Инициирование цепной реакции начинается с внедрения свободного радикала в липидный слой мембран или липопротеинов. Чаще всего это радикал гидроксила. Являясь небольшой незаряженной частицей, он способен проникнуть в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови, образуя при этом липидные радикалы: НО^*+LH> Н₂О+L^*

Липидный радикал (L^*) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом, при этом образуя новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LОО^*):

L^* +О₂> LОО^*

Образовавшийся радикал атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образванием гидроперекиси липида LООН и нового радикала L^*:

LОО^*+ LН> LООН+ L^*

Чередование двух последних реакций является цепной реакцией пероксидации (перекисного окисления) липидов. Значительное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств Fe⁺². В результате взаимодействия ионов двухвалентного железа с гидроперекисями липидов происходит разветвление цепей:

Fe⁺²+ LООН> Fe⁺³ +НО^- +LО^*

Образующиеся радикалы инициируют новые цепи окисления липидов:

LО^*+ LН> LОН

Обычно в биологических мембранах цепи состоят из десятка и более звеньев. В конечном счете, цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности или друг с другом:

LОО^*+ Fe⁺²+Н⁺> LООН,

LОО^*+ InH>In^*

LОО^*+ LОО^*> молекулярные продукты.

Последняя реакция интересна тем, что она сопровождается свечением, интенсивность которого отражает скорость липидной пероксидации (Владимиров Ю.А., 2000).

+ L^*; L^*+О₂> LОО^* и т.д.

В результате ПОЛ происходит уменьшение стабильности липидного слоя, следствием которого является электрический пробой мембраны собственным мембранным потенциалом, то есть под действием разности электрических потенциалов, существующих на мембранах функционирующей клетки. Описанные процессы ведут к полной утрате мембраной ее барьерных функций (Владимиров Ю.А., 2000).

Активация свободнорадикального окисления липидов отмечена при различных заболеваниях, вызванных как эндогенными, так и экзогенными причинами. Особое значение в настоящее время придается нарушению регуляции в системе ПОЛ при неврологических заболеваниях. Так, активация процесса ПОЛ отмечена у больных с черепно-мозговой травмой (Зацепина С.Н. и др., 1983), с инфекционно-токсическим поражением ЦНС, прогрессирующих мышечных дистрофий (Бадалян Л.О. и др., 1984), при боковом амиотрофическом склерозе (Захарова М.Н., 2001). По данным некоторых исследователей, некомпенсированная активация свободнорадикальных реакций в нервной ткани является важным звеном эпилептогенеза. (Крыжановский Г.Н. и др., 1984; Никушкин Е.В., 1991). Выявлено участие свободнорадикальных реакций и аутоантител к фактору роста нервов в патогенезе рассеянного склероза (Переседова А.В.,1999). Интенсификация процесса ПОЛ и снижение активности антиоксидантных ферментов, была обнаружена при развитии болезни Паркинсона (Cаdet J. and Brannock C., 1998; Савищева О.С. и др., 2000). Особую патогенетическую значимость эти процессы приобретают при острых (ОНМК) и хронических (ДЭ) сосудистых заболеваниях головного мозга (Суслина З.А., Максимова М.Ю., 1996, 2007; Федорова Т.Н., 2004). Несколько последних обзоров освещают роль АФК в патофизиологии таких нейродегенеративных заболеваний как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. (Trompier D. et al., 2013; Rao V., Carlson E. and Yan S. 2013).

1.2 Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на разных биологических объектах, включая клеточные культуры

1.2.1 Экспериментальные модели окислительного стресса

Механизм развития окислительного стресса, а также оценка нейропротекторного действия резличных препаратов, изучается на различных биологических объектах как в экспериментальных исследованиях на различных животных (таких как нокаутированные мыши, крысы), а также на многочисленных клеточных культурах, включая первичные культуры нейронов, имеющие свойства стволовых клеток.

Исследование гипоксических/ишемических повреждений мозга крыс осложняется тем, что после гипоксического/ишемического эпизода у животных, как правило, не выявляется неврологической симптоматики, что затрудняет как сопоставительную оценку метаболических нарушений, так и эффективности нейрофармакологических препаратов.

Комбинация гипобарической гипоксии, отягощенной нарушением энергетического метаболизма в результате действия нейротоксина 3-нитропропионовой кислоты (3-НПК), приводит к более выраженным нарушениям двигательной активности и выявлению характерной неврологической симптоматики. Введение карнозина повышало активность митохондриальной супероксиддисмутазы и предотвращало развитие окислительного стресса в ткани мозга, что коррелировало с улучшением неврологической симптоматики, снижением смертности и восстановлением двигательной активности, а также с улучшением процессов памяти животных. (Boldyrev et al, 1996; Stvolinsky et al, 2000).

Глобальная (3-х сосудистая) ишемия головного мозга, отягощенная систематическим введением 3-НПК, позволила выявить выраженную неврологическую симптоматику, коррелирующую со значительными метаболическими сдвигами и высокой смертностью животных. Курсовое введение карнозина в постишемическом периоде на фоне 7-14 дневной реперфузии защищает мозг от окислительных повреждений, что сопровождается снижением неврологической симптоматики и смертности животных (Федорова Т.Н. и др., 2002).

Для исследования окислительного стресса применяются различные подходы, позволяющие выяснять молекулярные механизмы этого процесса, одним из таких подходов является использование линии животных, для метаболизма которых характерен стационарно высокий уровень АФК, приводящий к ускоренному накоплению старческих признаков и уменьшению продолжительности жизни (Hosokawa M., 2002; Bulygina E. et al. 1999). Эта уникальная линия животных, выведенная путем близкородственного скрещивания, носит название SAM (Senescence Accelerated Mice - клон Prone (SAMP) и контрольная к ней линия SAMR1 (Resistant), выведенные из одной и той же линии JR/K путем близкородственного отбора) (Takeda et al., 1994).

Характерной особенностью животных этой линии является то, что они нормально развиваются до 4-месячного возраста, после чего наступает стадия ускоренного накопления старческих признаков. В их мозге активирована МАО В и подавлена активность СОД, причем это подавление связано с повреждением как цитозольной Cu/Zn-содержащей СОД, так и (главным образом) Mn-содержащей (митохондриальной) СОД, в то время как активность пероксисомальной Cu/Zn-содержащей СОД не отличается от этого показателя у мышей контрольной линии. Таким образом, в мозге этих мышей был выявлен дисбаланс между образованием и нейтрализацией АФК, приводящий к окислительному стрессу.

Получены новые данные о патогенезе нейродегенерации при исследовании этой уникальной экспериментальной модели паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone). Эта модель отличается ускоренной динамикой развития возрастных изменений и четко выраженной симптоматикой в ответ на введение МРТР. Установлено, что у мышей SAMP1 после введения МРТР имеют место выраженные нейрохимические нарушения, сопровождающиеся развитием окислительного стресса в мозге. Нарушение поведенческих реакций в результате воздействия МРТР свидетельствует о возникновении повреждений в области черной субстанции и в связанной с ней дофаминергической системе мозга (Сорокина Е.В., 2003) .

Окислительный стресс и его патофизиологические проявления в ткани мозга быстростареющих мышей с экспериментальным паркинсонизмом предотвращается курсовым введением карнозина, препятствующего угнетению двигательной активности животных и развитию мышечной ригидности. Нейропротекторный эффект карнозина позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной системы мозга, а также защищать белки и липиды от окислительной модификации (Сорокина Е.В. и др., 2003; Багыева Г.Б., 2009).

1.2.2 Клеточные культуры для изучения ОС

Одной из известных культур, на которых исследуется действие веществ с различными механизмами действия, является клеточная культура PC-12. Эта клеточная линия впервые была выделена в 1976 году из опухоли хромаффинных клеток надпочечника (Greene L., Tischer A., 1967). С тех пор она стала очень популярным объектом для изучения сигнальных путей при выживании клеток, пролифирации и дифференцировки. В зависимости от экспериментальных условий клетки высвобождают такие факторы как дофамин, норадреналин, ацетилхолин и содержит Na⁺-, K⁺- и Ca²⁺-каналы и другие мембранные рецепторы, сопряжённые с G-белками. Кроме того, в процессе дифференцировки в клетках сменяют друг друга различные подтипы Ca-каналов. Поэтому, клетки PC-12 представляют собой модель для изучения нарушения химических процессов, ассоциированных с нейрональной дифференцировкой, синтезом, запасанием и выбросом нейротрансмиттеров, функции и регуляции ионных каналов и воздействие друг на друга внутри- и внеклеточных соединений с мембраносвязанными рецепторами. Интересной чертой клеток PC-12, которая была описана учёными в самом начале использования этой культуры в качестве модельной клеточной линии, является их способность к образования нейритов или нейрон- подобных клеток в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene L., Tischer A., 1967). Рост нейритов может быть также спровоцирован cAMF и он сопровождается кроме обычного нейронального фенотипа такими признаками как остановка пролифирации, экспрессией нейрональных маркёров и секрецией нейротрансмиттеров (Vandry D. et al., 2002; Weterlink R. and Ewing A., 2008). Поскольку PC-12 очень легко культивируется, она позволяет осуществлять гораздо проще те же задачи, которые выполняются исследователями на нейрональных культурах.

Клеточная линия PC-12, наряду с культурой симпатических и кортикальных нейронов, в настоящее время одна из наиболее используемых моделей для изучения нейронального роста и развития конуса роста. (Varnurn -Finney B. and Reichard L., 1994; Halloran M., Kalil K., 1994). Например, культура клеток PC-12 была использована в экспериментах для описания роли винеулина в присоединении конуса роста к субстрату (Varnum -Finney B., Reichard L., 1994). А также помогла описать критическую роль Rho семейства GTP`аз в формировании нейритов и их роста. (Lamourex P. et al., 1997; Katoh.H. et al., 2000). Еще одной чертой нейритов PC-12 является рост варикоцитов, содержащих катехоламины. (Greene L., Tischer A., 1967). Культура клеток PC-12 также является объектом для изучения роли NMDA рецепторов в экзайтотоксичности и их функциях. Лаборатория университетф Division of Health Scieces в Австралии провела исследование о наличии субъединиц NMDAR на мембранах дифференцированных клеток PC-12. Брали несколько линий PC-12 (ATCC, WEHI, Ordway и Flinders) и с помощью метода ПЦР определили постоянную экспрессию NR1 и различное соотношение NR2 субъединиц в зависимости от типа клеточной линии PC-12. При действии на культуру фактором роста нервов в концентрации 50 нг/мл они отмечали значительное увеличение количества NR1 субъединиц у животных линий WEHI и Ordway. Количественные значения возрастали с 2.1 до 13,4 раза. мРНК для NR2A и NR2B не нашли ни в одной из линий PC-12. NR2C была определена в некоторых линиях клеток и её количество также возрастало в присутствии NGF в 4 раза. Иммуногистохимически подтвердилось наличие NR1, NR2C и NR2D субъединицы. Методом Patch-clamp не смогли зафиксировать рабочие NMDA рецепторы. Поэтому Edwards MA., Loxley RA, Williams AJ, Connor M, Phillips JK в своей статье «Lack of functional expression of NMDA receptors in PC-12 cells» (Neurotoxicology, 2007) сделали вывод о том, что по сравнению с нейронами ЦНС, клетки PC-12 не экспрессируют функциональные NMDA. Это может являться одним из факторов ограничивающих функциональный ответ на NMDA/глутамат и соответственно ограничивает возможности использования PC-12 в качестве нейрональной модели. В данной работе мы исследовали субьединичный состав NMDA рецепторов культуры PC-12 клона D4.

Было проведено исследование, в котором выяснялась возможность NMDAR2 субъединицы (NR2) контролировать экспрессию всего рецептора так же как и NR1, для этого они трансфецировали NR2 (A-D) в PC-12 клетки используя аденовирусный вектор. Зафиксированные токи, проводимые NMDA-рецепторами были получены не смотря на то, что в клетках не была найдена кДНК субъединицы NR1, а кДНК NR2A и NR2B присутствовала. Амплитуда токов была точно такой же как в случаях, когда к клеткам добавляли еще и кДНК, копирующую NR1 субъединицы NMDA рецепторов. В клетках, в которых находилась кДНК NR2C и NR2D субъединиц, токи также были зафиксированы, однако их интенсивность была намного меньше. Эти результаты доказывали что NR2 белок, который экспрессировался благодаря внедрённой с помошью аденовируса ДНК отлично дополнял эндогенный NR1 и образовывал полноценный NMDA рецептор. (Saito Y.et al., 2003).

Однако еще в 1995 году в Бостоне методом PCR и методом Nothern Blotting выявили наличие NMDAR2A, B и D субъединиц в клетках PC-12. И сделали вывод о том, что данная клеточная культура может быть пригодной моделью для изучения транскрипционной и посттранскрипционной регуляции и экспрессии генов субъединиц NMDA- рецепторов, включая и альтернативный сплайсинг. (Leclerc C.et al. 1995).

Клетки PC-12 являются идеальной системой для оценки изменения метаболизма активных форм кислорода при их дифференцировки по нейрональному типу. Эти клетки подвергаются терминальной дифференцировке или росту, зависящему от типа стимулов или формы киназного каскада. (Damon D. et al, 1990; Babior B., 1999). NGF селективно индуцирует долгосрочную активацию ERK1/2, которая является особенно важной для полноценной дифференцировки. На модели клеток PC-12, подвергшихся окислительному стрессу, тестируются различные антиоксиданты (Liu L, Wang SY., 2013; Im SE et al., 2013). Проведение экспериментальных исследований на нейрон-подобных клетках культуры чрезвычайно актуально, поскольку именно нервная ткань является наиболее чувствительной к окислительному повреждению и требует вмешательства препаратов, обладающих нейропротекторным действием.

1.3 NMDA рецепторы и клеточный сигналинг

Рис. 1.3. Участие NMDA-рецепторов в процессах клеточной сигнализации (Wang F. et al., 2007)

1.4 Индукторы окислительного стресса

Несмотря на противоречивые мнения учёных по поводу наличия работающих NMDA рецепторов в клетках изучаемой нами культуры, исследователи используют NMDA в качестве индуктора окислительного стресса на клетках PC-12 (Song Y.et al. 2010; Shen Y et al. 2006)

1.4.1 N-метил-D-аспартат (NMDA)

В экспериментальных исследованиях NMDA используется в качестве индуктора нейротоксичности. В работе Song Y с соавторами (2006 и 2007гг) было показано, что введение NMDA в культуру кортикальных нейронов, вызывало окислительный стресс (Ge QF et al.,2006). Было изучено действие миноциклина, который защищал клетки PC-12 против повреждений, индуцированных NMDA, посредством ингибирования активации 5- липоксигеназы. (Song Y., Wei E. et al., 2006)

В работе, опубликованной Shen Y. et al (2007), дифференцированные клетки, подвергавшиеся окислительному действию NMDA, предварительно содержали в растворе карнозина. Карнозин уменьшал экзайтотоксичность NMDA, которая проявлялась в снижении уровня апоптотических и некротических клеток. Измерения проводились методом MTT. Содержание внутри и внеклеточного карнозина, гистидина и гистамина измерялась методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии. В работе использовался ингибитор гистидиндекарбоксилазы, а также антагонисты H1 и H3 рецепторов для доказательства механизма действия карнозина посредством гистидин- гистаминового пути. Учёные полагают, то карнозин может участвовать в эффективном ингибировании глутаматного выброса посредством H1/H3 рецепоров.

Однако в литературе отсутствуют данные об эффекте NMDA на дифференцированную и недифференцированную культуру PC-12, что позволило бы определить, работают ли NMDA-рецепторы или в ответе задействуется нерецепторный механизм действия.

1.4.2 Гомоцистеиновая кислота

Гипергомоцистеинемия - независимый фактор риска сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Высокие концентрации гомоцистеиновой кислоты в крови влияют на систему гомеостаза, повышая риск развития заболеваний, связанных с повышенной свёртываемостью крови. Гомоцистеин обнаруживается в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Для нейронов и иммунокомпетентных клеток было показано взаимодействие ГЦ с ионотропными рецепторами глутамата, активируемыми NMDA, приводящие к эффекту, сходному с экзайтотоксическим эффектом глутамата. (Махро А.В. и др., 2008). В исследованиях, по оценке экзайтотоксического влияния ГЦ на нейроны, нейтрофилы и лимфоциты, было продемонстрировано, что эффект ГЦ ингибируется присутствием антагонистов NMDA-активируемых глутаматных рецепторов- MK-801 и D-AP5 (Болдырев А.А., 2009). Таким образом, предполагается, что одним из путей воздействия ГЦ на данные клетки является его воздействие в качетстве агониста ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-класса. Данных по нейротоксичности, индуцированной гомоцистеином в клетках PC-12 нет. Существует несколько работ, имеющих прикладное значение для изучения механизма действия гомоцистеиновой кислоты в клетках PC-12. В одной из них изучается эффект гидроген сульфида, как протектора против гипергомоцистеинемии вызваной ГЦ. Показано, что NaHS, являющийся донором H2S, защищает клетки PC-12 против ГЦ-индуцированной цитотоксичности и апоптоза, предотвращая снижение потанциала на мембрание метохондрий, а также снижение внутриклеточного содержания АФК, индуцированного гомоцистеином (Tang X. et al. 2009). Активные формы кислорода вносят свой вклад в нейротоксичность гомоцистеина, вызывая закисление, приводящее к гибели нейронов. В данной работе мы хотели проверить, является ли экзайтотоксический эффект ГЦ на нейрон-подобные клетки PC-12 адекватным ответу нейронов на ГЦ, а также исследовать взаимодействие ГЦ с его агонистами MK-801 и D-AP5.

1.4.3 Полиамины

Интерес учёных к проблеме изучения полиаминов продолжается в течение последних 50 лет. Получено много данных об их синтезе и распаде, о причине повышения их концентрации в клетках, однако до сих пор изучается роль концентрационных изменений путресцина, спермина и спермидина в организме человека. Как большинство ключевых веществ, содержащихся в нашем организме, полиамины могут играть двоякую роль в биохимических процессах, протекающих с их участием (Schipper G. and Verhofstad A.,2002). Известно, что полиамины поддерживают оптимальную скорость роста клеток. При этом клетки, характеризующиеся усиленным ростом, имеют высокий уровень полиаминов, а также фермента их распада орнитиндекарбоксилазы. Биосинтез многих белков стимулируется полиаминами (Igarashi K. and Kashiwagi K., 2010) В тоже время полиамины могут проявлять и негативные свойства в организме. Так путресцин, спермин и спермидин являются индикаторами развития патологических процессов в организме, сопровождающихся окислительным стрессом (Saiki R. et al., 2009) и последующей гибелью клеток (Schiller M., et al. , 2005).

При различных патологиях, содержание путресцина, спермина и спермидина в крови человека изменяется по-разному, т. е. нарушается баланс в обмене полиаминов. Спектр полиаминов растёт во всех случаях диабетической нейропатии, хроническом гломерулонефрите, нефросклерозе (Matsuoka Y et al., 1981; Huang BK et al., 2010). У пациентов, страдающих почечной недостаточностью повышается уровень путресцина в плазме крови, а спермина-уменьшается. Также известно, что содержание полиаминов в крови пациентов зависит от активности ферментов их биосинтеза и распада.

1.4.4 Акролеин

Распад полиаминов (спермина и спермидина) приводит к образованию высокотоксичного альдегида акролеина, который в настоящее время рассматривается как один из самых сильных индукторов окислительного стресса в организме. Акролеин является одним из наиболее значимых биохимических маркеров диагностики церебрального инсульта, болезни Альцгеймера и других заболеваний (Ivanova S. et al., 1998; Whiteley W. et al., 2008; Igarashi K. and Kashiwagi K., 2011). В настоящее время акролеин, продукт метаболизма полиаминов и окислительной деградации полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), рассматривается как один из наиболее токсичных альдегидов наряду с другими продуктами ПОЛ (4-гидроксиноненаль, малоновый диальдегид) (Bradley M. et al., 2010; Dalle-Donne R. et al., 2006; Esterbauer H. et.al., 1991; Luo J. and Shi R., 2004). Акролеин входит в число патогенетически значимых биомаркеров ишемического инсульта и нейродегенеративных заболеваний (Bradley M. et al., 2010; Reich E. et al., 2001; Whiteley W. et al., 2008). Акролеин-индуцированная гибель клеток, протекающая преимущественно по пути некроза, сопровождается накоплением в них активных форм кислорода (АФК) (Luo J., Shi R., 2004; Luo J, Shi R. 2005). В этих условиях становится целесообразным применение антиоксидантов как «ловушек» свободных радикалов.

1.4.5 Н₂О₂

Это устойчивая в растворах молекула, образующаяся при восстановлении супероксида (О₂^-) (реакция дисмутации). Из всех продуктов одноэлектронного восстановления кислорода только перекись водорода может реагировать не только радикальным, но и безрадикальным путем (Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996). Более того, вследствие своей электронейтральности, Н₂О₂ может свободно преодолевать клеточную мембрану (Скулачев В.П., 1996). Цепь событий, происходящих при действии на клетки in vitro Н₂О₂ в концентрации 0,1-2,5 мМ (и выше), сводится к следующему: разрывы цепей ДНК, активация репарирующего фермента поли (АДФ-рибозил)-полимеразы, уменьшение пула НАД, ЦТФ, ГТФ и УТФ; снижение интенсивности гликолиза в результате инактивации альдегиддегидрогиназы и уменьшение содержания лактата, увеличение концентрации внутриклеточного кальция, нарушение полимеризации актина и далее морфологические изменения плазматической мембраны. Истощение пула АТФ сопровождается гибелью клетки, а в случае с макрофагами, лимфоцитами и фибробластами - их лизосом (Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996).

К другим детально изученным эффектам Н₂О₂ относится перекисное окисление липидов, в первую очередь ненасыщенных жирных кислот плазматической мембраны. Несмотря на наличие, довольно емкого восстановительного буфера перекись водорода в малых дозах оказывает стимулирующее действие на клетки. В диапазоне концентраций 0,1-50 мкМ Н₂О₂ способна активировать К-каналы плазматической мембраны (Kuo S. et al., 1993; Krippeit-Drews P. et al., 1994,1995); дозозависимо усиливает окислительный взрыв нейтрофилов и макрофагов в ответ на хемотактический пептид (Winn S. et al., 1991; Gamaley I. et al., 1994); опосредует хемотаксис гладкомышечных клеток к тромбоцитарному фактору роста (Sundaresan M. et al., 1995); дозо-зависимо усиливает фагоцитоз макрофагами частиц опсонизированного латекса (Gamaley I. et al., 1994); стимулирует адгезию лейкоцитов к эндотелию (Suzuki J. et al., 1991; Gaboury C. et al., 1994); самостоятельно вызывает хемотаксис перитонеальных нейтрофилов мыши (Klyubin I. et al., 1996). Перечисленные эффекты, стимулированные перекисью водорода, могут быть опосредованы рядом событий внутри клетки. Показано, что в тех же малых дозах Н₂О₂ обратимо сдвигает потенциал плазматической мембраны в сторону гипер- или деполяризации в зависимости от типа клеток (Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996), вызывает транзиторный подъем внутриклеточного кальция (Dreher D. et al., 1995). Следует отметить, что в результате повреждающего действия перекиси водорода повышение внутриклеточного кальция уже необратимо (Oppenheim R., 1991; Elliot M. et al., 1992; Roveri A. et al., 1992), а непрерывный поток данных ионов при действии больших доз Н₂О₂ приводит в конечном итоге к лизису клетки (Elliott et al., 1992; Klyubin et al., 1996; Одгаева А. и др., 2007). Конечный эффект Н₂О_2, приводящий либо к гибели клетки, либо к ее активации зависит от ряда факторов, в частности от концентрации действующего агента.

1.5 Проточная цитометрия

В данной работе в качестве основного метода для оценки уровня АФК и гибели клеток в опытах in vitro был использован метод проточной цитометрии.

Метод цитометрии сформировался за последний 30 лет на основе опытов по подсчёту числа частиц и определению их размеров. В 1965 г. появилось первое сообщение о клеточном сортере, а в 70х годах cтали выпускать приборы, способные измерять интенсивность флуоресценции при двух или более длинах волн, что позволило определять сразу несколько клеточных параметров.

В настоящее время цитометрию принято подразделять на статическую и проточную. В первом варианте цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на основе обычных люминесцентных микроскопов. Наблюдений с помощью второго варианта цитометрии осществляются с помощью специальных приборов - проточных цитометров и сортеров.

В основе метода прочной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки в определенном количестве в присутствии специфического флуоресцирующего красителя вводятся в ламинарный поток в прочной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирается с помощью системы линз и зеркал, которые раскладывают их на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация отображается на гистограммах. Современные проточные цитометры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10є), которые ещё называют прямым светорассеянием; рассеяние света на угол 90є, так называемое боковое светорассеяние; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн. Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.

Рис. 1.4.Схема работы проточного цитофлуориметра

Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определять количество антигенов, исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный pH), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных реакций. К области применения проточной цитометрии можно отнести иммунофенотипирование (анализ субпопуляционного состава лимфоцитов), диагностику гемобластозов, определение содержания гемопоэтических стволовых клеток (CD34+) при трансплантациях костного мозга, анализ плоидности ДНК и анализ клеточного цикла, исследование экспрессии цитокинов, дифференциальную диагностику опухолей, анализ пролиферативного статуса клеток, определение минимальной остаточной болезни, а также определение маркёров апоптоза.

В нашей лаборатории используется прибор Facs Calibur, стандартной конфигурацией которого является цитометр с пятью детекторами, состоящий из жидкостного, оптического и электронного блоков и встроенного аргонового лазера с воздушным охлаждением. Собственно система Facs Calibur состоит из чувствительного блока, компьютера и различного программного обеспечения.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Моделирование окислительного стресса на культуре клеток РС12 in vitro

2.1.1 Характеристика клеточной культуры

Работа проведена на клеточной линии феохромоцитомы крыс PC-12 - D4. Культура была любезно предоставлена руководителем лаборатории генетики соматических клеток д. б. н. И. А. Гривенниковым из Института молекулярной генетики.

2.2.1.1 Культивирование клеток.

Клетки культивировали в среде RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium), с добавлением сульфата гентамицина/стрептомицина (0,04 г на 500 мл среды), глутамина (150 мг на 500 мл среды) и 15% эмбриональной телячьей сыворотки во флакон для культивирования объёмом 25 см³. В течение всего периода культивирования клетки содержали в СО₂ инкубаторе при температуре 37⁰С и 95% влажности и 5% содержании СО₂ в воздухе, проводя замену среды через каждые 2-3 дня.

Клетки периодически (каждые 3-4 дня) пересевали в зависимости от интенсивности роста. Смыв клеток осуществляли средой RPMI, с помощью пипетки, механически смывая их потоком жидкости (вследствие чего они отрывались от подложки). Затем клетки тщательно суспендировали и проводили количественную оценку изучаемой популяции клеток в камере Горяева. Суспензию клеток центрифугировали в течение 8 мин при 1100 об/мин, полученный осадок клеток использовали для работы. Эксперимент проводился при количестве клеток приблизительно равном 10⁶ в 1 мл. Внешний вид популяции интактных клеток представлен на рис. 2.1.

Рис. 2.1. Клетки феохромоцитомы PC-12 в интактном состоянии. Изображение получено на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.

Клетки замораживали для последующего использования. Замораживанию подвергали клетки, плотность суспензии которых соответствовала достаточному их количеству (когда процент клеток в монослое составлял примерно 80% от общей площади дна флакона, это количество примерно соответствует 10⁶ клеток в 1 мл). Клетки собирали, центрифугировали, затем осадок клеток растворяли в 1 мл телячьей сыворотки и добавляли 10% ДМСО в качестве криопротектора. Сбор клеток производился в стерильных условиях в ламинарном боксе с вертикальным воздушным потоком. В криопробирках (пробирках из специального пластика, который не разрушается при низких температурах), клетки переносили в холодильную камеру и оставляли при температуре +4?С на 1 час. Клетки могут храниться длительное время как в низкотемпературной камере глубокого охлаждения (-80?С), так и в жидком азоте.

Размораживание клеток осуществляли путем переноса криопробирки из сосуда Дьюара, содержащего жидкий азот, или из морозильной камеры, в которой они хранились, в тёплую воду (+37?С) для того, чтобы клетки оттаяли. Затем растаявшую суспензию клеток в стерильных условиях перемешивали пипеткой и переносили во флакон объёмом 25 см³ с приготовленной средой RPMI объёмом 10 см³. После того как клетки оседали и прикреплялись к нижней стенке флакона (через 3- 4 часа), среду заменяли, удаляя содержавшийся в замороженной суспензии ДМСО и оставляли в СО₂ инкубаторе на несколько дней (3-4 дня) до последующей рассадки или забора клеток для проведения эксперимента.

2.2.1.2 Подготовка клеток для анализа

В опытах использовали клетки феохромоцитомы PC-12 D4, выращенные по описанному выше протоколу. Кроме интактных клеток, использовали культуры, стимулированные дексаметазоном и rHu-NGF-в (рекомбинантный человеческий фактор роста нервов в) .

Дексаметазон - один из факторов, способных дифференцровать клетки PC-12 по почечному типу, превращая их в обычные хромаффинные клетки.

NGF-в - фактор дифференцировки клеток по нейрональному типу. В экспериментальных исследованиях мы использовали как недифференцированные, так и дифференцированные по нейрональному типу клетки РС-12.

2.2.1.3 Дифференцировка клеточной культуры с помощью дексаметазона и NGF-в

Согласно протоколу, культивированные клетки за два дня до начала эксперимента переносили в «среду голодания», т.е. не содержащую сыворотку, через сутки в среду вносились дифференцирующие агенты - NGF или дексаметазон.

В клеточную среду вносили rHu-NGF-в (к 6 мл добавляли 6 мкл раствора фактора роста нервов, содержащего 100 нг/мл сухого вещества) или дексаметазон (к 6 мл добавлял 30 мкл дексаметазона, присутствующего в концентрации 4 мкг/мл). Дексаметазон вносили в среду за 2 дня до эксперимента в концентрации 20 нг/мл. rHu-NGFв также вносили в среду за 2 дня до эксперимента в концентрации 0,1 нг/мл.

В день эксперимента клетки отделяли от подложки и переводили в раствор как описано выше, удаляли супернатант и суспендировали осевшие клетки в нескольких мл (3-4 мл) бесцветного раствора Хенкса. В течение всего подготовительного периода клетки содержали в СО₂ инкубаторе в присутствии 5% СО₂, 98% влажности и 37?С. Перед началом эксперимента проводили подсчет клеток под микроскопом. Количество клеток должно составлять примерно 10⁶/мл.

На рис. 2.2 представлен вид клеточной культуры РС-12 после стимуляции фактором роста нервов (слева) и дексаметазоном (справа).

Рис. 2.2. Культура PC-12, стимулированная NGF (слева) и дексаметазоном (справа). Изображение получено на микроскопе Nikon Eclipse TS-100F.

Из рис. 2.1 и 2.2 видно, что интактные клетки отличаются по морфологии от клеток, стимулированных дексаметазоном или фактором роста нервов. Клетки, стимулированные дексаметазоном, в свою очередь отличаются от клеток, стимулированных фактором роста нервов.

В культуре интактных клеток (см. рис. 2.1) преобладают шарообразные клетки, некоторые из которых имеют отростки, сопоставимые по длине с размером клеток. Отростки не сужаются на дистальном конце, а имеют такой же диаметр, что и на проксимальном конце. Клетки, стимулированные дексаметазоном (см. рис. 2.2-справа) более распластанные (имеют форму многогранников) и крупнее, чем интактные клетки. Отростки этих клеток отличные по форме от отростков интактных клеток. Клетки, стимулированные NGF (см. рис. 2.2-слева) напоминают по форме нейроны. У них есть «аксоны» и «дендриты», а тело самой клетки вытянутое и многогранное. Клетки этой культуры могут сплетаться в сети, однако могут существовать и отдельно друг от друга. Этот тип клеток приобретает видимые различия от интактных клеток уже через 1 сутки. Клетки, стимулированные дексаметазоном, дифференцируются в клетки почечного типа только через двое суток: они более тонкие и короткие. Клетки склонны к агрегации, что выражается в том, что их очень сложно смыть с чашки Петри для проведения эксперимента. Кроме того, их адгезивные свойства гораздо более ярко выражены чем свойства клеток, стимулированных NGF и клеток интактной культуры. Мы не анализировали кривые роста клеток, поскольку это не входило в задачу работы.

1.2.2 Определение уровня активных форм кислорода и клеточной смерти методом проточной цитометрии

1.2.2.1 Проточная цитометрия

В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств индивидуальных клеток. Суспензию клеток под давлением пропускают через капилляр, где в ламинарном токе жидкости они выстраиваются друг за другом за счет наличия “обволакивающей” жидкости. По краям потока создается более высокое давление, чем в центре, вследствие чего клетки, стремясь попасть в область наименьшего давления, образуют поток, состоящий фактически из одного ряда клеток, в котором они подвергаются поочередному анализу с помощью быстродействующих датчиков.

В качестве источника света в проточном цитометре могут быть использованы различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определённой длины волны возбуждает молекулы флуоресцентных красителей, которыми предварительно нагружают клетки. Одновременно могут возбуждаться сразу несколько красителей, если они имеют различные спектральные характеристики. Это позволяет оценивать одновременно несколько параметров. Свет, испускаемый красителями, собирается с помощью системы линз и преобразовывается в электрический импульс с помощью фотоумножителя (ФЭУ). Далее информация обрабатывается в цифровом режиме.

Рис. 2.3. Клетки феохромоцитомы PC-12 на проточном цитометре.

Ось Y - прямое рассеивание (FS), характеризует размер клеток, Ось Х - боковое рассеивание (SS), характеризует гранулярность клеток. Гейтами R1 и R2 выделены популяции клеток, параметры которых проанализированы независимо.

В настоящей работе измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, USA). В каждом измерении регистрировали 10000 событий. Результаты анализировали с помощью программы WinMDI 2.8 (Scripps Institute, La Jolla, USA). На рис. 2.3. представлен график распределения светорассеяния - прямое против бокового светорассеяния.

С помощью компьютерной аналитической программы WinMDI 2.7 оценивали распределение интенсивности флуоресценции двух флуорохромов - DCF и PI (см. ниже). При представлении результатов измерения в виде гистограмм по шкале абсцисс откладывали интенсивность флуоресценции данного красителя в логарифмических координатах, а по шкале ординат число событий для каждой величины сигнала (соответствующее количеству клеток). Положение максимума полученного распределения характеризует среднюю интенсивность флуоресценции, присущее основному числу клеток в данной популяции, а площадь распределения отражает гетерогенность клеточной популяции по данному параметру.

2.1.2.2 Определение уровня активных форм кислорода (АФК)

Концентрация АФК в клетке непостоянна. Известно развитие колебательного режима при пероксидазном катализе окисления кислородом NADH (Kummer J., 1996). Хотя до последнего времени роль АФК, а точнее сказать, роль радикалов и передачи электронов между ними, в этом процессе не была изучена. Известно, что в водных растворах карбонильных соединений (например, глюкозы, рибозы, метилглиоксаля) и аминокислот происходит восстановление кислорода, появляются свободные радикалы, и их реакции сопровождаются излучением фотонов (Воейков Ю.В., 2001).

Уровень АФК в клеточной популяции на проточном цитометре определяли с помощью флуоресцентного красителя 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата, DCFН₂-DA (Invitrogen), (_ex = 495 нм и _em = 520 нм), который хранили в растворе DMSO в концентрации 100 мМ.

Живые клетки способны аккумулировать и деацетилировать DCFH₂-DA до молекул 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина (DCFH₂₎, которые сами не флуоресцируют и не могут покидать клетки. Однако эти молекулы в присутствии АФК, ферментативно превращаются во флуоресцентный продукт 2',7'-дихлорфлуоресцин (DCF), который также аккумулируется внутри живой клетки, поскольку не может пройти через целую мембрану.

Таким образом, флуоресценция DCF соответствует уровню активных форм кислорода, имеющихся в клетке, и свидетельствует о внутриклеточном уровне АФК (Sureda F. et al, 1996; Boldyrev A. et al, 2000).

Суспензию клеток нагружали DCFH₂-DA (конечная концентрация в пробе 100 мкМ) и оставляли на 40-60 мин в темноте. Затем клетки распределяли в пробирки с различными лигандами и инкубировали в течение заданного времени. Затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США) рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft, США).

2.1.2.3 Определение доли мертвых клеток

Долю мертвых клеток также определяли методом проточной цитометрии, используя окрашивание клеток иодидом пропидия, PI, который является меткой клеток с поврежденной мембраной, то есть некротических. Иодид пропидия используется для окрашивания ДНК выделенных ядер. PI интеркалирует в спираль ДНК фиксированных и пермеабилизированных клеток (Patel D. and Shen C., 1978).

Клетки PC-12 D4 окрашивали внесением в среду 10 мкМ иодида пропидия за 3 мин (в темноте при комнатной температуре) до измерения доли мертвых клеток (лex =485 нм, и лem =610 нм). Оценивали данные, полученные из гистограмм, по оси ординат которых отложено количество событий, а по оси абсцисс - распределение флуоресценции иодида пропидия (рис. 2.3). Доля клеток в каждом квадранте указана в процентах; 2 нижних квадранта содержат живые клетки, 2 верхних - мертвые, характеризующиеся высокой величиной флуоресценции PI. Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США) рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft, США).

Рис. 2.4. Популяция клеток феохромоцитомы PC-12 в координатах PI vs DCF (при определении уровня АФК и смертности клеток)

2.1.3 Определение экспрессии NMDA-рецепторов методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания антителами

Определение экспрессии NMDA-рецепторов на поверхности клеток РС-12 проводили методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания двумя видами антител к двум субъединицам рецепторов: NR1 а также к NR2b субъединицам.

Клетки отделяли от дна культурального флакона и центрифугировали 2 раза в растворе Хенкса для отмывания от среды культивирования. После этого их считали и вносили в цитометрические пробирки по 125 мкл (примерно по 10⁶ клеток в мл). Добавляли 100 мкл 10% формалина и 275 мкл раствора Хенкса (конечное содержание формалина - 2%). Клетки перемешивали и оставляли на 10 мин при 37?C. Через 10 мин в пробы добавляли по 2 мл раствора Хенкса для того, чтобы «отмыть» формалин. После перемешивания центрифугировали при 1100 об/мин в течение 7,5 мин. Эту процедуру проводили три раза, после чего отбирали надосадочную жидкость и добавляли 96% спирт (в таком количестве, чтобы в конечном объёме его концентрация составляла 90%), а также по 500 мкл раствора Хенкса. Клетки выдерживали 20 мин на холоду при +4^оС и затем также трижды отмывали раствором Хенкса. Следующий этап включал окраску антителами. Ниже представлен коммерческий протокол окраски антителами клеток PC-12. Таким же образом окрашивались клетки, которые культивировались в присутствии дексаметазона или NGF.

Субъединицы NR1 и NR2 NMDA рецепторов обладают разной активностью. NR1 субъединица является канальной. Эта субъединица, встроенная в мембрану, обеспечивает полноценную работу рецептора. на NR2 субъединица показывает, обладает ли регуляторной активностью белок или нет. Подробнее о функциях субъединиц NMDA рецепторов см. главу «Обзор литературы»

В таблице представлена последовательность окрашивания первичными (I) и вторичными (II) антителами. Контрольные клетки окрашиваются только вторичными антителами. Метод непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания предполагает, что метка с флуоресцентным зондом находится на вторичных антителах. Это определяет дополнительную чувствительность метода.

Таблица 2.1. Протокол окрашивания антителами на субъединицы NMDA рецепторов пермеабилизованных клеток PC-12

К каждой изоформе белка прикрепляются первичные антитела, которые не обладают наличием флуоресцентной метки. Далее подбираются вторичные антитела, меченные флуоресцентным красителем. Вторичные антитела присоединяются к специфическому участку первичных антител. Таким образом, они не могут прикрепляться к белкам мембраны клетки, так как не имеют специфического сайта связывания с ними. Поэтому базовая флуоресценция, которая может детектироваться в проточном цитометре, является незначительной и принимается равной нулю. Все остальные клетки окрашиваются первичными антителами, которые связываются с белком NMDAR. После чего, клетки окрашиваются вторичными антителами, которые специфически связываются с первичными антителами. Детекция флуоресценции вторичных антител может быть количественно и качественно измерена при помощи метода проточной цитометрии.