Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза

Таким образом, при использовании МИС в модифицированном ИФА отпадает необходимость в полистироловых планшетах. Пористая структура маг-носорбента оптимальна для образования иммунохимического комплекса антиген-антитело, исключает внутридиффузионное торможение при проведении анализа.

Высокую чувствительность ИФА с применением МИС можно объяснить тем, что для такого фермента как пероксидаза, используемого при изготовлении иммуноферментного конъюгата, металл, входящий в структуру МИС, повышает каталитическую функцию энзима (Берёзов Т. Т., Коровкин Б.Ф., 1982).

В качестве иммунопероксидазного конъюгата для выявления МТБ использовали также его липосомальную форму, получение и свойства которой описано в главе 4. Данный препарат применен при постановке ИФА с МИС. Схема постановки анализа представлена на рис. 14.

После контакта МИС с антигеном во флаконы вносили по 0,2 мл туберкулёзного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата в его рабочем разведении, инкубировали при температуре (22 ±4) 0C в течение 15-20 мин и про-мывали 5-6 раз 0,1 М ФСБ с твин-20. Во все флаконы вносили хромогенную смесь. Через 1-2 мин надосадочную жидкость из флаконов дозатором перено-сили в планшет по 0,10-0,15 мл и останавливали реакцию, внося по 0,05 мл раствора серной кислоты в концентрации 4 моль/л. Визуально регистрацию результатов оценивали по изменению интенсивности окраски смеси от оранжево-желтого цвета (опытные) до слабо желтого (контрольные). При инструментальном учете на фотометре оптическую плотность хромогенной смеси измеряли при длине волны 492 нм.

Чувствительность препарата при выявлении МТБ была не ниже 1х10 м.к. в пробе, при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами бактерий. Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, замораживали и лиофилизировали в течение (18 ±2) ч до конечной температуры 25 0С. В готовом препарате контролировали физико-химические свойства (растворимость, цветность, прозрачность, потерю в массе при высушивании), а также иммунологическую активность, специфичность, чувствительность после лио-филизации и в процессе хранения в течение 3 лет (срок наблюдения). Данные представлены в таблице 12.

Учитывая, что липосомальный туберкулёзный иммуноферментный диаг-ностикум при использовании в качестве твёрдой фазы МИС позволял в ИФА обнаруживать МТБ в гораздо меньшем количестве, чем при постановке традиционной реакции в полистироловых микропланшетах, т.е. обладал большей чувствительностью, нами было получено 5 серий этих диагностических тест-систем. В полученный набор входят: лиофильно высушенный липосомально-иммуноперооксидазный конъюгат, 0,1 мл в ампуле; взвесь туберкулёзного микроба 109 м.к./мл (положительный контроль); туберкулёзный МИС (10 % взвесь)-2 ампулы по 2 мл, необходимые ингредиенты для постановки ИФА (ФСБ, БСА, твин-20, стоп-реагент- по 1 флакону, 0-фенилендиамин-2 флакона и таблетка гидроперита).

Таким образом, нами разработана биотехнология изготовления магноим-муносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы диагностические тест - системы для проведения сочетанного метода детекции микроорганизмов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постановки ИФА с МИС. Установлено, что туберкулёзные магноиммуносорбенты в жидком виде стабильны без потери физико-химических и иммунологических свойств в течение 3 лет (срок наблюдения). ИФА с применением МИС характеризуется высокой чувстви-тельностью (1х10 м.к. в пробе), специфичностью, быстротой постановки реакции (1-1,5 ч), стоимостью в 1,5 раза ниже традиционного ИФА (таблица 13). При этом отпадает необходимость применения сенсибилизированных микропланшет. При использовании разработанной липосомально-иммунопроксидазной тест-системы повышается срок годности препарата в 2 раза при сохранении его физико-химических и каталитичесих свойств.

ставлены нормативные документы: регламент производства и инструкция по применению на тест-систему диагностическую липосомально- иммунопероокси-дазную для выявления антигена возбудителя туберкулёза иммуноферментным методом, рассмотренные на Учёном Совете СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05 г) и утвержденные директором института.

6.2 РАЗРАБОТКА МЕТОДА СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЁЗА НА МАГНОИММУНОСОРБЕНТЕ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКОЙ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

В последние годы при выявлении МТБ широко применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения МТБ, простота флюорохромирования делает его доступным для практических лабораторий. Преимущество метода люминесцентной микроскопии состоит в том, что она позволяет просматривать в короткий срок больше полей зрения, чем при обычной микроскопии с иммерсионной системой, при этом удаётся быстрее и в большем количестве выявлять МТБ. Люминесцентная микроскопия с применением аурамина позволяет увеличить процент находок на 8 % по сравнению с методом флотации и на 17 % по сравнению с прямой бактериоскопией мазка (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люминесцентными красителями, в частности аурамином, основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в котором могут присутствовать трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ РФ № 558, 1978).

Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Циля-Нильсена (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001).

При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в результате некачественного обесцвечивания мазка с сохранением некоторыми сапрофитными бактериями оранжевой окраски. Микроскопические исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса МусоЬас^егшт tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) микобактериозов. Используя эти методы, можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобакте-рий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003).

При внутривидовой дифференциации бактерий наиболее перспективными являются методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, особенно в связи с возможностью использования в иммунофлуоресцен-ции твёрдых носителей (Стоев К.Г. с соавт., 1981; Подзолкова Г.Г. с соавт., 1989 и т.д.).

Нами апробирован данный метод с применением магноиммуносорбентов для обнаружения антигенов возбудителя туберкулёза и определены оптимальные параметры постановки КИФА, чувствительность и специфичность метода.

Эксперименты проводили с чистыми культурами туберкулёзного микроба. Из культур готовили взвеси с концентрациями от 1х101 до 1х109 м.к/мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации микобактерий и по 0,2 мл 10 % суспензии туберкулёзного магноиммуносорбента. Смесь инкубировали в течение 15, 30, 60 мин при температурах (22±4) 0С и (37±1) °С, затем гранулы МИС отмывали 0,9 % раствором хлорида натрия рН 7,2, используя для сепарации постоянный магнит, удерживающий МИС на внутренней стенке флаконов. В дальнейшем к МИС добавляли 200 мкл раствора иммуноглобулинов G туберкулёзных флуоресцирующих (полученных нами при конъюгации иммуноглобулинов из адсорбированной туберкулёзной сыворотки путём фракционированния капри-ловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969) с ФИТЦ (C21H11NO5S) по методу

Х.Шторц (Stortz, 1987) и инкубировали 15, 30, 60 мин при (22±4) 0С и (37±1) 0С. Сорбент отмывали вышеуказанным способом 2-3 раза забуференным физиологическим раствором и 1 раз дистиллированной водой. Контролем служили гранулы МИС, не контактировавшие с исследуемым материалом и окрашенные флуоресцирующими иммуноглобулинами. Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 20 мкл наносили на предметное стекло и микроскопировали. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный В7-76. Рабочее напряжение составляло 800 - 900 В, увеличение объектива х40 и окуляра х10. Применялись возбуждающие светофильтры БС-8-2, СЗС-7-2, ФС-1-6. Диаметр зонда фотометрической насадки составил 0,5 мм. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента закрывали полевую диафрагму и снимали цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Определяли среднеарифметические значения величины флуоресценции опытных (рис. 15), контрольных гранул и пространства между ними - фона.

Интенсивность флуоресценции магноиммуносорбента (М) представляла собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М)= М гранул - М фона. За положительные принимались ре-зультаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в 2 и более раз превышал аналогичный показатель контрольных (Владимцева И.В. с соавт, 1989).

Для оценки способности туберкулёзных МИС концентрировать на своей поверхности специфический антиген приготавливали пробы водопроводной во-ды объёмом 500 мл, куда вносили МТБ в количестве 101, 102, 103, 104, 105 м.к. В дальнейшем эти пробы пропускали через МИС, находящиеся в специальной «ловушке» и удерживающиеся в ней магнитным полем.

Общая схема постановки КИФА представлена на рисунке 16.

МТБ во всех случаях были выявлены при наличии в пробах 1х10 м.к. и выше. Аналогично контролировали специфичность диагностической системы, используя гетерологичные штаммы (таблица 14). В результате установлено отсутствие перекрёстных реакций.

В процессе отработки различных условий проведения анализа установлено, что чувствительность КИФА была одинаковой при исследуемых температурных режимах сорбции антигена на МИС- (22+4) 0С и (37±1) 0С, а для контакта сорбента с антигеном и окрашивания образовавшегося комплекса флуоресцирующими иммуноглобулинами было достаточно 15-30 мин инкубации.

Из таблицы следует, что отношение уровней флюоресценции опытных МИС в 2 раза выше по сравнению с контрольными, не контактирующими с ан-тигеном, а также с сорбентами, обработанными гетерологичными штаммами. Данная диагностическая система позволяет выявлять возбудитель туберкулёза в концентрации 0,5х10 - 1х10 м.к./пробе.

При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969) в серии опытов чувствительность КИФА t равна 0,82х10 м.к./мл (+7,9 %;-7,3 %).

Нами приготовлено 5 серий тест - систем МИС для диагностики возбудителя туберкулёза в КИФА, в которые входят 3 амп. по 2 мл. туберкулёзных МИС -10 % взвесь; положительный контроль - обеззараженные клетки мико-бактерий туберкулёза, 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула - 1 мл; иммуноглобулины туберкулёзные флуоресцирующие сухие - рабочее разведение 1:16 - 1:64 - 1 амп-0,5 мл.

При проведении технико-экономического обоснования применения сочетанных методов МИС с КИФА установлены явные преимущества данного метода перед традиционной иммунофлюоресцентной реакцией (таблица 15).

Таким образом, нами разработана биотехнология изготовления туберкулёзных МИС, на их основе сконструированы диагностические тест - системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителя туберкулёза в КИФА и оптимизированы параметры постановки этой реакции. Данный метод обеспечивает селективное концентрирование МТБ на сорбенте, обладает высокой чувствительностью (0,5х10 - 1х10 м.к./в пробе), в 1000 раз превышающую чувствительность общепринятой РИФ, специфичностью и отличается быстротой постановки реакции (1-1,5 ч). При этом реакция учитывается не только визуально, но и инструментально в условных единицах по показаниям вольтметра.

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ ДИАГНОСТИ-КУМОВ И ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА

Для получения положительных результатов клинического применения разработанных диагностических препаратов и тест-систем при выявлении МТБ необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, методах подготовки исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих составляющих зависит качество диагностики.

Существует многообразие форм туберкулёзной инфекции, наиболее распространёнными являются: туберкулёз внутригрудных лимфатических узлов; диссеминированный; милиарный; кавернозный туберкулёз; туберкулёз медиа-стинальных лимфоузлов.

Туберкулёз внутренних лимфатических узлов - вариант первичного туберкулёза. Процесс у человека развивается на фоне нарушения иммунной системы. Поражаются прикорневые лимфатические узлы преимущественно средней доли правого лёгкого, язычкового сегмента, а также бронхопульмональные лимфатичесие узлы верхних долей лёгких. Патологоанатомическая характеристика процесса сходна с казеозным лимфаденитом в первичном туберкулёзном комплексе.

Диссеминированный туберкулёз характеризуется лимфогематогенным распространением инфекции, начинается с поражения лимфатического сосуда и завершается в стенке кровеносного сосуда. Данный вид туберкулёза отличается хроническим течением и развивается на базе скрытого течения инфекции. При данной форме очаги в лёгких имеют различную величину и возраст, часть из них прогрессирует, часть рубцуется или кальцинируется, что свидетельствует о длительном волнообразном течении процесса. Очаги инфекции отличаются кортикоплевральной локализацией, симметричностью поражений, продуктивной тканевой реакцией, могут быть мелкими, средними и крупными. Наблюдается развитие сетчатого пневмосклероза, эмфиземы, лёгочного сердца. Нераспознанные и нелеченные формы диссеминированного туберкулёза через фазу инфильтративной вспышки с распадом могут трансформироваться в деструктивные формы туберкулёза.

Кавернозный туберкулёз характеризуется наличием изолированно сформированной каверны со слабо развитым фиброзным слоем и отсутствием в окружающей ткани выраженного склероза и очагов-отсевов. Его исходной формой может быть инфильтративный, очаговый, диссеминированный туберкулёз и ту-беркулёма. Каверна располагается обычно в более глубоких отделах лёгкого. Большое значение в прогрессировании каверны имеет состояние дренирующих бронхов, в стенках которых формируется казеозный эндомезо- и панбронхит. Больные данной формой туберкулёза могут умереть от лёгочного кровотечения или других осложнений.

Фиброзно-кавернозный туберкулёз лёгких является результатом про-грессирования большинства форм первичного или вторичного периодов болезни, характеризуясь формированием в органе одной или несколько каверн с широким фиброзным слоем на фоне распространённого очагового склероза и очагов-отсевов различного генеза. При длительном хроническом течении фиброз-но-кавернозного туберкулёза возрастают процессы фиброзирования и очаговой эмфиземы лёгких.

Туберкулёз медиастинальных лимфоузлов - интоксикационный син-дром в сочетании с кальцинацией лимфоузлов, продуктивным кашлем, выделением микобактерий. Основные методы диагностики в настоящее время- рентгенологический и бронхоскопический.

У больных с тяжёлым течением лёгочного туберкулёза первично нарушается функция соединительной ткани лёгкого, развивается мезенхимопатия, сопровождающаяся повышением проницаемости гистогематического барьера, поражением терминальных бронхиол.

В связи с этим, при туберкулёзе перспективны медико-биологические исследования соединительной ткани и микроциркуляторного русла лёгких в неблагоприятных условиях биосферы для жизни, при нейроэндокринных стрессах, иммуносупрессивном лечении и т.д. (Ерохин В.В. с соавт., 1996).

Данные, представленные Чутаевым Ю.П. с соавт. (1996) показывают, что положительная реакция на пробу Манту среди больных туберкулёзом лёгких составляет 67,7 %, кониотуберкулёзом - 52,4 %, силикотуберкулёзом -38,7, неспецифическими заболеваниями органов дыхания (пневмония, хронический бронхит, абсцесс лёгкого)- 50 %, здоровых людей- 33,3 %. Как видно из представленных данных, проба Манту не в полной мере выявляет заболевание туберкулёзом при наличии ложноположительных результатов у здоровых людей.

Выявление антигенов возбудителя туберкулёза крайне затруднительно. Известны случаи, когда в группе больных фиброзно-кавернозным туберкулёзом только в фазе распада впервые выявлялся антиген (Хоменко А.Г., 1992). Для внелёгочного туберкулёза на фоне широчайшего полиморфизма бактерий характерны малая частота обнаружения возбудителя в патологическом материале и невозможность воспользоваться данными рентгенологической картины на ранних этапах заболевания. L. K. Surkova et.al (2003) представлены исследования по изучению поражённых туберкулёзом очагов и установлено, что положительный ответ при исследовании секционного материала на МТБ был в 25 % случаев, при которых отмечался отрицательный результат изучения мокроты.

Длительный латентный период и поздняя манифестация симптомов вызывают трудности диагностики. Таким образом, контроль над туберкулезом среди населения требует хорошо организованных программ по скринингу и лечению (Miranda A.G., 2003).

Целью наших исследований являлось максимально возможное лабораторное выявление возбудителя МТБ у наиболее эпидемически опасной категории пациентов среди лиц, обратившихся в Краевой клинический противотуберкулёзный диспансер г.Ставрополя с подозрительным в отношении туберкулёза клиническими или рентгенологическими симптомами. С этой целью были сконструированы принципиально новые тест-системы, которые позволяют значительно повысить эффективность выявления возбудителя туберкулёза, по сравнению с существующими методами, что было подтверждено клиническими испытаниями.

Обследование людей проводили, оценивая следующие основные параметры, по которым больных подразделяли на группы:

- лица, имеющие соответствующую симптоматику со стороны органов дыхания (наличие в течение 3 нед. и более продуктивного кашля с выделениями слизистой, слизисто-гнойной мокроты или мокроты с прожилками крови);

- лица, имеющие выявленные лучевыми методами изменения в лёгких, подоз-рительные на туберкулёз;

- лица из контакта с больными туберкулёзом, выделяющие микобактерии и имеющие соответствующие симптомы заболевания;

- лица с подозрением на внелёгочные формы туберкулёза;

Особенно важны выделение и идентификация возбудителя при наблюдении за больными туберкулёзом с неудовлетворительными результатами стандартного курса химиотерапии, у которых возбудителями заболевания могут быть лекарственно-устойчивые формы микобактерий или нетуберкулёзные ми-кобактерии (возбудители микобактериозов).

Изучив формы туберкулёза, место локализации антигенов и истории болезни больных туберкулёзом, мы подошли к решению задачи подготовки проб исследуемого материала.

Сбор, хранение, транспортировку и работу с диагностическим материалом (моча, мокрота) проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение № 10 от 21.03.2003. Постановку РАЛ, РСА, ИФА проводили аналогично описанному в соответствующих главах диссертации. Селективное концентрирование антигена возбудителя туберкулёза на МИС с последующей постановкой экспресс-анализов (ИФА и КИФА) осуществляли в два этапа (рис. 17):

1 этап - селективное концентрирование. В каждый флакон с исследуемым материалом (мокрота, ресуспендированная в 10 кратном объёме забуференного физиологического раствора рН 7,2; моча, объёмом 1-10 мл) вносили по 0,5 мл 10% ресуспендированного МИС и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-40 мин. Далее, удерживая МИС при помощи постоянного магнита на дне флакона, выливали жидкость, к осадку МИС добавляли 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), перемешивали встряхиванием и переносили в бактериологическую пробирку или флакон. Таким образом промывали МИС 5-6 раз, удаляя отмывочный раствор, удерживая МИС при помощи магнита; 2 этап- исследование МИС в ИФА и КИФА (методика описана в главе 6).

Для обеспечения селективного концентрирования антигенов МТБ из проб больных большого объёма (мокрота, разведённая забуференным физиологическим раствором рН 7,2; моча) использовали туберкулёзные МИС, помещённые в проточную магнитную ловушку, через которую пропускали исследуемые жидкости, регулируя скорость их протекания зажимом (рис.18). Меняя местами колбы, можно многократно пропускать через ловушку исследуемую пробу, достигая максимального концентрирования микобактерий и их антигенов на МИС. После этого систему промывали 100 мл забуференного физиологического раствора рН 7,2, тем самым обеспечивая отмывание МИС от посторонних примесей и несвязавшихся компонентов. В дальнейшем из ловушки извлекали МИС, на поверхности которого за счёт реакции антиген- антитело фиксировались микобактерии туберкулёза и его антигены, и помещали в колбу или пробирку для проведения исследований в ИФА и КИФА.

Тестирование микобактерий осуществлено методами: РАЛ, РСА, ИФА, МИС с ИФА и КИФА.

Было исследовано 286 проб клинического материала (моча, мокрота) от больных различными формами туберкулёза из краевого клинического противотуберкулёзного диспансера, 12 проб материала от больных с нетуберкулёзными заболеваниями и 11 проб от здоровых людей, у которых исследовали мочу и слюну (табл.16).

Методики постановки этих реакций и система учёта положительных результатов приведены в главах 5 и 6.

Как видно из таблицы, используя комплекс разработанных препаратов и методов (РСА, РАЛ, ИФА, ИФА с МИС, КИФА с МИС), можно проводить качественную диагностику туберкулёза, обнаруживая у больных специфические туберкулёзные антигены. Максимальный процент выявления этих антигенов при исследовании больных достигнут с помощью сочетанных методов, использующих МИС с ИФА и КИФА.

Анализ полученных данных позволил установить, что использование адсорбированной туберкулёзной сыворотки при конструировании диагностических препаратов даёт возможность диагностировать заболевание туберкулёзом у людей, дифференцируя его от другой патологии.

С помощью ИФА и КИФА, где в качестве твёрдой фазы используются МИС с иммобилизованными антителами против антигенов МусоЬа^егшт tuberculosis, показано, что антиген возбудителя туберкулёза выявляется в мокроте, моче туберкулёзных больных в 91 % случаев и не обнаруживается у здоровых людей.

Указанные методы превосходят по информативности РСА, РАЛ и традиционный ИФА, проводимый в полистироловых планшетах. Это связано с тем, что при использовании МИС с ИФА и КИФА специфический антигенный материал концентрируется на сорбенте из проб большого объёма.

Недостаточная чувствительность традиционного ИФА (5х104-1 х 105 м. к./мл), как отмечают некоторые исследователи, связана с нестандартностью адсорбционной поверхности планшет из полистирола, что приводит к непрочному связыванию АТ и их адсорбции на этапах иммуноферментного анализа.

Отсутствие 100 % специфичности разработанных диагностических систем объясняется тем, что, хотя при их изготовлении использована туберкулёзная сыворотка, адсорбированая гетерологичными антигенами на твёрдом носителе (это несомненно повысило специфичность анализа), однако полного удаления из неё гетерологичных иммуноглобулинов, вероятно, не произошло, так как, род микобактерий составляет более 100 видов (Методические рекомендации МЗ РФ, 1992), которые содержат общие антигены с большим количеством нетуберкулёзных микобактерий и других микроорганизмов, например, с Nocardia, Brucella, Listeria и т.д.

В настоящее время усложнилась также микробиологическая и серологическая диагностика туберкулёза из-за часто встречаемых атипичных микобактерий, изменившейся биологии возбудителя (морфология, ферментативная активность, биологические свойства) вследствии широкого применения разнообразных противотуберкулёзных препаратов.

Обобщая преимущества данных тест-систем, следует отметить, что разработанные новые диагностические средства для выявления возбудителя туберкулёза на основе МИС позволяют обнаруживать корпускулярные и растворимые антигены возбудителя при их низкой концентрации в материале (50-100 микробных клеток в пробе), проводить исследования с пробами большого объёма. Эти системы относятся к средствам экспресс-диагностики туберкулёза, т.к. позволяют получить результат через 1-1,5 ч после начала исследования. Немаловажным является и тот факт, что туберкулёзный МИС не теряет своих физико-химических и иммунологических свойств при хранении на протяжении 3 лет (срок наблюдения).

В табл. 17 представлены сравнительные данные методов диагностики туберкулёза, используемые в настоящее время в клинической практике и разработанные нами.

Как видно из таблицы, наиболее эффективными методами для диагностики возбудителя туберкулёза являются ИФА и КИФА с МИС, которые отличаются высокой чувствительностью, специфичностью и непродолжительным сроком проведения анализа. При этом обнаружение туберкулёзных антигенов возможно у больных с различной локализацией патологического процесса при взятии материала на исследование у них бесконтактным способом (моча, мокрота).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Каждую минуту в мире от туберкулёза умирают четыре человека. В России в 2004 г. зарегистрировано около 102,9 тыс. больных с установленным впервые активным туберкулёзом, а показатель по сравнению с 2003 г. увеличился на 3,3 %, достигнув 71,7 на 100 тыс. населения. Среди детей до 14 лет также выросла заболеваемость на 3,8 %. Больные туберкулёзом органов дыхания составляют 95,6 % из числа всех зарегистрированных случаев заболевания туберкулёзом (Ильин И.А., 2005). В связи с неблагоприятной обстановкой по туберкулёзу в Российской Федерации в последние годы (Онищенко Г.Г. 2003) и недостаточным качеством диагностических препаратов, основные направления медицинской биотехнологии предусматривают расширение возможностей диагностики микобактерий туберкулёза за счёт появления новых экспрессных высокоспецифичных, чувствительных, доступных методов и препаратов, что способствует оперативному эпидемиологическому анализу и формированию целенаправленных противоэпидемических и медицинских противотуберкулёзных мероприятий.

Увеличение заболеваемости туберкулёзом, вызванным МТБ и нетуберкулёзными микобактериями, повышает значимость их индикации и идентификации, что крайне важно для проведения подходящей антибактериальной терапии.

В настоящей работе представлены результаты научно-методических разработок биотехнологии медицинских иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза.

Производство диагностических препаратов представляет собой единую биотехнологическую систему, которая складывается из последовательных стадий и операций, количество и особенности которых зависят от вида производимой продукции.

При получении качественных диагностических препаратов необходимо выделить из микробных биомасс высокоочищенные активные и специфические антигенные комплексы, применяемые при иммунизации животных и в качестве положительного контроля в тест-системах, подобрать схему иммунизации животных, получить специфические иммунные сыворотки, отработать параметры биотехнологии изготовления диагностических систем.

При всём многообразии способов извлечения специфических антигенов из микробных клеток необходимо было подобрать комплекс биотехнологических операций, который бы позволил изолировать в достаточном количестве для производственных целей полноценные в антигенном отношении фракции из МТБ. Для этого была использована водно-солевая экстракция МТБ и других бактерий. По данным ряда исследователей (Вейнблат В.И., 1971; Афанасьев Е.Н., 1986 и др.), такие экстракты обладают сложным макромолекулярным составом и в них обнаруживаются в тех или иных количествах большинство присутствующих у бактерий антигенов. Водорастворимые туберкулёзные антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией, ультразвуковой и механической дезинтеграцией, осаждением антигенов сульфатом аммония. Полученный препарат содержал не менее 20 мг/мл белка и формировал зоны преципитации в РИД с иммунной сывороткой в разведении 1:32 - 1:64.

Для получения туберкулёзных иммунных сывороток нами апробированы различные схемы иммунизации. При получении агглютинирующих сывороток, в которых в основном присутствуют иммуноглобулины класса М, использовали «короткую» схему иммунизации (Афанасьев Е.Н., 2000) с иммунокорректорами - тималином и циклофосфаном; при получении преципитирующих сывороток, в которых превалируют иммуноглобулины класса G, - применяли «длинную» схему (Тюменцева И. С., 1994) с иммунокорректором феракрилом. Использование иммунокорректоров позволило повысить эффективность иммунизации при незначительном расходе антигенного материала и существенном повышении титров специфических антител (до 1:600 в РНИФ и 1:64 в РИД).

В связи с тем, что антигенный спектр микобактерий туберкулёза имеет много общего с представителями родов Nocardia, Brucella, Listeria и некоторыми нетуберкулёзными микобактериями, идентификация МТБ и его дифференциация крайне важна для практического здравоохранения и проведения подходящей антибактериальной терапии. Для конструирования эффективных туберкулёзных диагностических препаратов необходимы высокоспецифические иммунные сыворотки, нуждающиеся в удалении из них перекрёстно реагирующих антител. Для этих целей наилучшим способом является использование аффинного сорбента, представляющего собой гетерологичные антигены, ковалентно закреплённые на твёрдой матрице. Очистка иммунной сыворотки происходит за счёт биоспецифического взаимодействия между антигенами, закрепленными на матрице, и антителами, подлежащими удалению.

Результаты предыдущих исследователей и наш собственный опыт показали, что сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител и делает непригодным сырьё для дальнейшего использования из-за появления в нём экстрагируемого из бактериальных клеток материала, применение же для этих целей полиакриламидных сорбентов базируется на применении высокотоксичных импортных реактивов и довольно трудоёмка. В связи с этим, мы впервые для данных целей использовали разработанный аффинный сорбент с магнитными свойствами, где в качестве твердой фазы выступает кремнезем-алюмосиликат. МС готовили при соотношении компонентов (Fe2O3, декстран, алюмосиликат) - 2:2:1 соответственно; время гелеобразования - 2 ч, значение рН гелеобразования - 7,0.

Активирование сорбента производили методом окисления, используя перхлорат натрия. Для придания магносорбенту аффинных свойств на его поверхность иммобилизовали лиганды - водорастворимые антигены (2,5 мл с концентрацией белка 2 мг/мл), полученные из гетерогенных штаммов микроорганизмов (Brucella abortus 19, Nocardia brasiliensis, M. intracellulare #23, M. Kansasii Yoss), дающих перекрёстные реакции с иммунными сыворотками. Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации антигенов на МС - 2 ч при значении рН 6 - 7 и температура 24 - 37 0С.

Методы получения иммуносорбентов просты и технологичны, исключающие применение токсичных веществ. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической и микробиологической устойчивостью, не подвержены набуханию. Использование отечественных экологически чистых компонентов, их дешевизна, простота технологии изготовления свидетельствуют о достоинствах алюмосиликатных МИС.

При сорбции туберкулёзной иммунной сыворотки данный антигенный МС, взаимодействуя с соответствующими иммуноглобулинами, освобождал сыворотку от неспецифических антител на одном этапе, сохраняя первоначальную специфическую активность нативных иммунных сывороток. Магнитные свойства иммуносорбента позволяли значительно упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования.

Проведённые исследования дают основание утверждать, что применение алюмосиликатных антигенных МИС позволяет проводить качественную имму-носорбцию, сохраняя активность и специфичность иммунных сывороток. При этом не происходит попадания в сыворотку антигенного материала, в ней отсутствуют комплексы «антиген-антитело», появляющиеся в материале при сорбции корпускулярными антигенами и мешающие в дальнейшем созданию специфических диагностических систем, титры специфических антител не снижаются и конечный продукт является качественным сырьем для дальнейшей работы. Данный сорбент можно регенерировать и многократно использовать.

Из сорбированной туберкулёзной сыворотки иммуноглобулины выделяли с помощью каприловой кислоты по методу G. Steibuch, R. Andran (1969).

Варьируя количеством используемых компонентов, рН растворов, температурой и временем проведения реакций, выделенные туберкулёзные иммуноглобулины конъюгировали с ферментом пероксидазой, липосомами, латексом, алюмосиликатом, органокремнезёмной матрицей, содержащей оксид железа, получая соответственно иммунопероксидазный конъюгат для ИФА, диагности-кумы для РАЛ, РСА и МИС.

Для ковалентного связывания пероксидазы с туберкулёзными иммуноглобулинами использовали метод перйодатного окисления углеводной части фермента (Р.К.Какапе, А.Kawaоi, 1974). Сформировавшиеся при этом альдегидные группы образовывали ковалентную связь с аминогруппами антител. Очистку конъюгата от непрореагирующих компонентов осуществляли на колонке с сефадексом G-100, после чего его лиофилизировали. Полученный препарат был стабилен без потери активности в течение 1 г. Рабочий титр полученных иммунопероксидазных туберкулёзных конъюгатов составил 1:4001:800.

В иммуноферментной реакции, в которой в качестве твёрдой фазы применяли стандартные планшеты, чувствительность конъюгата по водорастворимым антигенам составила 50-100 мкг/мл, по возбудителю туберкулёза - (5х104-1 х105 м.к./мл). С гетерологичными штаммами диагностикум не взаимодействовал, что говорит о его специфичности.

В результате проведённой сорбции сыворотки крови от гетерологичных антител и чётко отработанных параметров конъюгации лиганда и маркёра получены высокоэффективные (1:600), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с гетерологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты.

На основе полученных препаратов была сконструирована тест-система для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, состоящая из 1 ампулы имму-ноферментного конъюгата, 1 ампулы положительного контроля (обеззараженная взвесь туберкулёзного микроба)- 1 х109 м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобулинов туберкулёзных и необходимых ингредиентов для постановки ИФА (ФСБ, твин-20, БСА, стоп-реагента - 4 М раствора серной кислоты, хромогена - орто-фенидендиамина, таблетки гидроперита). Одной ампулы с препаратом в объеме 0,1 мл, с активностью-1:600 достаточно для исследования 300 проб в ИФА.

Ферменты с лабильной структурой молекулы даже в охлаждённом состоянии при 4 0С имеют ограниченный срок хранения, который удаётся увеличить при придании им определённой жёсткости в процессе иммобилизации энзимов на твёрдофазные носители.

В качестве такого носителя использовали липосомы, которые получали из фосфолипидов и ганглиозидов, выделенных из мозга к.р.с., а в последнее время из мозга свиней, не являющегося потенциально опасным при губчатой энцефалопатии животных (коровье бешенство). Разработанная биотехнология выделения сырья для приготовления липосом (ТУ 9154-00-01897080-2004) включала измельчение и обезвоживание мозга животных ацетоном, экстрагирование из него фосфолипидов и ганглиозидов смесью хлороформ-этанол (1:1) и дробное осаждение указанных липидсодержащих фракций ацетоном. Данные способы выделения фосфолипидов и ганглиозидов защищены патентами РФ № 2192265 от 10.10.2002 и № 2195296 от 27.12.2002.

Методом тонкослойной хроматографии в препарате фосфолипидов обнаружены в основном фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфотидилино-зит, а также холестерин.

Полученные препараты растворяли в хлороформе в конечной концентрации 50 мг/мл и смешивали фосфолипиды и ганглиозиды в соотношении 20:1, добавляя туда антиоксидант - 0,5 % а-токоферол. Этот липидный раствор использовали для приготовления липосом методом «выпаривания в обращённой фазе» в соответствии с методическими рекомендациями «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденными Главным Государственным санитарным врачом

России Г.Г. Онищенко. 06.04.2000 г. В результате получены липосомы, идентифицированные при электронной микроскопии, размером 150-300 нм.

При получении липосомального иммуноферментного диагностикума предварительно активировали (5+0,1) мг пероксидазы хрена по методике, описанной выше. В результате в углеводной части молекулы пероксидазы формировались альдегидные группы, обеспечивающие фиксацию фермента к мембране липосом за счёт аминогрупп ганглиозидов и последующую за этим иммобилизацию туберкулёзных иммуноглобулинов на сформировавшемся комплексе с участием оставшихся свободных альдегидных групп фермента.

С этой целью к 5 мг окисленной пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ рН 9,5, содержащей 18 мг липидов, смесь подвергали кратковременной ультразвуковой обработке. После удаления несвязавшейся на липосомах пероксидазы путём хроматографии на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной 0,01 М КББ рН 9,5, к препарату добавляли туберкулёзные иммуноглобулины G в оптимальном количестве (5 мг/мл). Смесь инкубировали 2 ч при температуре (22+4) 0С и несвязавшиеся иммуноглобулины отделяли от липосомального конъюгата хроматографически на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной 0,1 М ФСБ рН (7,2+0,1).

В лиофилизированном состоянии туберкулёзный липосомальный иммуно-ферментный препарат по чувствительности и специфичности не отличался от туберкулёзного иммуноферментного конъюгата и сохранял все свои свойства в течение 2 лет (срок наблюдения), в 2 раза превышая срок хранения туберкулёзного иммуноферментного диагностикума.

Нами осуществлена разработка биотехнологии изготовления латексных (полиакролеиновых) диагностикумов для выявления возбудителя туберкулёза. Латексы выбраны в качестве носителей, так как их химические свойства относительно постоянны и поддаются точной характеристике. Наличие альдегидных групп на их поверхности позволяет легко образовывать ковалентную связь с аминогруппами белков. Таким образом, проанализировав литературные данные и проведя экспериментальные исследования, направленные на повышение технологичности производства латексных диагностикумов, нами были отработаны оптимальные условия их изготовления. Для сенсибилизации использовали иммуноглобулины класса М из адсорбированных туберкулёзных сывороток при их оптимальной нагрузке -400 мкг/мл (при увеличении количества иммобилизованного лиганда отсутствовал отрицательный контроль, а при уменьшении - снижалась чувствительность диагностикума). Время сенсибилизации составило 6 ч при температуре - 50 0С и рН среды - (7,2+0,1). При уменьшении времени сенсибилизации, температуры и рН среды до 5 снижалась чувствительность препарата, при увеличении рН до 9,0 - отсутствовал отрицательный контроль.

Чувствительность разработанных диагностикумов в РАЛ с возбудителем туберкулёза составила 3,9х105-7,8х105 м.к./мл при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами.

С целью получения диагностикума, обнаруживающего возбудитель ту-беркулёза в течение нескольких минут, была использована алюмосиликатная кремнезёмная матрица с пористой структурой, обладающая высокой сорбцион-ной активностью. Твёрдофазный краситель окрашивали аурамином в весовом соотношении 2:1 и активировали вторичным алкилсульфатом натрия. Были подобраны оптимальные параметры биотехнологии подготовки твёрдофазного носителя и иммобилизации на него туберкулёзных иммуноглобулинов класса М, выделенных из адсорбированной сыворотки. Оптимальными параметрами при этом были следующие: концентрация белка иммуноглобулинов -1,5 мг/мл, время иммобилизации - 2 ч при температуре (26+4) 0С.

При исследовании влияния кислотности буферного раствора во время сенсибилизации, установлено, что при увеличении кислотности снижается процент связывания сенситина. Увеличение рН реакционного раствора до 10 приводит к ложноположительной агглютинации. Оптимальный рН при сенсибилизации матрицы и постановки РСА - 7,0.

Данный диагностикум в РСА на стекле, взаимодействуя с туберкулёзным антигеном, формировал крупнозернистые хлопья с просветлением жидкости. С гетерологичными штаммами бактерий агглютинации диагностикума не наблюдалось.

Чувствительность сконструированных диагностикумов суспензионных иммуноглобулиновых туберкулёзных в РСА на стекле составила 7,8 х 105 -1,56х106 м.к./мл, что соответствует чувствительности диагностикумов латекс-ных иммуноглобулиновых в реакции агглютинации латекса (РАЛ). При этом предварительный учет РСА на стекле возможен через 1-3 мин, а окончательный результат РАЛ (макрометод)- 16- 18 ч. Таким образом, преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции и быстроте получения результатов.

Основные требования, предъявляемые к современным методам экспресс-анализа, заключаются в выявлении низких концентраций патогенного агента в максимально короткие сроки с высокой специфичностью. В последнее время для этих целей нашли применение магноиммуносорбенты, благодаря которым упрощаются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительности диагностических препаратов и наличия возможности автоматизации учёта реакций.

Цель наших исследований - конструирование тест-системы диагностической магноиммуносорбентной туберкулёзной для иммуноферментного анализа.

Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность в иммобилизованном состоянии, обладать минимальной неспецифической адсорбцией и быть удобной при разделении фаз.

Нами разработана биотехнология изготовления органокремнезёмного магносорбента на основе алюмосиликата и окиси железа (III). Модифицирование его поверхности осуществляли в присутствии полимера - декстрана и поверхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия.

На основе проведенных исследований рекомендованы следующие опти-мальные условия получения алюмосиликатных магносорбентов: весовые соотношение компонентов синтеза окиси железа, декстрана, алюмосиликата 2:2:1, время гелеобразования 2 ч (при увеличении времени удлиняется процесс синтеза магносорбента, уменьшается размер его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда в порах сорбента), значение рН гелеобразования - 7,0.

Далее проводили иммобилизацию специфических туберкулёзных иммуноглобулинов G на МС (данные препараты без потери специфической активности хранятся в течение 3 лет (срок наблюдения). В качестве сшивающего агента нами использовано поверхностно-активное вещество - вторичный алкилсульфат натрия, при этом прочность связи антител с магносорбентом повышается за счёт создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсуль-фата натрия.

Исследования показали, что концентрация белка иммуноглобулинов 2,5 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси. При увеличении концентрации белка адсорбционная емкость МИС снижалась.

Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации 2 часа при значении рН раствора иммуноглобулинов 6-7 и температуры (22 + 4) 0С и (37 + 1) 0С.

Методы получения МИС просты и технологичны, исключают применение токсичных веществ, диагностикумы изготовлены из отечественных экологически чистых компонентов. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической, микробиологической устойчивостью и сохраняют специфическую активность в течение 3 лет (срок наблюдения).

МИС сохраняли способность концентрировать на своей поверхности бактериальные клетки возбудителя туберкулёза, которые затем выявляли с помощью ИФА.

В опытах на чистых культурах возбудителя туберкулёза получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 0,5х10 - 1х10 м.к. и выше. При этом данное количество микробных тел могло присутствовать в 1 или 500 мл исследуемых проб. Если объём этих проб был большим (500 мл), то данную пробу пропускали через МИС, удерживаемый в специальной ловушке магнитным полем, что обеспечивало концентрацию МТБ на МИС. В дальнейшем сорбент обрабатывали туберкулёзным иммуноферментным конъюгатом, отмывали от несвязавшихся компонентов реакции, вносили субстрат-индикаторный раствор, по изменению цвета которого проводили учёт реакции.

Результаты проведённых исследований показали, что чувствительность ИФА одинакова при исследуемых температурных режимах - (22+4) 0С и (37±1) 0С. Другим важным параметром являлся временной режим. Установлено, что равновесный процесс между туберкулёзным антигеном и МИС наступал через 30 мин, а между образовавшимся комплексом и конъюгатом - через 15 мин. Важным являлось количество отмывок МИС после контакта с конъюга-том. При отмывке МИС меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т. е. наблюдались фоновые значения оптической плотности в отрицательном контроле.

Разработанная диагностическая система отличалась высокой специфич-ностью, не давая положительных реакций с гетерологичными микроорганизмами с концентрацией 1 х102-1 х106 м.к. в исследуемой пробе.

Для сравнения полученного диагностикума с традиционным методом постановки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные туберкулёзными иммуноглобулинами в течение 18 ч, далее проводили анализ в соответствии с традиционной методикой. Чувствительность ИФА в данном случае составила 5х104 - 1х10 5 м.к./мл. При этом время постановки ИФА с применением МИС - 1-1,5 ч, а традиционным методом, учитывая 18 ч сенсибилизацию планшет, около 20 ч. Если объём исследуемых проб при использовании стандартных плашек не превышает 0,2 мл, то при использовании МИС он не ограничен.

В качестве иммунопероксидазного конъюгата для выявления МТБ использовали также его липосомальную форму. Данный диагностикум обнаруживал фиксированные на МИС за счёт специфической реакции «антиген-антитело» МТБ в количестве 1х10 м.к. в пробе при отсутствии реакций с гете-рологичными штаммами бактерий.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадала необходимость в полистироловых планшетах, сокращалось время сенсибилизации твёрдой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твёрдой фазы; время проведения непосредственно анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

Учитывая, что липосомальный туберкулёзный иммуноферментный диаг-ностикум при использовании в качестве твёрдой фазы МИС позволял в ИФА обнаруживать МТБ в гораздо меньшем количестве, чем при постановке традиционной реакции в полистироловых микропланшетах, т. е. обладал большей чувствительностью, нами было получено 5 серий этих диагностических систем. В полученный набор входят: лиофильно высушенный липосомально-иммуноперооксидазный конъюгат-0,1 мл -1 ампула; обеззараженная взвесь туберкулёзного микроба 1х109 (положительный контроль)- 0,5 мл-1 ампула; туберкулёзный МИС (10 % взвесь)-по 2мл-2 ампулы и все необходимые ингредиенты для постановки ИФА (ФСБ, БСА, твин-20, стоп-реагент -по 1 флакону, хромоген-ортофенилендиамин-2 флакона и таблетка гидроперита).

Таким образом, нами разработана технология изготовления туберкулёзных магноиммуносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы диагностические тест - системы для проведения сочетанного метода детекции микроорганизмов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постановки ИФА с МИС. Установлено, что туберкулёзные магноиммуносорбенты в жидком виде стабильны без потери физико-химических и иммунологических свойств в течение 3 лет (срок наблюдения). ИФА с применением МИС обладает высокой чувствительностью (1 х102 м.к. в пробе), быстротой постановки реакции (1-1,5 ч), что подтверждено многочисленными испытаниями. При этом отпадает необходимость использования сенсибилизированных микропланшет. При использовании разработанной липосомально-иммунопроксидазной тест-системы повышается срок годности препарата в 2 раза.

На основе полученных экспериментальных данных разработаны методические рекомендации «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», одобренные Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05) и утвержденные директором института. Составлены нормативные документы: регламент производства и инструкция по применению на тест-систему диагностическую липосомально- иммуноперооксидазную для выявления антигена возбудителя туберкулёза иммуноферментным методом, рассмотренные на Учёном Совете СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05 г) и утвержденные директором института.

В последние годы при выявлении микобактерий туберкулёза широко применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения микобактерий, простота флуорохромирования делает его доступным для практических лабораторий. Люминесцентная микроскопия с применением аурамина позволяет увеличить процент находок на 8 % по сравнению с методом флотации и на 17 % по сравнению с прямой бактериоскопией мазка (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люминесцентными красителями, в частности аурамином, основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ РФ № 558, 1978).

Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Циля-Нильсена (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001).

При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что может привести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранжевого цвета. Микроскопические исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) микобактериозов. На основе этих методов можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003).