Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза

Размещено на http://www.allbest.ru

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

Аг - антиген

АТ - антитело

г - грамм

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - карбонат-бикарбонатный буфер

КИФА - количественный иммунофлуоресцентный анализ

КМИС - композиционные магноиммуносорбенты

к.р.с. - крупный рогатый скот

ЛПС - липополисахарид

мг - миллиграмм

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

мин - минута

МИС - магноиммуносорбент

м. к. - микробные клетки

мкг - микрограмм

мкл - микролитр

мкм - микрометр

мл - миллилитр

МС - магносорбент

МТБ - микобактерии туберкулёза

Нм - нанометр

НТМ - нетуберкулёзные микобактерии

НРИФ - непрямая реакция иммунофлуоресценции

ООИ - особо опасные инфекции

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ВВЕДЕНИЕ

туберкулез возбудитель иммуносорбент микобактерия

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулёзом в нашей стране носит характер эпидемии (Онищенко Г.Г., 2002; Пунга В.В., Капков Л.П., 1999). По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) в промежутке времени с 2000 по 2020 гг. туберкулёзом в мире заболеют около 200 млн. человек, умрут около 35 млн. человек, будут инфицированы приблизительно 1 млрд. человек (WHO Fact Sheet, 2000). В связи с этим, одной из важных задач мировой медицины является разработка надёжных (активных и специфических), простых в использовании и дешёвых средств для быстрого выявления возбудителя в исследуемом материале.

В нашей стране при диагностике туберкулёза большое внимание уделяется культуральным методам, за рубежом - микроскопии мазка. Но оба эти метода имеют существенные недостатки. Культивирование с момента посева составляет три месяца, причём положительных результатов- 0,5-14 % (Клименко М.Т. с соавт, 1985; Клименко М.Т. с соавт., 1987; Литвинов В.И., 1996). При микроскопии мазка (флуоресцентной) наблюдается до 14 % положительных результатов (Канюк А.Н., 1995). Таким образом, данные методы не могут претендовать на роль основных в лабораторной диагностике туберкулёза. Известны способы диагностики туберкулёза с помощью эритроцитарных диагностикумов (Архангельский Н.И. с соавт., 1985), реакции агрегатагглютинации (Хоменко А.Г. с соавт,1992), реакции агглютинации латекса, масс-спектроскопии (Маякова Т.И. с соавт., 1995), но данные методы трудоёмки и малоактивны. Существуют препараты для ПЦР-диагностики, но они отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и поэтому распространения ещё не получили. В связи с этим, актуальным является разработка диагностических препаратов и методов исследований, обладающих высокой специфической активностью, экспрессностью и информативностью.

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования:

совершенствование биотехнологий иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза.

Основные задачи исследования:

- отработать методические подходы по извлечению полноценных антиген-ных комплексов из микробных биомасс возбудителя туберкулёза и получить высокоактивные иммунные туберкулёзные сыворотки;

- разработать магнитные сорбенты с фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов для удаления из туберкулёзных иммунных сывороток неспецифических антител;

- отработать биотехнологию изготовления высокочувствительных и ста-бильных туберкулёзных липосомально-иммунопероксидазных конъюгатов;

- разработать эффективные способы получения суспензионных диагности-кумов на основе полиакролеиновой (латексной) и алюмосиликатной матриц для реакций агглютинации;

- отработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами для диагностики туберкулёза в экспрессных методах (иммуноферментном анализе - ИФА, количественном иммунофлуоресцентном анализе - КИФА);

- определить диагностическую ценность применения разработанных иммунобиологических препаратов на экспериментальном и клиническом материале.

Научная новизна работы.

Полученные в результате исследований данные представляют интерес с точки зрения поиска путей извлечения полноценных специфических водорастворимых антигенных комплексов из микобактерий туберкулёза.

Разработан и применён аффинный магносорбент при проведении иммуносорбции гетерологичных антител из иммунных туберкулёзных сывороток, позволяющий получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускорять и упрощать процесс сорбции.

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства липосомальных туберкулёзных иммуноферментных конъюгатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью.

Разработаны приёмы по предварительному селективному концентрированию микобактерий туберкулёза и их антигенов на магноиммуносорбентах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИ-ФА), позволяющие исследовать объекты внешней среды, материал от больных людей или животных, в том числе и сильно загрязненные, неограниченного объёма пробы с низкой концентрацией микобактерий с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей общепринятые экспрессные методы.

Приоритетность ряда выполненных исследований подтверждена 2 патентами РФ на изобретения: № 2192265 «Способ получения комплекса фосфолипидов» (2002 г.) и № 2195296 «Способ получения ганглиозидов» (2002 г.).

Теоретическая и практическая значимость работы. Основная теоретическая значимость проделанной работы заключается в определении научно-методических аспектов разработки иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза, которые учитывают характерные особенности антигенной структуры микобактерий, свойства матриц биотической (липиды) и абиотической (органокремнезёмы, латексы) природы, методы конъюгации лигандов и маркёров, определяя направления последовательных стадий и операций биотехнологии производства диагностических туберкулёзных препаратов.

Разработаны научно-методические приёмы по получению полноценного антигенного материала из бакмасс микобактерий, высокоактивных иммунных сывороток, удалению из них перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов. Оптимизация параметров иммобилизации антител обеспечила конструирование высокоактивных и специфических диагностических препаратов (иммуноферментных, суспензионных латексных и алюмосиликатных для реакции агглютинации, магноиммуносорбентных).

Разработанные методические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и иммуноглобулинов позволили повысить стабильность и увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.

Сконструированные туберкулёзные магноиммуносорбенты в сочетании с экспрессными методами диагностики повышают их чувствительность до 50-100 микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения анализа до 1-1,5 часов за счёт селективного концентрирования на своей поверхности микобактерий, ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов.

Результаты проведённых исследований по сочетанным методам магноиммуносорбции с экспрессными анализами и использование липосомальных препаратов дополняют новыми научными данными сведения о возможности использования иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции микобактерий туберкулёза.

Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Главным Государственным санитарным врачом России Г.Г. Онищенко 06.04.2000 г., и «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», утверждённых директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ №3 от 3.03.2005 г.).

На Федеральном уровне утверждены зам. главного санитарного врача РФ Е.Н. Беляевым технические условия (ТУ) 9154-00-01897080-2004 на фосфолипиды для получения липосом (письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г.). На учрежденческом уровне утверждены два регламента: на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.2004 г.) и на тестсистему липосомально - иммунопероксидазную магноиммуносорбентную для выявления антигена туберкулёза иммуноферментным методом, утверждённую директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ по экспресс-диагностике туберкулёза и применению магноиммуносорбентных препаратов в мониторинге микобактерий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Научно-методические подходы к получению высококачественного биологического сырья (антигенов и антител) для производства диагностических туберкулёзных препаратов. Получены водорастворимые антигены микобак-терий, содержащие полный набор антигенных комплексов с высокой активностью (1:32-1:64 в реакции иммунодиффузии (РИД). Подобрана производственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами антител, основанная на оптимальной комбинации комплекса специфических антигенов и иммуномодуляторов.

2. Методические приёмы конструирования и применения аффинных сорбентов с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных туберкулёзных сывороток. Разработанные сорбенты с иммобилизованными гетерологичными антигенами и метод сорбции позволили за один этап получить не только высокоспецифичную сыворотку, но и сохранить её первоначальную серологическую активность.

3. Научно-методические основы изготовления липосомально - иммунопероксидазного конъюгата для выявления антигена туберкулёза иммуноферментным методом. Иммобилизованные на мембране липосом фермент и туберкулёзные иммуноглобулины повышают свою стабильность, что приводит к увеличению срока годности диагностической системы.

4. Биотехнология производства суспензионных латексных и алюмосиликатных диагностикумов, обеспечивающая высокую эффективность обнаружения микобактерий туберкулёза в экспериментальных и клинических условиях. Разработанные препараты по чувствительности аналогичны традиционным методам, но превосходят их по простоте изготовления и экспрессности (постановка и учёт результатов реакции с алюмосиликатным диагностикумом 1 - 3 мин).

5. Научно-методические основы биотехнологии изготовления твёрдофазных микрогранулированных аффинных магноиммуносорбентов для избирательного концентрирования микобактерий и их использования в экспрессных методах (ИФА, КИФА). Разработанные препараты позволяют повысить чувствительность более чем в 1000 раз при увеличении вероятности выявления микобактерий за счёт селективного концентрирования антигена на антителе, находящемся на твёрдой матрице.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI века» (Саратов, 28-30 сентября 2004); 1-й Всероссийской конференции «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 10-11 октября, 2004); региональном обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Ставрополь, 17 февраля 2005); научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпид. надзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа» (Ставрополь, 14- 16 апреля 2005), на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ.

Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных научных работах (2 патента на изобретение, 1 депонированная работа и 7 трудов в научных сборниках).

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Она изложена на 178 страницах, содержит 18 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 178 отечественных и 99 зарубежных литературных источников.

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ОБСТАНОВКИ ПО ТУБЕРКУЛЁЗУ И СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ЕГО ВОЗБУДИТЕЛЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ОБСТАНОВКА ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ В РОССИИ

Правительство РФ утвердило Перечень социально значимых и опасных для окружающих заболеваний. К первой группе отнесён туберкулёз наряду с такими заболеваниями как гепатит В, С, СПИД и некоторые другие (Алексеев П., 2004). В целях законодательного регулирования мероприятий по борьбе с инфекционными заболеваниями в 2001 г. принят Федеральный закон «О предупреждении распространения туберкулёза в РФ». Эпидемиологическая обстановка по туберкулёзу остаётся напряжённой. Туберкулёз - одна из главных причин высокой заболеваемости, хронизации и смертности, особенно в развивающихся странах (Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В., 2003; Murray C.J.L, Styblo K, Rouillon A. ,1990; Sudre P, Ten Dam H.G, Kochi A.,1992). В соответствии с данными ООН, 1/3 населения инфицирована МТБ (микобактериями туберкулёза), каждый год выявляется 8 млн. случаев ак-тивного туберкулёзного (ТБ) процесса, ведущего к смертности 3 млн. человек (Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi A. ,1994). В России в 2004 г. зарегистрировано около 102,9 тыс. больных с установленным впервые активным туберкулёзом. Показатель заболеваемости - 71,7 на 100 тыс. населения. По сравнению с 2003 г. отмечается рост заболеваемости на 3,3 % (Ильин И. А., 2005).

Туберкулёз человека вызывается чаще всего МТБ (более 90 % случаев туберкулёзной инфекции). Род Mycobacterium включает более 50 видов и подвидов микобактерий - патогенных (M. bovis, M. avium, M. kansasii (фотохромогенные), М. intracellulare (нефотохромогенные) и некоторые другие), условно патогенных и сапрофитов, широко распространенных в природе. Не менее 25 из них играют важную роль в патологии человека, являясь возбудителями туберкулёза, микобактериозов (нетуберкулёзных кислотоустойчивых микобактерий), проказы (Борисов Л.Б., 2002). Кроме этого известны кислотоустойчивые сапрофиты, не вызывающие заболевания человека. К нетуберкулёзным микобактериям (НТМ) относится и язва Бурули (ЯБ), вызываемая M. ulcerans. До сих пор как эпидемиология ЯБ изучена не-достаточно, так и резервуары и способы передачи данного заболевания. В природе свободно живущие фагоцитирующие простейшие играют важную роль как возможные естественные хозяева и резервуары для микобактерий, включая M. ulcerans, что необходимо также учитывать. В 1999 впервые заподозрили водяное насекомое (Hemiptera) как пассивный резервуар возбудителя ЯБ. Эта находка позволила предполагать возможную роль насекомых в передаче НТМ от животных к человеку (Portaels 2003).

Географические и климатические изменения могут оказывать влияние на эпидемиологию НТМ. F.Portaels (2003) продемонстрировал положительную связь между ПЦР(+) образцами из окружающей среды и частотой ЯБ на соответствующей территории. Пространственно-временные исследования окружающей среды важны и могут иметь ценность при выявлении возбудителя ЯБ и НТМ у человека и животных. Микроскопически они неотличимы от Mуcobacterium tuberculosis.

Патогенность туберкулёзных микобактерий связана с прямым или иммунологически опосредованным повреждающим действием липидов. Их действие выражается в развитии специфических гранулём и поражении тканей. Для вирулентных штаммов характерно наличие так называемого корд-фактора- гликолипида, состоящего из трегалозы и димиколата. Он разрушает митохондрии клеток инфицированного организма, тем самым нарушая функцию дыхания. Патогенные для людей возбудители могут вызывать местные и генерализованные туберкулёзоподобные процессы. Частота выделения и этиологическое значение указанных микобактерий зависит от их распространенности и состояния антиинфекционной защиты макроорганизма. Среди клинических форм могут быть: лёгочные поражения, инфицирование ран, поражение кожи, подкожной клетчатки, лимфатических узлов, костей, суставов, почек, а также системные инфекции (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2003). Весьма сходными с микобактериями туберкулёза по морфологии и антигенному составу являются микроорганизмы рода Nocardia. Различные виды нокардий обладают разной степенью патогенности для человека и животных. Больные нокардиозом незаразны для окружающих. В России описаны единичные случаи заболевания. В основном нокардиоз ре-гистрируется в странах тропического и субтропического поясов (Коротяев А.И., Бабичев С.А., 2002). Палочки BCG, используемые в качестве вакцины при туберкулёзе, имеют сходные свойства с M. bovis, исключая их низкую патогенность (Dankner WM, Davis C.E. ,2000; Ashford D.A., Whitney E, Raghunathan P. et al., 2001). У возбудителей микобактериозов возможны перекрёстные серологические реакции с микобактериями туберкулёза. Так, у M. Kansasii и M. tuberculosis имеются общие антигены, а у инфицированных M. Kansasii отмечают положительную реакцию Манту. Схожесть клинической картины и лечения при проявлении микобактериальных инфекций подразумевает, что многие лаборатории их не идентифицируют в полной мере (Gangadharam P.R.J., Droubi A.J., 1981; O'Reilly LM, Daborn C.J.,1995). Тем не менее, очень важно идентифицировать возбудителей для дальнейших эпидемиологических исследований по выявлению резервуаров и правильному лечению больных.

До 1978 г. в России отмечалось снижение заболеваемости туберкулёзом за счёт улучшений социальных условий и внедрения комплекса лечебно-профилактических мероприятий. Последующие годы (до 1991) характеризовались дальнейшим снижением заболеваемости до порога эпидемического благополучия, определённого ВОЗ - 30 случаев на 100 тыс. населения. Особенно быстро показатели снижались среди детей и подростков. Начиная с 1992 г., эпидемическая ситуация по туберкулёзу резко ухудшилась во всём мире, наблюдается рост заболеваемости как среди взрослых, так и среди детей (Журавлёв М.В., Арсенина Л.В., Виноградова И.Л. с соавт.,2002; Русакова Е.В., Иваненко Г.П., Иванова И.Н. с соавт., 2002). В период с 1997 по 1999 гг. в России заболеваемость, вызываемая МТБ, возросла. В 2000 г. этот показатель увеличился по сравнению с уровнем 1991 г. в 2,7 раза (Шешуков П.Ф., Готовский Ю.В., 2002) и лишь в 2000-2002 гг. стабилизировался на высоком уровне. В последние годы резко возрос показатель инфицированности детей, который в 2000 г. составил 2,5%, тогда как при благополучной ситуации он не превышал 0,1-0,3% (Онищенко Г.Г., 2003). Наблюдаемое в настоящее время в РФ прогрессирование заболеваемости туберкулёзом связано с очевидным снижением уровня жизни человека и сопутствующим дисбалансом в питании; многочисленными стрессами и наплывом беженцев из других республик бывшего СССР (их заболеваемость туберкулёзом достигает 700 случаев на 100 000 населения), особенно чеченских беженцев (Jakubowiak W., Komourzaeyev В., Dara M. et. al. 2003); увеличением количества эмигрантов (A. G. Miranda, 2003); ростом алкоголизма и наркомании; неудовлетворительным условием содержания заключённых (хотя, несмотря на напряженную эпидситуацию в местах лишения свободы, мероприятия, направленные на предупреждение и раннюю детекцию ТБ, включающие туберкулинодиаг-ностику, флюорографию 2 раза в год, химиотерапию, позволили уменьшить случаи выявления ТБ среди юношей в 6,5 раз (Rakisheva A., Erkenova G., Kas-senova L., 2003); скученностью населения в следственных изоляторах, лагерях беженцев; увеличением числа лиц "без определённого места жительства"; прекращением в 90 -х годах предоставления больным с открытой формой туберкулёза изолированной жилой площади (заболеваемость контактных в очаге достигает 700 на 100 000 населения); недостаточным количеством современных препаратов для больных; низкой материально- технической базой многих противотуберкулёзных учреждений (Онищенко Г.Г., 2003). С другой стороны, усиливается "активность" возбудителя, обусловленная, очевидно, вытеснением естественных конкурентов в результате применения антимикробных средств.

Во всех странах ежегодно регистрируют 8-10 млн. случаев инфицирования. Не меньшее значение имеет увеличение количества лиц с хроническими заболеваниями, сопровождающимися нарушениями иммунитета (Покровский В.И., Позднеева О.И. М.,1998).

Эпидемический процесс при туберкулёзе характеризуется наличием двух форм - антропонозной и зоонозной. В первом случае источником ин-фекции служит человек, заболевание вызывается Mycobacterium tuberculosis, во втором случае - животные (крупный рогатый скот), птицы, заболевания которых вызываются Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium. В отличие от других зоонозных инфекций, при туберкулёзе человек не является эпидемическим тупиком, от него возможно дальнейшее распространение инфекции антропонозным путём (Коротченко С.И., 1999; Фролова Ф.Н., Кулаков И.М., Зайнутдинова Н.Г., Фатыхова Р.Х., 2002). Особенностью при туберкулёзе является убиквитарное распространение и широкая циркуляция возбудителя среди населения, многообразие механизмов, путей и факторов передачи: при антропонозном - ведущий аспирационный механизм с воздушно-капельным и воздушно-пылевым путями передачи, возможен и контактный механизм с контактно-бытовым путём передачи; при зоонозном туберкулёзе преобладают алиментарный и контактно-бытовой пути заражения. Эпидемиологический процесс при туберкулёзе характеризуется высокой заболеваемостью у определённых групп населения, особенно среди лиц с вторичными иммунодефицитами, в том числе ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, в закрытых коллективах детей и взрослых. Повышается уровень заболеваемости среди медицинских работников, особенно противотуберкулёзных учреждений, среди работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих и птицеводческих хозяйств, среди лиц, имеющих профессиональные вредности (шахтёры, работники предприятий с повышенным пылеобразованием и др.).

Зависимость заболевания туберкулёзом от социальных факторов обусловлена усилением миграции с территорий, неблагополучных по туберкулёзу, снижением уровня жизни и ухудшением питания населения (в основном неработающей части населения), демографическими сдвигами в сторону старения населения (Покровский В.И., Позднеев О.И. М.,1998; Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Дергачёв А.В. с соавт., 2003).

Для возбудителя туберкулёза характерны относительно быстрое формирование лекарственной устойчивости, появление лекарственно-зависимых форм, способность к трансформации в L-формы, фильтрующиеся и оскольча-тые формы, персистирующие внутри макрофагов, а также некультивируемые формы с возможностью реверсии всех этих образований микобактерий в исходное состояние.

Клинические проявления туберкулёза имеют ряд особенностей, заключающихся в множественной локализации патологического процесса (лёгочные и внелёгочные формы) с преимущественным поражением дыхательной системы (до 90 % и более), невозможности определения точных сроков инкубационного периода (минимальным сроком инкубации считается 2 нед. до появления в лёгких специфических Т-лимфоцитов). Установить же максимальный срок инкубации при инфекции, развивающейся медленно и клинические признаки при которой возникают постепенно, достаточно сложно. Для туберкулёза характерны хронический характер инфекционного процесса при отсутствии ранней диагностики и лечения, преобладание клинически выраженных форм у подростков и лиц молодого возраста, первичное инфицирование преимущественно в детском возрасте, трудность раннего выявления заболевания у людей всех возрастов из-за полиморфности клинической симптоматики, отсутствия настороженности медицинских работников, а также нарушения регулярности профилактических осмотров.

В патогенезе туберкулёза возможны эндогенный и экзогенный меха-низмы развития инфекционного процесса. Экзогенный механизм проявляется чаще у взрослых при повторном инфицировании (суперинфекции), как правило, лекарственно-устойчивыми микобактериями. При эндогенном механизме развитие туберкулёза происходит в результате реактивации (реверсии) изменённых форм микобактерий, сохранившихся в остаточных очагах первичной туберкулёзной инфекции. Активация туберкулёзного процесса может происходить в разные сроки, иногда через длительное время от момента первичного заражения.

Восприимчивость человека к туберкулёзу всеобщая, хотя и неабсолютная. Из контактировавших с бациллярными больными инфицируются в течение года 40-50 чел., из которых заболевают 20-40 %. При этом отмечается неодинаковая восприимчивость к данной инфекции в разных возрастных группах: низкая - у детей 1-2 лет, 10-11 лет и у взрослых 30-50 лет (зрелый возраст); высокая - у детей раннего возраста, в препубертатный и пубертатный периоды (12-16 лет), у лиц молодого возраста и пожилых людей. Формирование противотуберкулёзного иммунитета происходит, как правило, на фоне инфицирования («нестерильный иммунитет») (Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В., 2003).

В структуре клинических форм туберкулёза стало больше пациентов, страдающих распространенными, запущенными и осложнёнными формами, а также больных, выделяющих лекарственно-устойчивые микобактерии туберкулёза, снизилась также эффективность лечения больных туберкулёзом (Шевченко Ю.Л. Приказ МЗ РФ № 109 от 21.03.2003).

Появление остро прогрессирующих форм туберкулёза способствует высокому уровню инфицирования туберкулёзом детского населения и увеличению числа заболевших детей, отмечаемому с 1990 г. (1989 г. - 7,4 на 100000 детского населения, 1990 г. - 7,8; 1997 г. - 14,7; 2001 г. - 18,6). Особую тревогу вызывают постоянно сохраняющиеся в течение ряда лет высокие показатели заболеваемости детей туберкулёзом в Чеченской, Ингушской,

Северо-Осетинской республиках, а также в республиках Алтай, Дагестан, Тыва и Бурятия.

Показатель заболеваемости туберкулёзом детского населения свидетельствует о сохранении неблагополучной общей эпидемической ситуации по туберкулёзу в стране. При этом структура впервые выявленного туберкулёза у детей подтверждает в целом удовлетворительное качество работы общей лечебной и противотуберкулёзной служб по активному выявлению и профилактике заболевания. Несмотря на ухудшение общей эпидемиологической ситуации в стране, структура фтизиопедиатрической службы была сохранена в прежнем объёме в большинстве регионов России. Охват специфической вакцинацией БЦЖ детей ежегодно составляет до 95 %, туберкулино-диагностикой - 85%. Доля впервые выявленных профилактическими методами больных детей составляет более 70 %. Эти подходы обеспечивают диагностику форм заболеваний, требующих проведения коротких курсов химиотерапии, позволяющих достичь быстрого излечения без остаточных изменений. При росте уровня общей заболеваемости детей в России в течение 10 лет встречаются единичные случаи фиброзно-кавернозного туберкулёза. Из 4712 заболевших детей 4003 ребёнка имели поражения органов дыхания. Уменьшается число случаев туберкулёзного менингита, его доля в структуре заболеваемости туберкулёзом составила 0,9 % в 2001 г. Показатель смертности детей от туберкулёза в России колеблется в последние два десятилетия от 0,6 до 0,11% на 100 000 детей. Наиболее высока смертность у детей первых 2 лет жизни, она в 10 раз превышает общий показатель (Аксёнова В.А. , 2003).

С 1996 г. наблюдался умеренный рост туберкулёза среди больных ВИЧ-инфекцией. Диагностировали эту сочетанную патологию главным образом на ранних стадиях ВИЧ - инфекции более чем в 50 % случаев в противотуберкулёзных учреждениях. В настоящее время ситуация начала изменяться. Это связано с тем, что у заразившихся ВИЧ 5 лет назад уже начинают развиваться поздние стадии ВИЧ - инфекции и, соответственно, иммунодефицит. Если проецировать такое развитие ситуации и дальше, то к 2007 г. число больных ВИЧ-инфекцией и туберкулёзом составит более 30 тыс. (Фролова О.П., 2003).

Государственная система мониторинга туберкулёза действует в России с 1997 г. на основе приказа Минздрава России № 193 от 13.07.97. Базы данных и программное обеспечение, установленные в более чем 40 административных территориях РФ, обеспечивают в настоящее время эффективный эпидемиологический мониторинг и контроль деятельности фтизиатрической службы (Белиловский Е. М., 2003).

В настоящее время НИИ туберкулёза и фтизиопульмонологии сотрудничает с зарубежными учреждениями по прикладным и фундаментальным исследованиям, по изучению механизмов возникновения лекарственной устойчивости и путей распространения туберкулёза, разработке методов ускоренного определения чувствительности МТБ к химиопрепаратам, иммуно-генетике туберкулёза с целью изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности макроорганизма туберкулёзной инфекции (Ерохин В.В.,2003).

В связи со своеобразием эпидемиологии, клиники и диагностики ту-беркулёза, эпидемиологический надзор должен осуществляться с учётом его особенностей (Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В., 2003). ВОЗ принимает участие во внедрении программы по контролю над туберкулезом на территории РФ с 1994 г. Сегодня 27 субъектов РФ используют рекомендации ВОЗ (Kluge H., Jakubowiak W., Pashkevich D. et.al., 2003).

1.2 АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА

На приоритетном месте медицинской биотехнологии стоят вопросы разработки и совершенствования технологий изготовления биопрепаратов с целью повышения их активности, чувствительности, специфичности, экс-прессности при диагностике туберкулёза у больных людей и выявлении возбудителя в объектах внешней среды.

Для конструирования высокоактивных диагностических препаратов необходимо получить качественный антигенный и антительный материал. При изолировании антигенного материала микобактерий, представляющего собой сложные комплексы, содержащие протеины, полисахариды, липиды, фосфатиды, необходимо более полное извлечение интересующих специфических компонентов с сохранением их биологических и антигенных свойств. Для перевода антигенов в растворимое состояние применяют экстракцию трихлоруксусной кислотой, солевыми растворами, фенолом, эфиром, хлороформом, ацетоном и т.д. Получаемые при этом экстракты имеют различные физико-химические, иммунохимические свойства и спектр антигенов. При анализе литературных данных по методам выделения антигенных комплексов из микробных клеток привлекли внимание сообщения Н.А.Бельской с соавт. (1972), В.И.Вейнблата с соавт. (1972), в которых показано, что наиболее сложным макромолекулярным составом обладали водно-солевые экстракты. Многими исследователями для извлечения антигенных компонентов из микробной клетки использовались различные методы её разрушения: физический, химический, механический и др. Эффективными методами разрушения микробной клетки является ультразвуковая и механическая дезинтеграция (Фихте Б.А., 1972; Афанасьев Е.Н., 1986), так как под их воздействием наступает, прежде всего, разрушение структуры клеток микробов, а изменения химических веществ, находящихся в них, происходят гораздо медленнее, что обеспечивает возможность получения различных нативных антигенных комплексов (Благовещенский В. А. с соавт., 1961).

Специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимости от активности и специфичности антитела, используемого для приготовления диагностического препарата (Скачек Д.В., 1984; Алексеев В.В. с соавт. 1987). Для получения сывороток описаны различные схемы иммунизации животных (Шаханина К.Л., 1977; Чибисова В.А., 1975; Тюменцева И.С. с соавт., 1994 г; Rowe D.S., 1970; Lachman P.J., 1970 и др.). Антисыворотки, приготовляемые к различным антигенам, испытывают на активность и специфичность методами кольцепреципитации, электрофореза и иммуноэлек-трофореза, преципитацией в агаре по Оухтерлони, реакциями агглютинации (РА), непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного анализа (ИФА) и т.д.. При наличии перекрестных реакций антисыворотки истощают (Шаханина К.Л., 1981; Смирнов В.В., 1980; Кузовлева А.А., Шаханина К.Л., 1982; Beuntner E.H. et al., 1970; Ansari A.A. et al.,1981). Лучшие результаты получают при удалении нежелательных антител нерастворимыми им-муносорбентами. Применяют иммуносорбенты, полученные путем присоединения специфического антигена к носителю (целлюлозе, агарозе, сефаро-зе и др.), либо "сшивкой" специфического антигена. Такие иммуносорбенты обладают прочной ковалентной связью антигена с матрицей и получаются при взаимодействии реакционноспособных функциональных групп биополимеров со специально подобранными бифункциональными соединениями.

Попытки истощения сывороток при использовании в качестве адсор-бентов микробных клеток, широко применяемых в сывороточном производстве (Карпов С.П. с соавт.,1976; Смирнов В.В. с соавт., 1980; Пекшев А.В., Елагин Г.Д., Пятков В.А., 1998), приводят к существенной потере специфической активности нативных сывороток, при их частичном насыщении антигенным материалом. При этом процесс адсорбции иммунной сыворотки корпускулярными антигенами очень трудоемок и требует приготовления большого количества биомассы. Значительные преимущества перед названными сорбентами имеют твердофазные иммуносорбенты. При их приготовлении отпадает необходимость получения большого количества биомассы микроорганизмов штаммов-адсорбентов, существует возможность длительного их использования после проведения регенерации и, что самое главное, в процессе адсорбции происходит незначительное снижение специфической активности сывороток при упрощении манипуляций (Лопаткин О.Н. с соавт., 1983). Тем не менее, метод иммуносорбции имеет и недостатки, связанные со сложностью подготовки иммуносорбентов, с использованием канцерогенных, дорогостоящих импортных реактивов, с недостаточной сорбционной емкостью сорбентов.

Чувствительность иммунометодов зависит, прежде всего, от активности антител, на основе которых они изготовлены. Чаще всего используют иммуноглобулины класса G, для выделения которых из сыворотки существует много способов: аффинная хроматография, высаливание сернокислым аммонием (Таран И.Ф., Лопаткин О.Н., 1985;.O'Berry P.A., 1964; Lenis V.J. с соавт., 1964), осаждение каприловой кислотой (Steibuch, Andran, 1969), поли-этиленгликолем (Poison A. с соавт., 1964), риванолом (по Корн, 1977), этиловым спиртом (Табаков П.К с соавт., 1962; Носков Ф.С., 1969) и т.д. Освобождение иммуноглобулинов от основного количества балластных белков (главным образом от альбумина) позволяет снизить неспецифические реакции.

Каждый из методов выделения иммуноглобулинов имеет свои пре-имущества и недостатки. Удаление солей, используемых при фракционировании белков, необходимо проводить полностью, так как загрязнения выделенных глобулинов даже небольшим количеством сульфата аммония мешают точному определению количества белка и дальнейшей его конъюгации с красителем или ферментом. Сульфатно-риваноловый метод обеспечивает эффективное удаление балластных веществ при очистке иммуноглобулинов (Водолазова А.М., Никитина Л.Н., 1981). Метод их выделения с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) является эффективным, так как ПЭГ хорошо осаждает белки, обладает селективностью, более специфичен при осаждении белков различной природы, чем сульфат аммония. При фракционировании иммуноглобулинов каприловой кислотой выделяется наиболее чистая фракция иммуноглобулинов класса G.

Только при чётко подобранном антигенном материале, эффективной схеме иммунизации, отработанном для каждого конкретного случая методе выделения иммуноглобулинов, возможно получение высокоактивных диагностических препаратов.

В настоящее время диагностика ТБ недостаточно эффективна. Так, например, основными методами диагностики ТБ медиастинальных лимфоузлов, сопровождающегося интоксикационным синдромом в сочетании с кальцинацией лимфоузлов и продуктивным кашлем, являются рентгенологический и бронхоскопический (Nikolayeva O., Shpak O., 2003).

При диагностике туберкулёза до сих пор на приоритетном месте находятся бактериоскопия и культуральный метод. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Бактериоскопия позволяет быстро получить результаты анализа, однако недостаточно чувствительна, а результаты культурального метода из-за длительности сроков культивирования микобактерий не отражают настоящую ситуацию по бактериовыделению (Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Васильева И.А. с соавт., 2004). Идентификация комплекса МТБ биохимическими тестами требует большого количества времени и наличия достаточного количества выросших колоний. На основании наличия внутривидовых различий результаты тестов могут разниться, поэтому необходимо проводить их в комплексе. Например, для идентификации МТБ необходимы, по меньшей мере, 4 биохимических теста - аккумулирование ниацина, редукция нитратов, каталазы и толерантность к парааминобензойной кислоте (Kent P.T., Kubica G.P., 1985). Стоимость этих анализов выше стоимости ПЦР в два раза, а время, необходимое для их проведения, составляет около 28 дней.

Газо-жидкостная хроматография является быстрым и действенным методом идентификации МТБ, для которого необходима чистая культура и определённое количество бактерий, формирующихся при трёх неделях роста (Butler W.R., Jost K.C., Kilburn J.O., 1991; Thibert L., Lapierre S., 1993; Duffey P.S., Guthertz L.S., Evans G.C., 1996; Zerbini E., Cardoso M.M., Sequeira M.D. et al., 1999).

Стремительное развитие биотехнологии в последние годы привело к появлению многочисленных новых методов исследования, однако, продолжает широко применяться хорошо известная реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА), заключающаяся в том, что эритроциты, связавшие серологически активный компонент, приобретают свойства агглютинироваться гомологичным серологически активным антикомпонентом. Такой метод выявления первичного взаимодействия антиген-антитело обладает весьма высокой чувствительностью. Эти реакции находят все большее применение в диагностике различных заболеваний, изучении иммунологической прослойки населения, исследовании антигенной структуры различных микроорганизмов и т. д. Эритроцитарные диагностикумы до сих пор привлекательны по себестоимости, доступности сырья, простоте производства и применения.

В качестве антигена для РНГА применяют экстракт туберкулиновых микобактерий или очищенный туберкулин, которыми сенсибилизируют эритроциты. Диагностическое значение имеет положительная реакция с сыворотками больных 1:8 и выше. Положительные результаты регистрируются у 70-90 % больных туберкулёзом (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2003).

Суспензии - распространённые микрогетерогенные системы, которые могут быть получены различными способами, например, конденсационными, дисперсными и т.д. (Хмельницкий Р. А., 1988). Адсорбция лигандов на данных системах зависит от химического строения сорбентов и соотношения фракций лиганда (Адамов А.К., 1965; Адамов А.К., Агафонов В.И., 1969). При изучении закономерностей адсорбции иммунных антител установлено, что они адсорбируются органическими соединениями, содержащими гидроксильные, хинонные, карбоксильные, альдегидо -, сульфо - и нитро-группы, органическими веществами, в состав которых входят атомы металлов, а также пористыми образованиями - активированным углём, каолином и т.д. (Адамов А.К, Бердиков В.Т., 1964). Иммуносорбенты могут быть получены из любых частиц, на которых фиксированные антитела сохраняют иммунологическую активность и специфичность. Суспензионные диагностикумы применяют в реакции суспензионной агглютинации (РСА), которую осуществляют на стекле или в U-образных иммунологических планшетах (Rama-dass P., Samuel B.,Nachimuthu K., 1999; Maruyama S., Boonmar S., Morita Y., 2000), обнаруживая невооруженным глазом склеивание или выпадение в осадок микробных тел при взаимодействии их со специфическими антителами, сорбированными на суспензии. Благодаря специфичности и простоте, реакция получила широкое распространение в микробиологической практике.

Среди матриц для суспензионных диагностикумов хорошо себя зарекомендовали латексы - полистирол, полиакролеин и др. (Лукин Ю. В. с соавт, 1985; Ерохин Е.П. 1991; Дячина М.Н. с соавт., 1995; Лазовская А.Л., Воробьёва З.Г., 2002). Латексы - водные эмульсии каучукоподобных полимеров, получаемые полимеризацией или сополимеризацией различных органических непредельных соединений (Бусеев А.И., Ефимов И.П., 1971). Реакции с использованием в качестве твёрдой основы латекса называются реакцией агглютинации латекса (РАЛ). Слининой С.А. (2001) выявлены микобактериальные антигены в моче больных с помощью РАЛ и показана перспективность использования данной реакции.

Особое распространение получили методы, основанные на применении антител, меченных специальными маркерами-флуорохромами, которые позволяют с помощью люминесцентного микроскопа проводить высокочувствительные определения исследуемого вещества в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) (Coons A.H. et al., 1942.). При диагностике туберкулёза широко используется люминесцентная микроскопия, основанная на том, что объекты (клетки), окрашенные специальными красителями (флуорохромами), дают излучение в видимом спектре света под действием облучения их ультрафиолетом. При обработке микобактерий флуоресцентными красителями (аурамин, родамин и др.) они связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. По чувствительности люминесцентная микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала, незначительно уступает методу посева. Этим методом можно исследовать любой материал кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ СССР № 558, 1978).

Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по Цилю-Нильсену (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001).

При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что может привести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранжевого свечения. Микроскопические исследования с использованием окрасок по Цилю-Нильсену и аурамином не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mуcobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) - возбудителей микобактериозов. На основе этих методов можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003).

В связи с этим, желательно использовать более специфические методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, в частности - метод иммунофлуоресценции. Он достаточно прост, экономичен, может использоваться в экспресс - диагностике инфекционных заболеваний и вместе с тем удобен для работы (Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В., 1982; Greenlee M.T. et al., 1994; Gall D. еt al., 2000; Nielsen K. еt al., 2000).

Данный метод основан на использовании специфичности иммунологических реакций и чувствительности флуоресцентной микроскопии. Один из компонентов иммунной реакции (специфические иммуноглобулины) коньюгируется с флуоресцирующим красителем (меткой). После возбуждения флуоресцирующего агента ультрафиолетовым излучением визуализация антигена становится возможной непосредственно наблюдателю вследствие развития флуоресценции. В качестве флуорохрома применяют изоцианаты, изотиоцианаты и сульфохлорид флуоресцеинов, которые связываются с белковыми молекулами. Метка белка ФИТЦ проводится в щелочной среде. Интенсивность свечения уменьшается в 2-3 раза после присоединения ФИТЦ к белку, но остается достаточно высокой при просмотре в люминесцентном микроскопе. В реакции конъюгации в основном участвуют аминогруппы лизина и N-концевые аминогруппы белковой молекулы. Известно, что конъюгация белка с ФИТЦ является химической реакцией, зависящей от ряда факторов: чистоты и активности красителя, его количества при метке, концентрации белка, взятого в конъюгацию, количества и степени его очистки, состава буфера, величины рН, времени конъюгации и температуры реакции.

В настоящее время разработаны методы экспресс-диагностики туберкулёза, основанные на использовании РИФ с моноклональными видоспецифическими флуоресцирующими сыворотками (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2003).

Большое внимание уделяется развитию методов флуоресцентного им-муноанализа с временным разрешением, что значительно повышает чувствительность анализа (Жердева В.В., Чудинов А.В., Савицкий А.П., 2002). В диссационно-усиленном лантаноидном флуоресцентном иммуноанализе используются ионы европия, тяжелого металла группы лантаноидов. Для образования прочной связи белка с ионом лантоноида применяют бифункциональные производные карбоновых кислот. На стадии детекции ионы европия диссоциируют из меченого антитела с поверхности твердой фазы в специальный раствор, образуя новый флуоресцирующий комплекс (Иванов Ю.В., Коровкин С.А., 1997).

Анализ данных литературы (Шаханина К. Л., Манько М.И., 1969; Шаханина К.Л., Походзей И.В., 1978; Стоев К.Г. с соавт., 1981; Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., 1986; Ефременко В.И. с соавт, 1989; Moldey R.S., Jen S.P.S., Rembaum A., 1977) свидетельствует о перспективности разработки твёрдо-фазного иммуноанализа на основе РИФ с использованием иммуносорбентов, позволяющих выявлять не только корпускулярные, но и водорастворимые антигены.

Для избирательной сорбции некоторых бактерий и риккетсий с целью последующего выявления микроорганизмов в РИФ К.Л.Шаханина с со-авт. (1969) применяли иммуносорбенты на основе целлюлозного носителя, при этом повышалась чувствительность метода в 10-15 раз, хотя он и не позволял проводить количественный учет свечения гранул.

Некоторые авторы работ считают, что синтетические диагностикумы на основе сефарозы, агарозы выгодно отличаются от эритроцитарных и ла-тексных тем, что их качество не зависит от типа носителя, к которому присоединение антитела или антигена происходит ковалентно. Результаты исследований сыворотки больных хроническим бронхитом позволили сделать вывод, что приготовленные сефарозные антительные и антигенные диагностикумы достаточно специфичны и более чувствительны, чем РСК (Шахани-на К.Л., Походзей И.В., 1978).

К. Г. Стоевым с соавт.(1981) разработан количественный метод РИФ с использованием специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа (DASS-система), что позволяет измерить концентрацию Ig Е человека в пределах 5-2500 м.е./мл. Метод обладает рядом преимуществ, отличается малой затратой времени, доступен практическим лабораториям.

В настоящее время появились сведения об усовершенствовании РИФ с использованием иммуносорбентов, обладающих магнитными свойствами. Описано использование магнитных полиакриламидных сорбентов (Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., 1986; Ефременко В.И. с соавт., 1989; Подзолкова Г.Г. с соавт., 1989); магнитных органокремнезёмных сорбентов (Жарникова И.В., 1995; Афанасьев Е.Н., 2000, Базиков И.А., 2000); магнитных железоокисно-декстрановых частиц (Molday R.S.et al., 1977). К недостаткам последнего метода следует отнести необходимость применения мощных магнитных полей для сепарации этих частиц.

На основе твердофазных иммуносорбентов различной природы Г.Г. Подзолковой с соавт. (1989) предложен метод количественной иммунофлуоресценции, позволяющий выявлять с высокой чувствительностью различные антигены. Таким образом, РИФ с использованием иммуносорбентов может успешно применяться для выявления возбудителей инфекций. Однако совершенствование метода иммунофлуоресценции на твердой матрице во многом определяется качеством сорбентов, лиганда, техникой постановки реакции.

На основании того, что диагностика МТБ с помощью традиционных методов требует длительного времени и в условиях широкого применения разнообразных противотуберкулёзных препаратов изменилась биология возбудителя туберкулёза (морфология, ферментативная активность и биологические свойства) (Приказ МЗ РФ № 558., 1978), в микобактериологии на протяжении последних лет используются молекулярные технологии - методы генодиагностики, а именно полимеразная цепная реакция (ПЦР), что позволило разработать методы генотипирования и дифференцирования штаммов микобактерий туберкулёза на уровне хромосомной ДНК (Goto M., Oka S., Okuzumi K. еt al., 1991; Lebrun L., Espinasse F., Povenda J. еt al., 1992; Badak

F.Z., Goksel S., Sertoz B. et al., 1999). В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфической для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности. Реакция осуществляется при помощи термостабильной ДНК-полимеразы и комплиментарных ДНК -мишени олигонуклеотидных праймеров. Образование в результате реакции фрагментов ДНК определённого размера оценивается как факт наличия в пробе клеток искомого микроба и позволяет идентифицировать исследуемую ДНК.

Визуализация результатов ПЦР достигается различными способами в зависимости от используемого формата реакции. При использовании электрофоретического разделения продуктов амплификации для обнаружения ампликонов используется окрашивание ДНК. Самый распространенный способ - окраска бромистым этидием с последующим просвечиванием геля на ультрафиолетовом трансиллюминаторе. Этот метод высокочувствителен, но бромистый этидий является мутагеном и требует осторожного обращения. Еще один подход основан на использовании флуорохромов, которые излучают свет разных цветов. Deng Shaoli, Yang Yuan (2002) провели детекцию Муcobacterium tuberculosis в образцах слизи туберкулёзных и нетуберкулёзных больных с помощью культурального метода, рутинной ПЦР и новой техники ПЦР с использованием гибридизации с Tagman флуоресцентным зондом. Было установлено, что «Tagman - техника» является высоко чувствительной, специфичной и может использоваться для диагностики туберкулёза.

Известны различные варианты гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР. После амплификации ампликоны с включенными биотинилированными праймерами вносят в лунки микропланшета с иммобилизиро-ванными одноцепочечными зондами к этим фрагментам, проводят гибридизацию и после отмывки добавляют авидин с конъюгированной пероксидазой или с фосфатазой, субстрат для фермента и выявляют окрашенный продукт с помощью фотометра.