Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом

Рис.3.13. Флуоресценция DCF в дифференцированных клетках PC-12 при действии гомоцистеиновой кислоты 500мМ и 60мин инкубации



Рис.3.14. Действие гомоцистеиновой кислоты и блокаторов NMDA рецепторов на клетки PC-12 (500мкМ, 60 мин)

Чтобы оценить механизм действия ГЦК на клетки PC-12, дифференцированные по нейрональному типу, мы по очереди добавили блокаторы NMDA рецепторов в пробу с гомоцистеиновой кислотой. DAP-5 является блокатором канальной субъединицы NMDA рецептора, в то время как MK-801 является блокатором наружной части белка NMDAR. Уровень флуоресценции нейрон-подобных клеток PC-12 при действии гомоцистеиновой кислоты составляет 166,9 отн. ед., в то время как при действии DAP-5 он снижается до 89,8 отн.ед.. В свою очередь MK-801 арестовывает действие гомоцистеиновой кислоты, значение которой после действия этого блокатора составило всего 40,58 отн. ед. Таким образом, мы можем утверждать, что действие гомоцистеиновой кислоты частично опосредовано NMDA рецепторами.

В качестве сопоставительного примера был поставлен эксперимент, в котором к пробе вместо ГЦК был добавлен пероксид водорода и блокатор MK-801. Из рис.3.15. видно, что перекись водорода вызывает рост АФК в клетках: контрольный уровень флуоресценции соответствует 10,8 отн. ед., в то время как уровень флуоресценции при действии перекиси водорода повышается до 230,2 отн.ед. Однако внесение в инкубационную среду одновременно с перекисью водорода антагониста NMDA-рецепторов MK-801 не смещает профиль распределения флуоресценции (не влияет на уровень АФК в клетках), смещенное в сторону увеличения под действием пероксида водорода. Это, в свою очередь подтверждает известный факт о том, что механизм действия пероксида водорода никак не затрагивает глутаматергическую систему клеток.

Рис. 3.15. Действие перекиси водорода на дифференцированные клетки PC-12 в условиях взаимодействия с антагонистами NMDA-рецепторов -500мкМ, 60мин

Таким образом, увеличение АФК и количества мёртвых клеток наростает пропорционально времени инкубации клеток с ГЦК. Реакция дифференцированных клеток на ГЦК специфична, действие ГЦК снимается антагонистами NMDA рецепторов.



3.3.3 Влияние полиаминов на клетки PC-12

3.3.3.1 Влияние спермина, спермидина и путресцина на недифференцированную клеточную культуру PC-12

На рисунке 3.15 приведены результаты воздействия на клетки полиаминов. По оси абсцисс отложены значения флуоресценции DCF недифференцированных клеток PC-12.

Рис. 3.16. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции DCF в недифференцированных клетках PC-12 при воздействии А- спермина, В- спермидина, С- путресцина-500 мкМ.

На рис. 3.16 представлены гистограммы распределения флуоресценции DCF контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления реагентов и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси абсцисс приведены значения самой флуоресценции DCF. Закрашенный профиль - это профиль флуоресценции контрольной группы клеток. Черная линия, наложенная поверх закрашенного профиля на рисунке А, обозначает значения флуоресценции клеток, инкубированных со спермином, В - спермидином, С - путресцином.

Профиль распределения флуоресценции полиаминов смещается вправо по оси абсцисс, то есть к большим значениям флуоресценции, что демонстрирует увеличение уровня активных форм кислорода под действием полиаминов от 296 отн.ед. в контроле до 362, 448 и 338 при действии спермина, спермидина и путресцина соответственно.

Рис.3.17. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции PI в недифференцированных клетках PC-12 при действии А- спермина, В-спермидина, С- путресцина. -500мкМ, 60мин

На рис. 3.17 представлены гистограммы распределения флуоресценции PI контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления реагентов, и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси абсцисс приведены значения самой флуоресценции PI. Закрашенный профиль соответствует распределению флуоресценции PI контрольной группы клеток. Черная линия, наложенная поверх закрашенного профиля на рисунке А обозначает значения флуоресценции клеток, инкубированных со спермином, В - спермидином, С- путресцином.

Из рис. видно, что профиль чёрной линии смешается вправо по оси, а значит значения флуоресценции увеличиваются при действии спермина, спермидина и путресцина Увеличение флуоресценции PI, в свою очередь указывает, что полиамины увеличивают смертность клеток, которая в контроле составила 27% мертвых клеток от всей популяции, а при действии спермина, спермидина и путресцина -32%, 35% и 39% соответственно.

На рис.3.18 представлено влияние полиаминов в условиях их инкубации с недифференцированными клетками РС12 в дозе 500мкМ в течение 60 мин. Как видно из рис. 3.17 инкубация клеток со спермином приводит к росту АФК на 22% относительно контроля, со спермидином - на 51% и с путресцином- на 31%. При этом рост АФК сопровождается незначительным увеличением гибели клеток: в присутствии спермина - на 6%, спермидина - на 8% и путресцина- на 12%. (рис. 3.19). Таким образом, токсическое действие полиаминов на недифференцированные клетки РС12 проявляется в значительном повышении уровня АФК.

Рис. 3.18. Влияние полиаминов на рост АФК в недифференцированных клетках РС12.

Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05

Рис. 3.19. Влияние полиаминов на гибель недифференцированных клеток РС12.

Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05

3.3.3.2 Влияние полиаминов на рост АФК и гибель клеток РС12, дифференцированных по нейрональному типу

Данные, представленные на рис. 3.20 свидетельствуют о том, что полиамины в концентрации 500 мкМ, индуцируют рост АФК и способствуют гибели клеток РС12.



Рис. 3.20. Точечная гистограмма (dot plot) распределения флуоресценции PI vs DCF в клетках PC-12, дифференцированных фактором роста нервов в контроле -A и при действии B- спермина , C-спермидина, D-путресцина. -500мкМ, 60мин

По оси абсцисс данного рисунка представлена флуоресценция DCF, по оси ординат- флуоресценция PI. На рис. 3.20 А представлена контрольная популяция. Видно, что клетки, выделенные гейтом обладают флуоресценцией по обеим осям. Однако клетки, представленные на рис.3.20.B-D обладают более интенсивной флуоресценцией клеток, что свидетельствует о накоплении внутриклеточных зондов, показывающих увеличение уровня активных форм кислорода и увеличение клеточной гибели.

Рис.3.21. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции DCF в клетках PC-12, дифференцированных фактором роста нервов при действии спермина- А, В- спермидина и С- путресцина.500мкМ 60 мин

На рис. 3.21 представлены гистограммы распределения флуоресценции DCF контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления реагентов и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси абсцисс приведены значения самой флуоресценции DCF. Закрашенный профиль - это профиль флуоресценции контрольной группы клеток.

Черная линия, наложенная поверх закрашенного профиля на рисунке А обозначает значения флуоресценции клеток, инкубированных со спермином, В- со спермидином, С-с путресцином.

Если на рис. 3.20 мы могли оценить общую картину увеличения уровня АФК под действием полиаминов, то на рис.3.21 наглядно показано, как смещается профиль распределения флуоресценции DCF вправо по оси абсцисс, свидетельствующий об увеличении уровня активных форм кислорода под действием полиаминов. В контроле он составляет 120 относительных единиц флуоресценции, а при добавлении спермина, спермидина и путресцина-150, 152 и 151 отн.ед. соответственно.

Рис.3.22. Гистограмма (histogramm) распределения флуоресценции PI в клетках PC-12, дифференцированных фактором роста нервов. А-контроль и спермин, В-контроль и спермидин, С-контроль и путресцин (500мкМ, 60 мин)

На рис. 3.22 представлены гистограммы распределения флуоресценции PI контрольной популяции, инкубировавшейся в среде без добавления реагентов, и клеток, инкубированных с полиаминами. По оси ординат откладывается количество событий с определённой флуоресценцией, по оси абсцисс приведены значения самой флуоресценции PI. Закрашенный профиль соответствует распределению флуоресценции PI контрольной группы клеток.

Черная линия, наложенная поверх закрашенного профиля на рисунке А обозначает значения флуоресценции клеток, инкубированных со спермином, В- спермидином, С- путресцином.

На рис.3.23 представлено влияние полиаминов в условиях их инкубации с дифференцированными клетками РС12 в концентрации 500мкМ, 60мин. Как видно из рис. 3.23 инкубация клеток со спермином приводит к росту АФК на 19% относительно контроля, со спермидином - на 20% и с путресцином - на 19%. При этом рост АФК сопровождается незначительным увеличением гибели клеток: в присутствии спермина - на 6%, спермидина - на 7% и путресцина- на 7%. (рис. 3.24). Следовательно, токсическое действие полиаминов на дифференцированные клетки РС12 проявляется в повышении уровня АФК.

Рис. 3.23. Влияние полиаминов на рост АФК в дифференцированных клетках РС12.

Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05.

Контрольный уровень флуоресценции DCF принимается за 100%. При действии полиаминов- спермина, спермидина и путресцина уровень флуоресценции увеличивается до 119%, 220% и 119% соответственно.



Рис. 3.24. Влияние полиаминов на смертность дифференцированных клетках РС12.

Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05.

Контрольное значение смертности клеток составляет 10% от всей популяции. При действии полиаминов оно увеличивается до 15%, 17% и 18% соответственно.

Таким образом, мы видим, что при действии спермина, спермидина и путресцина уровень АФК увеличивается как в недифференцированных, так и в дифференцированных клетках РС12, что сопровождается незначительным повышением их смертности. Причем, рост АФК под действием полиаминов более выражен в недифференцированных клетках РС12.



3.3.4 Токсическое действие акролеина на клетки РС-12 в зависимости от его дозы и времени инкубации

3.3.4.1 Влияние акролеина на рост АФК

При инкубации клеток в присутствии 10 мкМ акролеина в течение 1 ч, 3 ч и 24 ч отмечался значительный, постепенный рост АФК, пропорциональный времени инкубации: в 1,7 раза, 3 раза и 15,2 раза - соответственно, относительно интактных клеток. Инкубация клеток в присутствии 100 мкМ акролеина в течение 1 ч, 3 ч и 24 ч также выявила временную зависимость, однако в этих условиях наблюдалось более резкое увеличение АФК по сравнению с контролем: в 4,2 раза, 13,4 и 15, 3 раза - соответственно (см. рис. 3.25 и 3.26).

Рис. 3.25. Дозозависимое влияние акролеина на рост АФК в клетках РС-12. Клетки PC-12 (1-интактные), инкубированные с акролеином в концентрации 10мкМ (2) и 100 мкМ (3) Время инкубации с агентом составило 1 час. По оси абсцисс обозначены средние значения флуоресценции DCF в популяции исследуемых клеток, измеряемые в канале FL-1 проточного цитометра. По оси ординат - высота пика распределения флуоресценции измеряемых клеток.



Рис. 3.26. Продукция АФК при действии акролеина в концентрации 100 мкМ в течение 1 час (1), 3 час (2) и 24 час (3).

3.3.4.2 Влияние акролеина на гибель клеток РС-12

При воздействии акролеина в концентрации 10 мкМ на клетки в течение 1 ч, 3 ч и 24 ч происходило увеличение количества мертвых клеток в 1,6, в 4,2 и в 7 раз - соответственно относительно интактных клеток. С увеличением концентрации акролеина до 100 мкМ в аналогичных временных условиях отмечалось более выраженное увеличение числа мертвых клеток - в 6; 6,8 раз и в 8,7 раз. При этом максимальная гибель клеток (до 90%) отмечалась в условиях воздействия 100 мкМ акролеина в течение 24 ч (см. рис. 3.27).



Рис. 3.27. Гибель клеток при действии акролеина в концентрации 10 мкМ (слева) и 100мкМ (справа) в течение часа (1), трех часов (2) и 24 часов (3)

Таким образом, токсичность акролеина в отношении клеток РС-12 проявляется в увеличении уровня АФК и числа мертвых клеток пропорционально повышению концентрации акролеина и времени его воздействия на клетки. Следует отметить, что выраженная токсичность акролеина в концентрации 100 мкМ выявляется уже после его часовой инкубации и превосходит в 2,5 раза действие акролеина в концентрации 10 мкМ в эти сроки (рис. 3.28). Полученные данные указывают на то, что акролеин является фактором, запускающим развитие окислительного стресса, как это было показано в литературе (Lou J. et al., 2005).



Рис. 3.28. Дозозависимое влияние акролеина на гибель клеток РС-12. Клетки PC-12 до инкубации (1), инкубированные с акролеином в концентрации 10мкМ (2) и 100 мкМ (3). Время инкубации с агентом составило 1 час. По оси абсцисс обозначены средние значения флуоресценции PI в популяции исследуемых клеток, измеряемые в канале FL-3 проточного цитометра. По оси ординат - высота пика распределения флуоресценции измеряемых клеток.

3.3.4.3 Влияние акролеина на морфологические изменения клеток РС-12

Анализ морфологического состояния клеток РС-12 указывает на то, что под действием акролеина в концентрации 100 мкМ (рис. 3.29) происходило уменьшение размеров клеток и снижение их гранулярности, особенно значимое в условиях 24 ч инкубации. В целом представленные данные свидетельствуют о том, что подобные морфологические изменения являются типичными для гибели клеток по пути некроза.

Рис. 3.29. Изменение морфологических признаков клеток при действии акролеина в концентрации 100 мкМ (справа) в течение 24 ч. График представлен в виде точечной гистограммы в координатах прямого и бокового светорассеяния.

3.4 Защитное действие карнозина на клетки PC-12, в условиях окислительного стресса, индуцированного акролеином

В наших исследованиях по оценке влияния карнозина на уровень АФК и гибель клеток РС-12, подвергшихся окислительному стрессу под действием акролеина, были предприняты два экспериментальных подхода. В одном случае карнозин вводился в культуру клеток до воздействия акролеина, в другом - карнозин добавляли после инкубации клеток с акролеином в течение 1,3 и 24 час.

3.4.1 Защитное влияние карнозина на рост АФК

Предварительное введение карнозина в инкубационную среду до акролеина, независимо от его концентрации, способствовало снижению роста АФК, наиболее значимому после 24 ч инкубации: карнозин примерно в 5 раз снижал рост АФК, индуцированный до 10 мкМ акролеина и примерно в 2 раза снижал рост АФК, индуцированный 100 мкМ акролеина (рис. 3.30).

Эффект от внесения карнозина в инкубационную среду после действия акролеина зависел от дозы акролеина: так при концентрации акролеина 10мкМ в среде карнозин способствовал значительному (в 2 раза) предотвращению роста АФК, регистрируемых в течение 24 часов (см. рис. 3.30.А). Также прослеживалась тенденция к снижению АФК в течение трёх первых часов инкубации с акролеином, однако эффект не столь выражен, поскольку уровень АФК при действии акролеина 10 мкМ в течение 1 и 3х час инкубации возрастал незначительно.

В то время как при концентрации акролеина 100 мкМ защитное действие карнозина проявлялось в условиях 3х часовой инкубации с акролеином(снижение роста АФК в 1,8 раза). Введение карнозина после инкубации клеток в течение 24 часов с акролеином 100 мкМ не предотвращало рост АФК и тем самым не оказывало защитного действия на клетки РС12 (см. рис. 3.30.В).

Рис. 3.30. Влияние различных сочетаний введения карнозина и акролеина на флуоресценцию активных форм кислорода (A - акролеин 10 мкМ, B- акролеин в концентрации 100мкМ) на флуоресценцию DCF клеток PC-12. -контроль, -акролеин, - последующее действие карнозина на фоне акролеина, - предварительное действие карнозина на фоне акролеина.

Таким образом, наиболее выраженный защитный эффект карнозина в отношении предотвращения роста АФК выявлялся в условиях его предварительного введения до акролеина. Введение карнозина после инкубации клеток с акролеином оказалось менее эффективным, однако прослеживался его позитивный эффект в условиях 24 ч инкубации в присутствии 10 мкМ акролеина, а также после 3 ч инкубации с акролеином 100 мкМ.

Рис. 3.31. Влияние различных сочетаний введения карнозина и акролеина на смертность клеток PC-12 (A - акролеин 10 мкМ, B- акролеин в концентрации 100мкМ) на флуоресценцию DCF клеток PC-12. -контроль, -акролеин, - последующее действие карнозина на фоне акролеина, - предварительное действие карнозинана фоне акролеина.



3.4.2 Защитное влияние карнозина на гибель клеток

Карнозин в условиях его предварительного введения предотвращал гибель клеток, индуцированную акролеином независимо от его концентрации и сроков инкубации: в условиях инкубации с 10 мкМ акролеина карнозин в 1,8-2 раза снижал гибель клеток в условиях 3 час и 24 час. инкубации (см. рис. 3.31.А); в условиях инкубации с 100 мкМ акролеина карнозин также снижал гибель клеток в 1,7 - 2,6 - 1,5 раза в условиях инкубации в течение 1-3-24 час - соответственно (см. рис. 3.31.В)

В то время как защитное действие карнозина, вводимого после 10 мкМ акролеина оказалось наиболее выраженным при 24 часовом воздействии (в 1,3 раза). Токсическое действие 100 мкМ акролеина достоверно предотвращалось карнозином только при 1 часовой инкубации, в этих условиях карнозин снижал гибель клеток в 1,7 раза. Во всех остальных случаях, по-видимому, можно говорить только о тенденции к снижению количества мертвых клеток при последующем (после 100мкМ акролеина) воздействии карнозина.

Таким образом, в данной работе впервые выявлено защитное действие карнозина на акролеин - индуцированную гибель клеток культуры РС-12 и рост АФК, эффективность которого определялась токсичной дозой акролеина, времени инкубации в его присутствии, а также способа введения карнозина. Результаты проведенного исследования являются убедительным доказательством возможности использования клетки РС 12 как тест - системы для оценки токсичности альдегида акролеина, а также протекторного действия антиоксидантов.

3.5 Защитное действие карнозина на клетки PC-12, дифференцированные по нейрональному типу

В настоящей главе представлены результаты оценки антиоксидантной способности карнозина в составе нанолипосом на клетки культуры PC-12, дифференцированные по нейрональному типу в условиях окислительного стресса.

3.5.1 Исследование влияния карнозина на клетки РС12, инкубированные с перекисью водорода

На рис. 3.32 показана величина флуоресценции клеток из региона R3, отражающая уровень АФК. Инкубация клеток с 5 мМ перекиси водорода приводит к значительному (в 2 раза) повышению уровня АФК. Карнозин способствует снижению уровня АФК относительно клеток, инкубированных с перекисью водорода, однако остается повышенным относительно контрольных значений.

Рис. 3.32. Действие 1мМ карнозина на клетки РС12, стимулированные NGF в условиях неспецифического окислительного стресса, индуцированного 5 мМ Н₂О₂ из региона R3. * -достоверность отличий от контроля. * * - достоверность отличий от группы с Н₂О₂ p<0,05

На рис. 3.33 представлены величины флуоресценций DCF в клетках культуры PC-12, находящихся в условиях окислительного стресса, вызванного специфическим индуктором - NMDA (1 мМ).

Рис. 3.33. Действие карнозина на клетки РС12, стимулированные NGF в условиях специфического окислительного стресса 1 мМ NMDA. *-достоверность отличий от контроля. **- достоверность отличий от группы с NMDA, p<0,05

Инкубация нейрон-подобных клеток с 1 мМ NMDA приводит к заничельному повышению уровня АФК относительно контроля (в 3 раза); при этом введение карнозина вместе с NMDA препятствует росту АФК до уровня контрольных значений.

Таким образом, нейрон-подобные клетки из региона R3 отвечают на действие как неспецифического (перекись водорода), так и специфического (NMDA) индуктора ОС. При этом эффективность карнозина в отношении препятствия росту АФК в этом регионе более выражена в условиях индукции ОС NMDA.

3.5.2 Влияние карнозина на дифференцированные клетки PC-12 в условиях окислительного стресса, индуцированного гомоцистеиновой кислотой

Инкубация клеток с 500 мкМ ГЦК в течение 1 час приводит к повышению уровня АФК относительно интактных клеток (см. раздел 3.3.2.) на 30% относительно уровня АФК в интактных клетках (принятого за 100%).

Рис.3.34. Карнозин снижает уровень АФК при действии ГЦК на клетки PC12, дифференцированные по нейрональному типу

Инкубация клеток в аналогичных условиях в присутствии 1мМ карнозина приводит к снижению уровня АФК на 40% относительно уровня АФК в интактных клетках (принятого за 100%) и на 70% относительно уровня АФК в клетках, инкубированных только с ГЦК (рис.3.34). Инкубация с карнозином снижает уровень АФК на 70%.

3.5.3 Оценка антиоксидантной активности карнозина в составе нанолипосом

Повысить эффективность действия карнозина и защитить его от действия карнозиназ можно путем загрузки его в нанолипосомальную конструкцию. Нанолипосомы, встраиваясь в мембрану клетки, высвобождают карнозин непосредственно внутрь клетки.

Рис.3.35.Точечная гистограмма распределения контрольных (А) клеток PC-12, дифференцированных фактором роста нервов в координатах прямого и бокового светорассеивания а также клеток, инкубированных в среде содержащей нанолипосомы с карнозином (В). (А-medium, В-medium plus nanoliposomes containing carnosine).

По оси абсцисс откладывается боковое светорассеяние (Side scatter), которое является показателем гранулярности клеток. По оси ординат представлено прямое светорассеяние (foreword scatter), указывающее на размер изучаемых частиц.

На рисунке 3.35 представлена популяция нейрон-подобных клеток в координатах Fcs vs Scc. Внизу, ближе к левому углу (см. рис.3.35 А) расположены мелкие клетки и обломки клеток. Ближе к правому верхнему углу видна дополнительная популяция клеток, обладающая высокой гранулярностью и маленькими размерами (см. рис. 3.35 B). Очевидно, что это нанолипосомы, содержащие карнозин. Нанолипосомы добавлялись к клеткам в избытке, поэтому не все нанолипосомы встроились в клетки. При этом концентрация карнозина в липосоме составила - 450 мМ, в жидкости - 50мМ и конечная концентрация карнозина в пробе составила 1 мМ.



3.6 Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на дифференцированные клетки РС12 в условиях ОС, индуцированного полиаминами.

3.6.1 Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на уровень АФК клеток РС12, при инкубации их с полиаминами

Индукция ОС полиаминами (500мкМ спермина, спермидина и путресцина) в течение 60 мин приводит к одинаковому достоверному повышению уровня АФК (на 20 % относительно флуоресценции интактной культуры клеток) (см рис 3.36). Предварительное внесение в инкубационную среду (за 60 мин), содержащую полиамины, карнозина снижает рост АФК на 30% относительно проб, содержащих только полиамины; еще более эффективно действует карнозин, ключенный в состав нанолипосом - он снижает уровень АФК приблизительно на 55%. Видна небольшая (на 25%), но достоверная разница во влиянии на клетки карнозина и нанокарнозина, которая лучше всего проявляется в случае с путресцином.

В качестве контроля была использована популяция клеток, инкубировавшаяся в среде с добавлением пустых, не содержащих карнозин, нанолипосом. Флуоресценция этой группы клеток не отличается от популяции клеток, инкубировавшихся в среде без добавления как-либо реактивов. Достоверно не отличается от контроля флуоресценция клеток, инкубированная в среде, содержащей карнозин в течение 1ч. В отличие от этих данных, внесение в популяцию клеток карнозин-содержащих липосом приводит к достоверному снижению в них уровня АФК - на 40% относительно контроля и популяции карнозин-содержащих клеток.

Рис. 3.36. Флуоресценция активных форм кислорода при воздействии карнозина и карнозин содержащих нанолипосом на клетки PC-12, дифференцированные фактором роста нервов при инкубации с биогенными аминами (спермин, спермидин, путресцин).

По оси ординат отложены значения флуоресценции DCF в процентах. Med- (medium) среда, nl-(nanoliposomes) пустые не содержащие карнозин нанолипосомы, carn-(carnosine), nlcc-(nanoliposomes containing carnosine) нанолипосомы содержащие карнозин, sp-(spermine) спермин, sd-(spermidine) спермидин, pc-(putrescine) путресцин. - полиамины, - карнозин, -нанолипосомы, В качестве контроля использовали пробы с липосомами, не содержащими карнозин. *-достоверность различий от контроля, **-достоверность различий между действием полиаминов и действием ПА на фоне карнозина, ***-достоверность различий между карнозином и нанокарнозином. Статистическая обработка проводилась по тесту Манна- Уитни. Достоверными принимались значения при p<0,05

3.6.2 Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на гибель клеток РС12, индуцированную полиаминами

Смертность клеток в условиях токсического действия полиаминов (спермина, спермидина и путресцина) увеличивается на 50 % относительно контроля. Предварительное (за 60 мин) внесение карнозина в инкубационную среду, содержащую полиамины приводит к небольшому снижению гибели клеток - на 2-4 % в абсолютных процентах шкалы (с 16% до 14%- в случае со спермином, с 17% до 13% при инкубации со спермидином и с18 % до 15% в случае с путресцином); в то же время добавление карнозина в составе нанолипосом в значительной степени защищает клетки от гибели: смертность клеток в пробе падает до уровня, сопоставимого с уровнем смертности клеток в пробах, содержащих только нанолипосомы с карнозином.

Рис. 3.37. Уровень смертности дифференцированных фактором роста нервов NGF клеток PC-12 при окислительном стрессе, инициированном полиаминами и действии карнозина и нанокарнозина.

Med- (medium) среда, nl-(nanoliposomes) пустые не содержащие карнозин нанолипосомы, carn-(carnosine), nlcc-(nanoliposomes containing carnosine) нанолипосомы содержащие карнозин, sp-(spermine) спермин, sd-(spermidine) спермидин, pc-(putrescine) путресцин. - полиамины, -карнозин, -нанолипосомы. Значения смертности клеток в разных условиях, выражены в процентах.(500мкМ, 60мин). Статистическая обработка проводилась по тесту Манна- Уитни. Достоверными принимались значения при p<0,05

Как видно из рис. 3.37 гибель клеток в контроле составляет 10 % от общей доли измеренных клеток. «Пустые» липосомы, не содержащие карнозина не изменяют эти значения. Внесение карнозина в интактную культуру снижает смертность клеток на 30% при инкубации в течение 1 ч.; в этих же условиях карнозин, включенный в состав нанолипосом снижает этот показатель на 50 % относительно контроля.

Таким образом, мы показали, что полиамины в концентрации 500 мкМ активируют процессы окислительного стресса в клетках PC-12, дифференцированных фактором роста нервов, что приводит к росту активных форм кислорода и увеличению гибели клеток. «Пустые» нанолипосомы не влияют как на уровень АФК, так и на гибель клеток. При этом эффективность действия карнозина, включенного в состав нанолипосом на защиту клеток от роста АФК сопоставима с действием карнозина. Выявляется явное преимущество карнозина, включенного в состав нанолипосом в отношении предохранения клеток от гибели - смертность клеток, обусловленная его действием, оказалась на 60% ниже относительно самого карнозина.

3.7 Защитное действие нанолипосомальных структур, содержащих карнозин на нейроны головного мозга мышей линии SAMP1/SAMR1 в условиях окислительного стресса

3.7.1 Окислительный стресс in vitro cоздавали инкубацией суспензии выделенных гранулярных клеток мозжечка мышей линии SAMR1 с пероксидом водорода в присутствии и в отсутствие карнозин содержащих нанолипосом (КСЛ). Конечная концентрация карнозина, внесенного в составе КСЛ в суспензию нейрональных клеток, составляла 2,65 мМ.

Таблица 3.5. Уровень АФК в гранулярных клетках мозжечка мышей линии SAMR1 в условиях инкубации с КСЛ и нанолипосомами

Уровень АФК	Контрольные клетки	Клетки после инкубации с «пустыми» нанолипосомами	Клетки после инкубации с КСЛ
Среднее значение флуоресценции DCF (отн.ед.)	15,6 ±0,7	14,0±0,5	10,0±0,4 ?

(*) - p<0,05 по отношению к контролю (интактные гранулярные клетки, t-критерий Стъюдента)

Используемые в экспериментах in vitro гранулярные клетки мозжечка характеризовались уровнем флуоресценции DCF (15,6 ±0,7 отн. ед.), соответствующим стационарному уровню активных форм кислорода (АФК). Инкубация клеток с «пустыми» (не нагруженными карнозином) нанолипосомами не оказывала существенного влияния на уровень флуоресценции (14.0±0,5 отн. ед., рис.3.30Б). В этих же условиях КСЛ отчетливо снижали уровень АФК (до 10±0,4 отн. ед., рис.3.30В), что указывает на их антиоксидантную активность (рис. 3.38).



Рис. 3.38. Влияние карнозинсодержащих нанолипосом на стационарный уровень АФК в изолированных гранулярных клетках мозжечка мышей SAMR1. А - интактные гранулярные клетки, Б - клетки после инкубации с нанолипосомами, В - то же с КСЛ-. (*) - p<0,05 по отношению к контролю, t-критерий Стъюдента)

Для оценки антиоксидантной активности нанолипосом в суспензии клеток мозжечка мышей SAMR1 индуцировали ОС под действием перекиси водорода (Рис. 3.39) Уровень АФК при инкубации нейронов в течение 30 мин с 3,5 мМ Н₂О₂ увеличивался примерно в 3 раза (до 297,65%) относительно контроля, принятого за 100% (рис. 3.39А). Внесение в инкубационную среду за 30 мин до индукции ОС карнозинсодержащих нанолипосом (до конечной концентрации 2,65 мМ карнозина) подавляло рост АФК, уровень которых (95,2%) был при этом сопоставим с контролем (рис. 2Б). При этом также снижалась и смертность нейронов: в популяции клеток, содержащихся в среде с пероксидом водорода, эта величина составляла 21,2±3,0%, а в присутствии КСЛ она не превышала 15,4±2,9%.

Рис. 3.39. Индукция окислительного стресса в выделенных клетках мозжечка мышей SAMR1 пероксидом водорода (3.5 мМ, 30 мин) в отсутствие (А) и в присутствии карнозинсодержащих нанолипосом (Б). Серый фон - интактные клетки, черная линия - после инкубации с Н₂0₂: по оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс - относительные единицы флуоресценции АФК

Таким образом, нанолипосомы, содержащие карнозин, эффективно снижают накопление АФК в суспензии нейрональных клеток. «Пустые» нанолипосомы в условиях окислительного стресса не препятствовали накоплению внутриклеточных радикалов и гибели клеток.

3.7.2 Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой гипобарической гипоксии у мышей линии SAMP1.

На рис. 3.40 и в табл. представлены результаты экспериментов по оценке влияния КСЛ на устойчивость мышей к гипоксии. Видно, что время до потери позы (ВПП) у контрольных животных линии SAMR1(34,92±9,6 сек.) почти вдвое превышает этот показатель у животных линии SAMP1 с ускоренным темпом старения (18.83±7.59сек.); время жизни на высоте в условиях гипоксии до остановки дыхания (ВЖ) у мышей контрольной линии также больше (70,77±24,01 сек.), чем у мышей SAMP1 (52.0±14.7 сек). Напротив, время реституции - восстановление активной позы от момента перемещения животного в условия нормального атмосферного давления (ВР) у быстро стареющих мышей SAMP1 (92.92±35.77 сек.) выше, чем у контрольной линии - SAMR1 (68,36±21,65 сек). Введение мышам линии SAMR1 препарата нанолипосом, нагруженных карнозином, перед гипоксическим воздействием достоверно повышало ВПП (47,77±18,75 сек) и ВЖ (93,62±25.81 сек) и уменьшало ВР (49,0± 16,03 сек) - (см. рис. 3.40 А). В отличие от мышей линии SAMR1 введение КСЛ мышам линии SAMP1 улучшало только один показатель - ВР (67.17±23.29 сек) (см. рис. 3.40Б).

Рис. 3.40. Влияние КСЛ на устойчивость мышей линии SAMR1 (А) и SAMP1 (Б) к воздействию острой гипобарической гипоксии (карнозинсодержащие нанолипосомы вводили за 1 ч до гипоксии) (*) - p<0,05 по отношению к контролю

Еще одним информативным показателем оценки эффективности антигипоксического действия КСЛ может быть отношение времени реституции (ВР) к времени жизни на высоте (ВЖ). В условиях ОГГ без введения КСЛ у мышей контрольной линии SAMR1 составил 0,96; у быстростареющих (SAMP1) - 1,79. В то же время на фоне применения КСЛ значения этого параметра составили 0,52 и 1,23 - соответственно. Исходя из полученных данных, можно полагать, что этот параметр характеризует повышение адаптационных возможностей организма под действием КСЛ в условиях ОГГ.

Таблица 3.4. Устойчивость мышей SAM к гипоксии

	Условия эксперимента	Потеря позы (сек)	Остановка дыхания	Реституция
SAMR1	ОГГ без введения КСН	34,9±9.6	70.8±24,0	68.4±21,6
	ОГГ на фоне КСН	47,8±18.7*	93.6±25,8*	49.0±16,0*
SAMP1	ОГГ без введения КСН	18,8±7.6	52.0±14,7	92.9±35,8
	ОГГ на фоне КСН	19±6,0	55.2±14,4	67.2±23,3*
(*) р<0.05 по отношению к животным, подвергнутых действию ОГГ без введения КСН

Для оценки влияния нанолипосом, содержащих L-карнозин, на общую антиоксидантную активность в ткани мозга измеряли суммарное восстановление радикала ДФПГ. Введение КСЛ приводило к повышению суммарной антиоксидантной активности в мозге мышей обеих линий. При этом у мышей с нормальным темпом старения (SAMR1) отмечалось более выраженное антиоксидантное действие нанолипосомального карнозина (см. табл.3.5), что соответствует лучшим показателям устойчивости к гипоксическому воздействию, характерным для этой линии животных (см. рис. 3.40).



Табл. 3.5. Влияние карнозинсодержащих нанолипосом (введение за 1 час до ОГГ в дозе 48 мг/кг массы тела) на суммарную антиоксидантную активность экстрактов из ткани мозга, определяемую по восстановлению ДФПГ-радикала.

Линейные мыши	Восстановление ДФПГ, мкмоль/г ткани
	ОГГ	ОГГ на фоне введения нанолипосом, нагруженных карнозином
SAMR1	5,1 ± 1,0	6,3 ± 1,1*
SAMP1	4,6 ± 0,74	5,3 ± 0,48

Примечание: (*) р<0,05 по отношению к животным, подвергнутым действию ОГГ без введения нанолипосом, нагруженных карнозином (U-критерий Манна-Уитни).

Таким образом, в опытах in vitro и in vivo у мышей, характеризующихся ускоренным темпом старения (SAMP1) и их контрольной линии (SAMR1), в условиях окислительного стресса впервые была выявлена антиоксидантная активность нанолипосом, содержащих карнозин. В опытах In vitro в суспензии нейрональных клеток, выделенных из мозжечка мышей линии SAMP1/SAMR1 КСЛ подавляли образование активных форм кислорода и препятствовали их гибели в условиях индукции окислительного стресса перексидом водорода. При этом механизмы защиты нейронов от ОС, обусловленные действием КСЛ сопоставимы со свободным L- карнозином. С другой стороны, в опытах in vivo в условиях воздействия на мозг окислительного стресса, вызванного острой гипобарической гипоксией, были получены данные, указывающие на способность КСЛ защищать мозг от гипоксии. Профилактическое введение этого препарата мышам приводило к улучшению физиологических показателей устойчивости мозга к гипоксическому воздействию и повышению его суммарной антиоксидантной активности, более выраженным у мышей с нормальным темпом старения (SAMR1). Следует отметить, что эффективность L-карнозина, вводимого мышам в составе нанолипосом в дозе 48 мг/кг, сопоставима с действием L-карнозина, вводимого крысам линии Wistar в дозе 100 мг/кг до воздействия ОГГ. Таким образом, полученные результаты как в экспериментах in vitro, так и in vivo указывают на высокую антиоксидантную и нейропротекторную активность КСЛ, превышающую аналогичные эффекты карнозина. Поскольку карнозин как природное активно метаболизирующее соединение имеет ограниченное время жизни в организме, подвергаясь расщеплению специфическим ферментом карнозиназой, можно полагать, что нанопрепарат, созданный на его основе будет иметь большую длительность антиоксидантной активности за счет увеличения времени жизни в организме, что может обеспечить повышение эффективности его действия. В целом, нанопрепарат L-карнозина может рассматриваться как перспективная наноконструкция, обладающая антигипоксическими и антиоксидантными свойствами.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Роль окислительного стресса (нерегулируемого образования активных форм кислорода) и состояния эндогенной антиоксидантной системы организма в развитии патологических процессов в ЦНС показана как в экспериментальных, так и клинико-биохимических исследованиях (Федорова Т.Н., 2004, 2005; Dobrota D. et al., 2005). Развитие окислительного стресса активирует каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза (программируемой клеточной гибели) или некроза, что может приводить к дальнейшему развитию неврологического дефицита и ухудшению состояния пациентов с различными заболеваниями ЦНС, такими как сосудистые и нейродегенеративные заболевания головного мозга.

В настоящее время окислительные повреждения мозга рассматриваются современной неврологией как значимый фактор патогенеза заболеваний, при этом доказана целесообразность введения в схемы лечения препаратов антиоксидантного действия (Верещагин Н.В. и соавт, 2004; Суслина З.А. и соавт, 2000, 2003, 2007; Максимова М.Ю. и Федорова Т.Н., 2013). Однако антиоксидантная терапия и профилактика заболеваний ЦНС все еще не находят широкого применения из-за недостаточной специфичности и эффективности, а также узкого спектра имеющихся препаратов. В связи с этим разработка новых антиоксидантных препаратов сохраняет высокую актуальность.

Одним их наиболее перспективных антиоксидантов является природный дипептид карнозин, протектор клеток и тканей от окислительного стресса. В настоящее время установлено, что в возбудимых тканях животных карнозин является природным гидрофильным антиоксидантом прямого действия (Болдырев А.А., 2012).

На различных экспериментальных моделях (ишемия/реперфузия головного мозга крыс, паркинсонизм была продемонстрирована защитная функция карнозина как при его профилактическом, так и постишемическом введении. Профилактическое введение карнозина повышало активность митохондриальной супероксиддисмутазы и предотвращало развитие окислительного стресса в ткани мозга, что коррелировало с улучшением неврологической симптоматики, снижением смертности и восстановлением двигательной активности, а также с улучшением процессов памяти животных (Федорова Т.Н., 2004; Багыева Г.Х., 2009).

Глобальная (3-х сосудистая) ишемия головного мозга, отягощенная систематическим введением 3-НПК, позволила выявить выраженную неврологическую симптоматику, коррелирующую со значительными метаболическими сдвигами и высокой смертностью животных. Курсовое введение карнозина в постишемическом периоде на фоне 7-14 дневной реперфузии защищает мозг от окислительных повреждений, что сопровождается снижением неврологической симптоматики и смертности животных (Федорова Т.Н. и соавт., 2002) .

Получены новые данные о патогенезе нейродегенерации при исследовании уникальной экспериментальной модели паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone), характеризующихся высоким стационарным уровнем свободных радикалов в их тканях. Эта модель отличается ускоренной динамикой развития возрастных изменений и четко выраженной симптоматикой в ответ на введение МФТР. Установлено, что у мышей SAMP1 после введения МФТР имеют место выраженные нейрохимические нарушения, сопровождающиеся развитием окислительного стресса в мозге. Нарушение поведенческих реакций в результате воздействия МФТР свидетельствует о возникновении повреждений в области черной субстанции и в связанной с ней дофаминергической системе мозга. Окислительный стресс и его патофизиологические проявления в ткани мозга быстростареющих мышей с экспериментальным паркинсонизмом предотвращается курсовым введением карнозина, препятствующего угнетению двигательной активности животных и развитию мышечной ригидности. Нейропротекторный эффект карнозина позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной системы мозга, а также защищать белки и липиды от окислительной модификации (Багыева Г.Х., 2009).

Полученные результаты позволили обосновывать целесообразность включения карнозина в комплексную терапию заболеваний ЦНС, сопровождающихся развитием ОС. В Научном центре неврологии РАМН было проведено стандартизованное (двойное слепое плацебо контролируемое) исследование, при котором карнозин применяли для лечения пациентов с нарушениями мозгового кровообращения. Больные с перенесенным ишемическим инсультом были случайным образом разделены на две группы - одна получала стандартное лечение, а другой одновременно со стандартным лечением давали карнозин. Кроме оценки неврологической симптоматики, проводили исследование реакции слухового центра коры на сдвоенные импульсы (потенциалы Р300) и анализ эндогенной антиоксидантной активности липопротеинов плазмы крови. По окончании 20 дневного курса лечения наблюдалось улучшение в неврологической симптоматике, в различении сдвоенных импульсов слуховой областью коры и в восстановлении эндогенной антиоксидантной защиты у пациентов, принимающих карнозин в качестве дополнительного лечения (Федорова и соавт, 2008). Действие карнозина было дозозависимым (применяли дозы 0,75 и 2 г в день). Другим примером явилось усиление эффективности лечения болезни Паркинсона при комбинации стандартной терапии с применением карнозина (1,5 г ежедневно) (Boldyrev A., et al., 2008). В этом случае после 30 дневного лечения наблюдали снижение стационарного уровня окисленных белков и липидов в липопротеинах плазмы крови, возрастание устойчивости к Fe2+индуцированному окислению липопротеинов плазмы крови, снижение активности тромбоцитарной МАО В и возрастание активности эритроцитарной Cu/Zn СОД. Все эти процессы протекали на фоне устойчивого снижения неврологической симптоматики.

В то же время присутствие в крови карнозиназы, фермента разрушающего карнозин требует введение высоких доз этого препарата, что лимитирует его использование в клинической практике. Повысить эффективность действия карнозина, защитив его от действия ферментов распада, можно путем его включения в наноструктурные конструкции.

Результаты исследования, проведенного в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБУ «НЦН» РАМН, биологической эффективности наноструктур различной природы на едином методологическом уровне выявили следующие закономерности. Так, исследованные водорастворимые производные фуллеренов характеризуются наличием собственной прооксидантной активности в культуре переживающих нейрональных клеток, тогда как наблюдающееся при этом увеличение пула активных форм кислорода не сопровождается при короткой экспозиции (30 мин) повышением клеточной гибели. В противоположность этим данным, значительная антиоксидантная активность по отношению к карнозину была выявлена у карнозина, включенного в состав нанолипосом. Исходя из полученных данных в качестве перспективной наноконструкции был выбран карнозин, включенный в нанолипосомы.

В связи с этим, нами была поставлена задача впервые оценить антиокидантную способность карнозина, включенного в состав нанолипосом в экспериментальных условиях. Экспериментальные исследования in vitro были проведены на суспензии нейрональных клеток мозжечка, выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения и на клетках PC-12.

Основным объектом экспериментальных исследований стала клеточная культура РС-12, дифференцированная по нейрональному типу. Для оценки адекватности используемой модели был проведен анализ морфологического состояния этих клеток, а также экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных фактором роста нервов NGF. Результаты проведенных исследований показали, что полученные в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF клетки PC-12 по морфологии имеют сходство с нейронами, по функциональным свойствам характеризуются наличием NMDA рецепторов. Эти данные согласуются с работой, в которой степень NGF- индуцированной дифференциации клеток PC-12 также оценивалась по изменению морфологических характеристик и нейрохимических параметров (Das K.P et al., 2012). Эта недорогая и легко поддерживаемая культура характеризуется морфологией дифференцированных нейронов в результате NGF-стимуляции. Дифференцированная по нейрональному типу культура клеток РС-12 показывает увеличение уровня фосфорилирования ERK1 / 2 , JNK / SAPK и Akt , но не p38MAPK. Поскольку фосфорилирование р38МАРК подавляет рост аксонов, этот факт может быть использован на практике при создании лекарственных препаратов или альтернативных лекарственных средств для лечения и профилактики неврологических заболеваний (Brassica L.et al., 2013).

Индукция окислительного стресса различными химическими агентами в недифференцированных и дифференцированных клетках PC12 выявила определенные особенности клеточного ответа в этих клетках. В данной работе в условиях in vitro было показано, что инкубация клеток РС12 с NMDA или с ГЦК приводит к росту АФК и этот процесс при длительной инкубации приводит к некротической смерти клеток.

NMDA-рецепторы играют важную роль в функционировании организма человека. Они участвуют и передаче сигналов при реализации важнейших его функций, таких как формировании памяти и выработке поведенческих реакций (Болдырев и др., 2004). Большинство рецепторов располагаются в кортикальных структурах, базальных ганглиях и сенсорно-ассоциативных системах. В настоящее время интерес учёных привлёк факт обнаружения NMDA рецепторов на мембранах клеток не нейронального происхождения, таких, например, как лимфоцитах (Mashkina et al., 2007).

NR1 субьединицы кодируется одним геном, который имеет три области альтернативного сплайсинга -N1, C1 и C2 и могут быть представлены восьмью вариантами сплайсинга. (Arseima Y Del Valle-Pinero et al., 2007). Экзон N1 и C1 могут присутствовать или отсутствовать, не изменяя при этом функций NR1 белка. N1 находится вне клетки и взаимодействует с различными фармакологическими модуляторами канала, включающими цинк, протоны и полиамины (Dingledine et al. 1999). С-концевой участок белка контролирует экспрессию NR1 на поверхности клетки, поэтому белок с самым коротким С-концевым участком экспрессируется больше всего на поверхности клетки (Okabe et al. 1999).

...