) от гидрофобности алкильных радикалов (ур-е 1, Рис. 3.1.- 3А) подтверждает экстракционный механизм взаимодействия НТЭ с фосфорорганическими ингибиторами, предложенный ранее [457]. Показано наличие строгой корреляция между ингибиторной активностью TFL в отношении НТЭ

(ki, М-1мин-1) и связыванием соединений в активном центре фермента, (Ka, М): r = 0.998, n = 7, р < 0.0001.

В результате проведенных кинетических исследований определены величины бимолекулярных констант ингибирования АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ производными TFL, т.е. получен эстеразный профиль каждого соединения

Таблица 3.1. - 2. Ингибиторная активность TFL (ki, М-1мин-1) в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ и аддитивная гидрофобность алкильных радикалов по Хэнчу (Ур CH2=0.5).

Как следует из Таблицы 3.1.-2 и Рисунка 3.1.-4, ингибиторная активность TFL в отношении всех четырех сериновых гидролаз возрастает с увеличением гидрофобности алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы, при этом БХЭ и КЭ в большинстве случаев ингибируются более эффективно по сравнению с первичными мишенями АХЭ и НТЭ. Стерические препятствия - наличие заместителя в б-положении алкоксильного радикала - cнижают ингибиторную способность соединений.

Анализ эстеразного профиля О-фосфорилированных этилтрифторлактатов

Для анализа эстеразного профиля TFL использованы величины их ингибиторной активности в отношении 4-х эстераз (Табл. 3.1.-2) и величины ингибиторных селективностей (S), рассчитанные как отношения соответствующих ki (М-1мин-1): селективность соединения в отношении эстеразы X в сравнении с эстеразой Y определяли как SX/Y = ki(EX)/ki(EY) (Табл. 3.1.-3), где Х,Y = АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ. В сумме это дает для моделирования 9 параметров, каждый из которых важен для определенных аспектов результирующего фармакологического профиля соединений.

Таблица 3.1. - 3. Ингибиторная селективность TFL в отношении четырех сериновых эстераз.

Так, отношения ki(БХЭ)/ki(АХЭ) и ki(КЭ)/ki(АХЭ) характеризуют селективность соединений в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ, и, как мы полагаем, могут рассматриваться в качестве характеристики вкладов БХЭ и КЭ как вторичных мишеней-скэвенджеров в формирование острой холинергической токсичности соединения [455, 473-475]. Аналогично отношения ki(БХЭ)/ki(НТЭ) и ki(КЭ)/ki(НТЭ) характеризуют вклад БХЭ и КЭ в формирование отставленной нейротоксичности соединения.

Отношениеki(НТЭ)/ki(АХЭ)=RIP(RelativeInhibitorPotency)- относительная ингибиторная активность соединений в отношении ферментов-мишеней отставленной (НТЭ) и острой (АХЭ) нейротоксичности. Это отношение коррелирует с отношением между LD50 и минимальной нейропатичной дозой, и для соединений, которые в соответствии со своей структурой способных стареть, используется в качестве индекса, характеризующего нейропатичный потенциал соединения [223, 224, 226]. Величина RIP > 1 указывают на то, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС данным соединением, будет меньше LD50, тогда как при RIP < 1 ОНТФОС может инициироваться при дозах, больших LD50 [79, 262, 296, 299, 309, 476, 477].

Как следует из Таблиц 3.1.-2 и 3.1.-3, исследуемые соединения являются слабыми или средней силы ингибиторами АХЭ и более эффективно ингибируют БХЭ в сравнении с АХЭ, особенно при увеличении гидрофобности алкильных радикалов. Для соединений с R ? Pr характерна также повышенная селективность в отношении КЭ в сравнении с АХЭ.

Довольно низкая анти-АХЭ активность TFL наряду с более эффективным связыванием соединений с БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ, особенно при увеличении гидрофобности алкильных радикалов, позволили предположить невысокую острую токсичность соединений. Действительно, при определении острой токсичности на мышах (в/бр, 24 часа) были получены низкие величины

LD50: для diEt-TFL - 720 (623 ч 817) мг/кг и для diBu-TFL - 1560 (1350 ч 1780) мг/кг.

Анализ величин RIP = ki(НТЭ)/ki(АХЭ), характеризующих нейро-патичный потенциал соединений [223, 226], показывает, что TFL с короткими R (Me, Et) значительно сильнее ингибируют АХЭ, чем НТЭ (RIP = 0.038 и 0.046, соответственно), в то время как соединения с длинными радикалами (Bu и Pent) в большей степени подавляют НТЭ (RIP = 2.15 и 4.04; Табл. 3.1.-3). Т.е. избирательность действия TFL в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ, возрастает с увеличением длины и, соответственно, гидрофобности алкильных радикалов.

Как подробно обсуждалось в Литературном обзоре диссертации, необходимым условием инициирования ОНТФОС является старение фосфорилированной НТЭ - деалкилирование алкоксигруппы, связанной с атомом фосфора в фосфорилированном по остатку серина ферменте [223, 226]. В структуре TFL присутствуют алкоксильные группы, т.е. фосфорилированный этими соединениями фермент способен «стареть». В связи с этим, высокие величины RIP для TFL с R = Bu и Pent (2.15 и 4.04, соответственно) позволяют предположить [223, 262], что эти соединения могут вызывать ОНТФОС в дозах, меньших LD50. Полученные результаты согласуются с представленными в литературе данными о высокой нейропатичности фосфорорганических соединений с длинными алкоксильными радикалами [79, 190, 249, 282].

Анализ эстеразного профиля исследуемых соединений проводили с помощью количественного анализа связи структура - ингибиторная активность и структура - ингибиторная селективность (QSAR) с построением моделей Хэнча [460]. Cвязь между структурой и антиферментативной активностью/селективностью соединений анализировали с использованием множественной линейной регрессии. При этом, учитывая характер зависимостей lgki от гидрофобности (Рис. 3.1.-4), мы использовали модели «гидрофобность - ингибиторная активность» с включением в них стерических факторов. Ранее было показано, что при анализе структура - активность в гомологичных рядах фосфатов и фосфонатов не удается выявить влияния электронных свойств заместителей на ингибиторную способность соединений [455, 478-480]. В качестве физико-химических дескрипторов мы использовали константы гидрофобности Хэнча (рCH2 = 0.5) и стерические константы Чартона ( Evs ) для алкильных и алкоксильных заместителей [460]. Значимость полученных корреляционных уравнений оценивали по величине r - коэффициента множественной корреляции, s - стандартного отклонения, F - секвенциального критерия Фишера и Р - уровня значимости критерия Фишера. Зависимость анти-АХЭ активности TFL от гидрофобности алкильных

Модель существенно улучшается при исключении из анализа соединения с б-разветвленным i-Pr радикалом (3):

Использование стерических характеристик алкильных заместителей У Evs (R) серьезно ухудшает статистические параметры модели:

n = 7, r = 0.880, s = 0.408, F = 6.84, P = 0.051.

Зависимость анти-НТЭ активности TFL от гидрофобности алкильных

Как и в случае АХЭ, наилучшее уравнение, описывающее зависимость ki(НТЭ) от структуры молекулы, получается при включении в анализ стерических характеристик алкоксильных заместителей Evs (RO) (6):

lg ki(НТЭ) = (1.05 ± 0.66) + (1.19 ± 0.12)Ур - (1.56 ± 0.68)УEvs (RO)

(n = 7, r = 0.981, s = 0.341, F = 52.13, P = 0.00136)

При использовании стерических характеристик алкильных заместителей Evs (R) статистические характеристики модели ухудшаются, хотя и в меньшей степени по сравнению с АХЭ: n = 7, r = 0.956, s = 0.519, F = 21.302, P = 0.0074.

Как видно из приведенных уравнений, гидрофобные взаимодействия являются более значимыми для ингибирования НТЭ, чем для АХЭ ( сравнение кэффициентов в ур-ниях 5 и 3, 6 и 4). В случае б-разветвленных заместителей стерические взаимодействия снижают ингибиторную активность соединений в

При включении в анализ стерических характеристик алкоксильных заместителей Evs (RO) получается наилучшее уравнение, описывающее зависимость ki(БХЭ) от структуры молекулы, (8):

(n = 7, r = 0.962, s = 0.298, F = 12.58, P = 0.033)

При использовании стерических характеристик алкильных заместителей У Evs (R) статистические характеристики ухудшаются:

n = 7, r = 0.921, s= 0.427, F = 5.62, P = 0.095

Зависимость анти-КЭ активности TFL от гидрофобности алкильных радикалов описывается уравнением (9):

Наилучшее уравнение, описывающее зависимость анти-КЭ активности TFL от структуры молекулы получается при включении в анализ стерических характеристик алкоксильных заместителей Evs (RO) (10):

lg ki(КЭ) = (1.44 ± 0.92) + (2.26 ± 0.93)Ур - (0.18 ± 0.14)(Ур)2 - (1.81 ± 1.19)У Evs

При использовании стерических характеристик алкильных заместителей У Evs

(R) модель ухудшается: n = 7, r = 0.963, s = 0.528, F = 13.00, P = 0.0316.

Как видно из проведенного анализа, наилучшие уравнения, описывающие зависимость между структурой TFL и их антиэстеразной активностью, были получены при включении в модели стерических констант Чартона для алкоксильных У Evs (RO), но не алкильных У Evs (R) заместителей. Это может свидетельствовать о существенном влиянии стерических свойств заместителей на стадии фосфорилирования ферментов [478].

Анализ ингибиторной способности TFL в отношении исследуемых сериновых эстераз показал, что гидрофобные взаимодействия играют важную роль при ингибировании всех эстераз, стерические препятствия снижают антиэстеразную активность.

Далее мы провели анализ связи структура - ингибиторная селективность с построением моделей Хэнча [460].

Зависимость ингибиторной селективности TFL в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ от гидрофобности алкильных радикалов описывается уравнением (11), которое демонстрирует линейное возрастание нейропатичного потенциала TFL (ki(НТЭ)/ki(АХЭ) = RIP) с увеличением гидрофобности

Селективность TFL в отношении биомишеней-скэвенджеров (БХЭ и КЭ) по сравнению с мишенью острого токсического действия (АХЭ) описывается

Эти уравнения описывают изменение потенциального вклада вторичных мишеней, БХЭ и КЭ, в формирование острой холинергической токсичности TFL с изменением гидрофобности алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы: с увеличением гидрофобности возрастает ингибиторная селективность соединений в отношении БХЭ и особенно КЭ в сравнении с ингибиторной активностью в отношении АХЭ. Т.е. с ростом гидрофобности соединений возрастает защитная роль БХЭ и КЭ при формировании острой холинергической токсичности TFL. Это иллюстрирует Рисунок 3.1.- 6, где прерывистые линии для селективности S(БХЭ/АХЭ) и S(КЭ/АХЭ) получены по уравнениям (12) и (13) соответственно. Аналогичная закономерность была показана ранее для гомологичных рядов структурно близких О-фосфорилированных гексафторизопропанолов [455] и других гомологичных диалкилфосфатов [478, 481].

Возрастание степени связывания TFL на токсико-кинетической стадии c эстеразами-скэвенджерами при увеличении гидрофобности молекулы снижает количество соединения, достигающего мишени - АХЭ, что должно приводить к снижению острой холинергической токсичности для более гидрофобных соединений. Это полностью согласуется с результатами по определению острой токсичности диэтильного и дибутильного производных TFL для мышей (в/бр, 24 ч): острая токсичность более гидрофобного diBu-TFL (LD50 = 1560 мг/кг) вдвое ниже, чем у diEt-TFL (LD50 = 720 мг/кг).

lg [ki(БХЭ)/ki(НТЭ)] = (2.11 ± 0.22) + (0.47 ± 0.16) Ур - (0.17 ± 0.03)(Ур)2

(n = 7, r = 0.993, s = 0.109, F = 140.423, P = 0.0002)

lg [ki(КЭ)/ki(НТЭ)] = (0.59 ± 0.13) + (0.71 ± 0.09) Ур - (0.12 ± 0.02)(Ур)2

Эти уравнения описывают изменение потенциального вклада вторичных мишеней, БХЭ и КЭ, в формирование отставленной нейротоксичности TFL с изменением гидрофобности алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы.

Как видно из Рисунка 3.1.-7, связывание с КЭ и особенно с БХЭ может существенно снижать степень взаимодействия с НТЭ для TFL с короткими R (Me, Et). С ростом гидрофобности алкильных радикалов снижается ингибиторная селективность TFL в отношении БХЭ и КЭ в сравнении с НТЭ , при этом линейно возрастает нейропатичный потенциал соединений (RIP) (ур-е 11). Таким образом, с ростом гидрофобности алкильных радикалов снижается защитная роль эстераз-скэвенджеров в формировании отставленной нейротоксичности, и соответственно возрастает нейропатичная опасность соединений.

Полученные результаты согласуются с известными экспериментальными данными о низкой способности вызывать ОНТФОС у соединений с короткими R (Me, Et) и возрастающей нейропатичности у соединений с длинными гидрофобными радикалами [190, 262, 273, 282, 299, 476].

Таким образом, анализ эстеразного профиля показывает различное влияние связывания TFL с неспецифическими эстеразами - КЭ и БХЭ на формирование острой и отставленной нейротоксичности: с увеличением гидрофобности молекулы наблюдается повышение защитного эффекта в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении способности соединения вызывать ОНТФОС. Аналогичный эффект наблюдался для близких по структуре О-фосфорилированных 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанолов (RO)2P(O)OCH(CF3)2, (PFP), ранее изученных в нашей лаборатории [455].

Как видно из полученных результатов, анализ эстеразного профиля позволяет сделать прогнозы о потенциальных терапевтических свойствах и нейротоксических эффектах соединений. Так, TFL с короткими алкильными радикалами (R=Me, Et) обладают низкой острой токсичностью и имеют низкий нейропатичный потенциал (RIP = 0.038 и 0.046); их высокая селективность в отношении эстераз-скэвенджеров, особенно в отношении БХЭ по сравнению с НТЭ, позволяет предположить дополнительный защитный эффект, снижающий вероятность развития ОНТФОС на уровне целого организма. Все это позволяет рассматривать данные соединения в качестве потенциальных антихолинэстеразных терапевтических средств, у которых отсутствует такой опасный побочный эффект как способность вызывать отставленные полинейропатии.

В то же время гидрофобные TFL с длинными алкильными радикалами (Bu, Pent), безопасные с точки зрения острой токсичности, обладают высоким нейропатичным потенциалом (высокие значения RIP) при сниженной защитной функции КЭ и БХЭ (низкие значения ki(БХЭ)/ki(НТЭ) и ki(КЭ)/ki(НТЭ)) и таким образом представляют опасность как отставленные нейротоксиканты. Это исключает их применение в качестве терапевтических средств. ингибирование ацетилхолинэстераза метаболизм липид

Следует отметить, что оценка эстеразного профиля антихолинэстеразного лекарственного препарата, дающая более полную информацию о его взаимодействии с другими ферментами-мишенями, позволяет оценить также нежелательные лекарственные взаимодействия, обусловленные перекрестной специфичностью лекарственного соединения, и, соответственно, возможные опасные побочные эффекты препарата [482]. Так, недавно было обнаружено, что ингибиторы АХЭ и БХЭ, применяемые в терапии болезни Альцгеймера, способны также снижать активность КЭ, определяющую метаболизм лекарственных препаратов со сложноэфирными группами. В частности, ривастигмин длительно ингибирует активность КЭ1 почти на 80% и КЭ2 более чем на 95%, такрин способен снижать активность КЭ2 практически на 60%. Т.е. применение этерифицированных лекарственных препаратов в сочетании с данными ингибиторами холинэстераз может привести к снижению скорости гидролиза таких препаратов, тем самым изменяя их эффективность [483].

Учет перекрестной специфичности путем анализа полного эстеразного профиля потенциальных лекарственных соединений и ее минимизация путем создания ингибиторов, селективных только в отношении целевой эстеразы, являются существенным фактором при применении ингибиторов холинэстераз в качестве терапевтических агентов и при конструировании новых лекарственных соединений.

Таким образом, на примере О-фосфорилированных этилтрифторлактатов показано, что анализ эстеразного профиля соединений позволяет получить более полную картину их потенциальных биологических эффектов, тем самым оценить терапевтический потенциал и возможные побочные эффекты исследуемых соединений, а также позволяет получить информацию о механизмах формирования токсичности. Полученные результаты представляют несомненный интерес для конструирования нетоксичных селективных ингибиторов АХЭ, БХЭ и КЭ как потенциальных терапевтических агентов.

- получен эстеразный профиль для ряда гомологичных

О-фосфорилированных этилтрифторлактатов путем определения бимолекулярных констант ингибирования в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ; - определены величины констант Михаэлиса для ингибирования НТЭ

(Ka, M) и константы фосфорилирования (k+2, мин-1). Показано, что ингибиторная активность TFL в отношении НТЭ определяется эффективностью связывания фермента с соединением, причем связывание TFL в активном центре НТЭ носит экстракционный характер и улучшается с увеличением гидрофобности соединений;

проведен анализ эстеразного профиля TFL с построением количественных моделей Хэнча структура-ингибиторная активность и структура-селективность;

показана более высокая ингибиторная активность TFL в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с мишенями острой (АХЭ) и отставленной (НТЭ) нейротоксичности;

получены уравнения, описывающие зависимость нейропатичного потенциала TFL от гидрофобности. Показано, что нейропатичный потенциал соединений линейно возрастает с увеличением гидрофобности молекулы;

количественный анализ связи структура-селективность БХЭ/АХЭ, КЭ/АХЭ, БХЭ/НТЭ и КЭ/ НТЭ показал различное влияние связывания TFL с неспецифическими эстеразами (КЭ и БХЭ) на формирование острой и отставленной нейротоксичности: с увеличением гидрофобности наблюдается повышение защитного эффекта в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении способности соединения вызывать

ОНТФОС;

- показана невысокая острая токсичность изученных TFL, имеющая тенденцию к снижению для более гидрофобных соединений.

Выбор соединений для исследований на тканях и на целом животном

Мы полагаем, что эстеразный профиль антихолинэстеразного соединения в значительной степени определяет его поведение на уровне тканей и целого организма. Для проверки этой гипотезы было необходимо исследовать ингибиторную активность ФОС с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ на препаратах тканей мышей (кровь и мозг) и на целом животном.

Для выбора наиболее подходящих соединений мы провели сравнительный анализ эстеразных профилей двух гомологичных рядов диалкилфосфатов: изученных в настоящей работе О-фосфорилированных этилтрифторлактатов (TFL) и исследованных ранее в нашей лаборатории структурных аналогов TFL - О-фосфорилированных 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанолов (PFP) общей формулы (RO)2P(O)OCH(CF3)2.

Наиболее подходящими кандидатами для исследования на тканях и на целом животном являются диэтил- и дибутилфосфаты, отличающиеся по гидрофобности, величине нейропатичного потенциала, селективности эстераза-скэвенджер/эстераза-мишень и острой токсичности для мышей.

В настоящей работе мы определили острую токсичность diBu-PFP (мыши CD1, в/бр, 24 часа) и воспроизвели ранее полученные данные по острой токсичности diEt-PFP [455]. В Таблице 3.1.- 4 для сравнения приведены данные по ингибиторной активности и селективности этильных и бутильных производных PFP и TFL в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ (отношения соответствующих ki), а также острая токсичность соединений.

Таблица 3.1. - 4. Ингибиторная активность (ki, М-1мин-1), ингибиторная селективность производных PFP и TFL в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и острая токсичность соединений.

Как видно из Таблицы 3.1.-4, этильное и бутильное производные PFP обладают бульшими различиями в ингибиторной активности и селективности в отношении большинства исследуемых эстераз и бульшими различиями в острой токсичности по сравнению с производными TFL. diEt-PFP имеет очень низкий нейропатичный потенциал RIP = 0.052, умеренную острую токсичность LD50 = 200 (161.1ч238.9) мг/кг, и проявляет высокую селективность в отношении эстераз-скэвенджеров БХЭ и особенно КЭ по сравнению с НТЭ, в то время как более гидрофобный diBu-PFP является потенциально опасным отставленным нейротоксикантом (RIP = 4.99), обладает очень низкой острой токсичностью (LD50 > 2000 мг/кг) и проявляет высокую селективность в отношении БХЭ и особенно КЭ по сравнению с АХЭ.

Эти факты послужили основанием выбора пары соединений diEt-PFP -(С2H5O)2P(O)OCH(CF3)2 и diBu-PFP - (С4H9O)2P(O)OCH(CF3)2 для дальнейших исследований на тканях и на целом животном.

Мы также включили в исследования на тканях и на целом животном известное нейропатичное соединение - О,О-дипропил-О-дихлорвинилфосфат (diPr-DClVP), которое детально изучено in vitro и in vivo на курах и крысах в предыдущих работах нашей лаборатории [306, 484]. diPr-DClVP, обладающий как антихолинэстеразными свойствами, так и способностью вызывать отставленную нейротоксичность [296, 306, 484, 485], будет использован в наших последующих экспериментах в качестве маркерного соединения.

Оценка эстеразного профиля О-фосфорилированных гексафторизопропанолов (diEt-PFP, diBu-PFP) и маркерного соединения О,О-дипропил-О-дихлорвинилфосфата (diPr-DClVP)

Перед проведением экспериментов на препаратах мозга и крови мы воспроизвели полученные ранее данные [64, 455], по эстеразному профилю ресинтезированных diEt-PFP и diBu-PFP, охарактеризовали эстеразный профиль diPr-DClVP и оценили его острую токсичность для мышей: LD50 = 15

Для удобства сравнения полученных данных с результатами экспериментов на препаратах мозга и крови мышей, величины полученных констант ингибирования (ki, M-1мин-1) исследуемых соединений в отношении ферментных препаратов АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ мы пересчитали на величины IC50 (М). Для расчета использовали соотношение: IC50 = (ln2)/(kiЧt), где t - фиксированное время инкубации с ингибиторами (20 мин) [81]. Результаты приведены.

Таблица 3.1. - 6. Ингибиторная активность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении ферментных препаратов АХЭ, НТЭ БХЭ, КЭ, представленная величинами IC50 (эстеразный профиль соединений).

При использования величин IC50 расчет селективности вели в соответствии с соотношением:

S(Ex/Ey) = ki (Ex) / ki (Ey) = IC50(Ey) / IC50(Ex).

Величины ингибиторной селективности исследуемых соединений в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ и величины LD50 приведены в Таблице 3.1.- 7.

Таблица 3.1. - 7. Ингибиторная селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и острая токсичность соединеий(мыши, в/бр, 24 часа).

Наши результаты хорошо соответствуют ранее полученным и опубликованным данным [455]. Из Табл. 3.1.-7 видно, что diEt-PFP имеет очень низкий нейропатичный потенциал (RIP = 0.07), умеренную острую токсичность, LD50 = 200 мг/кг, и проявляет высокую селективность в отношении эстераз-скэвенджеров БХЭ и КЭ по сравнению с НТЭ. В то же время гидрофобный diBu-PFP является потенциально опасным отставленным нейротоксикантом (RIP = 6.6), обладает очень низкой острой токсичностью (LD50 > 2000 мг/кг) и проявляет высокую селективность в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ. diPr-DClVP является наиболее активным ингибитором всех исследуемых эстераз, имеет высокий нейропатичный потенциал (RIP=3.5) и высокую острую токсичность, LD50 = 15 мг/кг.

Таким образом, соединения, выбранные для исследований на тканях in vitro и на уровне целого организма, обладают различным эстеразным профилем, различным нейропатичным потенциалом и разной острой токсичностью.

Мы полагаем, что биологические эффекты указанных соединений, предсказанные на основании анализа их эстеразного профиля, будут проявляться на уровне тканей и целого организма.

3.2 Исследование активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в крови оценка «эстеразного статуса» человека и грызунов

Эксперименты на тканях и на целом животном предполагали определение активности эстераз в цельной крови. В связи с особенностями распределения ферментов по фракциям крови у разных видов именно цельная, а не фракционированная кровь, является средой, более приближенной к условиям целого организма, т.к. в одной пробе локализованы все указанные ферменты в физиологическом соотношении. В связи с этим было необходимо отработать и стандартизовать метод пробоподготовки, а также оптимизировать методики определения активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в цельной крови.

Совокупность активностей АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в крови составляет «эстеразный статус» организма. «Эстеразный статус» в значительной степени определяет видовую и индивидуальную чувствительность к антихолинэстеразным соединениям и характеризует метаболический статус пациента [386, 485, 486, 487].

В настоящее время в литературе имеются в основном разрозненные данные об активности перечисленных эстераз у человека и лабораторных животных. Задачей данного эксперимента являлась характеристика «эстеразного статуса» человека и стандартных лабораторных животных - крыс и мышей.

Разработка методов пробоподготовки и оптимизация методик определения активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в цельной крови

Известно, что у человека БХЭ и PON1 локализованы преимущественно в плазме крови, тогда как АХЭ - в эритроцитах. НТЭ присутствует в периферических лимфоцитах и тромбоцитах. КЭ в плазме крови человека практически отсутствует [173], показано лишь незначительное содержание КЭ в моноцитах [322, 323] и лейкоцитах [488]. У грызунов, в отличие от человека, АХЭ находится как в эритроцитах, так и в плазме крови, КЭ в плазме присутствует в значительном количестве.

Общепринятые методы оценки активности указанных ферментов предполагают фракционирование крови и проведение стандартного определения активности в плазме крови (КЭ, БХЭ и PON1), в изолированных эритроцитах (АХЭ) и изолированных лимфоцитах (НТЭ). Использование препаратов цельной крови позволяет определять активность всех исследуемых ферментов в одних и тех же образцах крови с минимальной пробоподготовкой. В данном эксперименте кровь получали от мышей линии CD1, крыс популяции Wistar и человека.

Для стандартизации процедуры пробоподготовки были подобраны условия приготовления гемолизованных препаратов крови. Свежая или оттаявшая после хранения при -70оС цельная кровь разбавлялась охлажденной буферной средой в соотношении 1:100, после тщательного перемешивания (на водяной бане со льдом) быстро замораживалась в жидком азоте для обеспечения полноты гемолиза. Подготовленные таким образом образцы гемолизованной крови (гемолизаты) могли храниться в течение нескольких месяцев при -70оС до использования без заметного снижения активности целевых ферментов.

Активность АХЭ в цельной крови определяли методом Эллмана с 1 мM ацетилтиохолином (АТХ) в качестве субстрата в присутствии селективного ингибитора БХЭ - этопропазина для элиминирования вклада БХЭ в гидролиз субстрата [128, 135, 462, 489].

Активность БХЭ в цельной крови определяли методом Эллмана с 1 мM бутирилтиохолином (БТХ) в качестве субстрата. При этом селективный ингибитор АХЭ не требовался, т.к. специфичность АХЭ в отношении БТХ очень низка [489].

Для снижения интерферирующего влияния абсорбции гемоглобина стандартная длина волны для метода Эллмана 412 нм в обоих случаях была изменена на 436 нм. Снижению влияния гемоглобина также способствует разбавление крови при приготовлении гемолизата (примерно в 100 раз) и в реакционной смеси в кювете (еще в 3 раза), финальное разбавление крови ~ 300 раз согласно Worek F. [462].

Определение активности КЭ в образцах тканей животных проводят с применением специфических ингибиторов параоксоназы (ЭДТА) и холинэстераз (эзерин) для элиминирования вклада этих ферментов в гидролиз субстрата КЭ [3]. Один из стандартных методов анализа активности КЭ основан на реакции ферментативного гидролиза 4-нитрофенилацетата (4-NPA) с образованием продукта желтого цвета (4-нитрофенола), накопление которого измеряют спектрофотометрически при длине волны 405 нм [466]. Также в качестве стандартного субстрата КЭ используют 1-нафтилацетат (1-NA). Выделяющийся в результате его гидролиза 1-нафтол детектируется при длине волны 322 нм [171, 173, 323, 463, 490]. Фенилацетат (PhA) используется при биосенсорном определении активности КЭ в крови с помощью тирозиназного биосенсора. Метод основан на электрохимической детекции фенола, выделяющегося в результате ферментативного гидролиза PhA.

С целью выбора стандартного субстрата для наших дальнейших исследований мы провели сравнительные спектрофотометрические измерения активности КЭ в крови человека, мышей и крыс с использованием 1-NA (л=322 нм, е322=2200 M-1cm-1) PhA (л=322, е270=1310 M-1cm-1), 4-NPA (л=390 нм, е390=15060 M-1cm-1) в качестве субстратов. Для элиминирования PON1 и холинэстеразного гидролиза субстратов измерения проводили в присутствии специфических ингибиторов PON1/арилэстераз (2 мM ЭДТА) и холинэстераз (40 µM эзерин) [466]. Результаты измерений показали близкие величины активности КЭ в крови из разных источников при использованиии 1-NA и PhA в качестве субстратов, в то время как при использовании 4-NPA активность КЭ оказалась в несколько раз выше. Полученные данные представлены.

Таблица 3.2. - 1. Активность КЭ в крови человека, мышей и крыс при использовании 1-NA, PhA, 4-NPA в качестве субстратов.

Для выяснения причины этого явления мы провели серию экспериментов по исследованию влияния специфических ингибиторов КЭ: бис-пара-нитрофенилфосфата (BNPP, 0.1 мМ) [492] и iso-OMPA (1 мМ) [466] на гидролиз 1-NA, PhA, 4-NPA, используя в качестве источника фермента очищенный коммерческий препарат микросомальной КЭ печени свиньи (Sigma) и плазму крысы. Измерение активности КЭ проводили через 0, 10, 30 и 60 минут инкубации с каждым из ингибиторов в указанной концентрации и определяли остаточную активность фермента для каждого субстрата (контрольные значения активности КЭ приведены в Табл. 3.2.-1). Результаты представляли как % от величины активности КЭ в контроле - скорости гидролиза субстрата в отсутствие ингибитора в каждом из опытов.

Как видно из BNPP (0.1 мМ) и iso-OMPA (1 мМ) полностью ингибируют гидролиз исследуемых субстратов в присутствии КЭ микросом печени свиньи, т.е. в данных условиях гидролиз 4-NPA происходит исключительно под действием КЭ. Таким образом, очищенный препарат КЭ печени свиньи позволяет работать со всеми указанными субстратами, что соответствует литературным данным.

Полученные результаты согласуются с литературные данными о том, что КЭ является не единственным ферментом в плазме, гидролизующим 4-NPA. Известно, в частности, что 4-NPA является субстратом сывороточного альбумина [494-497]. Можно ожидать, что вклад гидролиза 4-NPA под действием сывороточного альбумина будет еще более существенным в плазме человека из-за высокой концентрации в ней альбумина и структурных особенностей его активных центров [494, 498].

Основываясь на полученных данных, мы исключили 4-NPA из числа субстратов, используемых для дальнейших спектрофотометрических исследований активности КЭ в крови и плазме, и проводили измерения с использованием 1 мM 1-NA в качестве стандартного субстрата при длине волны 322 нм. В отдельных случаях, при сравнении с результатами биосенсорных измерений, использовали PhA.

Определение арилэстеразной активности PON1 в цельной крови и плазме проводили в соответствии с методом Kitchen B.I. [467] с использованием в качестве субстрата фенилацетата в концентрации 4мМ при длине волны 270 нм ( е270=1310 M-1cm-1) в присутствии 1 мМ CaCl2 и специфического ингибитора холинэстераз - эзерина (40 µM) при 10-минутной преинкубации с этими ингибиторами [466].

PON1 локализована в плазме и ее параоксоназная активность в 1000 раз ниже, чем арилэстеразная [402]. Определение параоксоназной активности PON1 в гемолизованной крови затруднительно в связи с сильным разбавлением образцов, поэтому мы проводили измерения в плазме крови в соответствии с методом Furlong C.E. [468]. Предварительно для гидролиза параоксона (PO) под действием PON1 плазмы крови была определена величина Km. На.-3 представлена зависимость скорости ферментативного гидролиза PO под влиянием PON1 в плазме крови человека от концентрации PO в координатах Лайнуивера-Берка. Измерения проводили при длине волны 405 нм (е405=18050 M-1cm-1) [469 499, 500]. Исходя из полученной величины Km = 0.12 ± 0.02 мM, была выбрана рабочая концентрация PO для дальнейших измерений - 1.2 мМ, что соответствует литературным данным [468].

Определение активности НТЭ в цельной крови имеет серьезные ограничения. Низкая активность НТЭ в крови, а также интерферирующее влияние гемоглобина делают невозможным использование стандартного спектрофотометрического метода определения НТЭ [250]. Совместно с кафедрой химической энзимологии МГУ в нашей лаборатории был разработан принципиально новый подход к анализу активности НТЭ в крови с использованием тирозиназных биосенсоров для определения фенола, выделяющегося в результате гидролиза субстрата фенилвалерата [316]. Использование амперометрического биосенсора на основе графитовой пасты, содержащей грибную тирозиназу, впервые позволило проводить определение активности НТЭ с высокой чувствительностью и селективностью в цельной крови человека и грызунов при многократном разбавлении исходного образца.

В настоящее время разработан новый чувствительный планарный биосенсор на основе сочетания технологии трафаретной печати для создания графитовой подложки и технологии LBL (слой-за-слоем) нанесения полиэлектролитов и грибной тирозиназы [318]. Данный биосенсор использовался для определения активности НТЭ в крови мыши и человека в настоящей работе.

Перед определением активностей исследуемых ферментов для каждого фермента получена зависимость скорости гидролиза субстратов от концентрации плазмы и крови человека, мыши (линия CD1) и крысы (популяция Wistar) в реакционной смеси. Полученные данные позволили выбрать объем плазмы или крови из линейного участка зависимости с достаточной скоростью гидролиза для стандартного определения активности ферментов.

Из данных зависимостей определены оптимальные объемы гемолизита для каждой реакции, равные 800 мкл.

Из приведенных зависимостей определены оптимальные количества плазмы крысы: для определения активности АХЭ в плазме - 15 мкл, для определения арилэстеразной активности PON1 - 10 мкл.

Из данных зависимостей определены оптимальные количества гемолизата: для определения арилэстеразной активности PON1 в крови человека - 500 мкл, для определения активности АХЭ в крови человека - 800 мкл. Аналогичным образом были подобраны количества крови и плазмы человека, мыши и крысы для определения активности всех исследуемых ферментов.

Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в плазме крови человека и крысы в стандартных условиях

На данном этапе мы исследовали активности ферментов «эстеразного статуса» человека, мыши и крысы в цельной крови. Полученные результаты представлены в Таблице 3.2.-4. Общий характер соотношения активностей этих ферментов в крови сходен с данными по плазме.

Результаты демонстрируют существенные различия в «эстеразном статусе» человека, крысы и мыши: у человека значимыми являются активности холинэстераз, активность КЭ незначительна. У грызунов наибольший вклад вносит карбоксилэстераза, причем максимальная активность КЭ наблюдается у мышей. Во всех случаях показана высокая арилэстеразная активность PON1 и низкая активность НТЭ.

Таблица 3.2. - 4. Активность ферментов «эстеразного статуса» человека, мыши и крысы в цельной крови.

U* - нмоль субстрата/(мин Ч мл крови) для активности НТЭ

Как видно из Таблицы 3.2.-4 и Рисунка 3.2.-8, активность холинэстераз в крови человека выше, чем у грызунов: активность АХЭ в крови человека выше, чем у мыши и крысы в 4 и 6 раз, БХЭ - в 2 и 11 раз, соответственно. Активность КЭ в крови человека примерно в 16 раз ниже, чем у крысы и в 30 раз ниже, чем в крови мышей. В плазме человека активность КЭ в 80 раз ниже, чем в плазме крыс, что вполне согласуется с литературными данными [171]. Более высокая активность КЭ в крови человека по сравнению с плазмой может быть обусловлена присутствием КЭ в моноцитах [322] и лейкоцитах [488].

Активность НТЭ в крови имеет низкий уровень. При этом в крови грызунов она ниже, чем в крови человека примерно в 3 раза, что хорошо согласуется с более низким уровнем активности НТЭ в мозге грызунов по сравнению с активностью НТЭ в мозге человека [262, 277, 484, 501].

В н...