Полногеномное сравнение распределения ретроэлементов в ДНК человека и шимпанзе

Пожалуй, наибольшее число примеров взаимодействия ретроэлементов с клеточным геномом касается изменения генной экспрессии. Последовательности коротких ретропозонов насыщены сайтами связывания клеточных факторов транскрипции [432] и могут выступать в качестве промоторов для близлежащих генов. Аналогичную функцию могут выполнять и одиночные LTR ретровирусов и ретропозонов [433, 434]. Кроме того, близко расположенные ретроэлементы могут конкурировать с промоторами генов за связывание транскрипционных факторов, что создаёт новый механизм регуляции экспрессии [435].

Во многих ретроэлементах содержатся донорные и/или акцепторные сайты, а также энхансеры сплайсинга, которые могут реализоваться в генах, получивших копию ретропозона [436]). Копии SINE, LINE и LTR могут предоставлять сигналы полиаденилирования, вызывая укорачивание исходных транскриптов, в состав которых они попали [436, 437]. Наконец, наиболее интригующими являются данные о вхождении транскриптов некоторых SINE в состав загадочных малых РНП-частиц, по-видимому, участвующих в регуляции транскрипции определённых групп генов [438]. Антисмысловые взаимодействия транскриптов SINE с мРНК, содержащими комплементарные к ним последовательности (тоже копии SINE, но в обратной ориентации), возможно, играют большую роль в регуляции их трансляции [439], а также деградации этих мРНК и изменении транскрипции соответствующих генов [440].

За последнее десятилетие накопился также большой объём данных о структурной функции ретроэлементов. По крайней мере у двух разных организмов, дрозофилы (насекомое отряда Двукрылых) и хлореллы (одноклеточная зелёная водоросль), LINE-элементы участвуют в поддержания длины теломер. У дрозофилы это HeT (название дано по областям локализации копий: heterochromatin and telomere) и TART (telomere-associated retrotransposon) [96], у хлореллы - Zepp [441]. В обоих случаях местами интеграции новых копий этих элементов служат почти исключительно концевые участки хромосом, где они образуют тандемы, в которых элементы обращены олиго(А)-концами в сторону центромеры. В геноме одноклеточного простейшего Giardia lamblia присутствуют два активных семейства ретроэлементов, представители обоих интегрируют исключительно в теломеры. Возможно, это третий пример построения теломер с помощью LINE [442]. Как известно, у большинства организмов за поддержание теломер отвечает специальный фермент теломераза (либо, как у всех двукрылых за исключением рода Drosophila, оно обеспечивается рекомбинацией). Однако, при инактивации теломеразы часто вступает в действие другой, неизвестный механизм, поэтому не исключено, что связь LINE с теломерами более универсальна [443]. Интересен пример Ty5, LTR-ретротранспозона дрожжей, который интегрирует исключительно в районы неактивного хроматина, в основном в теломерные участки. Один из доменов его интегразы/обратной транскриптазы содержит мотив, специфически связывающийся с белком Sir4p, который является структурным компонентом гетерохроматина. Искусственное внесение мутаций в этот мотив лишило Ту5 возможности интегрировать в геномную ДНК [444].

По-видимому, не менее важную роль играют ретроэлементы и в организации структуры центромер [445, 446] и остальных участков гетерохроматина. Для последовательностей многих SINE характерно наличие блоков связывания белков ядерного матрикса (scaffold/matrix-associated regions, S/MAR) [447], а представитель SINE из генома капусты S1 сам предпочтительно интегрирует в последовательности MAR [448]. ДНК, выделенная из синептонемальных комплексов пахитенных хромосом у млекопитающих, помимо микросателлитных последовательностей, содержала множествo копий LINE и SINE-элементов [449]. Кроме того, для LINE человека показана специфичность при интеграции в определённые сайты -сателлитов центромер [450]. Вклад мобильных элементов в организацию структуры гетерохроматина лучше всего изучен на примере дрозофилы, однако есть все основания полагать, что насыщенность ими гетерохроматических районов хромосом является общей чертой всех эукариот.

К характерным особенностям гетерохроматина относятся пребывание в более или менее конденсированном состоянии на протяжении всего клеточного цикла, поздняя репликация в S-фазе, крайне низкое количество генов и неучастие в процессах гомологичной рекомбинации при мейозе [451]. С точки зрения молекулярной организации, для гетерохроматина характерно практически полное отсутствие уникальных последовательностей. Гетерохроматические районы обнаруживаются в областях ядрышкового организатора и в тех частях хромосом, где расположена центромера. На политенных хромосомах дрозофилы цитологически выявляются два вида гетерохроматиновых областей: сильно конденсированный -гетерохроматин, занимающий в хромоцентре центральное положение, и располагающийся ближе к периферии, на границе с эухроматином -гетерохроматин (термины предложены Э.Хейтцем в 1934г.). ДНК и -, и особенно -гетерохроматина сильно недопредставлена в политенных хромосомах по сравнению с ДНК эухроматических районов. Принято считать, что значительная часть -гетерохроматина составлена различными семействами микро- и минисателлитов.

Диффузный же гетерохроматин в основном сформирован умеренно повторяющимися последовательностями и небольшим числом уникальных генов, которые могут активно транскрибироваться. Перенос таких генов в эухроматические районы подавляет их экспрессию (явление, обратное классическому эффекту положения). Данные по гибридизации in situ показывают присутствие в -гетерохроматине большого разнообразия подвижных элементов всех типов [65], а клонирование некоторых участков этих областей выявляет перенасыщенность этих районов дефектными копиями ретроэлементов [452, 453], образующими подобие мозаики из гетерогенных блоков (англ. clustered, scrumbled regions [454]). Такая организация может быть объяснена вовлечённостью -гетерохроматина, в отличие от -гетерохроматина, в процессы рекомбинации.

Мобильные элементы могут образовывать протяжённые комплексы сложного происхождения друг с другом, с генами рибосомной РНК и рядом других структур. Эти агрегаты, в свою очередь, также иногда представлены в геноме несколькими копиями (например, SCLR (Stellate+copia-like+LINE+rDNA) [455]). Для некоторых ретропозонов наблюдается тандемное расположение копий [456]. Данные последних лет говорят о том, что не только в -, но и в -гетерохроматине имеются копии ретроэлементов [457], и наоборот: -гетерохроматиновые области могут содержать протяжённые блоки сателлитной ДНК, характерной для прицентромерного -гетерохроматина [458]. В связи с этим уместно упомянуть работу [138], в которой было показано, что некоторые типы микросателлитов у млекопитающих обязаны своим возникновением 3'-концам ретропозонов.

Возникшие таким образом блоки сателлитной ДНК могут затем разрастаться при помощи других механизмов (“проскальзывания” полимеразы при репликации, рекомбинации и др.). Интересно, что кластеры некоторых ретроэлементов, локализованные в эухроматических районах, способны организовывать участки так называемого интеркалярного гетерохроматина, характеризующегося склонностью к двунитевым разрывам и поздней репликацией. Этот факт говорит об активной их роли в формировании структуры гетерохроматина, в противовес взглядам на гетерохроматин как на “кладбище транспозонов”, ушедших благодаря локализации в нетранскрибируемом районе из-под контроля естественного отбора. Против последнего утверждения говорит также и то, что представленность ретроэлементов одного семейства в одинаковых гетерохроматических районах разных лабораторных линий дрозофилы сильно отличается [459, 460], иными словами, гетерохроматин не является стабильным компартментом генома, и наличие в нём ретроэлементов должно поддерживаться постоянными внедрениями новых копий (в скобках заметим, что эухроматиновый компартмент ещё быстрее освобождается от не нашедших применения ретроэлементов: многие ретропозоны, иммобилизованные у данного вида, но активные у родственных, могут сохранить некоторое количество дефектных копий только в гетерохроматине [453]).

Несмотря на то, что большинство исследований гетерохроматических районов проводилось на дрозофиле и других организмах, имеющих клетки с политенными хромосомами, не вызывает сомнения сходное устройство гетерохроматина и у других организмов. В частности, гетерохроматин человека также насыщен последовательностями ретропозонов [4, 461], а новейшие работы позволяют говорить о наличии в геноме высших позвоночных областей, соответствующих (в том числе по молекулярной структуре) -гетерохроматину дрозофилы [462]. Интересно, в ДНК человека кроме участков гетерохроматина повышенная плотность интеграций полноразмерных LINE наблюдается по всей Х хромосоме (в 3 раза выше, чем для аутосом), и по всей У хромосоме (в 9 раз выше, чем для аутосом) [463]. Видимо, это объясняется тем, что Х хромосома рекомбинирует только у женщин (то есть на 2 рекомбинирующие Х хромосомы приходится 1 не рекомбинирующая), а У хромосома не рекомбинирует вовсе. В принципе, LINE могут способствовать гетерохроматинизации ДНК, поскольку содержат сайты связывания с белками ядерного матрикса (для L1 человека показано связывание с таким белком SATB1 [464])

Изучение молекулярной структуры гетерохроматических районов сильно осложнено в силу трудностей клонирования данных областей. Протяжённые блоки сателлитов, характерные для них, невозможно клонировать в фаговые и космидные векторы из-за трудностей с упаковкой в капсид [465]. Кроме того, высокоповторяющиеся последовательности могут теряться и изменяться в ходе клонирования [466]. По этой причине данные о структуре этих районов генома скудны и требуют проведения дальнейших исследований.

Необычайное разнообразие функций, которые могут выполнять ретроэлементы, видимо, имеет довольно простое объяснение. Небольшое количество активных копий “эгоистичных” мобильных ретроэлементов, стараясь избежать элиминации при естественном отборе, постоянно осуществляет ретропозиции, при этом большинство вновь возникающих копий дефектны (иногда называемые в английской литературе “dead-on-arrival”, мертворождённые копии [467]) - это и есть “генетический груз”. Часть из них выбрасывается из генома при спонтанных делециях, часть остаётся законсервированными в гетерохроматине, некоторые же копии могут послужить материалом для эволюции, которая “лепит” из них самые разные функциональные формы [468]. Поэтому, пожалуй, правильнее было бы называть их не просто “утилем” (“junk”), а чем-нибудь вроде “утиль-сырья” (англ. scrap yard, как предлагает В. Макаловски в [469]). В рамках подобной концепции поставлять материал для молекулярной эволюции и является, по сути, единственной первичной функцией обратного потока генетической информации.

Часть II. Техника вычитающей гибридизации: эффективный подход к решению задач молекулярной генетики

Глава 2.1 Появление метода Вычитающей Гибридизации

Вторая часть обзора литературы посвящена методу вычитающей гибридизации, точнее сказать - семейству методов, основанных на вычитающей гибридизации (ВГ). Именно принцип вычитающей гибридизации показался нам оптимальным для создания на его основе метода полногеномного сравнения распределения мобильных элементов между организмами.

Появившись в 1984 году, когда Палмер и Ламар впервые применили ВГ для создания рекомбинантной библиотеки ДНК мыши, обогащённой последовательностями Y хромосомы [470], методика на настоящий момент претерпела кардинальные изменения и стала одним из наиболее важных и эффективных подходов молекулярной генетики. Количество задач, успешно выполненных с помощью ВГ, весьма велико, и продолжает расти с каждым годом. Метод оказался воистину универсальным, ВГ нашла удачное применение для таких целей, как клонирование и характеристика новых генов, поиск ткане- или опухоль- или организм- специфических транскриптов, поиск транскриптов, специфичных для определённых стадий развития организма, болезней, регенерации, либо индуцированных каким-либо сигналом. Одинаково эффективно метод применяли и применяют для сравнение ДНК бактериальных геномов, для поиска видоспецифичных локусов и полиморфных маркёров в геномах эукариот. Кроме того, ВГ успешно использовали для субклонирования ДНК из YAC (искусственных дрожевых хромосом) в более мелкие векторы, для поиска геномных перестроек при раке либо хромосомных аномалиях, и даже для заполнения брешей при массированном секвенировании геномов. По своей значимости и универсальности вычитающую гибридизацию можно сравнить с двухгибридной системой в дрожжах; оба метода обладают широким спектром применения, оба далеко не исчерпали своего потенциала, оба пока ещё не оцененены по достоинству и оба являются мощным орудием в руках исследователя, особенно при наличии у последнего определённой доли воображения.

Перечислению успехов, достигнутых при использовании методов ВГ, можно было бы посвятить отдельную большую работу, но в рамках данного реферата мне хотелось бы подробно остановиться прежде всего на описании разнообразных методических подходов, включающих стадию вычитающей гибридизации. Как было сказано выше, метод ВГ стал реальностью в 1984 году, когда Палмер и Ламар предложили простую общую идею разделения гомогибридов "Трейсера" (набор последовательностей, из которых производят вычитание) от гетерогибридов Трейсер-Драйвер и гомогидридов Драйвер-Драйвер ("Драйвер" - это набор последовательностей, которые вычитают из Трейсера; целью ВГ является получение фракции нуклеиновых кислот, обогащённой последовательностями, присутствующими в Трейсере и отсутствующими в Драйвере). Предложенная идея заключалась в том, что Трейсер и Драйвер должны иметь различные последовательности на концах [470]. Авторы преследовали цель приготовить мышиную рекомбинантную библиотеку ДНК, обогащённую последовательностями Y хромосомы (см. Рис. 2.1.1). ДНК самки мыши (Драйвер) была фрагментирована случайным образом, в то время как ДНК самца (Трейсер) была порезана эндонуклеазой рестрикции MboI. ДНК смешали в соотношении 100:1, денатурировали и ренатурировали. Только реассоциировавшие гомодуплексы Трейсера содержали липкие концы по обоим краям и могли быть лигированы в вектор pBR322, разрезанный BamHI. Вскоре этот принцип был успешно использован для поиска фрагментов ДНК, делетированных у пациентов, больных миотонической дистрофией Дюшенна [471].

Одновременно другие группы исследователей стали применять сходные подходы для обнаружения на сей раз уже не геномной ДНК, а РНК транскриптов, которые бы присутствовали в одном анализируемом источнике, и отсутствовали в другом [472, 473]. Так, предпринимали поиск мРНК, специфичных для того или иного типа клеток, состояния органа или организма (см. Рис. 2.1.2). На матрице выделенной поли А+ фракции РНК Трейсера синтезировали первые цепи кДНК, затем разрушали мРНК при обработке щёлочью, так что оставались только первые цепи кДНК, комплементарные мРНК трейсера; затем трейсер смешивали с драйвером, взятым в 100-кратном или большем избытке. Драйвер при этом представлял собой другую поли А+ фракцию РНК.

Рисунок 2.1.1. Схема вычитающей гибридизации образцов ДНК, применённая Палмером и Ламаром [470], см. текст выше.

В получившейся смеси фрагменты трейсера либо гибридизовались с комплементарными цепями взятого в избытке драйвера, либо не гибридизовались с ними. Задачу отделения незагибридизовавшейся части трейсера (то есть фракции, обогащённой уникальными для трейсера последовательностями) от гибридов трейсер-драйвер решали хроматографией на гидроксиапатитовом сорбенте (при этом сорбируются двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот). На матрице полученной фракции трейсера строили вторые цепи кДНК, продукты лигировали в векторы: либо в экспрессионные, если нужно было провести ещё один цикл вычитания, либо в векторы для наработки достаточных для секвенирования количеств ДНК [472, 473].

Для того, чтобы увеличить скорость ренатурации (гибридизации) в ходе ВГ, часто в гибридизационную смесь добавляли химические акселераторы, такие как фенол [474].

Последняя из описанных методик, наряду с большим количеством преимуществ, имеет ряд недостатков: (1) необходима наработка больших количеств мРНК, что возможно лишь при работе с ограниченным набором тканей, (2) работа весьма трудоёмка и может быть часто сведена на нет деградацией мРНК. Первая проблема была решена созданием специальных одно- либо двуцепочечных экспрессионных векторов (особенно эффективны были одноцепочечные фагмиды со вставками в заданном направлении), в которые клонировали кДНК трейсера и драйвера. РНК нарабатывали в E. coli, что позволяло оперировать большими количествами материала [475-477]. Второй недостаток метода удалось преодолеть, когда вместо мРНК драйвера для вычитания стали использовать его двухцепочечную кДНК (использование только первых цепей для вычитания являлось бы слишком дорогостоющей процедурой). При этом, естественно, вставала новая проблема: как отделить после вычитания дуплексы трейсер-трейсер от дуплексов драйвер-драйвер и трейсер-драйвер. В 1986 году Уэлчер с соавторами предложили использовать для этого биотин-стрептавиновую систему [478]: для синтеза кДНК драйвера использовали биотинилированные праймеры, а после вычитающей гибридизации продукты инкубировали с медными гранулами, конъюгированными со стрептавидином. При этом дуплексы трейсер-трейсер оставались в растворе, а все остальные гибриды, вместе с незагибридизовавшимся драйвером, сорбировались на поверхности гранул. Данный способ очистки гомогибридов трейсер-трейсер стал затем весьма популярен (претерпев, впрочем, некоторые модификации). В 1993 году в качестве твердофазного носителя для конъюгированного стрептавидина при очистке гибридов трейсер-трейсер начинают использовать магнитные гранулы [479, 480], которые с тех пор стали наиболее часто используемым типом носителя.

Глава 2.2 Применение ПЦР для усовершенствования ВГ

Несмотря на упомянутые выше усовершенствования, вычитающая гибридизация всё же оставалась слишком трудоёмким методом: при всех очевидных выгодах этого подхода в период с 1984 по 1989 годы было опубликовано всего 29 (!!!) статей (см. Рис. 2.2.1), где бы описывались применения ВГ. Прорывом в использовании ВГ, равно как и прорывом почти во всех остальных областях молекулярной генетики, стало изобретение метода ПЦР. Действительно, обладая любым, даже самым ничтожным количеством кДНК, исследователь отныне мог быстро и просто нарабатывать нужные ему количества трейсера и драйвера. Кроме того, значительно упростилась задача клонирования продуктов ВГ [481-483]. Начиная с 1990 года ПЦР становится неотъемлимой частью практически всех протоколов ВГ. Соответственно, повышается интерес учёных к использованию данного метода: количество выходящих в год публикаций, посвящённых ВГ, возрастает в 3-4 раза (см. Рис. 2.2.1).

Рисунок 2.2.1. Динамика цитирования техники ВГ в литературе.

Применение ПЦР дало возможность бороться также ещё с одной проблемой: раньше исследователь не мог проводить эффективное вычитание для редко представленных транскриптов: концентрация их была крайне низка, и скорость реассоциации при ВГ ничтожна, так что такие транскрипты, как правило, избегали анализа. Метод ПЦР позволял нарабатывать большие количества ДНК для ВГ, что, соответственно, позволяло детектировать более редко представленные транскрипты, чем ранее [481-485]. В 1991 году впервые ВГ начинают крайне успешно использовать для поиска различий между бактериальными геномами [486]; с тех пор это становится одним из наиболее частых применений вычитающей гибридизации: поиски различий между геномными ДНК вирулентных и невирулентных штаммов, болезнетворных видов бактерий и их безвредных родственников является, во-первых, важнейшим источником молекулярно-генетических маркёров для диагностики заболеваний, и, во-вторых, позволяет наметить мишени для разработки новых лекарственных препаратов [486-488].

Попытки применения ВГ для более сложных смесей, чем фрагментированный бактериальный геном либо библиотека кДНК, оказываются менее результативными [489, 490]: при полногеномном сравнении ДНК высших эукариот ВГ, как правило, не даёт высоких значений для обогащения по специфическим последовательностям. Хотя применение химических акселераторов при гибридизации (фенол) и позволяет повысить скорость реассоциации в гибридизующейся смеси, её значения всё же остаются слишком низкими для того, чтобы проводить полногеномные вычитания сложных геномов. Авторы публикации [491] отмечают, что, кроме выше перечисленных, ещё одна трудность возникает при сравнении сложных геномов: скорость реассоциации повторяющихся элементов генома (а они, например, составляют более 40% генома человека [4, 492]) значительно превосходит скорость реассоциации уникальных последовательностей, что, разумеется, становится тяжёлым препятствием для сравнения геномов методом ВГ "в лоб". В обзоре [4, 487, 492] впервые проводится анализ преимуществ и недостатков ВГ, базируясь на имеющемся экспериментальном материале [493] и собственных рассчётах, авторы приходят к выводу, что наибольшее обогащение может быть достигнуто в случае, если трейсер и драйвер будут не двуцепочечными, а одноцепочечными молекулами. В своей более поздней статье за 1996 год авторы предложили математическую модель для описания хода ВГ [494].

Согласно опубликованному, значение Ed(t) - то есть ожидаемого обогащения от времени гибридизации, при использовании двуцепочечных трейсера и драйвера, выражается формулой:

Ed(t)=(1+RD0 t)/(1+RT0 t),

где R (M-1sec-1) - константа скорости реассоциации, D0 и T0 - концентрации трейсера и драйвера в молях. Максимальное обогащение при t®Ґ составляет D0 /T0. Для ограниченных значений времени, например для 14 часов, обогащение тем выше, чем выше RD0. Таким образом, для достижения наилучших результатов следует использовать наибольшие величины R и D. Применение химических акселераторов повышает значение R, что вместе с высокими концентрациями драйвера повышает скорость реассоциации, и, соответственно, эффективность ВГ. Однако же в случае использования в качестве трейсера и драйвера фрагментированных сложных геномов (таких, как геномы млекопитающих) даже максимально достижимые концентрации отдельных фрагментов в гибридизационной смеси недостаточны для получения сколь либо значимого обогащения, так что таким способом могут быть обнаружены лишь крайне протяжённые отличия между геномами (как, например, отсутствие Y хромосомы в геноме самки мыши). Таким образом, в этой работе авторы, Е. Свердлов и О. Ермолаева, впервые теоретически обосновали ограничения применения метода ВГ для сравнения геномов.

Глава 2.3 Появление метода Репрезентативного Дифференциального Анализа (RDA)

В 1994 году Николай Лисицын опубликовал новый метод, названный им RDA (от Representative Differences Analysis [495]), которому суждено было придать “второе дыхание” использованию техники Вычитающей Гибридизации. Метод сразу же был применён для сравнения двух геномов млекопитающих и клонирования различающихся последовательностей. Кинетические ограничения снимаются в методе RDA ненаправленным упрощением сравниваемых смесей ДНК: к полученным после обработки эндонуклеазами рестрикции фрагментам ДНК трейсера и драйвера (см. Рис. 2.3.1) лигируют разные олигонуклеотидные адаптеры и затем проводят 50-100 циклов ПЦР с праймерами, комплементарными адаптерам. При этом, благодаря эффекту “ПЦР-селекции”, различные фрагменты амплифицируются далеко не равномерно, так что в конце процедуры полученная смесь содержит только 2-10% от всего разнообразия исходных продуктов. Полученные ампликоны обрабатывают нуклеазой из зёрен манго (при этом деградируют 3'-концевые участки фрагментов ДНК, содержащие последовательность адаптеров), затем трейсер смешивают с избытком драйвера, денатурируют и проводят гибридизацию. После этого гибридизационную смесь инкубируют с ДНК-полимеразой, при этом по комплементарным цепям дуплексов достраиваются “объеденные” нуклеазой фрагменты. Далее следует стадия ПЦР с праймером, комплементарным адаптеру, который ранее лигировали к ДНК трейсера. При этом лишь дуплексы трейсер-трейсер амплифицируются экспоненциально, остальные дуплексы амплифицируются либо линейно, либо не амплифицируются вовсе. Полученные на выходе двухцепочечные ПЦР-продукты без труда могут быть лигированы в нужные исследователям векторы. Метод позволяет также проводить несколько циклов вычитания, что позволяет значительно повысить финальное обогащение смеси продуктами, специфичными для трейсера. Описанная технология недорога, относительно проста и быстра, позволяет работать с небольшими количествами материала (геномной ДНК, либо кДНК). Неудивительно, что вскоре RDA стал широко использоваться научным сообществом (см. Рис. 2.2.1) как для поиска различных молекулярно-генетических маркёров, так и для сравнительного анализа спектров транскриптов из разнообразных источников.

Рисунок 2.3.1. Схема применения метода RDA для сравнения двух сложных геномов.

Однако же при всех достоинствах метода главный недостаток его для геномных исследований очевиден: анализируется лишь небольшая часть генома, в то время как основная его часть (90-98%) ускользает от анализа. Метод не предоставляет возможностей для полного сравнения геномов, получаемые результаты выборочны и отрывочны. Тем не менее, метод успешно применяли и продолжают применять для поиска маркерных последовательностей в ДНК [496, 497].

Существенным ограничением использования метода RDA для вычитания кДНК часто является большой "шум" на выходе: ведь если различия в спектре транскриптов между двумя источниками малы, а избыток драйвера над трейсером высок, то дуплексов трейсер-трейсер будет образовываться мало, тогда линейная амплификация дуплексов трейсер-драйвер создаст реальные сложности при создании обогащённой библиотеки [496]. Картина становится ещё более пессимистичной, если предположить, что дифференциальные транскрипты ещё и являются редко представленными.

Тем не менее, несмотря на все сложности, интерес к применению ВГ продолжал расти, в 1995 году даже вышли две работы, где описывались новые программные продукты, моделирующие ход ВГ in silico [498, 499]. Авторы статьи [500] предложили новый способ применения ВГ: продукты вычитания транскриптов из интересующих образцов гибридизовали с нанесёнными на фильтр космидными библиотеками кандидатных геномных локусов. Такое использование ВГ, по мнению авторов, позволяет однозначно ответить на вопрос, содержит ли исследуемый локус дифференциально экспрессирующиеся гены.

Авторы следующей статьи [501] разработали ещё одно интересное применение ВГ, для субклонирования последовательностей искусственных дрожжевых хромосом (YAC) в более мелкие векторы, удобные для секвенирования. Геномы дрожжей, содержащих YAC (трейсер) и не содержащих YAC (драйвер), фрагментировали и проводили для них ВГ; в результате, после нескольких циклов вычитания, продукты клонировали в векторы для секвенирования и определяли первичную структуру вставок. Практически все вставки содержали последовательности из YAC. Данное применение ВГ, однако же, не нашло широкого распространения. Интересным применением ВГ может служить ещё одна модификация RDA: проводили вычитание ракового генома из нормального, затем гибридизовали с библиотекой YAC, таким образом были выявлены многие делеции, специфичные для данной опухоли [502]. В недавно опубликованной работе [503] RDA использовали для заполнения брешей при массированном секвенировании генома Xilella fastidiosa: из генома Xilella fastidiosa вычитали последовательности отсеквенированных клонов, полученные дифференциальные последовательности гибридизовали с полной геномной клонотекой Xilella fastidiosa, дающие позитивные сигналы клоны секвенировали.

Отдельного упоминания заслуживает метод поиска полиморфизмов длин рестриктных фрагментов (ПДРФ) на основе ВГ, называемый "RFLP subtraction" [504]. Сравниваемые образцы ДНК расщепляются эндонуклеазами рестрикции и наносятся на различные дорожки агарозного геля. После электрофоретического разделения из обеих дорожек вырезаются определённые зоны (например, фрагменты от 100 до 500 пн). Продукты элюируются из геля и подвергаются вычитающей гибридизации, в результате происходит обогащение по тем продуктам, которые присутствуют в данной зоне в одном образце, но отсутствуют в другом. Таким способом удаётся эффективно находить ПДРФ, генетические маркёры самого широкого применения.

Этот метод был расширен и улучшен в работе [505], где вычитание проводили в самом геле. Оба рестрицированных образца, один в 100-кратном молярном избытке над другим, наносили на гель в одну дорожку и проводили электрофорез. Затем гель обрабатывали щёлочью, при этом ДНК денатурировала, а после гель нейтрализовали, при этом ДНК гибридизовалась. После этого продукты элюировали и проводили ПЦР-амплификацию дуплексов трейсер-трейсер. В этом случае авторам удалось добиться весьма высоких значений обогащения, близких к максимальным. Это может быть объяснено тем, что локальная концентрация фрагментов каждого типа в геле выше таковой в растворе. К сожалению, данный метод не нашёл широкого применения, возможно, в силу своей трудоёмкости.

Глава 2.4 Метод Супрессионной Вычитающей Гибридизации (SSH)

На рисунке 2.2.1 чётко прослеживается резкое повышение интереса к ВГ, произошедшее после публикации метода SSH, разработанного под руководством С. А. Лукьянова и Е. Д. Свердлова [506, 507], и выхода в продажу соответствующего кита фирмы Clontech. Кроме того, в публикациях, где бы упоминался метод ВГ, с 1999 года произошли "качественные" изменения. Так, если в период 1984-91 гг. примерно в каждой третьей статье содержались какие-либо улучшения (по крайней мере, с точки зрения авторов) и модификации ВГ, с 92 по 95 гг. - в каждой пятой, с 98 по 99 гг.- в каждой десятой, то в 2000-2001 гг. - только в каждой 56-й (!). Это свидетельствует о том, что распространение метода SSH, вместе с RDA, почти полностью отбило у учёных охоту изобретать какие-либо другие модификации ВГ. Возможно, это связано с тем, что методы настолько хороши, что не могут быть улучшены (во всяком случае, пока), либо же их и не стремятся улучшать - метод даёт воспроизводимые желаемые результаты, ВГ становится рутинной процедурой.

Принципиальным отличием метода SSH от всех остальных методов ВГ является cущественное исключение шума, вызванного линейной амплификацией гибридов трейсер-драйвер, и нормализация дифференциальных библиотек кДНК по редко представленным транскриптам. Это достигается за счёт использования эффекта "ПЦР супрессии": к фрагментам ДНК лигируются одноцепочечные GC-богатые линкеры длиной около 40 пн, так называемые суппрессионные адаптеры. После обработки ДНК полимеразой достраивается вторая цепь адаптеров, таким образом, исходные фрагменты ДНК оказываются фланкированными инвертированными GC-богатыми 40-нуклеотидными последовательностями. Принцип метода состоит в том, что праймеры, комплементарные этим последовательностям, не могут сами по себе давать ПЦР продукт (см. Рис. 2.4.1). После денатурации, при отжиге праймеров происходит внутримолекулярное комплементарное спаривание инвертированных последовательностей адаптеров друг с другом, таким образом, сайт посадки праймера на ДНК оказывается занят.

Рисунок 2.4.1. Схематическое изображение эффекта ПЦР-супрессии (см. описание выше в тексте).

Рисунок 2.4.2 показывает применение SSH на примере сравнения двух бактериальных геномов, ДНК фрагментировали рестриктазами, к двум разным фракциям трейсера лигировали два разных супрессионных адаптера, к фракции драйвера не лигировали ничего. Обе фракции трейсера смешивали с драйвером и проводили ВГ; при этом благодаря эффекту ПЦР супрессии только обогащённые уникальными последовательностями дуплексы Трейсер А/ Трейсер Б могли быть амплифицированы с праймеров, комплементарных последовательностям использованных супрессионных адаптеров [508].

Рисунок 2.4.2. Схема применения метода SSH для сравнения двух бактериальных геномов.

Необходимо отметить, что метод также (даже более широко) используется для получения дифференциальных библиотек кДНК [506], причём эффект ПЦР супрессии позволил частично преодолеть одну из основных трудностей, с которой сталкиваются почти все исследователи, имеющие дело с кДНК, а именно - потерю редко представленных транскриптов. Разработанный метод нормализации смесей кДНК (см. Рис. 2.4.3) позволяет значительно сократить пропасть, лежащую между концентрациями часто и редко представленных транскриптов. К двум порциям библиотеки двухцепочечных к ДНК лигируют два различных супрессионных адаптера, денатурируют обе порции по отдельности и оставляют ренатурировать, потом фракции объединяют и оставляют ренатурировать ещё на некоторое время. Затем, после достройки концов, осуществляют ПЦР с праймерами на последовательности, комплементарные адаптерам. При этом амплифицируются только те молекулы, которые загибридизовались во время второй ренатурации, но не загибридизовались во время первой. Таким образом происходит обогащение смеси по редко представленным транскриптам. Метод является достойной альтернативой гораздо менее удобному и более сложному подходу [509], когда для получения редко представленных транскриптов проводили специальную процедуру вычитания из тотальной библиотеки кДНК библиотеки часто представленных транскриптов.

Рисунок 2.4.3. Схема применяемого для SSH метода нормализации смеси кДНК по редко представленным транскриптам.

Интересно, что хотя количество неспецифических продуктов в результирующей смеси после использования SSH и невелико, но оказалось возможным сделать его ещё меньше. Недавно опубликованный метод MOS (mirror orientation selection) [510], см. Рис. 2.4.4, базируется на том, что появление "шума", вызванного реассоциацией в ходе SSH неспецифических для трейсера молекул - случайное явление, и каждый из типов таких молекул сильно обеднён в результирующей смеси по сравнению с содержанием в ней целевых продуктов ВГ. Поскольку продукты ВГ (см. Рис. 2.4.2) содержат адапторы, фланкирующие последовательность трейсера в обеих ориентациях (см. Рис. 2.4.4), то при удалении одного из адапторов, денатурации и последующей ренатурации и заполнения концов появляются фрагменты трейсера, с обеих сторон фланкированные последовательностями второго адаптора. При использовании соответствующего праймера такие фрагменты могут быть экспоненциально амплифицированы с помощью ПЦР.

Для "фоновых" фрагментов этого не происходит, поскольку их появление в результирующей смеси ВГ носит случайный характер. Каждый тип таких фрагментов представлен очень малыми концентрациями (при большом разнообразии таких типов). Поэтому вероятность того, что пройдёт гибридизация фрагментов, фланкированных противоположно ориентированными адапторами, пренебрежимо мала.

Метод SSH может быть использован в комбинации с дифференциальным дисплеем [511] и с использованием микрочипов [512]. Последнее представляется прогрессивным подходом, так как могло бы дать целостную картину дифференциальной экспрессии генов в пространстве и времени. Важно, что применение микрочипов "напрямую" практически всегда не позволяет детектировать редкие транскрипты, предварительное же применение SSH для библиотек кДНК, особенно вместе с методом нормализации (см. выше), могло бы существенно улучшить ситуацию.

Рисунок 2.4.4. Схема метода MOS. Метод позволяет эффективно избавляться от нежелательного "шума" - нецелевых продуктов ВГ.

Глава 2.5 Дальнейшие перспективы развития техники ВГ

Описанные в двух предыдущих главах методические подходы поставили технику ВГ на небывалую высоту, сделав её одним из наиболее эффективных подходов современной молекулярной биологии, наряду с дифференциальным дисплеем, тотальным секвенированием геномной ДНК и EST, использованием микрочипов и методом серийного исследования экспрессии генов (SAGE) [513]. То, что количество работ, в которых используется ВГ, неуклонно растёт, даже на фоне отсутствия за последние 5 лет серьёзных изменений в методологии, говорит о том, что метод востребован и далеко ещё не выработал свой ресурс, как пророчили скептики ещё в начале 90-х.

Нельзя не упомянуть о нескольких недавно опубликованных оригинальных подходах, базирующихся на использовании ВГ. В работе [514] ДНК драйвера (назван авторами как "subtracter") химически модифицировалась таким образом, что все гибриды с цепями драйвера, полученные после ВГ, оказывались связаны с ним не только водородными связями, но и ковалентно. В результате, гибриды трейсер/драйвер и драйвер/драйвер не могут быть амплифицированы ПЦР или клонированы в вектор, а гибриды трейсер/трейсер - могут.

Близкий подход, направленный на улучшение метода RDA, описан в работе [515]. Для того, чтобы повысить селективность амплификации гибридов трейсер/трейсер в результирующей смеси, перед ВГ 3'-концы дуплексов трейсер/трейсер защищали альфа-тио-дезоксирибонуклеотидами. После вычитающей гибридизации смесь обрабатывали нуклеазами ExoIII u Mung Bean Nuclease, в результате чего в растворе оставались только гомогибриды трейсер/трейсер, которые затем амплифицировали с помощью ПЦР.

Следующий подход, названный TGDA, targeted genomic differences analysis [312], являющийся основным предметом представляемой работы (см. Главу 3.2), позволил провести с помощью метода ВГ полногеномное сравнение распределения ретроэлементов в геномах человека и шимпанзе. Упрощение генома перед ВГ носило в данном случае не случайный характер, как при использовании RDA, а было обусловлено предварительной ПЦР амплификацией только тех областей генома, которые фланкировали ретроэлементы. Остаточные фрагменты ретроэлементов перед ВГ удалялись экзонуклеазой ExoIII, так что они не создавали помех при гибридизации. Авторы работы [516] вернулись к идее использования фенола как химического акселератора при ВГ и оптимизировали условия реассоциации и разделения дуплексов с использованием биотин-стрептавидиновой системы. Найдут ли эти и другие [517, 518] последние модификации ВГ своих адептов - покажет время.

В заключение нельзя не сказать о недостатках, которыми обладает любая самая совершенная современная техника на основе ВГ. Во-первых, это ПЦР селекция (см. выше), во-вторых - техника ВГ не различает друг от друга представителей эволюционно молодых генных семейств, имеющих высокогомологичные участки. Это же касается и повторяющихся элементов генома, как при ВГ кДНК, содержащих повторы, так и при вычитании геномной ДНК. Третьим ограничением техники является то, что ''незначительная" разница в транскрипции, то есть разница менее чем на порядок (которая может иметь весьма значительные последствия для клетки), не может быть эффективно обнаружена при использовании вычитающей гибридизации.

Экспериментальная часть работы

Часть 3. Разработка метода TGDA и применение его для поиска специфичных для генома человека внедрений ретроэлементов

Глава 3.1 Актуальность метода

Выход молекулярной генетики на качественно новый уровень - уровень исследования структуры и функций целых геномов и их сопоставления, - возможен лишь при прогрессивном развитии арсенала экспериментальных методов, которыми обладают исследователи. Первым этапом могло бы являться получение исчерпывающих структурных данных, вторым - расшифровка на их основе функциональной роли тех либо иных участков генома. Возможно, наилучшим из имеющихся подходов с точки зрения полноты охвата проблемы является тотальное секвенирование геномной ДНК и библиотек транскриптов, полученных из различных тканей исследуемого организма. Вместе с тем, регуляторные участки генома таким способом выявить невозможно. Кроме того, подход очень дорог и требует огромного напряжения усилий множества учёных.

Применение технологии микрочипов не может быть полноценной заменой тотального секвенирования, так как не позволяет различать слабодивергировавших представителей мультигенных семейств, а также те последовательности, в состав которых входят повторяющиеся элементы. Кстати, наличие большого количества повторяющихся последовательностей в определённых локусах создаёт проблемы и для определения полной структуры генома методом тотального секвенирования - так, последовательности теломерных и центромерных районов хромосом принципиально не могут быть получены при использовании имеющегося инструментария.

В нашей лаборатории проводятся попытки создания методологической базы для “новой эры” молекулярной генетики. Так, был создан метод для полногеномного определения последовательностей, связывающихся с ядерным матриксом [519], а также метод для полногеномного сравнения профилей метилирования ДНК между различными тканями (неопубликованные данные). Целью настоящей работы являлось создание экспериментальной техники, которая бы позволяла проводить полногеномное сравнение распределения мобильных элементов в ДНК различных организмов. Автор надеется, что данные, изложенные в первой части представляемой работы, смогли убедить читателя в том, что мобильные элементы генома отнюдь не являются просто “мусором”, несущественной фракцией ДНК, которую и исследовать-то не стоит. Воздержавшись, однако же, от диферамбов мобильным элементам, отметим лишь, что связанные с ними изменения в структуре ДНК являются одним из важнейших, если не самым важным, фактором эволюции геномов и, соответственно, видообразования.

Кроме понимания некоторых аспектов эволюции, изучение ретроэлементов может дать исследователям новые полиморфные маркёры, которые могут быть использованы как для филогенетических, так и для медико- и популяционно-генетических исследований. Важно, что такие маркёры, созданные на основе ретроэлементов, обладают рядом преимуществ относительно остальных типов полиморфных маркёров [520]: (1) они стабильны и редко претерпевают делеции, (2) возможность независимых внедрений нескольких ретроэлементов в один и тот же сайт генома пренебрежимо мала, (3) поскольку известно “предковое” состояние геномного локуса - отсутствие ретроэлемента, можно определять степень родства между различными анализируемыми организмами и, наконец, (4) наличие либо отсутствие ретроэлемента в исследуемом локусе можно просто и надёжно детектировать с помощью ПЦР.

Таким образом, сравнение распределения ретроэлементов между геномами представляется одной из важнейших задач генетики. Вместе с тем, применяемые исследователями экспериментальные техники не обладают полнотой анализа. Казалось бы, наилучшим выходом могла бы стать тотальная идентификация мобильных элементов в геномных базах данных и последующий ПЦР-анализ распределения этих транспозонов в ДНК различных видов или представителей различных популяций одного вида, как это было сделано группой Марка Батцера для эволюционно молодых групп Alu и L1 генома человека [179, 521]. Авторам удалось обнаружить в геноме человека большое количество эволюционно недавних внедрений таких ретроэлементов, многие из которых являлись полиморфными в человеческих популяциях. Однако же описанный выше подход имеет и свои недостатки. Вся информация о наличии ретроэлементов в различных локусах генома берётся из баз данных и, учитывая, например, что для проекта “геном человека” секвенируют ДНК лишь пяти случайных представителей Homo sapiens, подавляющее большинство аллелей теряются. Кроме того, отнюдь не вся последовательность генома человека содержится или будет в ближайшее время содержаться в базах данных (согласно соображениям, изложенным в начале главы). Эти же доводы относятся и к иным, нежели человеческий, геномам. Таким образом, ограниченность описываемого подхода очевидна: к сожалению, базы данных содержат далеко не исчерпывающую информацию. К тому же, этот подход может быть использован только для исследования тех объектов, чья геномная последовательность частично или же почти полностью установлена (будучи применима, например, к изучению ДНК человека, методика не будет применима к изучению ДНК всех остальных приматов, пока их геномы также не будут отсеквенированы).

В связи со всем вышеизложенным, весьма актуальной представляется задача создания такой экспериментальной техники, которая бы позволяла проводить полногеномное сравнение распределения мобильных элементов между организмами без предварительного знания первичной структуры их геномов.

Глава 3.2 TGDA: экспериментальная техника, позволяющая проводить полногеномное сравнение распределения мобильных элементов между организмами без предварительного знания первичной структуры их геномов

В нашей рабочей группе, включающей ведущего научного сотрудника Ю. Б. Лебедева и аспирантов С. В. Устюгову, К. В. Ходосевича, И. З. Мамедова и А. А. Буздина, был разработан метод, названный TGDA (от англ. Targeted Genomic Differences Analysis), позволяющий проводить полногеномный сравнительный анализ повторяющихся последовательностей ДНК изучаемых организмов. Идея метода принадлежит акад. Е. Д. Свердлову, чьему неуклонному детальному и мудрому руководству наша рабочая группа и обязана созданием техники TGDA.

Принцип метода. Принципиально, метод TGDA состоит из трёх основных стадий (cм. Рис. 3.2.1):

(1) Селективная амплификация последовательностей ДНК, фланкирующих мобильные элементы в сравниваемых геномах, с использованием эффекта “ПЦР-супрессии”.

(2) Обработка полученных ампликонов экзонуклеазой ExoIII для получения 5'-выступающих концов (эта стадия критична для всего процесса; она призвана убрать из ампликонов, полученных после (1) стадии, остающиеся в них последовательности мобильных элементов.

(3) Основанная на ПЦР вычитающая гибридизация (ВГ) обработанных ампликонов.

Для вычитания один из ампликонов (так называемый драйвер, англ. driver) берётся в значительном избытке над другим, называемым трейсер, англ. tracer. ВГ (описана в части II литературного обзора данной работы) позволяет напрямую идентифицировать последовательности (назовём их мишени), присутствующие в трейсере, но отсутствующие в драйвере.

Остановимся на перечисленных трёх стадиях поподробнее.

Первая (1) стадия (Рис. 3.2.1.А), базирующаяся на использовании эффекта ПЦР-супрессии, разработанного группой С. А. Лукьянова [522, 523], включает в себя (i) фрагментацию геномной ДНК частощепящей(узнающей 4-нуклеотидные последовательности) эндонуклеазой рестрикции; например, мы использовали эндонуклеазу AluI. (ii) К полученным рестриктным фрагментам лигируются олигонуклеотидные адапторы, формирующие сковородоподобные структуры (Рис. 3.2.1.А, стадия 2; структуры олигонуклеотидов A1A2 и a1 приведены в Разделе 4.4).

ретроэлемент репрезентативный гибридизация супрессионный

Мы использовали стандартные адапторы [524], образующие после лигирования одноцепочечные (оц) 5'-выступающие концы, по которым ДНК-полимераза достраивала 3'-концы (структуры адапторов, а также всех остальных использованных в данной работе олигонуклеотидов, приведены в разделе "Материалы и методы"). В результате, все рестриктные фрагменты ДНК оказываются фланкированы инвертированными повторами. Таким образом, при денатурации, образующиеся оц фрагменты содержат взаимно комплементарные последовательности, образующие мощные внутримолекулярные шпилечные (или сковородоподобные) структуры (Рис. 3.2.1.А). ПЦР фрагментов ДНК, содержащих такие внутримолекулярные структуры, супрессируется, если используются только праймеры, комплементарные лигированным адапторам (Рис. 3.2.1.А, стадия 2).

Если же такие праймеры используются в паре с праймерами, комплементарными внутренней (одноцепочечной) части сковородоподобной структуры, ПЦР проходит нормально (Рис. 3.2.1.А, стадия 2). Амплифицированная ДНК в этом случае будет иметь различающиеся концевые последовательности, не образующие внутримолекулярных структур, и может быть далее успешно амплифицирована с праймерами A1+T1 (iii). Этап “Nested” ПЦР с праймерами А2 и Т2 призван повысить специфичность амплификации. При правильном выборе праймеров процедура позволяет обеспечить амплификацию практически только лишь тех фрагментов, которые содержат последовательность интересующего мобильного элемента.

На второй (2) стадии, перед обработкой ExoIII, c помощью ре-амплификации полученных на предыдущей стадии ампликонов, готовят две отдельные фракции ДНК трейсера (Fig. 3.2.1.Б, слева, стадия 1). Для этого используется “step-out” вариант ПЦР [525] с праймерами А1А2, А1 и Т2, либо же А1Т2, А1 и А2 для амплификации фракций А и Б, соответственно. Получившиеся фрагменты ДНК фракции А содержат последовательность А1А2 на одном конце и Т2 - на другом, а у фрагментов фракции Б на концах содержатся последовательности А2 и А1Т2.

Затем полученные ампликоны обрабатывают экзонуклеазой ExoIII. Эта стадия получения оц 5'-концов (Рис. 3.2.1.Б, стадия 2) является критической для всего процесса: она предотвращает кросс-гибридизацию повторяющихся частей, общих для всех ампликонов, и обеспечивает последующую специфическую амплификацию двухцепочечных гетеродуплексов ТрейсерА/ТрейсерБ, образующихся в процессе ВГ. Для формирования оц 5'-выступающих концов, ампликоны (как трейсера, так и драйвера) обрабатывают ExoIII из рассчёта, что фермент удаляет ~6,7 3'-терминальных нуклеотидов в минуту.

На последней (3) стадии трейсеры А и Б смешивают со 100- или 200- кратным избытком драйвера (Рис. 3.2.1.Б, стадия 3), денатурируют и оставляют гибридизоваться на 14 часов. Получившаяся в результате смесь содержит оц фрагменты трейсера и драйвера, двуцепочечные гибриды трейсера и драйвера, гомодуплексы, получившиеся при само-реассоциации драйвера и трейсеров А и Б, и гетеродуплексы, сформированные при кросс-реассоциации комплементарных цепей трейсеров А и Б (фракция ТрейсерА/ТрейсерБ).