Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом
Окислительный стресс и антиоксиданты. Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo. Моделирование окислительного стресса на культуре клеток РС12 in vitro. Интактные клетки PC12.
Рубрика | Биология и естествознание |
Вид | дипломная работа |
Язык | русский |
Дата добавления | 22.10.2018 |
Размер файла | 6,4 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Федеральное государственное бюджетное учреждение
Научный центр Неврологии РАМН
На правах рукописи
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo
03.01.04 - Биохимия
Коновалова Евгения Викторовна
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
Федорова Татьяна Николаевна
Москва 2013
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Окислительный стресс и антиоксиданты
1.1.1 Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических условиях
1.1.1.2 Кислородные радикалы и их повреждающее действие на клетку
1.1.1.3 Окисление и продукция свободных
1.1.2 Антиоксидантная система клеток
1.1.3 Карнозин и родственные ему соединения
1.1.4 Нанопрепараты и их применение
1.1.5 Окислительный стресс и мозг
1.1.6 Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных клеток
1.1.7 Свободнорадикальное окисление липидов и антиоксидантная терапия при заболеваниях ЦНС
1.2 Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на разных биологических объектах, включая клеточные культуры
1.2.1 Экспериментальные модели окислительного стресса
1.2.2 Клеточные культуры для изучения ОС
1.2.2.1 Гранулярные клетки мозжечка
1.2.2.2 Клеточная культура PC-12
1.3 NMDA рецепторы и клеточный сигналинг
1.4 Индукторы окислительного стресса
1.4.1 NMDA
1.4.2 Гомоцистеиновая кислота
1.4.3 Полиамины
1.4.4 Пероксид водорода
1.4.5 Акролеин
1.5 Проточная цитометрия
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Моделирование окислительного стресса на культуре клеток РС12 in vitro
2.1.1 Характеристика клеточной культуры
2.1.1.1 Культивирование клеток
2.1.1.2 Подготовка клеток для анализа
2.1.1.3 Дифференцировка клеточной культуры с помощью дексаметазона и NGF-в
2.1.2 Определение уровня активных форм кислорода и клеточной смерти методом проточной цитометрии
2.1.2.1 Проточная цитометрия
2.1.2.2 Определение уровня активных форм кислорода (АФК)
2.1.2.3 Определение доли мертвых клето
2.1.3 Определение экспрессии NMDA-рецепторов методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания антителами
2.2 Способы индукции окислительного стресса
2.2.1 Пероксид водорода
2.2.2 N-метил-D-аспартат
2.2.3 Гомоцистеиновая кислота
2.2.4 Полиамины
2.2.5 Акролеин
2.3 Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС
2.3.1 Схема экспериментов
2.3.2 Приготовление нанолипосом, содержащих карнозин
2.3.2.1 Измерение размеров
2.3.2.2 Выбор оптимальной липидной композиции
2.3.3 Карнозинсодержащие нанолипосомы
2.3.4 Определение содержания карнозина в составе нанолипосом по диазореакции
2.4 Приготовление растворов
2.5 Экспериментальные исследования in vitro и in vivo на быстро стареющих мышах линии SAM
2.5.1 Окислительный стресс in vitro
2.5.2 Выделение гранулярных клеток мозжечка
2.5.3 Окислительный стресс in vivo
2.5.4 Устойчивость мышей к гипоксии
2.5.5 Определение общей антиоксидантной
2.6 Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Морфологическая характеристика клеточной культуры PC12, дифференцированной дексаметазоном и фактором роста нервов rHuNGF
3.2 Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF
3.3 Индукция окислительного стресса различными химическими агентами в недифференцированных и дифференцированных клетках PC12
3.3.1 Индукция окислительного стресса при действии NMDA и Н2О2
3.3.1.1 Интактные клетки PC12
3.3.1.2 Интактные клетки PC12 в условиях окислительного стресса
3.3.1.3 Влияние H2O2 и NMDA на рост АФК в клетках РС12, дифференцированных по нейрональному типу
3.3.2 Влияние гомоцистеиновой кислоты на клетки PC-12
3.3.2.1 Влияние гомоцистеиновой кислоты на развитие окислительного стресса в недифференцированных клетках PC-12
3.3.2.2 Влияние гомоцистеиновой кислоты на рост АФК в клетках PC-12, дифференцированных по нейрональному типу
3.3.3 Влияние полиаминов на клетки PC-12
3.3.3.1 Влияние спермина, спермидина и путресцина на недифференцированную клеточную культуру PC-12
3.3.3.2 Влияние полиаминов на рост АФК и гибель клеток РС12, дифференцированных по нейрональному типу
3.3.4 Токсическое действие акролеина на клетки РС-12 в зависимости от его дозы и времени инкубации
3.3.4.1 Влияние акролеина на рост АФК
3.3.4.2 Влияние акролеина на гибель клеток PC-12
3.3.4.3 Влияние акролеина на морфологические изменения клеток РС-12
3.4 Защитное действие карнозина на клетки PC-12, в условиях окислительного стресса, индуцированного акролеином
3.4.1 Защитное влияние карнозина на рост АФК
3.4.2 Защитное влияние карнозина на гибель клеток
3.5 Защитное действие карнозина на клетки PC-12, дифференцированные по нейрональному типу
3.5.1 Исследование влияния карнозина на клетки РС12, инкубированные с перекисью водорода
3.5.2 Влияние карнозина на дифференцированные клетки PC-12 в условиях окислительного стресса, индуцированного гомоцистеиновой кислотой
3.5.3 Оценка антиоксидантной активности карнозина в составе нанолипосом
3.6 Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на дифференцированные клетки РС12 в условиях ОС, индуцированного полиаминами
3.6.1 Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на уровень АФК клеток РС12, при инкубации их с полиаминами
3.6.2 Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на гибель клеток РС12, индуцированную полиаминами
3.7 Защитное действие нанолипосомальных структур, содержащих карнозин на нейроны головного мозга мышей линии SAMP1/SAMR1 в условиях окислительного стресса
3.7.1 Окислительный стресс in vitro
3.7.2 Окислительный стресс in vivo
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
активные формы кислорода
ВЖ- время жизни
ВПП- время до потери позы
ВР- время реституции
ГЦ- гомоцистеин
ГЦК-гомоцистеиновая кислота
ДФПГ- 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразил
КСЛ- карнозинсодержащие липосомы
ОГГ-острая гипобарическая гипоксия
ОС- окислительный стресс
ЦНС- ценральная нервная система
DCF-dichlorfluoresceine
NGF -nerve growth factor
NMDA -N-methyl-D-aspartate
PC-12-клетки феохромоцитомы
PI- propidium iodide
SAMP- senescence accelerated mice (prone)
SAMR- senescence accelerated mice (resistant)
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время развитие окислительных реакций в различных биологических структурах рассматривается как один из основных повреждающих механизмов. Особенно значимыми эти процессы являются для нервной системы, что связано с избирательной чувствительностью клеток возбудимых тканей к окислительной деструкции. (Karnaukhov V., et al., 2008). Показано, что развитие окислительного стресса (ОС) активирует каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза или некроза (Luk'ianova L., et al., 1989; Majno G., and Joris I., 1995; Nicotera P. and Lipton S., 1999) Окислительные повреждения мозга рассматриваются современной наукой как значимый фактор патогенеза заболеваний ЦНС. В связи с этим, разработка новых антиоксидантных препаратов сохраняет высокую актуальность и имеет хорошие фармакологические перспективы. В последние годы, как в России, так и за рубежом проводятся исследования по возможности применения нанокомплексов на основе фуллеренов, ферригидрита, синтетических полимеров и липосом и других нанокострукций. Принципиально значимыми являются данные о способности различных наноструктур преодолевать гематоэнцефалический барьер, проявлять антиоксидантные и нейропротекторные свойства, а также возможность их адресной доставки в мозг. Физико-химические особенности наноразмерных структур делают их перспективными для создания новых лекарственных препаратов (Сейфулла Р.Д., 2012; Amstad, E. et al. 2011; Heng H.et al.2010)
Природным протектором клеток и тканей от окислительного стресса является дипептид карнозин - антиоксидант прямого и непрямого действия. Его существенной особенностью является легкое включение в метаболические процессы с образованием используемых в обмене веществ метаболитов, гистидина и в-аланина. ( Болдырев А.А. и соавт. 2002; Boldyrev A., 2012; Boldyrev A et al. 2013).
Повысить эффективность действия карнозина можно путем его модификации, обеспечивающей устойчивость дипептида к действию карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для активного центра фермента. В данной работе на биологических моделях in vitro и in vivo впервые предпринята попытка использовать карнозин, включенный в состав фосфолипидных наноструктур, для защиты от окислительного повреждения.
В настоящее время для решения целого ряда научных задач в условиях in vitro используется клеточная культура линии РС-12. Опухолевая клеточная линия PC-12 была впервые получена в 1976 г. из хромаффинных клеток мозгового вещества надпочечников (Greene L.,Tischier A.,1976). Особенностью этих клеток является их способность к образованию нейритов в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene L., Tischier A.,1976). Дифференцировка клеток сопровождается такими характерными признаками, как формирование нейронального фенотипа, экспрессия нейрональных маркеров и секреция нейротрансмиттеров, а также определённая последовательность событий в клетке во время пролиферации, (Vandry et.al., 2002; Wesering, Ewing, 2008).
В условиях in vivo для оценки нейропротекторного действия изучаемых соединений разрабатываются различные экспериментальные модели заболеваний ЦНС на здоровых животных, что ограничивает обьективность получаемых результатов. С этой точки зрения одним из наиболее перспективных обьектов являются мыши линии SAMP1, характеризующиеся ускоренным темпом старения и сниженным уровнем антиоксидантной защиты (Stvolinskii S, et al., 2003; Федорова Т.Н. и соавт, 2005). Оценка протекторного действия наноразмерных биологически активных композиций в условиях моделирования патологических процессов в мозге, развивающихся под действием ОС, является актуальной задачей.
Цель работы: оценка защитного действия карнозина и его наноструктурного аналога в условиях индуцированного ОС in vitro (нейроны и клетки РС12) и in vivo (мыши с ускоренным темпом старения)
Задачи работы:
1. Охарактеризовать морфологические и функциональные свойства клеток PC-12, полученных в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF.
2. Выявить экспрессию мембранных белков: NMDA-рецепторов в клетках PC-12, дифференцированных под действием фактора роста нервов NGF.
3. Оценить действие индукторов окислительного стресса (H2O2, гомоцистеиновая кислота, NMDA-специфический агонист NMDA-рецепторов, полиамины и акролеин) на продукцию активных форм кислорода и гибель клеток РС-12.
4. Оценить действие наностуктурного аналога карнозина на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, в условиях ОС, индуцированного H2O2.
5. Оценить действие карнозина на рост АФК и гибель клеток PC-12 в условиях токсического влияния акролеина в зависимости от концентрации и времени инкубации.
6. Оценить действие карнозина, включённого в состав нанолипосом, на рост АФК и гибель клеток PC-12 (дифференцированных по нейрональному типу) в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина).
7. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1/SAMR1) выявить эффекты наностуктурного аналога карнозина на физиологические (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидантная активность) параметры.
Научная новизна:
Впервые на суспензии нейроно, выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) в условиях ОС, индуцированного H2O2, показано протекторное действие наностуктурного аналога карнозина в сопоставлении с карнозином.
Впервые выявлено защитное действие карнозина и его наностуктурного аналога в условиях токсического действия полиаминов (спермина, спермидина и путресцина), а также продукта их распада акролеина на рост АФК и гибель клеток PC12.
Впервые в условиях in vivo на модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1/SAMR1) выявлены позитивные эффекты наностуктурного аналога карнозина in vivo, проявляющиеся в улучшении физиологических параметров и повышении антиоксидантного статуса животных.
Теоретическая и практическая значимость: полученные результаты послужат обоснованием для разработки и применения высокоэффективных и специфичных препаратов, обладающих способностью к контролируемому транспорту в зону повреждения мозга.
Положения выносимые на защиту:
1. Полученные в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF клетки PC-12 по морфологии имеют сходство с нейронами, по функциональным свойствам характеризуются наличием NMDA рецепторов и могут быть использованы в качестве модели для изучения патологических процессов, происходящих в ЦНС.
2. Карнозин в составе нанолипосом оказывает более выраженное протекторное действие на уровень АФК и гибель нейрон-подобных клеток PC-12 относительно карнозина в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина).
3. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, проявляется в условиях ОС, индуцированного H2O2.
4. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом выявляется на модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) на физиологических (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению) и нейрохимических (общая антиоксидантная активность) параметрах.
Апробация работы:
Результаты исследований были доложены на 7 международных конференциях.
1. «Expression of Na/K-pump and N-methil-D-aspartat receptors in pheochromocytoma cells, activated by dexamethasone and nerve growth factor» Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A // Membrane Proteins: Abstracts.-Italy.-Florence.- 2009.- P.69.
2. «Dexamethasone and rhu-NGF as differentiation factors of PC-12 cells» Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A // Neurological congress: Abstracts.-Slovakia.- Martin.- 2009.- P.63.
3. «Carnosine containing nanoliposomes protect PC-12 cells and neurons from oxidative stress in vitro» Konovalova E., Karpova L., Stvolinsky S., Boldyrev A. // Carnosine in exercise and disease. Abstracts.- Belgium.- Ghent.- 2011. -P45.
4. «Нейропротекторные эффекты нанолипосом, содержащих карнозин» Е.В. Коновалова, О.А.Шадрина, О.А.Трунова, С.Л.Стволинский // International Congress «neuroscience for Medicine and Psychology» Тезисы- Украина.- Крым.- Судак.- 2012.- С.210-211.
5. «Моделирование биохимических процессов нейродегенерации и способы её коррекции» М.Г.Маклецова, Е.В. Коновалова, С.Л. Стволинский, Т.Н.Федорова // Материлы XVI Международной конференции по нейрокибернетике - Россия.- Ростов-на Дону.- 2012. -С.28-31.
6. «New mechanisms of neuroprotective carnosine action: role of polyamine system». Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. // 5th Conference on Advances in Molecular Mechanisms Underlying Neurological Disorders. Abstract book- Bath. - UK. - 2013. -P31.
7. «Polyamines neurotoxicity at the brain and ways of its correction». Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. // The 38th FEBS Congress.FEBS Journal.Abstracts-Saint Petersbourg.- Russia.- 2013.-P576.
Публикации
Материалы диссертации изложены в 2 публикациях
1. Коновалова Е.В., Федорова Т.Н., Маклецова М.Г., Березов Т.Т. Влияние карнозина на гибель клеток РС-12, индуцированную токсическим действием акролеина. // Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии.- 2013.- №6.-С.43-48 .
2. Березов Т.Т., Маклецова М.Г., Сяткин С.П., Рихирева Г.Т., Куликова О.И., Коновалова Е.В., Федорова Т.Н. Роль обмена полиаминов в функциональной активности мозга в норме и при патологии. // Журнал неврология и психиатрия им. С.С.Корсакова.- 2013.-№7.-С. 65-70.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Окислительный стресс и антиоксиданты
1.1.1. Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических условиях.
1.1.1.1 Кислородные радикалы и их повреждающее действие на клетку
Молекулярный кислород является широко распространенным окислителем в живых системах. Особенностью строения его молекулы является наличие двух неспаренных электронов с параллельным состоянием их спинов, в то время как электроны в молекулах стабильных органических соединений организованы в пары с антипараллельными спинами. По этой причине в ходе взаимодействия кислорода с окисляемыми им соединениями возможно образование короткоживущих комплексов.
Для полного исчерпания окислительной способности молекулярного кислорода и образования двух молекул воды необходимо присоединить к нему 4 электрона.
е- е-, 2Н+ е- е-, 2 Н+
О2 > О-2 > Н2О2 > ОНя + ОН- > 2 Н2О
При постадийном присоединении электронов к молекулярному кислороду образуются супероксид-анион радикал, гидропероксид и гидроксид-радикал. Изменение спинового состояния электронов в молекуле кислорода может происходить и без присоединения электронов, например, при поглощении кванта света. При этом образуется синглетный кислород, также обладающий свойствами окислителя (Болдырев А.А., 2001, табл. 1).
Гидропероксид (Н2О2), образующийся при восстановлении супероксид-аниона кислорода, является практически инертной молекулой, достоинством которой является ее гидрофобность. По этой причине гидропероксид относительно легко покидает клетки. Однако он может являться предшественником гидроксид-радикала, сильнейшего окислителя, разрушающего разнообразные структуры живой клетки, включая ДНК и белки. Гидроксид-радикал способен также атаковать ненасыщенные мембранные липиды, что приводит к развитию свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ). Финалом этой цепи превращений может стать клеточная смерть.
Гидроксид-радикал генерируется в реакции Хабера-Вайса (Haber-Weiss):
Fe2+
Н2О2 + О2? > ОН* + ОН? + Fe3+
Fe3+ + О?2 > Fe2+ + О2
и в реакции Фентона (Fenton):
Н2О2 + Fe2+ > ОН* + ОН? + Fe3+
Эта реакция катализируется ионами металлов с переменной валентностью, преимущественно Fe2+ и Cu2+, которые высвобождаются из белковых структур и становятся доступными только в условиях ацидоза.
Таблица 1. Активные формы кислорода и родственных соединений
Соединения |
Название |
Формула |
Относительная активность |
|
Радикальные Нерадикальные |
Супероксид анион Гидроперокси-радикал Гидроксид-радикал Алкоксил-радикал Липоперокси-радикал NO-радикал Пероксид водорода Синглетный кислород Гипохлорит-анион Пероксинитрит |
02? НООя ОНя LOя LOOя NOя H2O2 1O2 OCl? ONOO? |
0 1 107 104 1 Не измерена 0 1 103 102 |
В табл. 1 и 2 приведены данные о наиболее важных видах активных форм кислорода (Болдырев А.А., 2001). Они имеют разную реакционную способность, и, соответственно, характеризуются различным временем жизни.
Таблица 2. Некоторые характеристики активных форм кислорода
Форма |
Хим. символ |
Полупериод существования при 37oС, с |
Свойства |
|
Супероксид анион кислорода |
О2.- |
10-6 |
Хороший восстановитель, плохой окислитель |
|
Гидроксид- радикал |
OH. |
10-9 |
Чрезвычайно реактивен в реакциях акцепции, донирования и переноса электронов; диффундирует на очень малое расстояние |
|
Гидропероксиль-ный радикал |
HO3. |
10-8 |
Более сильный окислитель и сильнее растворяется в липидах, чем супероксид; может инициировать ПОЛ |
|
Пероксильный радикал |
ROO. |
10-2 |
Низкая окислительная активность по сравнению с OH., но более высокая диффузия |
|
Алкоксильный радикал |
RO. |
10-6 |
Эффективность взаимодействия с липидами промежуточная между ROO. и OH. |
|
Пероксид водорода |
H2O2 |
10-100 |
Оксидант, но с малыми скоростями взаимодействия с органическим субстратом. Обладает высокой диффузионной способностью |
|
Синглетный кислород |
1O2 |
10-6 |
Мощный окислитель |
|
Молекулярный кислород |
O2 |
>102 |
Умеренный окислитель |
1.1.1.2 Окисление и продукция свободных радикалов
является неотьемлемой частью метаболизма живых организмов (Papas A., 1996). Активные формы кислорода (АФК) генерируются в различных биологических системах в ходе нормального аэробного дыхания митохондрий (Boveris A., 1977), в процессе дыхательного взрыва фагоцитирующих клеток (реализации функций макрофагов), липидного переокисления, в процессе метаболизма арахидоновой кислоты (по цикло - и липооксигеназному пути), во время аутоокисления катехоламинов, а также реакций, катализируемых железом. (Sies H., 1991; Halliwell B. et al., 1995; Thomas M., 1995, Henry et al., 2001; Пономарев Т.М., 2005).
Эндогенными источниками АФК в организме являются митохондрии. Большая часть внутриклеточных активных форм кислорода образуется в митохондриях в электрон-транспортной дыхательной цепи. Компоненты дыхательной цепи встроены в митохондриальную мембрану в виде 4 белково-липидных комплексов: НАДН-КоQН2-редуктаза (комплекс I), сукцинат-КоQ-редуктаза (комплекс II), КоQН2-цитохром c - редуктаза (комплекс III) и цитохром а - цитохромоксидаза (комплекс IV). В нормальных условиях, комплекс III является главным источником образования АФК (Chen J. et al., 2003). АФК появляются в клетке в качестве побочного продукта, если кислород в дыхательной цепи митохондрий восстанавливается не полностью.
АФК образуются также за счет работы некоторых водорастворимых мембранносвязанных ферментов клеточных органелл, например, в случае ксантиноксидазы, в качестве побочного продукта. Кроме того, существуют ферменты, единственное назначение которых - генерация активных форм кислорода (NOX - восстанавливает молекулярный кислород во внеклеточном пространстве до супероксида) (Bedard K., Krause K., 2007).
Экзогенными источниками АФК являются УФ-радиация, хемотерапевтические агенты, окислительный стресс, провоспалительные цитокины, факторы роста, а также инфекционные агенты (вирусы, бактерии и паразиты). (Lo, Y. and Cruz T., 1995)
В норме свободные радикалы участвуют в выполнении важнейших физиологических процессов в организме (Болдырев А.А., Куклей М.Л., 1996; Болдырев А.А., 2001). Супероксид-анион, гидроксид-радикал и перекись водорода могут участвовать в поддержании вазоконстрикторного-вазодилятаторного баланса, обусловливающего органного кровотока.
Чрезвычайно велика роль активных форм кислорода в воспалительных реакциях, которые имеют место практически при всех типах повреждений тканей, в том числе и при ишемии. Продуцируемые свободные радикалы и АФК выполняют важные биологические функции в процессе фагоцитоза, когда активированные фагоциты продуцируют АФК и используют их затем для уничтожения таких патогенных факторов, как бактерии и вирусы (Bogdan C. et al., 2000).
Свободнорадикальное окисление является одним из естественных механизмов модификации липидного состава клеточных мембран, обусловливающим изменения их функциональных характеристик .
Вместе с тем, в настоящее время особую значимость приобрела роль АФК в нормальных физиологических процессах. Одним из весомых доказательств того, что АФК вовлекаются в нормальный метаболизм нейронов, является внутриклеточная генерация свободных радикалов (главным образом, супероксид-аниона, гидроксид- и NO-радикалов) в ответ на активацию глутаматных рецепторов, осуществляющуюся в нормальных условиях (Oyama H. et al., 1996; Boldyrev A. et al., 1999). Таким образом, АФК регулируют клеточный рост и участвуют во внеклеточной сигнальной системе, где они являются внутриклеточными сигнальными молекулами (Finkel T., 1998).
Низкий уровень АФК необходим для поддержания клеточной пролиферации. Высокое значение отводится АФК в нормальном функционировании иммунной системы. Продукция простациклина эндотелиальными клетками в метаболических реакциях арахидоновой кислоты обусловливает важную сосудистую функцию, включающую агрегацию тромбоцитов, регуляцию сосудистого тонуса и регуляцию слипания нейтрофилов.
1.1.2 Антиоксидантная система клеток
В живых организмах имеется антиоксидантная система, необходимая для контроля за продукцией активных форм кислорода и предотвращения некомпенсированного развития свободнорадикальных реакций. В ее состав входят как ферменты, так и многочисленные низкомолекулярные антиоксиданты или соединения, препятствующие образованию свободных радикалов (Табл. 3). Их согласованная работа держит под постоянным контролем как образование, так и превращение АФК в клетках.
Антиоксиданты делятся на две подгруппы: жирорастворимые и водорастворимые. Первые играют важную роль в защите основных структурных компонентов биологических мембран - фосфолипидов и белков, вторые - действуют в цитоплазме клетки и плазме крови.
Среди жирорастворимых антиоксидантов, наиболее известным является б - токоферол/ витамин Е, расположенный в клеточной мембране. б - токоферол содержит фенольное кольцо с системой сопряженных двойных связей, поэтому он легко отдает электрон, восстанавливая свободные радикалы до стабильных продуктов. Известно, что витамин Е участвует в биосинтезе гема и белков, пролиферации клеток, защищает клетки от повреждения, замедляя окисление липидов и формирование свободных радикалов, улучшает циркуляцию крови, необходим для регенерации тканей (Singh et al., 2006). Кроме того, этот витамин защищает другие растворимые жирами витамины от разрушения кислородом (витамин А). Витамин Е участвует в формировании коллагеновых и эластиновых волокон межклеточного матрикса, может замедлять старение (Li-Weber, 2002)
Кроме витамина Е, к жирорастворимым антиоксидантам относятся каротиноиды. Представитель этой группы веществ - в-каротин, который является предшественником витамина А. Известно, что каротиноиды являются «ловушками» синглетного кислорода.
К водорастворимым антиоксидантам относятся различные тиоловые соединения, биофлавоноиды и аскорбиновая кислота (витамин С). Известно, что аскорбиновая кислота является мощным восстановителем и играет важную роль в регуляции окислительно-восстановительных процессов, участвует в синтезе коллагена, обмене фолиевой кислоты и железа, а также синтезе стероидных гормонов и катехоламинов (Bobko et al., 2007). Ключевым ферментом антирадикальной защиты является супероксиддисмутаза (СОД), которая, по-видимому, представляет наиболее важный уровень клеточной защиты. У эукариот известно несколько изоформ фермента, в числе которых митохондриальная Мn-СОД, цитозольная Cu/Zn-СОД и отличная от нее Cu/Zn-СОД, определяемая во внеклеточной среде. Растительные объекты содержат в дополнение к ним еще и Fe-зависимую форму СОД. Прокариоты (Streptomices) содержат разнообразные сочетания указанных форм, а также недавно описанную Ni-СОД.
Многие патологии человека, сопровождающиеся и, возможно, вызываемые ростом АФК, протекают на фоне генетически обусловленного дефицита СОД. Таковы боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания (Olanov C., 1993). Восстановление активности мозга после перенесенного инсульта, вероятно, также протекает на фоне пониженного уровня СОД, хотя попытки лечения пациентов введением этого фермента не привели к положительному результату.
Таблица 3. Антиоксиданты в живых системах
Антиоксиданты |
Локализация |
Функция |
|
Ферменты и белки |
|||
Сu/Zn-СОД |
Эритроциты, цитоплазма |
Тушение O2.- |
|
Mn-СОД |
Митохондрии |
Тушение O2.- |
|
Внеклеточная СОД |
Плазма крови, стенки сосудов |
Тушение O2.- |
|
Каталаза |
Пероксисомы |
Тушение H2O2 |
|
Глутатион-пероксидаза |
Цитоплазма, митохондрии |
Деградация H2O2 и перекисей липидов |
|
Глутатион-трансфераза |
Клеточные мембраны, митохондрии, эндоплазматичес-кий ретикулум |
Деградация H2O2 и перекисей липидов |
|
Ферритин |
Цитоплазма |
Хелатор Fe2+ |
|
Трансферрин |
Внеклеточная среда |
Хелатор Fe2+ |
|
Лактоферрин |
Внеклеточная среда |
Хелатор Fe2+ |
|
Церулоплазмин |
Внеклеточная среда |
Хелатор Сu2+, окисление Fe2+, тушение O2.- |
|
Альбумин |
Внеклеточная среда |
Хелатор Сu2+, тушитель OH. , LOO. , НОCl |
|
Низкомолекулярные соединения |
|||
Витамин Е |
Биомембраны |
Тушение OH. , LOO. , НОCl и т. п. |
|
Убихинол |
Биомембраны |
Тушение OH. , LOO. , НОCl и т.п. |
|
Каротиноиды |
Биомембраны |
Тушение OH. , LOO. , НОCl, 1O2 |
|
Витамин С |
Цитоплазма |
Тушение OH., O2.- |
|
Карнозин |
Цитоплазма |
Тушение OH., O2.-, нейтрализация гипохлорита |
|
N-ацетил-цистеин |
Цитоплазма |
Неизбирательное тушение АФК |
|
Таурин |
Цитоплазма |
Нейтрализация гипохлорита |
|
Глутатион |
Цитоплазма, митохондрии |
Тушение OH., O2.- |
|
Мочевая кислота |
Кровь |
Предотвращение перекисного окисления липидов |
|
Билирубин |
Кровь |
Предотвращение перекисного окисления липидов |
СОД локализована преимущественно в нейронах (Delacourte A et al., 1988), а глутатионпероксидаза и глутатион - в астроцитах (Benzi G. and Moretti A., 1995).
Глутатион-зависимые антиоксидантные ферменты глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы принимают участие в нейтрализации перекисей, субстратом для которых являются как гидроперекиси липидов, так и Н2О2.
В мозге антиоксидантная ферментная система представлена в основном суперокисддисмутазой и глутатион-зависимыми ферментами (Болдырев и соавт., 2001).
Для мозга характерно низкое содержание основных компонентов антиоксидантной защиты (Halliwell B.et al., 1999; Зенков Н.К и соавт., 2001) (Табл. 4). В целом, дефицит антиоксидантной системы в мозговой ткани объясняет ее особую чувствительность к продукции свободнорадикальных соединений.
Таблица 4. Активность ферментов антиоксидантной защиты в мозге
Мозг (серое вещество) |
Печень |
||
Cu/Zn-СОД г/мг белка |
3.7 |
4.7 |
|
Каталаза Ед/мг белка |
7 |
1400 |
|
Глутатион-пероксидаза Ед/мг белка |
68 |
155 |
|
Глутатион-редуктаза (наличие) |
умеренное |
Высокое |
|
Глутатион (восст) мМ |
2 |
7-8 |
Для ткани мозга млекопитающих характерен высокий уровень аскорбата (витамина С) и глутатиона (трипептид глутамил-цистеинил-глицин) - низкомолекулярных водоростворимых антиоксидантов (Lyrer P et al., 1991; Rice M.E. 1995, 2000). Наиболее важной функцией этих соединений является нейтрализация реактивных свободных радикалов и поддержание нормального red/ox статуса нервной клетки (Cohen G., 1994).
Важной функцией аскорбата является защита клеток мозга от кислородных радикалов, генерируемых активацией глутаматных рецепторов, поскольку как каинат, так и NMDA могут быть причиной деполяризации митохондрий и увеличения ими продукции супероксид-аниона (Prehn J., 1998; Lafon-Cazal M. et al., 1993). Аскорбат, как и антагонисты глутаматных рецепторов, способен предотвратить формирование отека мозга.
Антиоксидантные свойства способны проявлять стероидные гормоны, они входят в состав естественных антиоксидантных систем организма. Так, эстрогены относятся к группе истинных антиоксидантов, которые участвуют в защите клеточных мембран от ПОЛ. Антиоксидантное действие эстрогенов считают одним из компонентов их вазопротекторного (противоатеросклеротического и противоишемического) эффекта. Экспериментально выявлено ингибирование эстрадиолом процессов ПОЛ в сердце, крови и аорте (Караченцев А.Н, Мельниченко И.А., 1997).
В настоящее время список низкомолекулярных антиоксидантов дополнен рядом других соединений, в числе которых N-ацетилцистеин, таурин, дигидролипоевая кислота, карнитин, мочевая кислота, дипептид карнозин (Packer L.et al., 1997; Naleez K.А. et al., 1997: Luo X. et al, 1999; Болдырев А.А., 1999).
1.1.3 Карнозин и родственные ему соединения
Карнозин был впервые выделен В.С. Гулевичем, который изучал состав мясного фарша. Он и назвал это соединение карнозином (от лат. сaro, carnis - мясо). Пептид не выводится из организма нерасщеплённым, а, значит, претерпевает ряд превращений. Он не расщепляется протеолитическими ферментами такими как пепсин и трипсин, не гидролизуется кишечной флорой. Работами лаборатории С.Е. Северина (1938, 1940) было показано, что в почках, селезёнке эритроцитах и печени содержится фермент карнозиназа, расщепляющий карнозин. Этот фермент был впервые выделен из почек свиньи (Hanson, Smith, 1949). В отсутствие ионов металла в окружающей среде карнозиназа расщепляет карнозин и анзерин, а в присутствие ионов кобальта может гидролизовать и другие дипептиды. Процесс синтеза карнозина был изучен в 1975 г. Разиной, которая проводила исследование с помощью метки 14С и показала, что карнозин синтезируется в реакции конденсации фермента в-аланина и гистидина, причём оба вещества встраиваются целиком, а не отдельным фрагментом. Реакция является обратимой, из чего следует, что карнозин служит источником гистидина в организме.
Дефицит гистидина в пище вызывает снижение концентрации карнозина в мышцах крыс, что было показано в работе Фуллера (Fuller et al., 1947). Наивысшая активность метаболизма карнозина была найдена в обонятельном эпителии: 0,5 мкмоль/г белка в час. В обонятельной луковице активность этого фермента составляет 1/5 активности в эпителии, а в коре мозга и мозжечке-1/50. (Болдырев, 1998). Скорость обмена в обонятельном эпителии в 10 раз выше, чем в мышце, хотя обе ткани имеют сравнимые концентрации карнозина (Margolis et al., 1985).
Существует очень много работ, посвящённых карнозину, в которых показано, что он способен проявлять различные биологические свойства. Впервые карнозин как мембранопротектор изучался Севериным (1958), в котором он отметил мембранотропный эффект карнозина на митохондрии. Позднее было обнаружено благотворное влияние карнозина на АТФ-зависимый транспорт Ca2+ фрагментами методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) а также ионов Na и K через плазматическую мембрану, что означает благотворное действие карнозина на мембраны клеток, сохраняющих способность осуществлять без утечки активный транспорт ионов H+, Ca2+, Na+, K+ (Boldyrev, 1987).
Антиоксидантные свойства карнозина были впервые продемонстрированы в опытах на ткани печени. В этих экспериментах, крысам делали инъекции карнозина и через разные промежутки времени после инъекции животных забивали и исследовали микросомы печени. В эксперименте ткань печени исследовали на устойчивость к перекисному окислению липидов, индуцированному совместным введением аскорбата и ионов Fe2+. Было установлено, что наименьшее образование перекисных продуктов в печени выявлялось в тот промежуток времени, когда в ней регистрировался наименьший прирост карнозина (15-30 мин) (Болдырев, 1997). Антиоксидантные свойства карнозина были также показаны на атерогенных липопротеинах, выделенных из донорской крови (Фёдорова Т.Н., 2003).
Показано, что в условиях усиленной эмоциональной или физической нагрузки, а также с возрастом и при развитии нейродегенеративных заболеваний, содержание карнозина в возбудимых тканях снижается, и потребности в нём не могут обеспечиваться внутренними ресурсами (собственной системой синтеза, представленной карнозинсинтазой) (Hipkiss A., 2009).
В настоящее время биологические эффекты этого дипептида значительно расширены. Установлено, что карнозин (-alanyl-L-histidine), является эффективным протектором от окислительного стресса, сочетающий как прямое антиоксидантное действие, так и модулирующие эффекты на активность вовлеченных в развитие ОС ферментов и NMDA-рецепторов (Boldyrev A., 2012). Кроме того, он обладает свойствами антигликирующего агента, хелатора ионов, промотора ранозаживления, перехватчика радикалов, молекулярного шаперона и индуктора антиоксидантных систем в условиях окислительного стресса (Bellia F., 2011). Все эти свойства привлекли к карнозину пристальное внимание как к полезному пищевому и биологически активному соединению (Hipkiss A. , 2009). В последние десятилетия в России интенсивно исследовались позитивные эффекты карнозина на различных экспериментальных моделях заболеваний ЦНС (болезнь Паркинсона, гипоксия/ишемия головного мозга и др.) (Федорова Т.Н., 2005; Boldyrev A., 2012). В пилотных клинико-биохимических исследованиях было показано, что карнозин повышает эффективность базисной терапии у пациентов с дисциркуляторной энцефалопатией (Fedorova, T. et al., 2009) и болезнью Паркинсона (Boldyrev A. et al., 2008). В настоящее время карнозин применяется как биологическая добавка, которая используется в качестве поддерживающего лечения при болезни Паркинсона, Альцгеймера и др. (Фёдорова и соавт., 2002; Fonteh A. et al., 2006; Calabrese J. et al., 2008).
В то же время, эффективность действия карнозина в организме лимитирована его гидролизом, осуществляемым специфическим ферментом - карнозиназой (Margolis, F. et al., 1983; Lenny, J.,1990). Для достижения стабильного протекторного эффекта карнозина требуется введение его избыточных доз, чтобы компенсировать гидролиз под действием специфических дипептидаз - тканевой и сывороточной карнозиназы (Lenny, J., 1990). Повысить эффективность карнозина можно путем его модификации, обеспечивающей устойчивость дипептида к действию карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для ферментов. Ранее были описаны производные карнозина, полученные путем его конденсации с Тролоксом®, обладающие основными биологическими свойствами карнозина, но при этом характеризующиеся высокой устойчивостью к карнозиназе (Stvolinsky et al., 2010). Другим подходом к этой проблеме может быть включение карнозина в наноструктурные конструкции, наиболее распространенными среди которых являются нанолипосомы.
1.1.4 Нанопрепараты и их применение
Нанолипосомы определяются как липосомы в пределах нанометрных размеров, везикулы которых образованы одно - или мультибислойными оболочками из амфифильных липидных молекул и содержат одно или несколько водных отделений (Rockville M., 2002). В последние годы как в России, так и за рубежом проводятся исследования по возможности применения нанокомплексов на основе фуллеренов, ферригидрита, синтетических полимеров, липосом и других нанокострукций. Принципиально значимыми являются данные о способности наноструктур преодолевать гематоэнцефалический барьер и проявлять заданные свойства при их адресной доставке в мозг. Физико-химические особенности наноразмерных структур делают эти конструкции перспективными для создания новых лекарственных препаратов. Уже утвержден ряд липосомальных препаратов для лечения онкологических заболеваний и различных инфекций (Zolnik B. and Sadrieh N., 2009). Выявлена перспектива использования липосом в лечении заболеваний ЦНС, включая опухоль мозга, ишемию, инфекции и энцефалиты (Zhong Y. and Bellamkonda R., 2008; Reddy M. and Labhasetwar V., 2009). В то же время, оценка протекторного действия наноразмерных биологически активных композиций в условиях моделирования патологических процессов в мозге, развивающихся под действием многофакторного ОС, является актуальной задачей. С этой точки зрения создание наноструктурных комплексов на основе карнозина в составе фосфолипидных структур - липосом - является актуальной задачей.
В настоящей работе впервые предпринята попытка использовать карнозин, включенный в состав фосфолипидных наноструктур на биологических моделях in vitro и in vivo в условиях окислительного стресса.
Нанопрепараты являются шагом в будущее для решения вопросов в области научного знания, направленного на решение технологических проблем, связанных с манипуляцией материей (атомами и молекулами) в диапазоне от 1 до 100нм (Суздалев И.П. 2009). При уменьшении размера изучаемого объекта до масштабов 100нм и менее на смену классическим физическим законом и взаимодействиям приходят квантовые, например, туннельные переходы и поверхностынй плазменный резонанс (Сейфула Р.Д., 2012). В первую очередь, разрабатываемые в настоящее время лекарства применяются в онкологии. Для этого нанолипосомы снабжаются так называемым «молекулярным компасом», в качестве которого могут выступать различные структуры, способные определить избирательное направление движение наноструктур к поражённым клеткам в орнанизме больного, а отличае от пассивного равномерного распределения по органам и тканям. Ранее применялись такие подходы, как доставка лекарств с помощью моноклональных антител, однако адресная доставка в составе наноструктур позволяет решить ряд принципиально значимых проблем:
· защитить лекарства от деградации метаболизирующими ферментами,
· увеличить селективную абсорбцию лекарств опухолевыми клетками,
· контролировать фармакокинетику лекарств,
· увеличить биодоступность лекарств внутри опухолевых клеток.
В настоящее время разработано более 200 систем адресной доставки противоопухолевых и других лекарств.
Нанопрепарат, применяемый нами в данной работе не содержит молекулярного компаса, однако выполняет все функции по защите вещества, упакованного в нанолипосому, а также облегчает транспорт и поглощения клеткой карнозина обусловленного химическим составом оболочки липидной структуры. Он равномерно распределяется по организму, проходя через ГЭБ (67%), и высвобождает карнозин в области, где происходит перекисное окисление липидов.
1.1.5 Окислительный стресс и мозг
Окислительный стресс - это нарушение баланса между продукцией свободных радикалов и механизмов антиоксидантного контроля за их содержанием. Окислительный стресс сопровождается повышенной скоростью образования свободных радикалов и снижением активности АО системы, что приводит к увеличению уровня радикальных соединений и возможной гибели клетки (Halliwell B., Gutteridge J.M.C., 1999; Ланкин В.З.и соавт., 2000). Массированная атака АФК несет сигнал о клеточной смерти, поскольку молекулярной мишенью для действия свободных радикалов являются липиды, белки и ДНК (Carney J. et al., 1996; Chan P., 1996; Hayashi T. et al., 1999).
По ряду причин мозг высоко чувствителен к окислительному стрессу (Halliwell B. and Gutteridge J., 1999; Aruoma O. and Halliwell B., 1999), что объясняется высокой интенсивностью обменных процессов в ткани мозга, отсутствием в ней запасов энергии, большим содержанием ПНЖК в нейрональных мембранах и катализаторов свободнорадикальных реакций - ионов металлов с переменной валентностью, в основном железа и меди (Halliwell B, Gutteridge J., 1984), а также особенностями кровоснабжения и относительно недостаточной активностью защитной антиоксидантной системы. Так, составляя всего 2% от общей массы тела, мозг утилизирует 20-25% получаемого кислорода. И этот уровень так велик, что превращение в супероксид-анион радикал даже только 0,1% метаболизируемого нейронами кислорода окажется токсичным для ткани (O'Brien J. and Sampson E., 1965; Ansell J., 1973). Окислительный стресс является одним из основных повреждающих факторов мозга, обусловленных нарушением его кровоснабжения.
Таким образом, свободные радикалы являются медиаторами тканевого повреждения и могут индуцировать каскад патофизиологических процессов, приводящих к дисфункции и клеточной смерти (Kehrer J., 1993) при различных патологических состояниях.
1.1.6 Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных клеток
Основным показателем гибели нервной ткани можно считать необратимую потерю ее морфологических и функциональных характеристик (Nedergaard M., 1987). Существуют два разных пути гибели клетки (Clarke P., 1990; Majno G., and Joris I., 1995) - апоптоз или некроз. Апоптоз - это запрограммированный физиологический процесс. Морфологические и биохимические признаки апоптоза после ишемического повреждения обнаруживаются как в нейронах, так и в глии (Linnic M. et al., 1993). Апоптоз может индуцироваться с помощью различных стимулов и в разных условиях, однако ишемия является превалирующим фактором для его протекания, включающим усиленную генерацию свободных радикалов (Jacobson M., 1996; Patel T. et al., 1996), в том числе NО-радикала (Nicotera P. et al., 1995); нарушение митохондриальной функции (Jacobson N. et al., 1994; Wolvertang E. et al., 1994), увеличение концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме поврежденных клеток (Nicotera P et al., 2000), активацию кальпаина, активацию каспаз - специализированных цистеиновых протеаз - непосредственных инициаторов апоптоза (Chan S. et al, 1999, 1999а) и, наконец, фрагментацию ядерной ДНК. Активация каспаз блокируется как in vivo, так и in vitro низкомолекулярными пептидами, ковалентно связывающимися с ними и инактивирующими их, что приводит как к уменьшению объема погибших ишемических клеток, так и к снижению неврологического дефицита.
Апоптические нейроны характеризуются уменьшением тела клетки, конденсацией ядерного хроматина и фрагментацией ДНК. Наиболее примечательным в процессе нейронального апоптоза является фрагментация дендритов и аксонов, которая начинается на последующих этапах этого процесса. В дальнейшем апоптические нейроны распознаются и поглощаются микроглией, такая «очистка» от апоптических клеток не вредна для соседних клеток и не вызывает воспаления (Mattson M. et al., 1998, 2000).
Критическую роль в стимулировании апоптоза играет снижение эндогенных антиоксидантов (Mignotte B. and Vayssiere J., 1998), поскольку нарушение баланса между АФК и антиоксидантами, соотношения АТФ/АДФ, индуцирует деполяризацию митохондрий в результате чего высвобождаются проапоптотические белки, активируются каспазы, непосредственные медиаторы апоптоза (Rathmell J. and Thompson C., 1999).
Исчерпывающие экспериментальные доказательства того, что апопотоз критичен для развития нервной системы возник из экспериментов in vivo на мышах, которые имели незначительные мутации различных генов, таких как Bcl-xL, каспазы 3 и 9 и гена Apaf-1. (Kuida K. et al. 1996; Motoyama N. et al., 1995). Во всех таких случаях рост образования аномалий в развитии ЦНС приводил к пренатальной смертности. Соответственно, в отсутствии гена Bcl-xL, подавляющая смертность нейронов возникала в спинном и головном мозге. Эмбриональные мыши с мутациями генов каспазы 3 и 9 выявили морфологические нарушения развития ЦНС, такие как увеличение вентрикулярной зоны и изменения формы, возникновения выпуклостей в мозге. Такие исследования доказывают, что механизмы, ответственные за раннюю гибель нейронов могут отличаться от таковых у пост- митотических нейронов, у которых ген Bcl-xL действует в направлении противоположном генам каспаз. Более того, гиперэкспрессия Bcl-2 в состоянии защитить против Ab-индуцированного апоптоза в клетках PC-12 а также в первичных кортикальных нейронах. (Behl С. et al., 1993).
Апоптотические пути также активируются через нейрональную гибель, которая возникает при острых и хронических нейродегенеративных заболеваниях, например активированные формы каспаз выявляются при дегенерации нейронов при инсульте, а также при болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера (Su J. et al., 1994). Недифференцированные, пролиферирующие клетки PC-12 подвергаются клеточной смерти при изъятии сыворотки из среды инкубации. Тем не менее, этот процесс можно остановить добавлением различных факторов выживания, таких как инсулиноподобный фактор-1 или фактор роста нервов или при помощи управления геном BT2cAMF (Yao R. and Cooper G.M., 1995, Science 267, 2003-2006).
Некроз также обусловлен стойкой генерацией свободных радикалов, повышением цитозольного уровня Са2+ и Nа+, который поддерживается за счет внеклеточного повышения уровня глутамата. Индукция некроза АФК (Troy C. and Shelanski M., 1994; Bonfoco E et al., 1995; Greenlund L. et al., 1995) показана на культуре нейронов, когда введение антиоксидантов эффективно предотвращало этот процесс (Krohn A. et al., 1998).
Гибель клеток является неотъемлемой частью развития нервной системы, где нейрогенные предшественники клеток вырабатываются в избытке и затем ликвидируются через определенное время путём миграции и дифференцировки отдельных популяций нейронов (Oppenheim R., 1991; Raff M. et al. 1993; Pettman B. and Henderson.C, 1998). Напротив, подавление клеточной гибели жизненно необходимо для поддержания неделящихся нейронов после конечной дифференцировки.
Доказано, что в экспериментальных условиях ишемии мозга нейроны могут гибнуть как по пути апоптоза, так и по пути некроза (Nicotera P. and Lipton S., 1999). Умрет ли нейрон, когда подвергнется инсульту, по-видимому, зависит от того, по какому пути он пойдет - апоптозу или некрозу, что во многом зависит от состояния митохондрий (Zaidan E., and Sims N., 1994; Kohno K. et al, 1997; Brorson J. et al., 1999).
1.1.7 Свободнорадикальное окисление липидов и антиоксидантная терапия при заболеваниях ЦНС
Особенностью перекисного окисления липидов следует считать его цепную реакцию с разрушением ненасышенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов мембран (Капелько В.И., 2000; Владимиров Ю.А. и др., 2000) условно делят эту реакцию на несколько стадий, которые получили название «инициирование», «продолжение», «разветвление» и «обрыв» цепи (Владимиров Ю.А., 2000).
...Подобные документы
Исследование системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса у млекопитающих. Экспериментальное изучение параметров, связанных с развитием окислительного стресса и метаболизмом железа, при развитии асцитной гепатомы Зайделя.
дипломная работа [1,2 M], добавлен 24.09.2012Рассмотрение и анализ основных групп факторов, способных вызвать стресс у растений. Ознакомление с фазами триады Селье в развитии стресса у растений. Исследование и характеристика физиологии стрессоустойчивости растений с помощью защитных систем.
контрольная работа [194,8 K], добавлен 17.04.2019Общая характеристика клетки: форма, химический состав, отличия эукариот от прокариот. Особенности строения клеток различных организмов. Внутриклеточное движение цитоплазмы клетки, метаболизм. Функции липидов, углеводов, белков и нуклеиновых кислот.
лекция [44,4 K], добавлен 27.07.2013Строение и функции оболочки клетки. Химический состав клетки. Содержание химических элементов. Биология опухолевой клетки. Клонирование клеток животных. А была ли Долли? Клонирование - ключ к вечной молодости? Культивирование клеток растений.
реферат [27,3 K], добавлен 16.01.2005Антиоксиданты и ингибиторы радикальных и окислительных процессов. Перекисное окисление липидов. Биологическое действие витаминов. Исследование биологической роли активированных кислородных метаболитов. Определение концентрации белка по методу Бредфорда.
курсовая работа [525,8 K], добавлен 12.11.2013Коннекторный и рестриктазно-лигазный методы конструирования рекомбинантных молекул ДНК in vitro, их применение в генной инженерии. Реакция лигирования; рестриктазные операции. Использование метода амплификации сегментов ДНК в полимеразной цепной реакции.
презентация [985,3 K], добавлен 17.08.2015Принципы классификации бактерий, их разновидности и общая характеристика. Научная классификация рода Salmonellа. Краткое описание семейства Enterobacteriaceae. Рост и развитие патогенов in vivo и in vitro. Сальмонеллезная инфекция, распространение.
курсовая работа [64,8 K], добавлен 03.06.2014Культура ткани в размножении пшеницы. Гормональная регуляция в культуре ткани, схема контроля органогенеза. Роль гуминовых кислот в процессе стимуляции роста растений, их влияние на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro.
курсовая работа [1,9 M], добавлен 05.11.2011Исследование взаимодействия чистых молочнокислых бактерий и дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae, входящих в состав микробиологического препарата "Эмбико", с корнями растений огурца (Cucumis sativus L.) сортов Конкурент и Феникс плюс in vitro.
реферат [1,8 M], добавлен 25.04.2014Методы трансгенеза в животноводстве. Использование половых клеток семенников. Факторы повышения экспрессии трансгенов в организме животных. Особенности пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro. Перспективы генно-инженерных работ в животноводстве.
реферат [38,6 K], добавлен 26.09.2009Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.
статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017Применение клеточных технологий в селекции растений. Использование методов in vitro в отдаленной гибридизации. Работы по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала. Гибридизация соматических клеток и ее основные результаты.
реферат [28,6 K], добавлен 10.08.2009Комплекс ферментов, локализованных на внутренней мембране митохондрий. Процесс окислительного фосфорилирования. Синтез АТФ на внутренней мембране митохондрий в присутствии кислорода. Компоненты дыхательной цепи. Суть хемиосмотической теории П. Митчелла.
презентация [117,1 K], добавлен 22.10.2014Современная клеточная теория. Атомный состав клетки как единицы живого, ее молекулярный состав. Обмен веществ, превращение энергии и воспроизведение. Сравнительная характеристика животной и растительной клеток. Электронограмма клеточного центра.
реферат [4,0 M], добавлен 23.05.2012Криоконсервация — заморозка биологического материала, обеспечивающая сохранение и жизнеспособность клеток после разморозки; объекты и температурный режим, криоповреждения и криопротекторы. Методы биоинженерии: экстракорпоральное оплодотворение, in vitro.
курсовая работа [57,6 K], добавлен 16.06.2014Клетка как основная единица живого. Химический состав клетки, ее элементарные частицы и характер протекающих внутри процессов. Роль и значение воды в жизнедеятельности клетки. Этапы энергетического обмена клетки, реакций расщепления (диссимиляции).
реферат [28,2 K], добавлен 11.07.2010Сходство физической природы звука и вибрации. Действие низкочастотной вибрации на клетки и ткани организма животных и человека. Патологические процессы, возникающие в результате действия вибрации. Совместное действие шума и вибрации на живой организм.
контрольная работа [20,8 K], добавлен 21.09.2009Экологические группы растений: гидатофиты, гидрофиты, гигрофиты, мезофиты и ксерофиты. Общая характеристика ультрафиолетового излучения и его роль в эволюции живого. Влияние УФ-радиации на содержание фотосинтетических пигментов. Понятие стресса растений.
курсовая работа [43,1 K], добавлен 07.11.2015Температура как экологический фактор. Температура растений. Действие температурного стресса. Картина повреждения. Причины гибели при перегреве. Гибель от охлаждения и от мороза. Устойчивость протоплазмы. Растения и высокая температура.
курсовая работа [45,0 K], добавлен 31.07.2007Тканеспецифичные стволовые клетки, стволовые клетки крови млекопитающих. Базальные кератиноциты - стволовые клетки эпидермиса. Способность клеток к специализации (дифференцировке). Регенерация сердечной ткани. Перспективы применения стволовых клеток.
реферат [25,2 K], добавлен 07.04.2014