Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза

На наш взгляд, оптимальным значением времени гелеобразования при синтезе сорбентов является 1-2 часа, так как при увеличении времени синтеза магносорбента уменьшается радиус его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда при ковалентном связывании в порах сорбента, стерическим препятствиям образования специфического комплекса антиген-антитело.

На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза Fe2O3, декстран, алюмосиликат 2:2:1, время гелеобразования 2 - час при рН - 7,0.

На рисунке 3 представлена фотография микроструктуры алюмосили-катного магносорбента, из которой следует, что у образца магносорбента наблюдается ярко выраженная губчатая структура.

Исследование удельной поверхности по методу А.А.Клячко-Гурвича (1961) показало, что введение магнитного порошка (Fe2O3) в структуру кремнеземного сорбента изменяет его структурные характеристики: удельная поверхность в данном случае достигает 18 м /г, объем пор 1,19 см /г, радиус пор 132,2 нм, тогда как сорбент, не содержащий в своём составе Fe2O3, имеет удельную поверхность - 58 м /г, объем пор- 1,70 см /г, радиус пор - 42,5 нм.

Концентрация альдегидных групп активированных сорбентов состави-ла 0,57 мг-экв/г. Достоверность и воспроизводимость аналитического метода определения альдегидных групп представлена в таблице 3.

Далее проводили иммобилизацию гетерологичных водорастворимых антигенов (Brucella abortus 19, Nocardia brasiliensis, M. intracellulare, M. Kansasii Yoss) на сорбенты, для чего исследовали ряд параметров: концентрацию белка в антигенах, время и температуру инкубации, влияние рН на иммобилизацию лигандов.

Иммобилизацию лигандов на поверхности магносорбента проводили следующим образом: к 0,4 мл 10 % взвеси МС приливали 1 мл водорастворимых антигенов, варьируя количеством белка от 0,5 до 10 мг/мл, инкубацию проводили в течение 1-24 часов, при температуре 4-5 °С; (22 + 4) °С и (37±1) °С. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель промывали °,9 % раствором хлорида натрия до полного удаления белка, наличие которого в промывной жидкости контролировали спектрофотометрически.

Для иммобилизации использовали различную концентрацию белка водорастворимых антигенов (°,5-1° мг/мл). Исследования показали, что концентрация белка 2,5 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антигенами сорбента, находящегося в 1° % взвеси. При использовании лиганда с концентрацией белка больше 2,5 мг/мл адсорбционная емкость МИС снижалась. Вероятно, зависимость адсорбционной емкости сорбента от количества иммобилизуемого белка объясняется факторами стерического характера (Муромец В.И., Наградова Н.К, 1984).

Изучена кинетика процесса иммобилизации и оценка связывания вы-деленных антигенов с сорбентом. Из полученных данных следует (рис. 5), что 2 ч достаточно, чтобы произошло полное насыщение МС антигенами.

Схема получения иммобилизованных антигенов на МС представлена на рис. 6.

Ковалентное связывание водорастворимых антигенов с твердой матрицей осуществляется через альдегидную группу с образованием азометиновой связи.

При определении зависимости рН раствора водорастворимых антиге-нов на процесс иммобилизации установлено, что изменение рН от 5 до 9,5 не сказывается на специфической активности и чувствительности МИС.

Определена максимальная адсорбционная емкость сорбента, которая наблюдалась при температуре (22 + 4) °С и (37±1) °С.

Таким образом, оптимальными факторами, способствующими получе-нию МИС, являются: время иммобилизации лигандов на сорбенте - 2 часа при значении рН раствора водорастворимых антигенов 6-7 и температуры в интервале 24 - 37 оС.

Методы получения иммуносорбентов просты и технологичны, исклю-чающие применение токсичных веществ. Полученные магноиммуносорбен-ты характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической и микробиологической устойчивостью, не подвержены набуханию, равновесие между антигенами и сорбентом наступает в течение 2 часов. Использование отечественных экологически чистых компонентов, их дешевизна, простота технологии изготовления свидетельствуют о достоинствах алюмосиликатных МИС.

Иммуносорбцию проводили дважды, соединяя 1° мл иммунной туберкулёзной сыворотки с 1 г магноиммуносорбента. Смесь инкубировали при 37 °С в течение 6 часов или при температуре 4 °С - 16 часов на шуттель - аппарате. После инкубации, используя постоянный магнит (при этом отпадает необходимость центрифугирования или фильтрования) для фиксации МИС, сыворотку сливали. Сорбент регенерировали 3 М раствором калия роданистого и отмывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН (7,3 ± 0,1). Такой сорбент после процедур регенерации можно использовать до 10 - 15 раз. Магнитные свойства иммуносорбента позволили осуществлять отделение его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования.

Титр антител и специфичность туберкулёзных сывороток, определяе-мые в НРИФ в мазках гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов, окрашенных иммуноглобулинами флуоресцирующими антикроличьими, представлен в таблице 4.

Из таблицы видно, что до сорбции туберкулёзной сыворотки наблюдалась перекрестная реакция со штаммами B.abortus, М. intracellulare, Nocar-dia brasiliensis, M. Kansasii Yoss при её активности 1:400 в реакции НРИФ. При сорбции иммунной сыворотки использование данного иммунносорбента позволило не только освободить препарат от неспецифических антител на одном этапе, но и сохранить первоначальную специфическую активность нативных сывороток.

Проведённые исследования дают основание утверждать, что применение алюмосиликатных антигенных магноиммуносорбентов позволяет проводить качественную иммуносорбцию. Преимуществами её являлось то, что при сорбции не происходило попадания в сыворотку антигенного материала и в ней отсутствовал комплекс «антиген-антитело», мешающий в дальнейшем созданию специфических диагностических систем.

Такая иммуносорбция приводила к повышению специфичности сывороток. Титры специфических антител не снижались и конечный продукт оставался качественным сырьем для дальнейшей работы.

Таким образом, нами разработана биотехнология получения аффинного сорбента с магнитными свойствами. В качестве матрицы использовали алюмосиликат - химически чистый сорбент, имеющий жёсткий остов, обладающий значительной адсорбционной ёмкостью, микробиологической и химической устойчивостью, механической прочностью. Для придания сорбентам биоспецифических свойств в структуру или на их поверхность иммобилизовали антигены путём ковалентной сшивки, т.е. образования химической связи при участии неспаренных электронов, принадлежащим обоим партнёрам по реакции (наиболее прочная связь). Для её осуществления нами использован перхлорат натрия. В результате варьирования соотношением компонентов синтеза, отработки всех параметров: рН, температуры, времени, способов иммобилизации лигандов получены магноиммуносорбенты, пористая структура которых наиболее эффективна для образования иммуно-химического комплекса «антиген -антитело». Наличие магнитного материала обеспечивает упрощение, ускорение манипуляций с сорбентами. Данные сорбенты отличаются простотой технологии изготовления, экологической чистотой, доступностью сырья и низкой стоимостью.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЁЗА

4.1 ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНОГО КОНЪЮГАТА

Иммуноферментный анализ является наиболее перспективным при иммунодиагностике возбудителя туберкулёза у человека и животных. Однако внедрение его в широкую практику сдерживается значительным количеством ложноположительных результатов, обусловленных атипичными сапрофитными микобактериями и низкой чувствительностью при использовании туберкулиновых антигенов (Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В., 1993).

Нами проведены исследования по получению высококачественных иммунопероксидазных конъюгатов для выявления микобактерий туберкулёза.

Для конструирования иммуноферментных диагностикумов использо-ваны водорастворимые антигены микобактерий туберкулёза и гипериммунные сыворотки, полученные на их основе. Так как наблюдались перекрёстные реакции туберкулёзных сывороток с нетуберкулёзными микобактериями и сапрофитами, проведена их сорбция по технологии, представленной в главе 3. Иммуноглобулины из гипериммунных сывороток выделяли с помощью каприловой кислоты (Steibuch G., Andran R., 1969).

Для ковалентного связывания фермента - пероксидазы хрена («Сиг-ма» США) с иммуноглобулинами выбран метод перйодатного окисления (Nakane P.K., Kawaoi A., 1974). Конъюгацию пероксидазы хрена с иммуноглобулинами осуществляли в два этапа: сначала получали активированное производное пероксидазы, содержащее альдегидные группы, далее проводили диализ. На втором этапе альдегидная группа пероксидазы, взаимодействуя с аминогруппой антител, образовывала конъюгат, формируя азометиновую связь.

Краткое изложение биотехнологии получения конъюгата выглядит следующим образом: пероксидазу в количестве 5 мг растворяли в 1 мл 0,3 М раствора натрия углекислого. Добавляли 0,025 мл 0,32 % раствора формалина, перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 минут, затем вносили 1 мл 0,04 М раствора перйодата натрия и перемешивали. По истечении времени инкубации добавляли 1 мл 0,16 М раствора этиленгликоля и перемешивали 1 час. Все перечисленные операции проводили при температуре (22+4) 0С. Затем раствор диализовали против 0,01 М КББ раствора рH 9,5 при 4 0С в течение 18 часов. Раствор переносили во флакон, добавляли 1 мл туберкулёзных иммуноглобулинов с концентрацией от 2,5 до 10 мг/мл, перемешивали 2 часа при температуре (22+4) 0С и вносили 5 мг боргидрида натрия, оставляя без перемешивания на 2 часа при 4 0С. Раствор диализо-вали против 0,1 М ФСБ рН 7,2 в течение 18 часов при 4 0С.

Очистку конъюгата от несвязавшегося фермента осуществляли мето-дом гель-фильтрации с использованием сефадекса G-100 на установке LKB-2137 (Швеция). В качестве элюата применяли 0,1 М ФСБ рН 7,2-7,4. Фракции собирали в объеме 3,0 мл и исследовали светопоглощение каждой из них при длинах волн 280 нм и 403 нм. Фракции, имеющие Rz (соотношение экс-тинций при длинах волн 403 и 280 нм - области максимального поглощения пероксидазы хрена и белка), равное 0,4 - 0,6, объединяли. Во фракции добавляли бычий сывороточный альбумин из расчета 10 мг на 1 мл. Фракции разливали в ампулы по 0,1 мл и лиофилизировали. В результате контроля активности установлено, что для иммобилизации достаточной является концентрация белка 5 мг/мл, так как при использовании 10 мг/мл показатель соотношения экстинции пероксидазы хрена и белка, а также активность препарата оставались на том же уровне при большем расходе белка (таблица 5).

Конъюгат лиофилизировали на лиофильной установке LZ-9C. Препа-рат был стабилен без потери активности в течение 1 года и соответствовал всем необходимым медико-биологическим требованиям.

Примечание: Rz - показатель соотношения экстинции при спектрофотомет-рии пероксидазы хрена при длине волны 403 нм и белка при 280 нм.

Полученные конъюгаты исследовали на активность, специфичность и чувствительность. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M.Clark и A.Adams (1977) в "сэндвич"-варианте ИФА, оптимизируя некоторые параметры. В работе использовали полистироловые планшеты для иммунологических реакций Красноярского завода.

Планшеты сенсибилизировали туберкулёзными иммуноглобулинами в концентрации 100 мкг/мл в объеме 0,1 мл КББ рН 9,5, инкубировали 3 часа при температуре 37 0C. Несорбированные иммуноглобулины удаляли, в лунки вносили по 0,1 мл туберкулёзного водорастворимого антигена с концентрацией белка 0,1 мг/мл, инкубировали 1 час при температуре 37 0С.

Несвязавшиеся антигены удаляли, планшеты промывали 5-кратно по 34 мин 0,05 % раствором твин-20 в ФСБ и просушивали. Затем вносили по 0,1 мл разведенного пероксидазного конъюгата от 1:100 до 1:800, инкубировали 1 час при температуре 37 0С. После промывки добавляли по 0,1 мл свежеприготовленного субстрат-индикаторного раствора (0,1 М раствор лимонной кислоты с 0,2 М раствором натрия фосфорнокислого однозамещенного рН 5,0 в присутствии 0,006 % перекиси водорода и ортофенилендиамина в концентрации 0,4 мг/л) и инкубировали 10 мин при температуре

(22 +4) 0С без доступа света. Для остановки реакции использовали 2 М раствор серной кислоты. Результаты реакции учитывали визуально и на фотометре ПЭО ФЭК при длине волны 492 нм путем определения оптической плотности (ОП) проб, находящихся в лунках планшета. Результаты считали положительными, если ОП исследуемого образца в 2 и более раз превосходила среднее значение ОП отрицательных контролей.

Рабочий титр разработанных нами иммунопероксидазных туберкулёзных конъюгатов всех изготовленных серий составил 1:400-1:800 с соответствующими штаммами. Чувствительность конъюгатов по водорастворимым антигенам - 50 - 100 нг/мл.

Все серии полученных конъюгатов для ИФА дали отрицательные ре-зультаты с гетерологичными штаммами (таблица 6), что свидетельствовало об их специфичности.

Кроме того, для оценки чувствительности и специфичности конъюга-тов в качестве тест-объектов использовали взвеси клеток туберкулёзных штаммов. За рабочее разведение конъюгата принимали такое максимальное разведение последнего, при котором в ИФА выявлялось минимальное количество клеток возбудителя при отсутствии окрашивания контроля. Чувствительность иммунопероксидазных конъюгатов по корпускулярным антигенам составила 5х104 - 1х105 м. к./мл (таблица 6).

Лабораторные испытания экспериментальных серий иммунопероксидазных конъюгатов показали, что они отвечают ОМБТ, предъявляемым к таким препаратам (таблица 7).

На основе полученных препаратов были сконструированы тестсистемы для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, состоящие из 1 ампулы иммуноферментного конъюгата, 1 ампулы положительного контроля (взвесь туберкулёзного микроба)- 10 9 м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобулинов туберкулёзных и необходимых ингредиентов для постановки ИФА (ФСБ, твин-20, БСА, 2 М раствора серной кислоты, ортофенилендиамина, таблетки гидроперита (перекись водорода).

На первом этапе конструирования иммуноферментного конъюгата провели подбор оптимальных условий получения препарата, в качестве ли-ганда используя иммуноглобулины туберкулёзные, полученные из адсорбированной сыворотки. Второй этап работы - оптимизация постановки анализа. Третий этап - конструирование тест-систем для экспресс-диагностики.

Одной ампулы с препаратом в объеме 0,1 мл с активностью-1:600 достаточно для проведения 300 иммуноферментных анализов с дубликатом.

Таким образом, в результате проведённых исследований получены высокоактивные (до 1:800), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с гетерологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты, позволяющие выявлять МТБ от 5х10 4 - 1х10 5 м. к./мл.

4.2 ПОЛУЧЕНИЕ ЛИПОСОМ И ЛИПОСОМАЛЬНО-ИММУНОПЕРОКСИДАЗНОГО КОНЪ-ЮГАТА

Липосомы получали из фосфолипидов и ганглиозидов, выделенных из мозга к.р.с., а в последнее время из мозга свиньи (ТУ 9154-00-018970802004), не являющегося потенциально опасным при губчатой энцефалопатии животных (коровье бешенство). Разработанная биотехнология выделения сырья для приготовления липосом включала следующие этапы:

1. Головной мозг животного в количестве 1000 г гомогенизировали в 4000 мл охлаждённого до минус 20 0С ацетона, периодически перемешивая в течение 12 ч. Суспензию фильтровали на воронке Бюхнера, осадок вновь суспендировали в 2000 мл охлаждённого ацетона в течение 4 часов и повторно фильтровали на воронке Бюхнера.

2. Для извлечения фосфолипидов и ганглиозидов полученный осадок экстрагировали 2000 мл смеси хлороформ - этанол (1:1) при встряхивании на шуттеле в течение 1 ч при температуре 20 0С. На этом этапе мы использовали указанную экстрагирующую смесь в отличие от традиционной, высокотоксичной смеси, включающей хлороформ и метанол.

Если традиционный метод выделения фосфолипидов требует удаления экстрагирующего раствора на роторном испарителе, то нами фосфолипиды осаждались из него при добавлении 1,5-2 объёмов охлаждённого (-20 0С) ацетона. При этом осаждался и холестерин, необходимый для стабилизации липосом в процессе их приготовления. Данный способ выделения фосфоли-пидов защищён патентом РФ № 2192265 от 10.10.2002.

3. Осадок фосфолипидов, собранный при фильтровании, высушивали при комнатной температуре до постоянного веса. Выход препарата составил 1,4 % от массы исходного сырья. В дальнейшем препарат растворяли в хлороформе (50 мг/мл) и хранили в сосуде с притёртой пробкой в темноте под подушкой инертного газа (азота) при температуре 4 0С.

Для предотвращения перекисного окисления липидов в процессе приготовления липосом в их хлороформный раствор вносили 0,05 % атокоферола.

4. При внесении в надосадочную жидкость, образующуюся после изоляции из органической смеси фосфолипидов, дополнительно охлаждённого ацетона до 5 объёмного соотношения, в осадок выпадала фракция ганглиозидов, также используемая нами при конструировании липосом. Способ получения ганглиозидов защищён патентом РФ № 2195296 от 27.12.2002.

Высушенный осадок ганглиозидов растворяли в хлороформе (50 мг/мл) и хранили в условиях, аналогичных хранению фосфолипидов. Разработанная биотехнология выделения фосфолипидов и ганглиозидов представлена на рис. 7.

Хроматографическое изучение полученного препарата фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол» в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4) с использованием в качестве свидетелей тест-наборов стандартов фосфолипидов и холестерина показало наличие в нём преимущественно фосфотидилхлолина, фосфотидилсерина, фосфотидилинозита и холестерина, которые выявлялись при прокрашивании парами йода (Кейтс М., 1975).

Липосомы получали методом «выпаривания в обращённой фазе» согласно методическим рекомендациям «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом» (2000 г.), используя в качестве сырья для их приготовления хлороформные растворы фосфолипидов и ганглиозидов в соотношении 20:1.

С этой целью в хлороформную смесь указанных липидов дополнительно вносили хлороформ до достижения липидной концентрации 30 мг/мл. К 3 мл этого раствора добавляли 1 мл водной фазы в виде 0,01 М ФСБ рН 7,2, содержащего 0,01 % хлористого кальция. Для исключения негативного влияния ультразвука на липиды, которые при этом интенсивно окисляются, полученную смесь перемешивали в течение 10-12 мин на скоростной мешалке до образования стойкой эмульсии типа «вода в масле». Затем эмульсию упаривали в вакууме на роторном испарителе при температуре нагревающей жидкости 45 0С, не допуская кипения и вспенивания смеси, до полного удаления органической фазы. В дальнейшем колбу снимали с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М ФСБ рН 7,2 и интенсивно встряхивали в присутствии стеклянных бус до образования гомогенной структуры ли-посом. Контроль образования и размеров липосом осуществляли с помощью электронного микроскопа при инструментальном увеличении х 5000-50000. Для этого на сетку-подложку, покрытой формваровой плёнкой, с помощью бактериологической петли наносили взвесь полученных липосом, предварительно разводя их 0,01 М ФСБ рН 7,2 до получения суспензии, хорошо просматривающейся при электронной микроскопии. После нанесения взвеси на сетку избыток удаляли фильтровальной бумагой. Липосомы, находящиеся на сетке, контрастировали 1 % водным раствором уранилацетата, который наносили бактериологической петлёй.

В результате изучения полученных препаратов на электронном микроскопе были обнаружены липосомы со средним размером 150-300 нм, который рассчитывали по формуле: D = (X n * DV / X n ) * К , где D - средний диаметр липосом в препарате (мкм); DV - средний размер липосом в каждой группе (мкм); n - число липосом в каждой группе; К - коэффициент увеличения, включая инструментальное увеличение микрофотографий.

Полученные липосомы были использованы в качестве «твёрдой» фазы при получении иммуноферментного препарата для диагностики МТБ. Ковалентно фиксируясь на поверхности мембраны липосом, фермент и иммуноглобулин резко снижают способность к конформационным изменениям структуры своих молекул под воздействием повышенной температуры, изменениях рН среды и т.д. Всё это способствует повышению стабильности и увеличению срока годности диагностической системы.

Для получения диагностикума мы предварительно активировали пе-роксидазу хрена. С этой целью (5 ±0,1) мг пероксидазы хрена растворяли в 1 мл раствора натрия углекислого кислого в концентрации 0,3 моль/л, добавляли 0,025 мл 0,32 % раствора формалина. Смесь перемешивали на мешалке в течение (30±5) мин при температуре (22 ±4) 0С и добавляли 1 мл раствора перйодата натрия в концентрации 0,04 моль/л, продолжая перемешивать в течение (30±5) мин при температуре (22 ±4) 0С. Далее вносили 1,0 мл раствора этиленгликоля в концентрации 0,16 моль/л (для снижения поверхностного натяжения), осторожно перемешивая в течение (60±5) мин при температуре (22 ±4)0С. В конце процедуры препарат активированной пероксидазы должен быть жидким, прозрачным, без запаха, зеленовато-коричневой окраски. Активированную пероксидазу переносили в диализный мешок и диализовали против 1 л 0,01 М КББ рН (9,55 ±0,05), в течение (19±1) ч на мешалке при температуре 2-8 0С в холодильной камере. Данная процедура приводила к образованию альдегидных групп в углеводной части фермента пероксидазы.

В дальнейшем на наружной мембране липосом последовательно фик-сировали пероксидазу хрена и туберкулёзные иммуноглобулины класса G. С этой целью к 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ рН 9,5, содержащей 18 мг липидов.*

* Работа выполнялась совместно со с.н.с. СтавНИПЧИ Зайцевым А.А. , гл.спец. Диковой С.П. и гл.спец. Головченко Т.В.

Суспензию подвергали в течение 1 мин ультразвуковой обработке, обеспечивающей эффективный контакт поверхности липидной мембраны липосом с ферментом, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре 1 ч. Ковалентное связывание липосом с ферментом осуществлялось за счёт части активированных групп пероксидазы и аминогрупп, присутствующих в молекулах ганглиозидов, встроенных в мембрану липосом при их приготовлении.

Несвязавшуюся пероксидазу удаляли хроматографически, используя колонку 100х12 мм с сефадексом G-100, уравновешенную 0,01 М КББ рН 9,5. В первом пике экстрагировались активированные ферментом липосомы, во втором - несвязавшийся фермент. Фракции первого пика объединяли и к ним добавляли туберкулёзные иммуноглобулины Ig G в количестве от 2,5 до 10 мг/мл. Фиксацию иммуноглобулинов на поверхности липосом с иммобили-зированной пероксидазой хрена проводили при температуре (22+4) 0С, помешивая на шуттеле в течение 1-24 ч и стабилизировали 5 мг боргидрида в холодильнике при температуре (4-6) 0С. При этом иммуноглобулины за счёт свободных аминогрупп связывались с оставшимися свободными альдегидными группами углеводной части пероксидазы. Для очистки конъюгата от несвязавшихся иммуноглобулинов использовали гель-хроматографию. Коньюгат наносили на колонку 100х12 мм с сефадексом G-100, уравнове-шенную ФСБ в концентрации 0,1 моль/л, рН (7,2+0,1). В результате происходило фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. Поэтому в первом пике (свободном объёме колонки) выходил конъюгат, далее несвязавшиеся иммуноглобулины. Элюцию проводили тем же буферным раствором, фракции собирали по 2,0 мл и исследовали поглощение каждой фракции визуально по мутности раствора и на спектрофотометре при двух длинах волн - 280 и 403 нм. Фракции, имеющие отношение А403/А280, равное 0,4-0,5, объединяли и к готовому препарату добавляли до 1 % БСА.

Установлено, что наиболее высокочувствительный липосомальный иммуноферментный диагностикум был получен при концентрации белка иммуноглобулинов 5 мг/мл и времени их инкубации с липосомальным ферментным конъюгатом 2 ч (рис.8).

Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, замораживали и лиофилизировали в течение (18 ±2) ч до конечной температуры 25 °С. В готовом препарате контролировали физико-химические (растворимость, цветность, прозрачность, потерю в массе при высушивании) и иммунологические свойства (активность, специфичность, чувствительность) после лиофилизации и в процессе хранения в течение 2 лет (срок наблюдения). Чувствительность и специфичность конъюгата определяли в ИФА аналогично способу, описанному выше, с гомологичными и гетерологичными штаммами.

Биотехнологическая схема получения липосомального иммунофер-ментного диагностикума представлена на рисунке 9.

В таблице 8 представлены результаты анализов физико-химических свойств и чувствительности препарата. Разработанные препараты удовлетворяют требованиям нормативных документов, а их стабильность превосходила традиционные иммуноферментные конъюгаты.

Таким образом, в результате проведённых исследований разработана биотехнология изготовления иммобилизованного ферментного препарата, значительно увеличивающая его стабильность.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Первым зам. министра здравоохранения РФ, Главным Государственным санитарным врачом России Г.Г. Онищенко 06.04.2000 г.

На Федеральном уровне утвержден нормативный документ (НД): технические условия (ТУ) 9154-00-01897080-2004 на фосфолипиды для получения липосом. Утверждены зам. Главного Государственного санитарного врача РФ Е.Н. Беляевым (Письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г).

На учрежденческом уровне утвержден регламент на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 2°.°4.°4).

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ТУБЕРКУЛЁЗНЫХ СУСПЕНЗИОННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ

5.1 БИОТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) известна давно. Данная реакция по своему механизму аналогична реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), но химические свойства латексных микроносителей относительно постоянны и поддаются более легкой и точной характеристике по сравнению с поверхностными структурами наружной мембраны эритроцитов, которые широко варьируют в зависимости от многих условий, таких как пол, возраст, гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови, источника выделения и методов предварительной обработки. Поэтому латексные микроносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению с эритроцитами и могут с успехом их дополнять или заменять в методах им-муноанализа. Преимущество латексных (полиакролеиновых) систем перед другими микросферами обеспечивается наличием альдегидных групп на поверхности латексных частиц, легко образующих ковалентную связь с аминогруппами белков.

При выполнении настоящего раздела работы перед нами стояли следующие задачи: оптимизировать условия иммобилизации лигандов на синтетический носитель (использовав иммуноглобулины из адсорбированных туберкулёзных сывороток, подобрав количественные, температурные, временные параметры и рН при сенсибилизации); разработать условия стабилизации, подобрать рН и разводящую жидкость, необходимую при постановке реакции агглютинации латекса (РАЛ).

Для приготовления иммуноглобулиновых диагностикумов использовали агглютинирующие туберкулёзные кроличьи сыворотки, адсорбировали их иммобилизованными на магноиммуносорбентах гетерологичными водорастворимыми антигенами, как описано ранее, и фракционировали иммуноглобулины каприловым методом.

Латексную основу - акролар К (ТУ 6-69-10-1824-88) получали из института биоорганической химии им. Шемякина. Латекс окрашен в малиновый цвет, со средним диаметром частиц (1,2±0,1) мкм. Для сенсибилизации матрицы использовали иммуноглобулины туберкулёзные с концентрацией белка от 100 до 1000 мкг/мл. Лиганд соединяли с 2 мл 2% полимерного носителя. К этим смесям добавляли 2 мл забуференного физиологического раствора рН (7,2±0,1). Сенсибилизацию проводили в течение 1, 3, 6, 9, 12 часов при температуре (24±4) 0С, 37 0С и 50 0С на магнитной мешалке *.

Далее суспензию осаждали центрифугированием при 5 000 g в течение 4-5 минут и дважды отмывали от несвязавшегося лиганда забуферен-ным физиологическим раствором рН (7,2±0,1). Осадок суспендировали в белковом стабилизаторе (растворённом 1:50) до концентрации 0,2 % с 0,1 % формалина. Оптимальная нагрузка иммуноглобулинов составляла 400 мкг/мл (при увеличении нагрузки белка отсутствовал отрицательный контроль, при уменьшении - снижалась чувствительность), время сенсибилизации 6 ч, температура - 50 0С (рис. 10).

Диагностическую ценность препаратов оценивали в реакции агглютинации латекса (РАЛ) в U- образных микропланшетах. В качестве разводящей жидкости использовали белковый стабилизатор (состоящий из 1 части белка куриного яйца, 4 частей раствора натрия двууглекислого, нейтрализованного 1 Н раствором соляной кислоты) с твин-80. Перед употреблением белковый стабилизатор разводили в 50 раз на 0,9 % растворе хлорида натрия, рН (7,2±0,1) и смешивали с твин-80 до конечного разведения последнего 1:80 000. Подбор концентрации детергента (твин -80) очень важен, так как при его увеличении чувствительность диагностикума снижалась, а при уменьшении концентрации твин- 80 отсутствовал отрицательный контроль. На постановку реакции влияние оказывал рН разводящей жидкости. При уменьшении рН до 5,0 уменьшалась активность препаратов, при увеличении рН до 9,0 отсутствовал отрицательный контроль.

Постановку РАЛ микрометодом проводили следующим образом: в 8 рядов полистироловой пластины дозаторами вносили по 0,05 мл разводящей жидкости. Дозатором или иглой микротитратора, имеющей головку объемом 0,05 мл, в первые лунки 7 рядов добавляли исследуемый материал, а в первую лунку 8 ряда - взвесь микробных клеток в концентрации 5х10 м.к./мл. Делали последовательные двукратные разведения переносом по 0,05 мл из одной лунки в другую по 7-ю лунку включительно. Из последних лунок по 0,05 мл удаляли. 8-е лунки использовали для контроля диагностикума. Затем во все лунки добавляли по 0,025 мл диагностикума полиакролеинового (латексного) иммуноглобулинового 0,2 % концентрации. Содержимое пластины осторожно встряхивали до получения гомогенной суспензии и оставляли при комнатной температуре на (2,5+ 0,5) ч.

Учет результатов (по феноменам "зонтик", "пуговка") предварительно учитывали через (2,5 + 0,5) ч, а окончательно - через 16 - 18 ч. Результат РАЛ считали положительным, когда полиакролеиновые микросферы выпадали на дно лунок равномерным слоем в виде «зонтика», занимая не менее 2/3 диаметра сферической поверхности дна лунки. При отрицательном результате полиакролеиновые микросферы выпадали на дно лунки в виде "пуговки" или узкого колечка с ровным краем. В контрольных лунках результат должен быть отрицательным.

При контроле чувствительности диагностикумов иммуноглобулиновых в планшетах использовали взвеси микобактерий туберкулёза в концентрациях от 5х10 до 1,95х10 м.к./мл. В результате постановки реакции уста-новлено, что чувствительность разработанных диагностикумов составила 3,9х105 - 7,8х105 м.к./мл. При изучении специфичности в РАЛ на гете-рологичных штаммах (в концентрации 1 х10 и ниже) перекрёстных реакций не выявлено.

Проведенные исследования показали, что по чувствительности и специфичности полученные препараты в реакции агглютинации латекса удовлетворяют требованиям нормативных документов.

Изготовлено 5 серий диагностикумов туберкулёзных полиакролеиновых (латексных) иммуноглобулиновых. При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969), в серии опытов титр РАЛ Гравен 5,2 х105 м.к./мл (+14,1 %;-12,3 %).

Таким образом, проанализировав литературные данные и проведя экспериментальные исследования биотехнологии изготовления туберкулёзных латексных иммуноглобулиновых диагностикумов, нами отработаны оптимальные условия, включающие использование иммуноглобулинов для сенсибилизации из адсорбированных туберкулёзных сывороток, нагрузку иммуноглобулинов -400 мкг/мл; время сенсибилизации 6 часов при температуре -50 0С и рН раствора при сенсибилизации и постановке анализа - 7,2±0,1. 5.2. Разработка биотехнологии получения алюмосиликатного диагности-кума

В последние годы медицина обогатилась новыми методами исследований, в которых используются новейшие достижения биотехнологии, одним из которых является разработка и внедрение иммобилизованных биосистем. Приобретение последними биоспецифических качеств достигается путём иммобилизации в структуре или на поверхности матрицы различных лигандов (иммуноглобулинов, бактериальных клеток или их антигенов и т.д.). Адсорбция лигандов на данных системах зависит от химического строения сорбентов и условий иммобилизации, которая, осуществляясь на твёрдых носителях, приводит к значительному повышению термической устойчивости и стабильности лигандов.

Для получения иммуносорбентного препарата для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза изучены условия сенсибилизации матрицы антителами, стабилизации сенсибилизированных суспензий и стандартизации полученных диагностикумов. В работе использовали типичные штаммы возбудителя туберкулёза, из биомассы которых извлекали антигенные комплексы, используя их для получения иммунных сывороток (по схеме Е.Н. Афанасьева, 2000 г.) и постановки реакций как описано ранее.

Первостепенной задачей при разработке иммунносорбентных диагностикумов является выбор матрицы с оптимальными характеристиками по отношению к фиксируемым биомолекулам. Нами выбран алюмосиликат, так как для данного кремнезема характерна высокая реакционная способность поверхностных групп при взаимодействии со многими веществами.

Введение в матрицу красителя обуславливает цветовой эффект, в результате чего повышается наглядность серологического теста. В качестве красителя использовали аурамин.

Следующей задачей был выбор способа активирования матрицы для иммобилизации лиганда и достижения агрегативной устойчивости суспензии. Для данной цели нами использовано поверхностно-активное вещество (ионный детергент)- вторичный алкилсульфат натрия, благодаря которому предотвращается сближение частиц, их агрегирование.

Нами сконструированы иммуносорбентные диагностикумы, представляющие собой активированную вторичным алкилсульфатом натрия матрицу, состоящую из алюмосиликата и аурамина. Лигандом служили иммуноглобулины, выделенные из агглютинирующих иммунных туберкулёзных адсорбированных сывороток. В результате получены иммобилизованные системы, которым присущи положительные свойства неорганических матриц: гидро-фильность, жесткость остова, химическая и микробиологическая устойчивость, отсутствие набухаемости в растворах, значительная адсорбционная емкость, отсутствие токсичности. Нами изучены закономерности иммобилизации антител и условия, при которых они проявляют иммунологическую активность в суспензиях.

Технология приготовления диагностикума состояла в следующем: к 100 мг алюмосиликата добавляли 50 мг аурамина и готовили 2 % суспензию в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ), рН (7,2+0,2). Далее проводили активирование матрицы, добавляя 0,1 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубировали 30, 60, 120, 240 мин при температуре 24 0С, 37 0С, 50 0С. Для иммобилизации использовали иммуноглобулины туберкулёзные в концентрации от 1 до 10 мг/мл, в объёме 5 мл, которые инкубировали от 2 до 18 часов, отмывали от несвязавшихся антител и красителя 0,1 М ФСБ, рН (7,2+ 0,2), центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяли в 0,9 % растворе натрия хлорида с 1 % бычьего сывороточного альбумина до 1 % взвеси диагностикума и добавляли формалин до 1 %. Количественное соотношение красителя и алюмосиликата (1:2) оптимально. При исследовании влияния рН буферного раствора во время иммобилизации, установлено, что при увеличении кислотности снижается процент связывания сенситина. Увеличение рН реакционного раствора до 10 приводит к ложноположительной агглютинации. В результате подбора параметров установлено, что для оптимальной иммобилизации достаточной является концентрация белка 1,5 мг/мл, время иммобилизации - 2 час при температуре (26 + 4) 0С, рН при сенсибилизации матрицы и постановки РСА - 7,0. Зависимость чувствительности препарата от времени и рН представлена на рис.11.

Постановку реакции суспензионной агглютинации (РСА) осуществляли на стекле. В качестве положительного контроля использовали взвесь туберкулёзного микроба в концентрациях: 5х107; 2,5х107; 1,25х107; 6,25х106; 3,125х106; 1,56х106; 7,8х105; 3,9х105 м. к./мл. В качестве отрицательного контроля использовали 0,9 % раствор натрия хлорида.

На предметное стекло с отрицательным контролем наносили 2 капли (0,05 мл) 0,9 % раствора натрия хлорида, рН (6,8+0,2) и 1 каплю (0,025 мл) диагностикума суспензионного туберкулёзного иммуноглобулинового. На предметные стёкла с положительным контролем наносили по 2 капли микробной взвеси и по 1 капле соответствующего диагностикума. Капли тщательно перемешивали и при лёгком покачивании предметного стекла наблюдали в течение 1-5 мин в косопроходящем свете за изменением структуры суспензии. В отрицательном контроле агглютинация отсутствовала (рис. 12а), в то время как на стёклах со взвесями туберкулёзного микроба наблюдалось полное просветление жидкости с крупнозернистыми хлопьями, т. е. чёткая агглютинация (рис. 12б). Чувствительность суспензионных диагностикумов составила 7,8 х 105 -1,56х106 м.к./мл по корпускулярным антигенам, при отсутствии агглютинации с гетерологичными штаммами.

Лиофилизация препаратов осуществлена на лиофильной установке LZ-9С в течение 18 часов, вакууме 10 Па, конечной температуре продукта 25 0С. В результате установлено, что препарат стабилен в течение 1 года (срок наблюдения) без потери специфической активности.

Разработанная биотехнология получения туберкулёзного алюмосили-катного диагностикума обеспечивает получение сорбентов заданного состава, строения и эффективное выявление возбудителя туберкулёза.

Испытано 5 серий туберкулёзного диагностикума в 5 повторностях. Диагностикумы проверены в РСА на стекле с гомо- и гетерологичными штаммами (таблица 9). При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969), в серии опытов титр РСА t равен 0,92х106 м.к./мл (+7,2 %;-6,7 %) .

Чувствительность разработанных диагностикумов соответствует чувствительности диагностикумов латексных иммуноглобулиновых в реакции агглютинации латекса (РАЛ). При этом учет результатов РСА на стекле возможен через 1-3 мин, а окончательный результат РАЛ через 16 - 18ч.

Таким образом, преимущество алюмосиликатного туберкулёзного диагностикума заключается в простоте постановки РСА и быстроте получения результатов.

ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ ИММУНОСОРБЕНТОВ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА

6.1 РАЗРАБОТКА МЕТОДА СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЁЗА НА МАГНОИММУНОСОРБЕНТЕ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Основное требование, предъявляемое к современным методам экспресс-анализа - выявление низких концентраций патогенного агента в максимально короткие сроки с высокой специфичностью. В последнее время актуальным является разработка и применение магносорбентов, благодаря которым упрощаются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительности препаратов и возможности автоматизации учёта реакций.

Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность, обладать минимальной активностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз.

Целью наших исследований было конструирование тест-системы диагностической магноиммуносорбентной (МИС) туберкулёзной для иммунофер-ментного анализа (ИФА)

В работе использовали изготовленные нами (глава 4) иммунопероксидаз-ные конъюгаты туберкулёзные с активностью 1:400-1:800, аффинные туберкулёзные магноиммуносорбенты, полученые по способу И.В. Жарниковой с соавт. (1999), оптимизируя параметры, применительно к данной инфекции.

Нами разработана биотехнология приготовления органокремнезёмного магносорбента на основе окиси железа (III) и алюмосиликата. Модифицирование поверхности осуществляли в присутствии полимера - декстрана и поверхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия.

На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных магносорбентов: весовое соотношение компонентов синтеза окиси железа, декстрана, алюмосиликата 2:2:1; время гелеобразования 2 часа (при увеличении времени удлиняется процесс синтеза магносорбента, уменьшается размер его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда в порах сорбента), значение рН гелеобразования -7,0.

При возрастании количества окиси железа в композиционной смеси происходит увеличение размера радиуса пор сорбента и уменьшение удельной поверхности МС. Декстран оказывает стабилизирующий эффект за счёт образования вокруг частиц геля сольватных оболочек в связи с возникновением комплексов между электронодонорными атомами кислорода молекул органического вещества и силанольными группами кремнеземных корпускул. Алюмосиликат - пористый кремнезёмный носитель обладает активной поверхностью в отношении белков, проявляя механическую, микробиологическую и химическую устойчивость.

Далее проводили иммобилизацию специфических туберкулёзных иммуноглобулинов на МС (данные препараты без потери специфической активности хранятся в течение 3 лет (срок наблюдения). В качестве «сшивающего» агента нами использовано поверхностно-активное вещество (ПАВ)-вторичный алкил-сульфат натрия, при этом прочность связи антител с магносорбентом повышается за счёт создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсульфа-та натрия (рис.13).

Для иммобилизации использовали различную концентрацию белка иммуноглобулинов (0,5-10 мг/мл). Исследования показали, что концентрация белка иммуноглобулинов 2,0 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси. При увеличении концентрации белка адсорбционная емкость МИС снижалась. Вероятно, это объясняется факторами стерического характера.

Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации 2 часа при значении рН раствора иммуноглобулинов (6,0 - 7,0) и температуры в интервалах (22 + 4) оС и (37 + 1) оС.

Методы получения МИС просты и технологичны, исключают применение токсичных веществ, изготовлены из отечественных экологически чистых компонентов. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической и микробиологической устойчивостью.

Сконструированные МИС были использованы при экспресс-диагностике возбудителя туберкулёза.

Эксперименты проводили с чистыми культурами туберкулёзного микроба. Из культур микобактерий готовили взвеси с концентрациями от 1 х101 до 1х109 м.к. в 1мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации микобактерий и по 0,2 мл 10 % суспензии туберкулёзного магноимму-носорбента, инкубировали в течение 30 - 60 мин при комнатной температуре, затем тщательно отмывали забуференным физиологическим раствором, вносили по 200 мкл рабочего разведения пероксидазного коньюгата и инкубировали при температуре (22+4) 0С или (37±1) 0С в течение 15, 30 и 60 мин. Промывали 0,1 М фосфатно -солевым буфером с твин-20 не менее 6 раз, используя по-стоянный магнит, поднося его к стенке флакона, в результате чего МИС оказывались фиксированными магнитным полем. После чего во флаконы вносили по 200 мкл хромогенной смеси. Через 1 - 2 мин (когда надосадочная жидкость слегка желтела в отрицательном контроле) содержимое флаконов переносили в микропланшеты и останавливали реакцию 50 мкл стоп-реагента (2М раствором серной кислоты). Для учета результатов производили измерение оптической плотности на приборе "Мультискан" при длине волны 492 нм. Ответ считали положительным при превышении оптической плотности опытного раствора над контрольным (без контакта с антигеном) в 2 и более раза.

Аналогично проводили иммуноферментный анализ и в модельных опытах на нестерильной воде в объёме 500 мл, контаминированной различными концентрациями туберкулёзных микобактерий. Суспензии пропускали через устройство, удерживающее МИС магнитным полем. МИС после контакта с пробой тщательно промывали, снимали с ловушки, помещали во флакон и проводили ИФА по вышеописанному методу. Отрицательным контролем служили МИС, не контактировавшие с антигеном.

В обоих опытах получены положительные результаты при наличии в объеме пробы (1 мл и 500 мл) 0,5х10-1х10" м. к. и выше.

Результаты проведённых исследований показали, что чувствительность ИФА одинакова при исследуемых температурных режимах - (22+4) 0С и (37±1) 0С. Другим важным параметром являлся временной режим. Установлено, что равновесный процесс между антигеном и МИС наступал через 30 мин, а между образовавшимся комплексом сорбент- антитело - антиген с конъюгатом -через 15 мин. Важным являлось количество отмывок после контакта с конъюга-том, так как при отмывке меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т.е. наблюдались фоновые значения оптической плотности в отрицательном контроле.

Для сравнения полученного диагностикума с традиционным методом постановки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные туберкулёзными иммуноглобулинами в течение 18 ч, после чего проводили анализ в соответствии с методикой M.Clark и A. Adams (1977) в "сэндвич"-варианте ИФА. Чувствительность ИФА в данном случае составила 5х104 - 1х10 5 м.к./мл. При этом время постановки ИФА с применением МИС составило 1-1,5 ч, а традиционным методом, учитывая 18 часовую сенсибилизацию планшет, около 20 ч. Если объём исследуемой пробы при использовании стандартных планшет не превышает 0,2 мл, то при применении МИС он неограничен (в нашем случае он равнялся 500 мл).

Результаты контроля специфической активности и специфичности туберкулёзного МИС представлены в таблице 10. Для контроля специфичности использовали штаммы культур гетерологичных микроорганизмов, из которых готовили взвеси с концентрацией от 1 х106 до 1 х10 2м. к. в пробе.

Разработанная диагностическая система отличалась высокой специфичностью, не давая положительных результатов с гетерологичными микроорганизмами (таблица 10).

При использовании стандартного иммуноферментного метода имеются следующие недостатки, которые отсутствуют в предложенной тест-системе в связи с использованием магнитоуправляемого магносорбента с включёнными антителами: 1) для исследования берётся ограниченный 0,2 мл объём исследуемого материала (т.к. объём лунки - 0,4 мл), в то время как при использовании магноиммуносорбента объём неограничен; 2) время постановки иммунофер-ментного анализа около 20 часов, включая 18-ти часовую сенсибилизацию, а время проведения анализа с магноиммуносорбентами - 1-1,5 ч, 3) чувствительность иммуноферментного метода 5х104 - 1х10 5 м. к./мл по корпускулярному антигену, а чувствительность представленной тест-системы составляет 1x10 м. к./мл.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадала необходимость в полистироловых планшетах, становилось возможным проведение анализа проб неограниченного объёма, сокращалось время сенсибилизации твёрдой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок её хранения. Время проведения непосредственно анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

Нами проведены исследования по определению активности иммуногло-булиновых МИС жидких в ИФА в процессе их хранения. При закладке опыта активность МИС составляла 100 м.к. в пробе, опыт превышал отрицательный контроль (без контакта с антигеном) в 3 и более раз. Через 12 месяцев после проведения повторного контроля диагностикумов были получены аналогичные результаты. Такие исследования проводили каждый год в течение 3 лет (срок наблюдения). Препараты сохраняли свои физико-химические свойства и специфическую активность в течение всего срока наблюдения и оставались механически прочными, химически стабильными, устойчивыми к действию микро-организмов (таблица 11).

При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт. (1969), в серии опытов титр ИФА t равен 0,8х10 м.к./мл (+8,7 %;-8,0%).

Нами приготовлено 5 серий тест - систем магноиммуносорбентных для диагностики возбудителя туберкулёза в иммуноферментном анализе (ИФА), в которые входят: туберкулёзные магноиммуносорбенты -10 % взвесь, 3 ампулы по 2 мл; положительный контроль - обеззараженные клетки микобактерий туберкулёза 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула -1 мл; иммунопероксидазный конъюгат с активностью 1:400-1:800 и все ингредиенты, необходимые для постановки ИФА (ФСБ, БСА, твин -20, цитратный буфер, хромоген, гидроперит, стоп-реагент).

Кроме стандартного метода ИФА, нами разработан и модифицированный способ его постановки, обеспечивающий упрощение, сокращение времени анализа при высокой чувствительности метода.

Сущность модификации при постановке анализа заключалась в том, что в качестве твёрдой фазы используются магносорбенты с иммобилизованными антителами (эту операцию можно провести заранее и хранить данные препараты без потери специфической активности в течение 3 лет (срок наблюдения). Постановку ИФА осуществляют в наконечниках от дозаторов, шприцах или маленьких колонках, внося туда 2 мл 10 % взвеси аффинных МИС. В дальнейшем через МИС пропускают исследуемый материал, а через сорбент с отрицательным контролем - фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) с твин-20. За 2 - 5 мин через МИС, взаимодействуя с антителом, прикреплённым к магносорбенту, проходит антиген, находящийся в исследуемом материале, формируя комплекс антитело-антиген (АТ-Аг). МИС промывают 1 мл ФСБ-твин и вносят 0,2 мл рабочего разведения туберкулёзного иммунопероксидазного конъюгата, который, проходя через МИС, взаимодействует с комплексом АТ-Аг. Далее колонку промывают 5 мл ФСБ-твин. Для визуализации реакции через сорбент пропускают 0,2 мл субстрат-индикаторного раствора и учитывают результаты через 1-2 мин на сканирующем приборе «Мультискан» при 492 нм, добавив в окрашенный раствор стоп-реагент. Ответ считают положительным, если оптическая плотность опытного раствора превосходит оптическую плотность контрольного в 2 и более раза. В результате проведённых опытов было установлено, что показания оптической плотности опытных образцов превышали показания отрицательного контроля более чем в 5 раз, что говорит о положительном результате реакции. Данный метод позволяет обнаружить микобактерии в пределах 1 х10 - 1 х10 м. к. в пробе, при отсутствии перекрёстных реакций с гете-рологичными штаммами, что свидетельствует о специфичности метода.