Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом

В качестве первичных антител использовали антитела мыши (mouse antibodies), вторичных - FITC-меченные антитела козы (goat-antimouse antibodies). Флуорохромы обладают различным спектром эмиссии. Каналы на цитометре подобраны так, что они примерно соответствуют спектрам известных флуорохромов. FITC обладает самой короткой длиной волны эмиссии, поэтому мы измеряли FITC-меченые антитела в первом канале. Инкубация как с первичными, так и со вторичными антителами происходила в течение 1 часа, после чего клетки отмывали и проводили измерения. Обработку результатов проводили по программе WinMDI 2.8 (Scripps Institute, La Jolla, USA).

2.2 Способы индукции окислительного стресса

2.2.1 Перекись водорода

Перекись водорода при повышенном образовании в клетке вызывает окислительный стресс. Некоторые ферменты, например глюкозоксидаза, образуют в ходе окислительно-восстановительной реакции перекись водорода, которая может играть защитную роль в качестве бактерицидного агента. В клетках млекопитающих нет ферментов, которые бы восстанавливали кислород до перекиси водорода. Однако, несколько ферментных систем (ксантиноксидаза, НАД(Ф)H-оксидаза, циклоксигеназа и др.) продуцируют супероксид, который спонтанно или под действием супероксиддисмутазы превращается в перекись водорода. В данной работе мы использовали перекись водорода для индукции неспецифического окислительного стресса, т.е. окислительного стресса, индуцированного внесением эндогенного оксиданта, который закисляет клетку не через рецепторный механизм действия, а влияет прямым образом, как донор активных форм кислорода. Клеткам давали перекись водорода в концентрации 5 мМ. Время инкубации составляло 30 мин. После инкубации с перекисью водорода клетки отмывали и измеряли количество активных форм кислорода, а также долю мёртвых клеток.

Протокол эксперимента:

1. интактные клетки (контроль),

2. интактные клетки + 1 мМ карнозин,

3. интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом,

4. интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин,

5. введение в культуру клеток 5 мМ H₂O₂ ,

6. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 5 мМ H₂O₂,

7. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 5 мМ H₂O₂,

8. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 5 мМ H₂O₂.

Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с 5 мМ H₂O₂ составило 0,5 часа.

2.2.2 N-метил-D-аспартат

Для стимуляции специфического окислительного стресса, запускаемого через механизм, опосредованный рецепторами, использовали N-метил-D-аспартат (NMDA) в концентрации 1 мМ. N-метил-D-аспартат - это агонист NMDA-рецепторов. Он вызывает гиперактивацию рецепторов и экзайтотоксический эффект, развитие которого обусловлено резким увеличением концентрации внутриклеточного Ca²⁺ в цитоплазме нейронов, что влечет за собой накопление активных форм кислорода, инициацию перекисного окисления липидов и клеточную смерть.

Для изучения механизма действия NMDA на клетки PC-12, мы использовали блокаторы NMDA-рецепторов: MK-801 и D-AP5.

Протокол эксперимента:

1. интактные клетки (контроль)

2. интактные клетки + 1 мМ карнозина

3. введение в культуру клеток 1 мМ NMDA

4. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 1 мМ NMDA

5. введение 10 мкM MK-801 за 1 ч до добавления в культуру клеток 1 мМ NMDA

6. введение 50 мкМ DAP5 за 1 ч до добавления в культуру клеток 1 мМ NMDA

Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с 1 мМ NMDA составило 0,5 часа.

2.2.3 Гомоцистеиновая кислота

Гомоцистеиновая кислота, метаболит гомоцистеина, обладает экзайтотоксическими свойствами, стимулируя NMDA-рецепторы. При этом происходит избыточное поступление ионов кальция в клетки и образование большого количества свободных радикалов. Мы добавляли гомоцистеиновую кислоту в пробы в концентрации 500мкМ. Пробы инкубировались в течение 1 часа. Затем проводили измерения.

Протокол эксперимента:

1. интактные клетки (контроль)

2. интактные клетки + 1 мМ карнозина

3. интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом

4. интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин

5. введение в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты. Измерения проводили через 5, 15, 30 и 60 минут инкубации

6. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты, инкубировавшейся полчаса с клетками

7. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)

8. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)

9. введение 10 мкM MK-801 за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)

10. введение 50 мкМ DAP5 за 1 ч до добавления в культуру клеток 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты (30 мин)-10.

2.2.4 Полиамины

В работе использовали спермин, спермидин и путресцин. Путресцин образуется при декарбоксилировании бактериями аминокислоты орнитина. В тканях организма путресцин -- исходное соединение для синтеза двух физиологически активных полиаминов -- спермидина и спермина. Полиамины добавляли к клеткам в концентрации по 50, 100 и 500 мкМ каждый. Инкубация клеток с полиаминами происходила в течение 1 часа при 37⁰С.

Протокол эксперимента:

1. интактные клетки (контроль)

2. интактные клетки + 1 мМ карнозина

3. интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом

4. интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин

5. введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина

6. введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина

7. введение в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина

8. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина

9. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина

10. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина

11. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина

12. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина

13. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина

14. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермина

15. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ спермидина

16. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 50, 100, 500 мкМ путресцина

2.2.5 Акролеин

В работе мы использовали акролеин в концентрации 1 мМ, который готовили под тягой. В культуру клеток вносили 10 мкМ или 100 мкМ водного раствора акролеина. Инкубация клеток в присутствии акролеина составила 1 час, 3 часа или 24 часа при 37⁰С. Эксперимент проводили в тёплой среде RPMI без содержания сыворотки.

Протокол эксперимента:

1. интактные клетки (контроль) -1;

2. интактные клетки + 1 мМ карнозина-2;

3. интактные клетки + 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом-3

4. интактные клетки + 1 мМ нанолипосом не содержащих нанокарнозин-4

5. введение в культуру клеток вводили 10 мкМ акролеина («Aldrich») -5;

6. 100 мкМ акролеина-6;

7. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 10 мкМ акролеин-7;

8. введение 1 мМ карнозина за 1 ч до добавления в культуру клеток 100 мкМ акролеина-8;

9. введение 1 мМ карнозина после инкубации клеток с 10 мкМ акролеин-9;

10. введение 1 мМ карнозина после инкубации клеток со 100 мкМ акролеина-10.

11. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 10 мкМ акролеина -11;

12. введение 1 мМ карнозинcодержащих нанолипосом за 1 ч до добавления в культуру клеток 100 мкМ акролеина -12;

13. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 10 мкМ акролеина -13;

14. введение соответствующего объёма нанолипосом не содержащих нанокарнозин за 1 ч до добавления в культуру клеток 100 мкМ акролеина -14.

Во всех сериях экспериментов время экспозиции культуры клеток с акролеином составило: 1 ч, 3 ч и 24 ч.

2.3 Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС

2.3.1 Схема экспериментов

В экспериментах, по индукции ОС различными по химической природе веществами, перечисленными выше, клетки снимали с подложки, суспендировали, затем оставляли «контрольную» группу клеток, которая была необходима для настройки проточного цитометра, свечение клеток которой, так называемый «шум», принималось равной нулю. Остальные клетки окрашивали DCF в течение 40-60 минут при 37⁰С, помещая пробирку в место, недоступное для попадания солнечных лучей. После окрашивания клетки делили на четыре группы, в одну из которых добавляли карнозин, в другую липосомы, содержащие карнозин, в третью - пустые нанолипосомы, в четвёртые оставляли в растворе среды RPMI в качестве контроля. После часовой инкубации с антиоксидантами, клетки делили по пробиркам, в которых уже содержались вещества - активаторы окислительного стресса, находящиеся в них в нужной концентрации, инкубация с которыми занимала от 0,5 часа до 1 часа. После этого, клетки окрашивались PI и величина их флуоресценции измерялась в проточном цитометре. Эксперимены схематически представлены на следующем рисунке.

карнозин нанолипос окислительный стресс

Рис. 2.5. Схематический план эксперимента.

Карнозин, карнозин в составе нанолипосом, а также «пустые» липосомы добавляли за 1 час до инкубации с веществами, индуцирующими ОС.

2.3.2 Приготовление нанолипосом, содержащих карнозин

Для приготовления пустых и нагруженных карнозином липосом применялся метод фазовой реверсии (работа выполнена в лаборатории института Philipps-Universitдt Marburg Department of Pharmaceutics & Biopharmacy Левачёвой Ириной Сергеевной).

Все липиды: 1,2-дипальмитол-сн-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-дистеароил-сн-глицеро-3-фосфохолин (Lipoid GmbH, Germany), 1,2-дистеароил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[малеимид (полиэтилен гликоль)-2000] (соль аммония) и холестерол (Avanti Polar Lipids, Inc., USA) были растворены в хлороформе. Органический растворитель испаряли в вакуумных условиях после того как формировалась липидная плёнка. Раствор сульфата аммония был использован для гидратации липидной плёнки при постоянном перемешивании и нагревании до 50°C. Полученная дисперсия многослойных везикул с большим спектром размеров пропускалась через поликарбоновую мембрану (Nuclepore, Whatman, United Kingdom) с порой размером 200 нм и 50°C, при этом использовали Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., USA). Чтобы достичь максимальной монодисперсности, процедуру последовательно проводили 21 раз.

Карнозин загружали в липосомы, используя градиент сульфата аммония. Процесс происходил в 20-кратно разбавленном HEPES буфере (4-((2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан сульфатная кислота) (AppliChem GmbH, Germany), содержащем криопротектор (4 % сахароза), при pH 8.4. Свежеприготовленный раствор карнозин-содержащих нанолипосом был профильтрован стерильно, с использованием нейлоновой мембраны с порой размером 0.45 мкм и 0.22 мкм (Pall Corporation, USA).

На первом этапе, нанолипосомные конструкции отсеивались по загруженности и размеру везикулы.

2.3.2.1 Измерение размеров

Гидродинамический диаметр везикулы и размер был оценен с помощью динамического светового рассеивателя на приборе, измеряющем наноразмерные структуры Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, USA). Липосомную взвесь растворяли в фосфатно-солевом буфере 1:100 (PBS) до концентрации, удобной для измерения и анализа, используя 5-mW HeNe лазер (632.8 nm) при угле рассеяния равном 90°. Вязкость жидкости была приведена к 0, 933 Пуаз, которая соответствовала вязкости воды при 23°C. Показатель преломления растворителя приводилась к 1.333, что соответствует показателю преломления воды. Интенсивность среднего рассеяния приводилась к 300 кГц. Полученные результаты являются средними величинами, полученными в результате как минимум трёх повторных измерений со стандартным отклонением.

2.3.2.2 Выбор оптимальной липидной композиции

Шесть различных липидов были приготовлены и изучены на предмет их максимальной эффективности по критерию способности инкапсулировать карнозин (оценка проводилась спектрофотометрическим методом) и размер везикулы (динамическое светорассеяние) для подбора оптимальной липидной композиции, используемой для создания липосомной мембраны. Результаты не представлены. Также было выбрано определенное молярное соотношение липидов (23:16:1.6), чтобы загруженность липидов карнозином составила 84%. Гидродинамический размер везикулы составляет 150 нм.

Методом замораживания-скалывания оценивался размер наноструктурных комплексов при помощи двух микроскопов - трансмиссионном электронном микроскопе и зеркальном (отражательном) электронном микроскопе.

Трансмиссионный электронный микроскоп использует высоковольный электронный луч для того чтобы сформировать изображение. Электронный луч выпускается из электронной пушки, обычно использующей вольфрамовый катод в качестве источника электронов. Электронный луч обычно усиливается анодом при +100 килоэлектрон-вольт (от 40 до 400 кэВ). Что касается катода, сфокусированного на электростатической и электромагнитной линзах, и пропускаемого через образец, то он частично пропускает электроны, а частично рассеивает их из луча. Когда он проходит через образец, электронный луч получает информацию о структуре образца, которая усиливается с помощью системы линз объектива микроскопа. Изображение выводится на экран, покрытый фосфором или каким-либо сцинтиллятором, например сульфидом цинка. Кроме того, можно записать данные о структуре образца с помощью фотоплёнки прямо под электронным лучём. Также изображение можно вывести на экран компьютера.

Рис. 2.6. Нанолипосомы. Проба, полученная на трансмиссионном электронном микроскопе методом замораживания-скалывания. Размер каждой липосомы составляет около 150 нм.

В отражательном (зеркальном) электронном микроскопе, также как и в трансмиссионном, электронный луч падает на поверхность, но вместо использования трансмиссии, отражаемый луч упругорассеянных электронов сразу же анализируется детектором и выдаётся в виде численного значения обрабатывающим устройством.



Рис. 2.7. Нанолипосомы. Проба, полученная на отражательном электронном микроскопе методом замораживния-скалывания.

Метод приготовления препаратов для изучения их в электронном микроскопе называется метод замораживания-скалывания. Этот метод используется для исследования липидных мембран. Свежеприготовленная суспензия моментально замораживается (криофиксация), затем просто скалывается, либо скалывается с использованием микротома. Замороженная поверхность затеняется испаряемой платиной или золотом под углом 45° в вакуумном устройстве. Иногда дополнительно распыляется углерод, наносимый перпендикулярно поверхности скола, обычно это может использоваться для большей стабильности покрытия реплики (копии). Образец возвращают в комнатные условия (давление и температура), затем очень хрупкая плёнка, покрывающая биологический образец, снимается с помощью химических реактивов, кислот, раствора гипохлорида или детергента SDS. Далее реплика отмывается от химических агентов и может быть исследована в трансмиссионном микроскопе.

2.3.3 В работе использовался и второй наноструктурный препарат на основе карнозина (КСЛ)

В качестве нанокострукций использовали липосомы, состоящие из 95,3% фосфолипидов, 2,5% неполярных липидов, и содержащие 1,2% L-карнозина, стерилизованные автоклавированием при избыточном давлении 1 атм. в течение 45 минут. Средний диаметр липосомальных частиц составлял 150-160 нм.

2.3.4 Определение содержания карнозина в составе нанолипосом по диазореакции (Практикум по биохимии. Издательство Московского университета)

Реактивы:

1. Сульфаниловая кислота - раствор содержит 0,9 г сульфаниловой кислоты, 9 мл концентрированной HCl, воды до 100 мл.

2. NaNO2-5%ный раствор, свежеприготовленный.

3. Диазотированная сульфаниловая кислота. В колбу, стоящую во льду, помещают 6 мл раствора сульфаниловой кислоты, приливают туда 6 мл свежеприготовленного раствора NaNO2 , перемешивают и оставляют на 5 мин. Прибавляют при помешивании еще 24 мл NaNO2 и через 5 мин доливают водой до 100 мл. Каждый раз готовят свежий раствор (на льду хранится в течение 5-6 ч).

4. NaCO3 безводный - 10%ный раствор.

5.Карнозин- стандартный раствор 0,5 мг/мл.

Карнозин содержащие нанолипосомы после упаривания на роторном испарителе растворяют в 1-2 мл воды. Отбирают различные количества этого раствора, доводят водой до 2мл, приливают 3 мл диазореактива, хорошо премешивают и оставляют на 5 мин. Затем добавляют 3 мл 10%-ного раствора соды, перемешивают и через 10 мин колориметрируют при 490 нм. Следует убедиться в том, что интенсивность образующейся краски пропорциональна количеству исследуемого раствора, взятого для определения. Количество карнозина рассчитывают с помощью калибровочного графика, построенного по стандартному раствору карнозина, содержащему от 0,05 до 0,5 мкмоль в пробе. Рассчитывают количество карнозина в микромолях на 1 г ткани.

2.4 Приготовление растворов

Карнозин. Раствор карнозина, в концентрации 0,5 мг/мл готовили из сухого реактива. К сухому веществу приливали раствор среды для культивирования клеток PC-12, RPMI, содержащей все компоненты, кроме телячьей сыворотки (состав среды см. выше), объёмом 10 мл. После этого в среде подводили pH до значения, равного 7,4. Растворы хранили в холодильники не более 1 месяца, проверяя pH каждый раз перед экспериментом по окраске среды (в ней содержится феноловый красный, который является индикатором pH)

Пероксид водорода. Концентрированный раствор пероксида водорода брали в аптеке. В экспериментах использовался водный раствор с конечной концентрацией 5 мМ. Плотность перекиси проверялась непосредственно перед проведением эксперимента, т.к. жидкость нестабильна.

NMDA, Гомоцистеиновая кислота. NMDA и гомоцистеиновая кислота в концентрации 1мМ и 500мкМ соответственно были приготовлены из сухого реактива, исходя из молекулярной массы каждого - соответственно. Сухое вещество растворяли в тёплом готовом растворе Хэнкса, затем приводили pH к стандартному значению 7,4. Раствор гомоцистеиновой кислоты выходит за границы буферной ёмкости при pK2, то есть при значении константы диссоциации аминогруппы, что осложняет подведение pH до стандартных значений, поэтому мы готовили раствор на буфере (р-р Хенкса).

Полиамины. Полиамины (спермин, спермидин, путресцин) готовили на дистиллированной воде. Исходная концентрация составляла 5 мМ.

Акролеин. Акролеин в концентрации 10 мкМ и 100 мкМ готовили под тягой на основе дистиллированной воды. Исходная концентрация составляла 1 мМ.

MK-801, DAP5 готовили на основе дистиллированной воды. Исходная концентрация составляла 1 мМ Конечная концентрация составила 10 мкМ и 50 мкМ соответственно.

2.5 Экспериментальные исследования in vitro и in vivo на быстро стареющих мышах линии SAM (Senescence Accelerated Mice, клоны SAMR1 - resistance и SAMP1 - Prone) SPF-категории

Мыши выращены в Питомнике экспериментальных животных в Пущино-на-Оке. Все эксперименты проводились с соблюдением регламента работы с экспериментальными животными, описанными в русскоязычной версии издания Guide for the Care and Use of Laboratory Animals - Russian Version, National Academy Press, Washington. DC, 1996.

2.5.1 Окислительный стресс in vitro создавали инкубацией суспензии выделенных гранулярных клеток мозжечка с 3,5 мМ перекиси водорода в течение 30 мин при 37^ОС в присутствии и в отсутствие карнозинсодержащих нанолипосом (КСЛ). Конечная концентрация карнозина, внесенного в составе КСЛ в суспензию нейрональных клеток, составляла 2,65 мМ.

2.5.2 Выделение гранулярных клеток мозжечка. Опыты in vitro проводили на суспензии гранулярных клеток мозжечка. Выделение гранулярных клеток мозжечка проводили из 10-12 дневных быстростареющих мышей (Sureda F. et al., 1998). Животных декапитировали, выделяли мозжечок, промывали его ледяным физиологическим раствором, удаляли крупные кровеносные сосуды и измельчали скальпелем. Для разрыхления межклеточного вещества использовали раствор коллагеназы, приготовленный на основе буфера Тироде (Wako collagenase, 2 mg/ml/1 животное). Измельченные фрагменты ткани мозжечка инкубировали при 32^оС в течение 20 мин, не перемешивая. После инкубации декантацией удаляли раствор коллагеназы, трижды отмывали осадок частично диссоциированных тканей мозжечка раствором Тироде. Далее к осадку добавляли раствор Тироде из расчета 1мл на 1 животное и диссоциировали клетки с помощью пастеровской пипетки до получения опалесцирующей суспензии. Полученную суспензию пропускали через фильтр с размером пор 60 мкм для удаления крупных фрагментов ткани, после чего в 1 мл суспензии проводили подсчет клеток в камере Горяева, число которых не должно быть меньше 10⁶/мл. Затем в выделенной суспензии нейронов индуцировали окислительный стресс.

2.5.3 Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой гипобарической гипоксии. Острую гипобарическую гипоксию (ОГГ) создавали в барокамере проточного типа для предотвращения развития эффекта гиперкапнии (Boldyrev A.А. et al., 1997). Опыты выполнены на 8-месячных мышах линий SAMR1 (n=25) и SAMP1 (n=25), самцы: самки - 50:50%, весом 25-30 г. Мышей из каждой линии делили на 2 группы по 12-13 особей в каждой. Животным одной из групп за 1 час до гипоксического воздействия вводили внутрибрюшинно раствор карнозинсодержащих липосом (48 мг/кг массы тела), животным другой группы (контрольной) - физиологический раствор.

2.5.4 Устойчивость мышей к гипоксии оценивали по стандартным физиологическим характеристикам: времени до потери позы (ВПП, сек), времени до остановки дыхания (время жизни - ВЖ, сек), времени от момента перемещения животного в условия нормального атмосферного давления до восстановления активной позы (время реституции (ВР, сек). На следующие сутки после гипоксии животных декапитировали, извлекали мозг и замораживали его в жидком азоте до проведения биохимических исследований.

2.5.5 Определение общей антиоксидантной активности в образцах ткани мозга (10% экстракты в 0,15 М КС1, 15000 g-супернатант) проводили по тушению стабильного радикала 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) (Schlesier K. et al., 2002).

Для получения экстракта замороженную ткань мозга размораживали, гомогенизировали при охлаждении с помощью механического гомогенизатора Поттера в 9 объемах холодного раствора КСl (0,15 М) в 3 приема: сначала фрагмент ткани гомогенизировали со скоростью 40 об/мин без добавления экстрагирующего раствора до получения гомогенной массы, затем в два приема добавляли раствор КСl - с первой порцией раствора (примерно половина общего объема) гомогенизацию вели при скорости 40 об/мин, используя 15 возвратно-поступательных движений пробирки гомогенизатора вдоль оси вращения пестика, затем добавляли остаток раствора КСl и продолжали гомогенизацию в таком же режиме, но при скорости 60 об/мин. Полученный гомогенат подвергали центрифугированию на рефрижераторной центрифуге Heinz Janetzky K-24 в угловом роторе 12х10 мл со скоростью 12000 об/мин в течение 20 мин. Полученный супернатант осторожно собирали и хранили на холоду до момента спектрометрического исследования.

К 1,9 мл водно-спиртового раствора ДФПГ (50% этанола, 100 мкМ ДФПГ) добавляли 100 мкл исследуемого экстракта мозга и через 20 мин измеряли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro UV/Visible spectrophotometer (Amersham Biosciences, USA) суммарное снижение поглощения при длине волны 519 нм. В качестве стандарта использовали калибровочную кривую по Тролоксу, так называемый ТЕАС -Trolox Equivalent of Antioxidant Capacity. Для построения калибровочной кривой к 1,9 мл раствора ДФПГ добавляли раствор тролокса концентрацией 0,5 мг/мл в объемах 80, 60, 40, 20, 10 или 5 мкл и доводили общий объем пробы для измерения до 2 мл водой. Измеряли суммарное снижение концентрации ДФПГ также за 30 мин. Для расчетов использовали величину удельной оптической плотности для растворов ДФПГ, равную 9690 М^-1,см^-1.

2.6 Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты представлены в виде M±m. Данные обрабатывали с использованием программы “Statistica 6.0”. Для оценки достоверности обнаруженных изменений применяли тесты Стьюдента и Манна-Уитни, достоверность значений принималась при p < 0,05.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Морфологическая характеристика клеточной культуры PC12, дифференцированной дексаметазоном и фактором роста нервов rHuNGF

В работе использована культура клеток PC12 линии D4. Клетки содержали в СО₂ инкубаторе в присутствии 5% СО₂, 98% влажности и 37?С. В экспериментах были использованы клетки различных пассажей. Согласно протоколу, клетки за два дня до эксперимента переносили в голодающую среду, не содержащую сыворотку, с одновременным добавлением дифференцирующих агентов - rHuNGF (NGF) или дексаметазон. Дексаметазон - один из факторов, способных дифференцровать клеки PC-12 по почечному типу, превращая их в обычные хромаффинные клетки. Эта работа выполнена для сравнения с клетками, дифференцированными по нейрональному типу (с добавлением NGF), на которых проводилась дальнейшая работа. После двух суток культивирования клеток с NGF и дексаметазоном, проводили различные эксперименты, протоколы которых описанны в разделе «Материалы и Методы».

На рис. 3.1.представлен вид популяции клеток и интактном состоянии. В культуре интактных клеток преобладают шарообразные клетки, некоторые из которых имеют отростки, сопоставимые по длине с размером клеток. Отростки не сужаются на дистальном конце, а имеют такой же диаметр, что и на проксимальном конце. Одиночные или объединённые в группы клетки хорошо прикреплены к дну пластикового флакона для культивирования.

Рис. 3.1. Клеточная культура PC-12 в интактном состоянии. Фотографии получены на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.

Рис. 3.2. Культура PC-12, стимулированная дексаметазоном. Изображение получено на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.

На рис. 3.2 представлен вид клеточной культуры РС-12 после стимуляции дексаметазоном. Дексаметазон вносили в среду за 2 дня до эксперимента в концентрации 20 нг/мл. Клетки, стимулированные дексаметазоном (рис. 3.2) более распластанные (имеют форму многогранников) и крупнее, чем интактные клетки. Отростки этих клеток отличные по форме от отростков интактных клеток.

Рис. 3.3. Клеточная культура PC-12, стимулированная фактором роста нервов. Изображение получено на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.

На рис. 3.3 представлена клеточная культура PC-12, стимулированная rHu-NGFв по нейрональному типу. rHu-NGFв вносили в среду за 2 дня до эксперимента в концентрации 0,1 нг/мл.

Клетки, стимулированные NGF (см. Рис. 3.3.) напоминают по форме нейроны. У них есть «аксоны» и «дендриты», а также тело самой клетки вытянутое и многогранное. Клетки этой культуры могут сплетаться в сети, однако могут существовать и отдельно друг от друга. Этот тип клеток приобретает видимые различия от интактных клеток уже через одни сутки. Клетки, стимулированные дексаметазоном, дифференцируются в клетки почечного типа только через двое суток: более тонкие и короткие. Эти клетки склонны к адгезии, что выражается в том, что их очень сложно смыть с чашки Петри для проведения эксперимента. Кроме того, их адгезивные свойства гораздо более ярко выражены чем свойства клеток, стимулированных NGF и клеток интактной культуры. Мы не анализировали кривые роста клеток, поскольку это не входило в задачу работы.

Из сравнения рис. 3.1, 3.2 и 3.3 видно, что интактные клетки отличаются по морфологии от клеток, стимулированных дексаметазоном или фактором роста нервов. Клетки, стимулированные дексаметазоном, в свою очередь отличаются от клеток, стимулированных фактором роста нервов.

3.2 Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF

NMDA рецепторы содержат несколько субъединиц. В настоящей главе мы изучали наличие NR1-канальной субьединицы и NR2- регуляторной субьединицы в культуре клеток РС12. При исследовании экспрессии NMDA рецепторов под влиянием дексаметазона или NGF мы использовали протоколы активации клеток, описанные в разделе «Материалы и Методы».

На рис. 4.3 представлены достоверные отличия в экспрессии NR1 субъединицы у интактных клеток и у клеток, стимулированных различными химическими агентами. Данные для NR2 субъединицы также достоверно отличаются. Количество NR1 субьединиц вырастает приблизительно от 2% до 10% в случае клеток, стимулированных дексаметазоном и растет до 17% у клеток, стимулированных фактором роста нервов. NR2b субьединица растёт от 1% до 5% и 14% - соответственно. Подробные данные о соотношении экспрессии субьединиц в клетках представлены в таблице 3.1. Анализ полученных нами в эксперименте данных показывает, что NMDA рецепторы экспрессируются в клетках феохромоцитомы как в интактном состоянии, так и в стимулированном дексаметазоном или NGF. Также полученные нами данные показывают, что экспрессия проходит по обеим субъединицам - канальной и регуляторной, что важно. С точки зрения функции данных рецепторов можно было предположить, что субъединицы данных глутаматных рецепторов экспрессируются больше в нейрон-подобных клетках, т.к. преимущественно эти рецепторы присущи нервным клеткам. Полученные данные подтверждают наше предположение о том, что в NGF стмулированных клетках NMDA рецепторов достоверно больше, чем в клетках, стимулированных дексаметазоном.

Рис. 3.4. Анализ экспрессии субъединиц NMDA рецепторов с помощью специфических антител.

По оси ординат - процент клеток метящихся антителами «goat-antimouse» относительно всех клеток, присутствующих в анализируемой прибором суспензии клеток. Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05

Исходя из данных, представленных на рисунке 3.4 можно предположить, что количество субъединиц NR1 и NR2b растёт пропорционально друг другу, однако данные представленные в таблице 3.1 опровергают эту гипотезу.



Таблица 3.1. Характеристика экспрессии субъединиц NMDA рецепторов

Экспрессируемая субъединица NMDA рецептора	Интактные клетки PC-12(I), %	II/I	PC-12+ дексаметазон 50 мМ (II), %	III/I	PC-12+NGF (III), %
NR1	1,43± 0,4	7,1	10,02± 1,1 **	11,9	16,60± 1,1 **
NR2b	0,51± 0,09	9,6	4,80± 0,43 *	27,6	13,82± 1,2 *

Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05

Данные, представленные в таблице 3.1, показывают, что соотношение субъединиц при активации клеточной интактной культуры РС-12 разными дифференцирующими агентами отличается. Так, при активации клеток дексаметазоном количество NR1 и NR2b возрастает пропорционально исходному количеству данных субъединиц, присутствующих в интактной культуре. Это отношение приблизительно равно 8. При активации клеток NGF, канальная субъединица(NR1) экспрессируется в 12 раз больше, чем в интактной культуре, а регуляторная (NR2b)- в 28 раз. Это свидетельствует о том, что безусловно NR1-субъединица NMDA-рецептора является обязательной для формирования канал-рецепторного комплекса, она выполняет каналообразующую функцию. Но реализация функций рецептора осуществляется с помощью NR2b субъединицы.

Таким образом, в интактных клетках PС-12 мы обнаружили канальную и регуляторную субьединицы NMDA рецепторов, однако их количества настолько малы, что возможность их работы минимальна. В клетках, активированных фактором роста нервов содержится в 11,9 раз большее количество NR1 субьединицы и в 27,6 раз большее количество NR2b субьединицы. Однако, несмотря на то что количество субьединиц в нейрон-подобных клетках оказалось большим чем, в интактных клетках, нам необходимо убедиться в том, что эти рецепторы функционально активны и работают так же как в нейронах. Для этого мы сравним ответ нейрон-подобных клеток и интактных клеток на перекись водорода и специфический агонист NMDA. А также посмотрим, каков будет ответ нейрон-подобных клеток при блокаде рецепторов при помощи агониста- MK-801 и DAP-5 и одновременном действии NMDA. Результаты данных экспериментов представлены в следующей главе.

3.3 Индукция окислительного стресса различными химическими агентами в недифференцированных и дифференцированных клетках PC-12

3.3.1 Индукция окислительного стресса при действии NMDA и Н₂О₂

В данном фрагменте работы мы моделировали окислительный стресс двумя способами: с помощью специфического лиганда, активирующего NMDA рецепторы и с помощью экзогенного источника активных форм кислорода- пероксида водорода.

Далее мы анализировали способность специфического и неспецифического активатора развития окислительного стресса стимулировать выброс АФК при помощи подсчёта количества клеток с большей и меньшей флуоресценцией DCF и сравнивали среднюю флуоресценцию субпопуляций клеток, находящихся в состоянии окислительного стресса. Далее определяли, функциональны ли NMDA-рецепторы в исследуемой культуре. В случае, если рецепторы не отвечают на действие лиганда повышением уровня АФК, проверяли при помощи действия пероксида водорода, способны ли клетки отвечать повышенной продукцией активных форм кислорода на окислительный стресс, созданный неспецифическим путём. Результаты представлены ниже.



3.3.1.1 Интактные клетки PC-12

Анализ проводили для всех субпопуляций клеток, однако ниже представлены только результаты, исключающие отсутствие ответа на лиганды. Так, популяция интактных клеток РС-12 в координатах прямого светорассеяния против бокового рассеяния выглядит следующим образом (Рис. 3.5.):

Рис. 3.5. Вид популяции интактных клеток РС-12 в координатах «Forward Scatter vs Side Scatter».

На Рис. 3.5 видно, что клетки можно разделить на две субпопуляции в соответствии с их размерами и гранулярностью. С помощью анализа субпопуляций было установлено, что в нижней части графика находятся нежизнеспособные клетки. В координатах DCF vs PI они не окрашены DCF, но положительно окрашены по пропидий йодиду. В дальнейшем мы исключали нежизнеспособную часть популяции из анализа и сосредоточили своё внимание на изучение популяции из области, обозначенной как R1(рис. 3.6).

Рис. 3.6. Вид популяции интактных клеток РС12 в координатах Forward Scatter vs Side Scatter с гейтами, разделяющими анализируемые клетки (R1) от клеток, вступивших в апопотоз (R2).

3.3.1.2 Интактные клетки PC12 в условиях окислительного стресса

При анализе распределения клеток из R1 в координатах «PI vs DCF» оставшаяся часть клеток также разделяется на субпопуляции. Мертвые клетки хорошо отделяются от суммарной популяции, концентрируясь в области высоких флуоресценций PI, а живые клетки, плохо метящиеся иодидом пропидия, могут условно быть разделены на две подгруппы - с низкой и высокой флуоресценцией DCF (см. рис. 3.7). Это послужило основанием разбивки графика на квадранты, позволяющие дифференцировать ответ на окислительный стресс не всей популяции, а отдельных групп клеток. При этом прибор дает количественную характеристику каждой группы клеток в процентах (по углам квадрантов), проанализировав которую мы получили результаты, представленные ниже (см. рис. 3.7). Около 15% интактных клеток положительно окрашены DCF. При добавлении к клеткам перекиси водорода количество интенсивно окрашенных клеток возрастает в 4,5 раза и приблизительно равно 68%. Очевидно, что пероксид водорода легко проникает через мембрану клеток и активирует окислительный стресс внутри клетки. При действии NMDA также происходит активация окислительного стресса, что подтверждает наличие специфического рецепторного белка, принимающего сигнал. Количество АФК возрастает до 23%. Доля мёртвых клеток после действия NMDA (1 мM) и перекиси (5 мМ) составила 23%, 21% что сравнимо с контролем - 24%.

А Б В

Рис. 3.7. Вид субпопуляции интактных клеток РС-12 из региона R1 (см. рис. 3.9), представленной в координатах «PI vs DCF».

На рис. представлены клетки PC-12 из региона R1 в координатах DCF-PI. Ось абсцисс - флуоресценция DCF, ось ординат - флуоресценция PI. А - в интактном состоянии, Б - при действии NMDA в концентрации 1 мM, В - при действии H2O2 в концентрации 5 мМ.

Из рис. 3.7 видно, что клетки из нижнего левого квадранта (А) под действием NMDA сдвигаются в область правого нижнего квадранта (Б), т.е в область с большей интенсивностью флуоресценции DCF, что свидетельствует о том, что в данных клетках под действием NMDA повысился уровень АФК. Следовательно, в клетках присутствуют функционально активные NMDA рецепторы и отвечают продукцией АФК на действие специфического агониста.

Под действием 5мМ перекиси (рис. 3.7 В) клетки приобретают усиленную окраску DCF, поскольку пероксид водорода проникает в клетку, расщепляется до активных радикалов, которые вызывают свечение DCF.

Таким образом, интактная культура PC-12 отвечает как на специфический, так и неспецифический окислительный стресс, вызванный лигандами различной природы.

3.3.1.3 Влияние H₂O₂ и NMDA на рост АФК в клетках РС12, дифференцированных по нейрональному типу

В клетках, стимулированным фактором роста нервов определяли уровень активных радикалов при действии перекиси водорода и NMDA. Полученные данные представлены на рис.3.8, 3.9, 3.10 и 4.11, а также в таблице 3.2.

А Б В

Рис. 3.8. Вид субпопуляции клеток РС-12, активированных NGF.

На рис в координатах «PI vs DCF» представлены клетки PC-12 из региона R1, активированные NGF, контрольные (А), а также клетки инкубированные с H₂O₂ 5 мМ (Б) и NMDA 1мМ (В). Ось абсцисс - флуоресценция DCF, ось ординат - флуоресценция PI.

На рис. 3.8 видно, что клетки разделяются на 3 различные субпопуляции, которые, как выяснилось, по-разному отвечают на действие лигандов. Это связано с тем, что не все клетки подверглись дифференцировке. Вероятно, те клетки, которые имеют полностью развитые NMDA рецепторы находятся в правом нижнем квадранте и составляют маленькую популяцию клеток, равную приблизительно 12% от общего количества клеток. Мы обозначили её как R1. Оси квадрантов построены таким образом, чтобы отделить популяцию, положительно окрашенную по пропидию, от остальных субпопуляций. Изолированная субпопуляция изменяет своё положение относительно вертикальной оси только при действии перекиси водорода. Вероятно, как и в случае интактной культуры, это является результатом того, что перекись проникает в повреждённые при некрозе участки мембраны. В клетке она превращается в радикал (·ОН) и, связываясь с DCF, вызывает свечение. Механизм образования активных форм кислорода при действии NMDA носит более сложный характер, который, возможно, не может реализоваться клеткой в условиях апоптоза.

Две другие субпопуляции клеток реагируют на лиганды иным образом. Субпопуляция, представленная на рис. 3.8 А в правом нижнем квадранте, отвечает на действие обоих лигандов (специфического и неспецифического) увеличением уровня АФК- то есть развитием окислительного стресса.

Следует заметить, что при действии NMDA и пероксида водорода данная субпопуляция также «смещается» по оси ординат, то есть по уровню флуоресценции йодида пропидия. Это может значить, что в мембране клетки появляются повреждения, в которые проникает флуорохром PI. Повреждения эти возникают при действии индукторов окислительного стресса. Очевидно, что концентрация их довольно высока, причем клетки искусственно поддерживаемой интактной культуры PC-12 более резистентны к данным концентрациям индукторов стресса, чем клетки, стимулированные NGF.

Клетки, находящиеся в левом нижнем квадранте, также реагируют на добавление лигандов, но для более точных выводов нужно более детальное изучение каждой субпопуляции, результаты приведены ниже.

На рисунке 3.9.представлены нейрон-подобные клетки, разделённые гейтами. Субпопуляция, находящаяся вне гейтов не анализировалась, т.к. она положительна окрашена по PI, то есть содержит некротические клетки.

Рис. 3.9. Вид популяции клеток РС-12, стимулированных NGF.

По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции DCF, по оси ординат - PI. С гейтами гейтом R5 обозначена субпопуляция клеток, обладающая низкой флуоресценцией DCF. Гейтом R3 обозначена субпопуляция клеток с выокой флуоресценцией DCF.

Субпопуляции, находящиеся в гейтах R3 и R5, анализировались отдельно друг от друга поскольку клетки по-разному реагировали на добавление лигандов. Результаты представлены на рис. 3.10 и в таблице 3.2.



А Б В

Рис. 3.10. Распределение флуоресценции DCF в клетках стимулированных NGF.

На рис. 3.10 представлены клетки PC-12 из региона R3 в координатах DCF от количества событий. А - в интактном состоянии, Б - при действии H₂O₂ 5 мМ, В - при действии 1 мМ NMDA.

Данные, представленные на рис. 3.10, показывают, что при добавлении лигандов окислительного стресса, среднее значение флуоресценции DCF увеличивается как в случае инкубации с перекисью водорода, так и в случае инкубации с NMDA. Значения средней флуоресценции клеток из региона R5 представлены в виде таблицы.

Таблица 3.2. Уровень активных форм кислорода клеток анализируемых субпопуляций клеток РС-12 (отн. ед.)

	Флуоресценция клеток из региона R5	Флуоресценция клеток из региона R3
Контроль	8,8±1,3	862,7±34,4
H2O2	18,2±5,2 *	1106,9±134,3 *
NMDA	9,6±5,6	1501,7±111,3 *
MK801	9,2±4,5	1378,8±98,9 *
DAP5	9,1±4,2	1210,2±102,1 *

Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05. Данные, представленные в таблице 3.2 показывают, что при действии перекиси водорода в клетках из субпопуляции R5 наблюдается наибольшая генерация АФК, примерно в 2 раза выше контрольных значений. В то же время действие специфического лиганда NMDA рецепторов не вызывает существенного роста АФК в этом регионе. Напротив, данные субпопуляции из региона R3 показывают, что наибольший рост АФК наблюдается в условиях активации клеток N-метил-D-аспартатом (в 1,8 раза выше контрольных значений). Так как анализируемые клетки находились в одинаковых условиях во время эксперимента, можно полагать, что концентрация действующих на клетки лигандов, была одинаковой. Следовательно, эти субпопуляции различаются по физиологическим параметрам. Возможно, в субпопуляции R3 есть сформированные и функционирующие NMDA-рецепторы, а в популяции R5 данные рецепторы не до конца встроились в мембрану или по каким-то причинам не способны функционировать. Возможно, этим клеткам требуется дополнительное время активации для того, чтобы экспрессировать больше функционирующих рецепторов.

Следовательно, интактные и дифференцированные по нейрональному пути клетки PC-12 по-разному отвечают на действие специфических и неспецифических индукторов окислительного стресса. Если пероксид водорода вызывает стандартный ответ клеток, проявляющийся в виде повышения уровня АФК и клеточной смерти, то NMDA влияет на клетки по-разному. Очевидно, нейрон-подобные клетки, синтезировавшие NMDA рецепторы за время инкубации с фактором роста нервов, отвечают более выраженно. Подтверждением этого факта являются данные о том, что только клетки PC-12 дифференцированные нейрональному типу проявляют достоверный эффект снятия действия NMDA после воздействия агонистов MK801 и DAP-5, средняя флуоресценция после действия антагонистов составила приблизительно 1200 и 1300 относительных единиц при 1500 после действия NMDA и 800 отн.ед. в контроле, что свидетельствует о «полноценности» синтезированных рецепторов и специфичности ответа на NMDA.

В следующем разделе работы мы исследуем влияние гомоцистеиновой кислоты на клетки PC-12, действие которой также опосредуется NMDA рецепторами.

3.3.2 Влияние гомоцистеиновой кислоты на клетки PC-12

3.3.2.1 Влияние гомоцистеиновой кислоты на развитие окислительного стресса в недифференцированных клетках PC-12

На рис. 3.11.изображено распределение уровня флуоресценции DCF. Видно, что при инкубации клеток с ГЦК в течение 5 мин график имеет два пика, больший и меньший.

Рис. 3.11. гистограмма распределения уровня флуоресценции клеток под действием 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты в течение 5 минут (закрашенный профиль) и через 60 минут (линия).

Меньший пик соответствует мелким клеткам, обломкам, а также он суммируется с так называемым «шумом». Смысловую нагрузку несёт второй большой пик. Если сравнить закрашенный высокий пик с незакрашенной линией, видно, что первый заканчивается примерно на значениях флуоресценции равных 1000. Второй, который является показателем значений флуоресценции клеток, инкубированных 1 час с гомоцистеиновой кислотой, заканчивается приблизительно на значениях, равных 50 000. Средние значения данного распределения указаны в таблице ниже, однако из графика видно, что инкубация клеток в присутствии гомоцистеиновой кислоты в течение одного часа значительно повышает флуоресценцию DCF клеток, которая отражает уровень активных форм кислорода.

Обращаем внимание на высокий пик (рис. 3.12), находящийся в области значений, равных 1000. Видно, что флуоресценция PI в данном случае значительно выше у клеток, инкубировавшихся час с гомоцистеиновой кислотой, чем у той популяции клеток, которая содержалась с гомоцистеиновой кислотой в течение 5 минут.

Рис 3.12 уровень клеточной смерти в анализируемой популяции PC-12 при действии 500мкМ гомоцистеиновой кислоты при инкубации в течение 5 минут (закрашенный профиль) и в течение часа (линия)

Полученные данные свидетельствуют о том, что в популяции растёт количество мёртвых клеток, обусловленное действием ГЦК. Данные по другим временным интервалам представлены в таблице.



Таблица 3.3. Значения смертности и количества активных форм кислорода в анализируемой популяции недифференцированных клеток PC-12 при действии на них гомоцистеиновой кислоты в концентрации 500 мкМ.

Мин/средняя флуоресценция	DCF	PI
0	251,5±12,6	595±29,8
5	266,5±13,3	649,6±32,5
15	280,1±10,0*	635,8±31,8
30	367,2±18,4*	751,5±37,6*
60	390,4±19,5*	621,4±31,1

Знак * соответствует статистически достоверному различию между контрольными и опытными образцами. Статистический анализ проводился по критерию Манна Уитни. Достоверным принималось значение при p < 0,05. В таблице приведены данные эксперимента, в котором клетки PC-12 инкубировались с гомоцистеиновой кислотой в концентрации 500мкМ и различном времени инкубации. Во временном интервале 60 минут были взяты точки измерения, соответствующие 0 времени инкубации принятые за контрольные, далее в течение 5 минут, 15, 30 и 60 минут инкубации с ГЦК. Значения в таблице приведены в относительных единицах флуоресценции обоих флуорохромов. Из табл. видно, что флуоресценция DCF постепенно нарастает пропорционально времени инкубации при этом достигая максимального значения при 60 мин. Флуоресценция PI также нарастает, достигая своего пика после 30 минут инкубации с ГЦК, а далее идёт на спад. Такой эффект может быть связан с тем, что в течение 60 мин погибает довольно большое количество клеток, а так как флуоресценция, представленная в таблице, является средним арифметическим всех флуоресценций анализируемых клеток, то и общая флуоресценция клеток становится немного ниже.



3.3.2.2 Влияние гомоцистеиновой кислоты на рост АФК в клетках PC-12, дифференцированных по нейрональному типу

Закрашенный профиль на гистограмме обозначает уровень DCF в интактных клетках, чёрной линией обозначен уровень DCF клеток, подвергшихся действию гомоцистеиновой кислоты. Очевидно, что гомоцистеиновая кислота увеличивает уровень АФК.

...